EXTRACCION DE ADN EN SANGRE Y EN MOSQUITO Y

ELECTROFORESIS

Edin Arroyo, Leonardo Chamorro, José Martínez, Libardo caraballo

Universidad de Sucre. Facultad de Educación y Ciencias. Departamento de

Biología. Programa de Biología. Laboratorio de parasitología molecular.

RESUMEN

El proceso de extracción del ADN geonómico sigue ciertas pautas para su

correcta purificación que son muy diferentes a los empleados en la purificación
de proteínas. Existen varias técnicas que se utilizan para la extracción de
ADN; en esta práctica se utilizó el método de altas concentraciones de sales
con el fin de extraer material genético de muestras de sangre y de mosquito.
Este método consiste en la utilización de altas concentraciones de sales
acetato de amonio para precipitar proteínas y posteriormente precipitar ADN
con alcohol absoluto, para comprobar los resultados de la extracción se realizo
un electroforesis en la cual se visualizaron las bandas de ADN corridas en el
gel de agarosa. Este método resulta ser viable para la extracción de ADN en
ambas muestras.

Palabras claves: extracción de ADN, electroforesis, sangre, , mosquito,

acetato de amonio, gel de agarosa.

INTRODUCCION información genética usada en el

desarrollo y el funcionamiento de los
El ácido desoxirribonucleico,
organismos vivos conocidos y de
frecuentemente abreviado como
algunos virus, siendo el responsable
ADN o DNA, del inglés
de su transmisión hereditaria.
DeoxyriboNucleic Acid, es una
La extracción de ADN de una
macromolécula que forma parte de
muestra celular se basa en el hecho
todas las células. Contiene la
de que los iones salinos son
atraídos hacia las cargas negativas de le adicionó 500 µL de acetato de
del ADN, permitiendo su disolución potasio 8M se incubo durante 30
y posterior extracción de la célula. minutos en hielo y posteriormente
Se empieza por lisar (romper) las se centrifugo a 13000 rpm durante
células mediante un detergente o un 15 minutos. Sele adiciona 100 µL
buffer de lisis, vaciándose su de etanol y se incubo a temperatura
contenido molecular en una ambiente por 10 minutos. Se vuelve
disolución tampón en la que se a centrifugar por 15 minutos y el
disuelve el ADN. En ese momento, precipitado se lavo con etanol al
el tampón contiene ADN y todo un 70% dos veces. Se seca a
surtido de restos moleculares: ARN, temperatura ambiente y se
carbohidratos, proteínas y otras resuspende en 20 µL de buffer TE.
sustancias en menor proporción. Extracción de ADN del mosquito.
Las proteínas asociadas al ADN, de El ejemplar de mosquito fue
gran longitud, se habrán fraccionado triturado en 50ml de tampón de lisis.
en cadenas más pequeñas y Esta solución se incubo por 1hr a
separadas de él por acción del 65°C. Se adicionaron 14µl de
buffer de lisis. Sólo queda, por acetato de potasio 8M y se incubo
tanto, extraer el ADN de por 30min en hielo, posteriormente
esa mezcla tampón y detergente, se centrifugo a 13000 rpm durante
para lo cual se utiliza etanol frio. 15min. Y se incubo a temperatura
ambiente por 10min en etanol
MATERIALES Y METODO absoluto. Se volvió a centrifugar a
13000rpm y el precipitado se lavo
Extracción de ADN en sangre
dos veces con etanol al 70%. Se
Para la extracción de ADN se tomo
seco a temperatura ambiente y se
una muestra de sangre (250 µL) a la
resuspendio en 20µl de buffer TE
cual se le adiciono 250 µL de buffer
de lisis (NaCl 0,1 M; sacarosa 0,2
Se lavó con 500µL de etanol al
M; EDTA 50mM, tris-HCl 100Mm pH
70%, se centrifugó a 12000 rpm por
8,25; SDS 0,05 %).A esta solución
10 min y se descarto el
de le adiciono proteínas K a una
sobrenadante. El precipitado se dejó
concentración de 10mg/ml. Se
secar a temperatura ambiente y por
incubó a 65 °C por una hora y luego
último se re suspende con 100 µL concentraciones de sales. Se utilizo
de agua. buffer de lisis, cuya función es
romper la membrana celular y
ELECTROFORESIS nuclear, permitiendo esto la
Después de realizar la extracción de
liberación del ADN. Dicho buffer,
ADN, tanto del vector como de la
para la extracción de ADN de
muestra de sangre se procedió a
sangre, contenía Proteinasa K, es
realizar la electroforesis, la cual se
una proteasa que degrada las
realizo en gel de agarosa 1%. Las
proteínas de membrana y facilita su
muestras de DNA tanto de sangre
lisis, liberando el ADN.
como de mosquito se disolvieron en
Químicamente la proteinasa K actúa
un buffer de carga (Green) en una
a nivel de los péptidos en los
proporción 8:2µl respectivamente.
grupos carboxílicos alifáticos y
Posterior a esto se hizo la siembra
aminoácidos aromáticos propios en
en los posos y se procedió a realizar
los lípidos de membrana. Este
el corrido.
proceso de lisis de membrana fue
complementado con el baño de
RESULTADOS María que a 65 0c activa de forma
Fig.1 Corrido de las muestras de
eficiente a la proteinasa K. La
ADN en el gel de agarosa.
remoción de proteína y
contaminantes se realiza por
centrifugación adicionando alcohol,
obteniendo un sobrenadante
compuesto por restos de
membrana, organelas celulares,
protoplasma y restos de
hemoglobina, esto para el caso del
ADN extraído de sangre, debido a
que la extracción de ADN de
ANALISIS DE RESULTADO mosquito no se utilizo la proteinasa

En la práctica realizada se obtuvo K.

DNA de sangre y de mosquito Después de la ruptura celular y la

mediante el método de altas eliminación del pellet de restos

celulares, se añade una sal para
disminuir la solubilidad de las separando las proteínas con
proteínas por incremento de la solventes orgánicos y precipitando
fuerza iónica del solvente, lo que se el DNA de la fase acuosa con etanol
conoce como precipitación por absoluto.
salado. Después de la adición La muestra es lavada y precipitada
de cierta cantidad de sal, se con alcohol al 70% del cual el 40%
establece una competencia entre es alcohol y el 30 % es agua. El
los grupos cargados y polares de la alcohol se encarga de precipitar el
proteína y los iones de la sal (en ADN, pues este, es soluble en agua
mayor número) por las moléculas de (y, por tanto, invisible a nuestros
agua que disminuye la capa de ojos, pues cada molécula está
solvatación alrededor de la molécula rodeada de agua y nuestra vista no
proteica, sus grupos hidrofóbicos percibe moléculas individuales de
superficiales se exponen y se ADN) pero insoluble en alcohol, lo
favorece el establecimiento de cual origina que en presencia de
interacciones intermoleculares, la éste se aglutine o "se precipite". Al
agregación y por tanto, la aglutinarse, el ADN forma partículas
precipitación. Cuando se centrifuga macroscópicas y se hace visible.
se obtiene un precipitado blanco. El Finalmente el ADN es resuspendido
pH puede variar la solubilidad de las en buffer TE, el cual es una solución
proteínas ya que los grupos pueden amortiguadora del pH comúnmente
cargarse o descargarse haciendo la empleada en biología molecular,
superficie más o menos polar. A pH especialmente para procedimientos
isoeléctrico las repulsiones que buscan proteger al DNA o RNA.
intermoleculares son mínimas ya La capacidad amortiguadora del
que la carga neta es cero. Las buffer depende del Tris, mientras
características del anión y del catión que el EDTA es el responsable de
también son importantes. Las sales proteger a los ácidos nucleicos
más efectivas son las que presentan inactivando a las DNAsas o
aniones polivalentes mientras que RNAsas. El EDTA logra esta
los cationes son menos importantes, inactivación actuando como
no obstante se prefieren los quelante de cationes divalentes
monovalentes. Con el sobrenadante como el Ca2+ y el Mg2+ los cuales
se procede de igual forma,
son indispensables para el http://www.escolares.net/des
funcionamiento de estas enzimas. cripcion.php?ide=942
Dicha muestra de ADN se utilizo
 Gustavo A. Saldaña, Efraín
para realiza la electroforesis en gel
G. Salazar. La extracción y
de agarosa, la cual demostró que el
purificación del ADN para el
proceso de extracción de ADN se
análisis por PCR [En línea].
dio de forma correcta e incluso se
Microbial S. Girona España.
dieron resultados en la muestras de
Disponibilidad:
ADN mal tratadas. Tal como se
http://www.microbial-
puede observar en la imagen.
systems.com/web/uploads/do
cs/news/Newslet _Microbial
CONCLUSIONES

 La proteinasa K es un buffer
de lisis del material celular, la
cual degrada los péptidos de
membrana plasmática y
nuclear, facilitando la
liberación de ADN.
 El ADN se precipita en
alcohol, pues es insoluble en
este, y se torna visible en la
interfaz alcohol-H2O.
 El corrido electroforético
depende de una buena
práctica de extracción de
ADN.

BIBLIOGRAFIA

 LETELIER Ignacio. Grupos

sanguíneos. [En línea]. Terra
Networks, S.A. Chile.
Disponibilidad: