PBL de Microbiologia

Dr. Carles Alonso Noviembre del 2006

PBL DE MICROBIOLO IA
Miembros que participan en la resolucin del caso.

GRUPO 1 . Erola Ainsua . Arantxa Blasco . Anna Ci it

GRUPO ! . "aniel Castillo . #$ria %&nc'e(

GRUPO ) . E a *einblatt . Carolina #$+e( . M, -ourdes %&nc'e(.Cid

GRUPO / . #$ria Mon0ort . Marta 1illarroel

GRUPO 2 . 3eresita Masan Galleto . Beatri( %outo

GRUPO 4 . Rosa *ern&nde( . #ira %u&re(

DOC!MEN"O DE ACEP"ACI#N
-os miembros que a continuacin 0irman este documento mani0iestan que 'an participado en la elaboracin del traba5o6 7 que 'an le8do 7 aceptado su contenido. . Erola Ainsua . Arantxa Blasco . "aniel Castillo . Anna Ci it . E a *einblatt . Rosa *ern&nde( . 3eresita Masan Galleto . #$ria Mon0ort . Carolina #$+e( . #$ria %&nc'e( . M, -ourdes %&nc'e(.Cid . Beatri( %outo . #ira %u&re( . Marta 1illarroel

CA$O CL%NICO DE MICROBIOLO %A

En la sesin de tutor8a se nos plantea un caso cl8nico re0erente a un paciente seropositi o que presenta un aumento de la car9a iral pasados tres a+os desde el inicio del tratamiento con antirretro irales. Pensamos que el paciente puede 'aber desarrollado una resistencia a dic'o tratamiento6 pero es necesario estudiar en pro0undidad el caso para con0irmarlo 7 descartar otras causas. El si9uiente traba5o se 'a estructurado en seis apartados que reunen los conocimientos necesarios para la resolucin del caso: 1. ;istoria natural de la in0eccin por 1<;. !. "eteccin de anticuerpos en el dia9nstico microbiol9ico ). %ensibilidad6 especi0icidad6 con0irmacin. /. Estudio de las car9as irales. 2. Estudios de resistencia a los antirretro irales: 0enotipado6 9enotipado 7 0enotipo irtual. 4. 3=cnicas de Biolo98a Molecular en el dia9nstico microbiol9ico: PCR cualitati a 7 PCR cuantitati a alor predicti o positi o 7 alor predicti o ne9ati o. Pruebas de

&I$"ORIA NA"!RAL DE LA IN'ECCCI#N POR EL (I&)I

IN"ROD!CCI#N * DE'INICI#N El 1irus de la <nmunode0iciencia ;umana >1<;? es el a9ente in0eccioso determinante del %8ndrome de <nmunode0iciencia Adquirida >sida?. -as primeras cepas de 1<;1 0ueron descubiertas 7 aisladas en el a+o 1@A). M&s tarde6 se identi0ic otra clase6 el 1<;!6 end=mico en ciertos pa8ses pero con menor irulencia que el 1<;1. Existen di0erentes clasi0icaciones de la en0ermedad. Una de ellas se basa en el recuento de lin0ocitos 3 C"/B6 7 en su cl8nicaC de manera que di ide el 1<; en ) cate9or8as: cate9or8a A6 en9loba aquellos pacientes asintom&ticos con lin0oadenopat8asC cate9or8a B6 pacientes con in0ecciones no en9lobadas entre las !) in0ecciones oportunistas clasi0icadas por la OM% como complicaciones del 1<;C 7 cate9or8a C6 pacientes con al9una de las !) in0ecciones oportunistas. Dsta 0ue re isada en 1@@): Cate9or8a >2EEF!EE./@@<!EEA >asintom&tica? A1 A! A) Cate9or8as cl8nicas B >sintom&tica6 no C condiciones? B1 B! B) C >indicador %<"A C1 C! C) condiciones Cel.3C"/B?

El 1<; 1 tambi=n se di ide en tres tipos: M6 O 7 #. -a M a la e( se subdi ide en @ subtipos siendo el subtipo B el predominante en Espa+a 7 en el mundo occidental en 9eneral. E$"R!C"!RA El 1<; pertenece a la 0amilia Retrovirae 7 al 9=nero Lentivirus. Es un irus es0=rico con en oltura de doble membrana. En esta membrana se encuentran unas prote8nas llamadas Gp/1 7 Gp1!E6 encar9adas de reconocer a los receptores de la c=lula 'u=sped6 act$ando como ant89enos proteicos que se acoplan espec80icamente a las c=lulas del 'u=sped. "entro del irus se encuentra una c&pside proteica que en uel e el 9enoma iral. El 9enoma est& 0ormado por dos copias de AR# monocatenario. "entro de esta en oltura tambi=n est&n presentes unas en(imas >transcriptasa6 inte9rasa 7 proteasa? que a7udan en la replicacin del AR# iral. El 1<;1 tiene tres 9enes estructurales denominados gag >prote8na de la nucleoc&pside?6 pol >proteasa6 transcriptasa 7 retrotranscriptasa? 7 env >9lucoprote8na de en oltura?6 adem&s de seis 9enes re9uladores que condicionan la comple5idad de la interaccin irus.c=lula 7 su pato9enia. CICLO (IRAL -a primera etapa de la in asin del irus a la c=lula es la 0i5acin. Consiste en un reconocimiento mutuo6 entre las prote8nas de la en oltura del irin >Gp/1 7 Gp1!E? 7 los receptores de los -3 C"/B6 macr0a9os6 c=lulas dendr8ticas 7 dem&s c=lulas 'u=sped6 con a7uda de unos correceptores de la c=lula a in adir6 CCR2 en el caso de macr0a9os 7 CGCRA en -3C"/B6 que son los que interact$an con las prote8nas de super0icie del irin >Gp1!E?. Una e( reconocidos6 la penetracin es el se9undo paso. -a en oltura del irin se 0usiona con la membrana plasm&tica de la c=lula 7 se ac8a en el citoplasma. %e eliminan las cubiertas proteicas 7 la c&pside de manera que el AR# 8rico queda libre para ser procesado. En la tercera etapa se desarrolla la transcripcin in ersa del AR# 8rico para dar A"#c. -as dos mol=culas de AR# con a7uda de la en(ima transcriptasa in ersa 0orman dos mol=culas de A"# que se asocian para 0ormar una mol=cula encar9ada de inte9rarse en el 9enoma de la c=lula 'u=sped. El A"# 8rico penetra en el n$cleo 7 se inserta en el A"# celular con a7uda de la inte9rasa procedente del irin. -a transcripcin del A"# se lle a a cabo por los mecanismos normales de la c=lula. El resultado es un AR#m que una e( procesado puede salir a tra =s de los poros nucleares. "e nue o en el citoplasma6 el AR#m se diri9e a los ribosomas para participar en la traduccin 9enerando poliprote8nas. -a proteasa iral es la encar9ada de cortar estas poliprote8nas 7 obtener prote8nas constituti as del irus. Estas prote8nas se ensamblan con AR# pro iral 7 0orman los compuestos internos de la estructura del irin. El $ltimo paso es la 9emmacin6 cuando los nucleoides 8ricos se acercan a la membrana plasm&tica de la c=lula6 0orman una erru9a 7 se acaban desprendiendo 0ormando un nue o irin capa( de in0ectar

a otras c=lulas. En cada c=lula in0ectada se ensamblan miles de incompletos e incapaces de in0ectar. "RAN$MI$I#N

iriones6 aunque muc'os son

Existen di0erentes 8as de transmisin: sexual6 parenteral 7 ertical. -a 8a de transmisin sexual se produce a tra =s del contacto de secreciones in0ectadas con la mucosa 9enital6 rectal u oral de la otra persona. Existe una alta relacin entre transmisin 7 contacto sexual por 8a anal debido a la 0ra9ilidad de la mucosa de la membrana rectal. Cuando se presenta una in0eccin asociada a una in0lamacin6 el n$mero de lin0ocitos 7 monocitos se e incrementado en las secreciones de manera que aumentan las posibilidades de transmisin 7a que est&n presentes un n$mero ele ado de c=lulas diana. Esta transmisin puede lle arse a cabo por dos 8as: directamente en san9re si 'a7 'erida en la mucosa6 o por la presencia de in0eccin de c=lulas diana que 0acilitan la transmisin. -a transmisin sexual de 'ombre a mu5er es oc'o eces m&s probable que de mu5er a 'ombre debido a la mor0olo98a 9enital. Puede producirse una transmisin por sexo oral6 aunque las posibilidades son menores. -a sali a consta con una respuesta inmunitaria 0uerte6 pero la presencia de in0ecciones bucales con in0lamaciones aumenta las posibilidades al i9ual que los traumatismos o 'eridas en la ca idad oral. Aunque el irus se encuentra en la sali a en menor cantidad6 es una posible 8a de transmisin si a acompa+ado de in0lamaciones bucales como la 9in9i itis al aumentar el n$mero de lin0ocitos 3 C"/B. -a recepcin de sexo oral no 9aranti(a se9uridad de no transmisin. En la 8a de transmisin parenteral se puede transmitir el irus por trans0usiones san9u8neas o por transplantes de te5idos u r9anos6 7 es la 8a com$n de transmisin entre toxicmanos al compartir 5erin9uillas. #o es necesaria una puncin intra enosaC por 8a subcut&nea o intramuscular el 1<; presenta buena transmisin6 siempre dependiendo de la cantidad de muestra 7 del periodo de exposicin. -os pro0esionales de laboratorio deben tener especial cuidado al estar expuesto a =l. -a transmisin por puncin con material contaminado se puede dar tambi=n dependiendo de la muestra6 del tiempo de exposicin 7 de las caracter8sticas de la puncin. %i no 'a7 puncin pero 'a7 contacto con material in0ectado la transmisin tambi=n depende de la presencia de 'eridas o mucosas en la piel. -a 8a de transmisin vertical se trata de la transmisin madre.'i5o a tra =s de la placenta. %in embar9o6 el contacto m&s 0recuente se da en el momento del parto por contacto de san9re o 0luidos a9inales de la madre6 dependiendo de la car9a iral presente. Por ello6 es aconse5able la ces&rea o el tratamiento con antirretro irales antes6 durante 7 despu=s del parto 7a que se 'a comprobado que disminu7e la probabilidad de transmisin. -a lactancia materna es otra posible 8a de transmisin de madre a 'i5o. PA"O ENIA El 1<;.< proli0era en 0orma continua desde el momento en que in0ecta a un paciente. Cabe distin9uir: 'ase +reco, in-ecci.n ag/da o +rimoin-ecci.n . 1a desde el in9reso del irus al or9anismo 'asta cuando el su5eto in0ectado comien(a a producir anticuerpos contra el irus -os anticuerpos aparecen entre las 4 7 1! semanas de la in0eccin primaria6 7 su deteccin es la base del dia9nstico de la en0ermedad. -os primeros anticuerpos detectados son aquellos contra las prote8nas estructurales o prote8nas Ga9 >p!/ 7 p!H?6 m&s tarde aparecen los anticuerpos contra el en oltorio >9p1!E6 9p14E6 pAA 7 9p/1? 7 contra los productos del 9en pol. Estos anticuerpos se 'a obser ado que pueden reali(ar una 0uncin protectora6 bien neutrali(ando directamente el irus o bien a7udando a los lin0ocitos #I en la destruccin de las c=lulas que expresan ant89enos irales6 aunque tambi=n pueden estar implicados en la pato9=nesis del irus6 7a que en al9unos casos los anticuerpos anti.9p1!E pueden lle9ar a destruir lin0ocitos 3 C"/B no in0ectados. -a respuesta inmunitaria celular es reali(ada principalmente por los lin0ocitos 3: los lin0ocitos 3 C"/B6 que a pesar de ser los primeros en ser in0ectados 7 destruidos a$n son capaces de sobre i ir 7 producir una expansin clonal6 7 los lin0ocitos 3 C"AB6 que pueden producir citocinas 7 destruir directamente las c=lulas a0ectadas uni=ndose a ellas por sus receptores de ant89eno. <ndependientemente del mecanismo de transmisin6 los s8ntomas que aparecen tras el conta9io del 1<; 9uardan relacin con la dosis in0ectante6 la irulencia de la cepa 7 la capacidad de respuesta del su5eto in0ectado. En esta 0ase se puede ser asintom&tico o presentar s8ntomas Jsimilares a los de la 9ripeJ6 que 9eneralmente duran pocos d8as 7 pueden incluir 0iebre6 escalo0r8os6 sudores nocturnos 7 erupciones en la piel. "espu=s6 la persona in0ectada uel e a erse 7 sentirse completamente bien. Aproximadamente un )E./EK de los casos cursan de 0orma asintom&tica. -a presentacin de 0iebre alta persistente durante un per8odo de 1E.1/ d8as puede pronosticar un curso r&pidamente pro9resi o. -a

serocon ersin6 es decir6 la aparicin de los anticuerpos anti.1<; se produce entre A d8as 7 1/ semanas6 aunque a eces se retrasa 'asta 4 meses. "urante este per8odo entana el su5eto permanece serone9ati o pero tiene capacidad in0ectante. A partir de las primeras 'oras de in0eccin el 1<;.< in ade el te5ido lin0&tico6 donde alcan(a concentraciones mu7 ele adas. "urante la primoin0eccin en el plasma se pueden alcan(ar ni eles mu7 altos de iriones circulantes cu7a presencia puede demostrarse a tra =s de la cuanti0icacin de copias de AR#.1<;.< >car9a iral? >!.4 semanas?. Posteriormente6 con el tiempo aparecen los di0erentes tipos de anticuerpos >1.) meses? 7 una dr&stica reduccin de la concentracin de irus circulante. A lo lar9o de este proceso a9udo puede 'aber una inmunodepresin transitoria. Particularmente6 la di0usin del irus a los r9anos lin0oides es un 0actor importante en el establecimiento de una in0eccin crnica 7 persistente. Parece que el ni el inicial del iremia del plasma en la in0eccin del 1<; primaria no determina necesariamente el 8ndice de la pro9resin de la en0ermedadC sin embar9o6 el punto de a5uste del ni el de la iremia del estado estacionario del plasma despu=s de 1 a+o se puede correlacionar con la rapide( de la pro9resin de la en0ermedad. 'ase in0ermedia o cr.nica. En esta 0ase6 que 9eneralmente dura arios a+os6 persiste la acti idad proli0erati a 8rica. En casi todos los pacientes es posible detectar 7 cuanti0icar la concentracin de AR# 8rico >car9a iral?. En el plasma se alcan(a un ni el de equilibrio que depende de la tasa de produccin 8rica 7 de la destruccin. -os pacientes suelen ser asintom&ticos o sin adenopat8as. -a car9a iral 7 en menos medida la ci0ra de lin0ocitos C"/B son los me5ores marcadores de la pro9resin cl8nica. A pesar de que una persona in0ectada puede parecer sana6 el 1<; est& acti o 7 durante esta etapa6 contin$a debilitando el sistema inmunol9ico durante arios a+os. En la ma7or8a de las personas6 sin embar9o6 en al9$n momento se produce una depresin r&pida del sistema inmunol9ico 7 el irus se multiplica r&pidamente. Este da+o se puede obser ar en los an&lisis de san9re antes de que se experimenten los s8ntomas. El establecimiento de la cronicidad de la in0eccin es debido a la capacidad del irus de e adir la eliminacin 7 el control por el sistema inmune mediante la mutacin6 ariando la con0ormacin del sitio de unin del receptor6 7 de in0ectar c=lulas que se escapan del control inmunol9ico como las del sistema ner ioso central.

'ase sin0om10ica. Cuando el sistema inmunol9ico se e comprometido por la in0eccin con 1<;6 muc'as personas comien(an a experimentar s8ntomas le es6 como erupciones en la piel6 0ati9a6 sudores nocturnos6 p=rdida de peso6 $lceras en la boca6 in0ecciones por 'on9os en la piel 7 en la u+as. -a ma7or8a6 pero no todos6 experimentar& s8ntomas le es de este tipo6 antes de desarrollar en0ermedad m&s 9ra e. %i bien el pronstico ar8a muc'o6 dependiendo de arios 0actores6 en 9eneral la aparicin de los primeros s8ntomas le es de en0ermedad se da entre cinco 7 siete a+os despu=s de la in0eccin. Estos s8ntomas marcan las etapas tempranas 7 media de la etapa sintom&tica de la en0ermedad por 1<; aunque no son necesariamente espec80icos del 1<; o del desarrollo de sida. %in embar9o6 deben ser moti o de preocupacin para los seropositi os. Generalmente6 los s8ntomas aparecen cuando el irus 7a

'a causado un da+o considerable en el sistema inmunol9ico. Por eso6 estos pacientes no deber8an esperar 'asta que apare(can s8ntomas para recibir tratamiento m=dico. 'ase -inal o crisis. En este momento 7a 'a7 una ca8da si9ni0icati a de los lin0ocitos C"/B >L!EEFmm)? 7 el irus se reproduce mu7 acti amente. El su5eto comien(a a presentar una serie de problemas relacionados con la in0eccin por el 1<; mismo 7 por la presencia de otras m$ltiples in0ecciones que atacan dado el deterioro de la inmunidad6 son las llamadas in0ecciones oportunistas6 causadas por or9anismos que 9eneralmente no producen en0ermedad en personas con un sistema inmunol9ico normal6 pero que emer9en en las personas con un sistema inmunol9ico comprometido. "urante esta etapa puede 'aber mani0estaciones a ni el de todos los r9anos6 por e5emplo: neumon8a por Pneumocystis carinii6 toxoplasmosis6 citome9alo irus >a0ecta retina6 es0a9o6 colon 7 m$ltiples r9anos?6 candidiasis del es0a9o6 diarreas por par&sitos como Isospora o Cryptosporidium. -as en0ermedades dermatol9icas6 como lin0omas o el sarcoma de Iaposi6 son unas de las m&s rele antes a la 'ora de dictaminar el inicio de esta etapa. 3ambi=n pueden aparecer problemas neurol9icos 7 demencia ocasionados por el da+o del 1<; al sistema ner ioso central. ;a7 p=rdida de memoria 7 atencin6 capacidad de 5uicio 7 ra(onamiento. %e presentan cuadros con compromiso motor 7 de la 0uncin de la e5i9a. Estos problemas pueden ser causados tambi=n por otros tipos de in0ecciones o ser debidos a problemas psiqui&tricos.

PR!EBA$ DE CRIBA2E EN DE"ECCI#N DE AN"IC!ERPO$

IN"ROD!CCI#N "espu=s de la in0eccin el primer marcador serol9ico que se detecta en al9unos pacientes es el ant89eno p!/6 al9unas semanas despu=s aparecen los anticuerpos que se diri9en 0rente al 1<; 7 se pueden detectar por las t=cnicas de cribado actuales en la ma7or8a de los pacientes in0ectados antes de transcurridos tres meses de la exposicin al irus. En 9eneral las t=cnicas que son m&s sensibles para la deteccin de anticuerpos diri9idos 0rente al core del 1<; se pueden positi i(ar antes6 al i9ual que las que detectan anticuerpos de la clase <9M6 si bien este tipo de anticuerpos no son espec80icos solamente de la primoin0eccin 7 pueden aparecer en etapas ulteriores del desarrollo de la in0eccin. "e este modo los primeros anticuerpos que se suelen positi i(ar son los anti.p!/ 7 anti.9p14E6 mientras que el resto de los anticuerpos an apareciendo de modo pro9resi o en las semanas si9uientes. Existen di0erentes m=todos para la reali(acin de las pruebas de cribado para la deteccin de anticuerpos espec80icos 0rente al 1<;. Entre ellos las t=cnicas E-<%A >en(7me.linMed immunoabsorbent assa7?6 pruebas de a9lutinacin 7 an&lisis dot.blot son las m&s utili(adas6 especialmente el E-<%A que tambi=n se denomina an&lisis inmunoen(im&tico >abre iado6 E<A?. "3CNICA ELI$A %e basa en la deteccin de un anticuerpo inmo ili(ado sobre una 0ase slida mediante ant89enos que directa o indirectamente producen una reaccin cu7o producto6 por e5emplo un colorante6 puede ser medido espectro0otom=tricamente. El ant89eno puede proceder del lisado iral de un culti o >como en los primeros E<A disponibles que se llamaron de 1, 9eneracin? o bien de prote8nas recombinantes o p=ptidos sint=ticos de 1E.2E amino&cidos espec80icos del 1<; >que se 'an cali0icado como E<A de !,. 7 de ),. 9eneracin?. Adem&s se 'an propuesto 7 desarrollado di0erentes m=todos de ampli0icacin de la se+al >luminiscentes6 cascadas en(im&ticas6...? que 'an permitido ele ar la sensibilidad de al9unos E-<%A a la obtenida en el R<A >radioinmunoensa7o? 'ormonal. "ispositi os empleados en E-<%A: %e 'an ensa7ado numerosas 0ases slidas6 desde los tubos de cristal de los or89enes a las actuales microplacas de @4 pocillos de pl&stico tratado para aumentar su capacidad de adsorcin de mol=culas 7 con 0ondos de pocillo pticamente claros para poder reali(ar las medidas de densidad ptica en instrumentos espec80icos6 espectro0otmetros de lectura de placas que 'an recibido el nombre de lectores E-<%A. Actualmente se est&n desarrollando dispositi os de ma7or capacidad6 por e5emplo con )A/ 7 12)4 pocillos6 adecuados para los sistemas de Nscreenin9N masi o de los sistemas roboti(ados >;3%6 N;i9'.t'rou9'put s7stemN? -os lectores E-<%A son espectro0otmetros capaces de reali(ar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa E-<%A. A di0erencia de un espectro0otmetro con encional6 con capacidad de leer todas las lon9itudes de onda del ultra ioleta 7 el isible de manera continua6 los lectores de E-<%A

disponen de sistemas de 0iltros que slo permiten la lectura de una o pocas lon9itudes de onda. %on la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad ptica de los crom9enos m&s com$nmente utili(ados. *ases de un ensa7o E-<%A: -a primera 0ase es la con5u9acin del anticuerpo o del ant89eno con un en(ima >peroxidasa6 0os0atasa alcalina6...?. El anticuerpo con5u9ado al en(ima se emplea en los ensa7os directos e indirectos6 sandOic'6 etc.. El ant89eno marcado se emplea en ensa7os de competicin de ant89eno. En se9undo lu9ar se da la unin del ant89eno >o del anticuerpo? a los pocillos. %e reali(a con 0acilidad a la super0icie de pl&sticos tratados que tienen 9ran a0inidad por prote8nas. "espu=s se 0orma una o m&s capas de inmunocomple5os. En el caso del ant89eno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti.ant89eno marcado >E-<%A directo? o empleando un anticuerpo primario anti. ant89eno 7 un secundario anti.primario marcado >E-<%A indirecto?. Este se9undo m=todo permite la ampli0icacin de la se+al al poderse unir uno o m&s anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una me(cla de ant89eno 7 ant89eno marcado. %e ensa7an di0erentes relaciones de ant89eno 0r8o 0rente a una cantidad 0i5a de ant89eno marcado. Es el ensa7o de competicin del ant89eno. *inalmente se re ela la reaccin en(im&tica. "espu=s de un la ado para eliminar todas las mol=culas marcadas no 0i5adas en 0orma de inmunocomple5os se a+ade el sustrato en(im&tico en solucin. %e de5a reaccionar 7 se lee la densidad ptica >".O.? mediante espectro0otometr8a. 3ipos de ensa7os E-<%A: %e 'an desarrollado m$ltiples ariantes de ensa7os E-<%A que permiten la cuanti0icacin de un ant89eno o la deteccin de un anticuerpo en solucin. A continuacin se describen los m&s com$nmente usados para la deteccin de anticuerpos: ELI$A com+e0i0ivo direc0o4 -as placas E-<%A se preparan recubriendo los pocillos con los ant89enos espec80icos para los anticuerpos que buscamos. A+adimos el suero del paciente que contiene los anticuerpos >no marcados? 7 tambi=n se a+aden los mismos anticuerpos pero marcados en(im&ticamente. Estos dos tipos de anticuerpos >marcados 7 no marcados? an a competir para unirse al ant89eno de manera que la aparicin de color al re elar6 ser& in ersamente proporcional a la concentracin de anticuerpos en la muestra. Es necesario incluir controles ne9ati os que ser&n muestras del mismo tipo que las anali(adas >san9re6 orina6...? pero en las que se ten9a la certe(a de la ausencia del anticuerpo buscado. Asimismo se inclu7en controles positi os >soluciones donde se encuentra el anticuerpo buscado6 o bien se le 'a a+adido?. ELI$A indirec0o: -as placas E-<%A se preparan de una 0orma id=ntica a la anterior. -os controles positi os 7 ne9ati os son los mismos. A+adimos el suero del paciente que contiene los anticuerpos 7 estos se unir&n a los ant89enos de la placa. Posteriormente se a+aden anticuerpos secundarios marcados en(im&ticamente6 que se unir&n a los del paciente >primarios? 7 que detectaremos a+adiendo un sustrato an&lo9o. -a deteccin tiene ma7or sensibilidad por presentar una ampli0icacin de se+al debida a la unin de dos o m&s anticuerpos secundarios por cada anticuerpo del paciente. Es el ensa7o m&s popular6 pues un mismo secundario marcado 7 un mismo sistema en(im&tico permiten cuanti0icar una 9ran cantidad de anticuerpos. Es el m&s utili(ado en las pruebas de criba5e en pacientes de 1<;. LA $EROLO %A EN LO$ RECI3N NACIDO$ El dia9nstico de la in0eccin por el 1<;.1 en los reci=n nacidos 7 ni+os menores de dos a+os tiene caracter8sticas propias determinadas en 9ran parte por la posibilidad de transmisin pasi a de los anticuerpos maternos6 que di0iculta conocer con las pruebas de cribado rutinarias si realmente el ni+o est& in0ectado6 7 los potenciales e0ectos indeseables que acompa+an a la terapia antirretro iral Actualmente el dia9nstico de la in0eccin por 1<; en los ni+os comprende una combinacin de pruebas como las determinaciones seriadas de anticuerpos 7 deteccin de ant89eno del 1<; que son asequibles a la ma7or8a de los laboratorios mientras que otras6 como el culti o del irus o deteccin de &cido nucleicos6 son reali(adas en laboratorios m&s especiali(ados o centros de re0erencia. Otro de los 'ec'os que an a caracteri(ar la positi idad de las pruebas es el momento e oluti o del embara(o en el que se 'a adquirido la in0eccin. Alrededor del )EK de los casos se producen intrauterinamente en cualquier momento de la 9estacin >in0eccin prenatal o intrauterina? pero la 9ran ma7or8a6 alrededor del HEK6 se adquieren en el mismo momento del nacimiento en el parto 7 solo mu7 pocos casos se adquieren despu=s del nacimiento >lactancia6 etc.?. En el primer caso a a ser posible detectar el 1<; m&s preco(mente que en el resto si bien no siempre es as8 por la posibilidad de quiescencia del irus en las c=lulas in0ectadas. Re iste importancia pues6 conocer que una sola determinacin ne9ati a en ni+os reci=n nacidos o con pocos d8as de ida no tiene alor para descartar la in0eccin 7 que una deteccin positi a en muestras tomadas en los primeros momentos de la ida puede re ertir a la ne9ati idad por la presencia de un inculo iral materno que no 'a in0ectado al ni+o.

-a deteccin de anticuerpos espec80icos por pruebas de E<A o PB aportan pocos datos sobre la in0eccin de los reci=n nacidos 7a que las <9G maternas pasan a tra =s de la placenta 7 se pueden mantener en el ni+o 'asta los 1A meses de ida. -a persistencia6 aumento de la intensidad o aparicin de nue as bandas en el PB a tra =s del an&lisis seriado en el tiempo de las muestras puede ob5eti ar la in0eccin del 'i5o6 sin embar9o no es $til si el 0in es establecer un dia9nstico preco( para instaurar la terapia. Otros tipos a anticuerpos como la <9M o la <9A espec80icas al 1<; no atra iesan la barrera placentaria 7 su presencia se puede considerar dia9nsticaC sin embar9o la sensibilidad de las pruebas E<A disponibles es escasa6 en torno al 1EK al nacer 7 al 2EK 'acia los seis meses de ida. -a deteccin de la anti9enemia p!/ re iste en los ni+os los mismos problemas que en los adultos: poca sensibilidad de los E<A 7 presencia de ant89eno solo en determinadas 0ases e oluti as probablemente por su 0i5acin en inmunocomple5os con su anticuerpo. Aunque reali(ada de 0orma rutinaria en los neonatos su sensibilidad es menor del !EK al nacer 7 un poco m&s alta a partir de los ) mesesC sin embar9o 7a que re0le5a la deteccin directa del irus6 su positi idad6 en ausencia de errores t=cnicos6 es un si9no inequ8 oco de in0eccin ertical . INM!NOCROMA"O RA'%A * PR!EBA$ DE A L!"INACI#N Estas dos t=cnicas son una buena alternati a a la E-<%A 7 la Radioinmunoen(imoan&lisis. %on pruebas alternati as a la E-<%A de 9ran utilidad que se usan en pa8ses subdesarrollados6 sobretodo en el continente A0ricano6 7a que su coste es mu7 in0erior al de un E-<%A a parte de las di0icultades t=cnicas de reali(ar estos ensa7os en pa8ses del )r mundo. En los pa8ses desarrollados tambi=n se utili(an 7a que son pruebas mu7 r&pidas 7 sensibles. <nmunocromato9ra08a: consiste en una peque+a placa de un material cromato9r&0ico donde en una (ona determinada tenemos 'ibridados los ant89enos de inter=s >en este caso6 p!/ por e5emplo? 7 al 0inal de la placa tenemos otros ant89enos uni ersales que utili(amos como control6 para determinar que la prueba 'a 0uncionado. %e deposita una 9ota de san9re al principio de la placa que por cromato9ra08a ir& corriendo. %i en la muestra 'a7 presencia de anticuerpos6 en la lectura eremos que tanto la (ona de ant89enos como la (ona control nos dan un resultado colorim=trico6 en caso contrario solo nos dar& resultado la (ona de control. %e sobreentiende que si no aparece nin9una l8nea es que la prueba no 'a 0uncionado correctamente. Pruebas de a9lutinacin: tienen un mecanismo mu7 parecido al anterior pero aun son m&s r&pidas. Consiste en 'ibridar los ant89enos de inter=s a unes peque+as bolitas de l&tex. En un portaob5etos colocamos una 9ota con bolitas de l&tex 7 otra peque+a 9ota6 a una cierta distancia6 de muestra >san9re?6 las me(clamos 7 esperamos unos se9undos. %i 'a7 presencia de anticuerpos eremos una reaccin de a9lutinacin6 ol i=ndose turbia la me(cla 7 compacta. Por el contrario6 si no 'a7 anticuerpos eremos bien di0erenciados los dos medios. Prueba r&pida 7 mu7 indicati a 7 de menor coste que los E<A.

E$"AD%$"ICA DE PR!EBA$ DIA N#$"ICA$ * PR!EBA$ DE CON'IRMACI#N

E$"AD%$"ICA$ Para elaborar un dia9nstico6 'a7 que acumular in0ormacin6 que se di ide en si9nos6 cl8nicos 7 complementarios. Aqu8 nos interesamos en los si9nos complementarios6 que son dados por los resultados de di0erentes pruebas. As86 para una a0eccin considerada6 buscamos si un si9no Q Rsi9no con un inter=s dia9nosticoS Q esta presente o ausente. Para e aluar pruebas complementarias6 utili(amos di0erentes probabilidades: el alor predicti o positi o16 el alor predicti o ne9ati o !6 la sensibilidad) 7 la especi0icad/. En estad8stica6 los si9nos son representados por ariables binarias6 es decir6 el si9no esta presente >%? o no >%T?. "espu=s emos si el dia9nstico es erdadero >M? o no >MT?6 es decir6 si el paciente tiene la en0ermedad o no.

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VPP = Pr (M/S) VP / (VP + FP) VPN = Pr (M/S) VN / (VN + FN) 3 Se = Pr (S/M) VP /(VP + FN) 4 Sp = Pr (S/M) VN / (VN+ FN) VP : verdaderos positivos ; FP : falsos positivos ; VN : verdaderos negativos ; FN : falsos negativos

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En realidad6 cuando se reciben los resultados de un examen6 'a7 que pre9untarse cual es la probabilidad de presencia de la en0ermedad >M? en este paciente6 si el resultado es positi o o ne9ati o. Esas probabilidades se llaman R alores predicti osS. El alor predicti o positi o de un si9no para una en0ermedad es la probabilidad de que el paciente ten9a la en0ermedad si tiene el si9no. El alor predicti o ne9ati o es la probabilidad de que el paciente no ten9a la en0ermedad si no tiene el si9no. Esos alores pueden exprimirse en 0uncin de la 0recuencia de la en0ermedad en la poblacin. Como las proporciones de en0ermos 7 de no en0ermos cambian6 para una misma en0ermedad6 de un centro 'ospitalario al otro6 los alores predicti os no son los par&metros m&s usados para e aluar una prueba. -os m&s usados son la sensibilidad 7 la especi0icad que son en 0uncin de la poblacin en0erma >sensibilidad? o de la poblacin sana >especi0icad?. -a sensibilidad de un si9no para una en0ermedad es la probabilidad de que el si9no est= presente >que la prueba de un resultado positi o? si el paciente tiene la en0ermedad. Por eso6 las pruebas sensibles son pruebas de criba5e. 3ienen la capacidad de resultar positi as en casi todas las personas in0ectadas6 7 no da 0alsos ne9ati os >es decir6 el si9no est& ausente pero el paciente tiene la en0ermedad?. %i el resultado de la prueba de criba5e es positi o6 se repite con la misma muestra de san9re. U si tambi=n es positi o6 los resultados se con0irman mediante pruebas de con0irmacin que pueden di0erenciar6 por e5emplo en el caso del sida6 los anticuerpos anti.1<; del resto de anticuerpos. -a prueba de criba5e E<A puede dar 0alsos positi os en personas no in0ectadas. Por eso6 la prueba de con0irmacin tiene que ser especi0ica. -a especi0icad de un si9no para una en0ermedad es la probabilidad de que el si9no est= ausente si el paciente no tiene la en0ermedad. "a un resultado ne9ati o para casi todos los pacientes no en0ermos. -as pruebas de con0irmacin que existen actualmente son el Pestern.Blot >el m=todo m&s utili(ado?6 la inmuno0luorescencia indirecta6 la radioinmunoprecipitacin 7 el inmunoensa7o en l8nea. PR!EBA$ DE CON'IRMACI#N El 5es0ern Blo0 65B? se basa en la separacin de las prote8nas >ant89enos? obtenidas del 1<;.1 procedentes del lisado del culti o del irus 7 puri0icadas por centri0u9acin. -a prote8na iral se coloca en un 9el de poliacrilamida en 0orma de l&minas del9adas 7 lue9o se e0ect$a una electro0oresis con la que las prote8nas mi9ran en 0uncin de su peso molecular. "espu=s se trans0ieren a una tira de nitrocelulosa 7 se cortan en tiras de unos 2 mm de anc'o. Dstas son las tiras que se exponen al suero 'umano diluido6 despu=s de una incubacin se la an 7 se uel en a incubar con una <9G anti'umana marcada con una en(ima que con la exposicin a un re elador en(im&tico producir& una banda coloreada en las (onas correspondientes a los anticuerpos espec80icos que conten9a la muestra. -as principales bandas del PB son las prote8nas de la en uelta: 9p14E6 9p 1!E 7 9p /16 las prote8nas del core P226 /E6 !/ 7 1H6 las prote8nas que codi0ican para la transcriptasa in ersa6 P44 7 P216 7 la endonucleasa6 la P)1. -os criterios para la interpretacin de los resultados son los expuestos a continuacin: #o bandas presentes NE A"I(O

Bandas en p)1 o p!/ U bandas presentes en 9p 14E PO$I"I(O o 9p 1!E. ;a7 bandas presentes pero el patrn no cumple el criterio de positi idad. INDE"ERMINADO

El ma7or problema que probablemente presentan los PB es la reacti idad indeterminada de bandas p!/6 p22 o p44. -as principales causas de PB indeterminado suelen obedecer a una reacti idad inespec80ica > er 0alsos positi os?6 una in0eccin por 1<;.! u otros retro irus 'umanos6 la serocon ersin

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al 1<;.16 el estado a an(ado de in0eccin 1<;.16 un 'i5o de madre seropositi a6 di er9encias 9en=ticas de la cepa del 1<;.1 >a0ricanos?. -as enta5as son que con0irma de0initi amente la in0eccin por ;<16 detecta al menos un @4K de las in0ecciones 7 que produce mu7 pocos 0alsos positi os. Dstos son debidos principalmente a reacciones cru(adas con ribonucleoprote8nas 'umanas6 otros retro irus6 anticuerpos 0rente a ant89enos mitocondriales6 nucleares6 de c=lulas 3 7 leucocitarios6 anticuerpos 0rente a ant89enos ;-A clases < 7 << 7 9lobulinas en una 9ammopat8a monoclonal. El principal incon eniente es su ele ado precio6 que lo 'ace in iable como prueba de con0irmacin en al9unos pa8ses subdesarrollados. Adem&s6 no puede detectar la in0eccin 'asta que los anticuerpos se desarrollan 7 produce al9unos resultados indeterminados. La Inm/no-l/orescencia indirecta permite detectar anticuerpos anti 1<;.1 en suero o plasma. *luoro9nos <*A 3M en concreto6 aprobado en 1@@! por la *"A6 utili(a c=lulas 3 'umanas inmortali(adas e in0ectadas que expresan ant89enos del 1<;.1. Como control se utili(an c=lulas 3 no in0ectadas. %i existen anticuerpos anti 1<;.1 en suero o plasma6 se unir&n a las c=lulas in0ectadas pero no a las control. -os anticuerpos unidos son detectados con inmuno9lobulinas anti.'umanas con5u9adas a isocianato de 0luoresce8na6 que emitir& 0luorescencia al ser expuesto a lu( U1. %e obser a con un microscopio de 0lorescencia 7 se e al$a la intensidad de 0luorescencia 7 el porcenta5e entre c=lulas in0ectadas 7 no in0ectadas. -a enta5a es que requiere menos experiencia t=cnica6 menos tiempo 7 dinero que el PB6 adem&s6 presenta una sensibilidad 7 especi0icidad similar. -a principal enta5a es que el resultado6 sea positi o o ne9ati o6 es m&s 0&cil de leer en comparacin con los resultados indeterminados que aparecen en el PB. La Radioinm/no+reci+i0aci.n usa ant89enos marcados radioacti amente para detectar anticuerpos espec80icos en el suero. -os ant89enos pueden reaccionar con el suero 7 precipitarse utili(ando un reacti o especial la prote8na A se0arosa. El inmunoprecipitado unido6 marcado radioacti amente6 se anali(a 9eneralmente mediante electro0oresis en 9el que es re elado por autorradio9ra08a. El incon eniente es que es una t=cnica limitada a laboratorios capaces de lo9rar la propa9acin del 1<;.1 en culti os celulares6 pero o0rece m&s sensibilidad que el PB 0rente a las prote8nas de alto peso molecular6 a excepcin de la p!/. El An1lisis inm/noen,im10ico de 0i+o lineal 6LIA7 es equi alente al PB pero incorpora en un soporte plano6 equi alente a la tira6 arias prote8nas recombinantes o p=ptidos sint=ticos correspondientes a di0erentes prote8nas del 1<;.1 7 en al9unos casos del 1<;.!. En al9unos sitios reempla(an al PB pero la presencia de p=ptidos sint=ticos puede ocasionar resultados 0alsos ne9ati os en la in0eccin 1<; a9uda 7 en ni+os.

C!AN"I'ICACI#N DE LA CAR A (IRAL EN EN'ERMO$ DE (I&

El test de cuanti0icacin de la car9a iral o P1- >Plasma 1iral -oad? consiste en la medida de los ni eles de AR# del 1<; en plasma para cuanti0icar el n$mero de part8culas irales circulantes. Es un marcador de la acti idad del 1<;. !$O CL%NICO Este test se usa rutinariamente desde 1@@H debido a la estrec'a correlacin de la car9a iral con la e olucin a sida en indi iduos 1<; positi os6 a la relacin con un ma7or ries9o de transmisin 7 pro9resin del irus 7 a la utilidad para e aluar nue os 0&rmacos. 3ambi=n se usa para monitori(ar el tratamiento con antirretro irales6 es decir6 para decidir el momento de inicio del tratamiento6 su e0ecti idad 7 la necesidad de un cambio si se perdieran los e0ectos bene0iciosos de =ste. C!R$O NA"!RAL DE LA IN'ECCI#N POR (I& El n$mero de part8culas irales en personas in0ectadas por 1<; es ele ado aunque existe 9ran ariabilidad entre indi iduos6 por este moti o se debe estudiar la e olucin del paciente en el tiempo. -a determinacin de lin0ocitos C"/B tambi=n puede ser de 9ran a7uda porque es un indicador del sistema inmune del indi iduo.

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Es importante cuanti0icar la car9a iral en los 4 meses posteriores a la serocon ersin para poder predecir la pro9resin de la en0ermedad. -os indi iduos que presentan W 1E2 copiasFml experimentan una r&pida ca8da de lin0ocitos C"/ B que condiciona la r&pida pro9resin a sida en los si9uientes 2 a+osC mientras que si la car9a iral es menor6 la pro9resin a sida se dar& despu=s de muc'os a+os de in0eccin. En la 0ase asintom&tica los ni eles de AR# en plasma ar8an entre los pacientes 7a que depende de la e0icacia del sistema inmune que es el que aten$a la replicacin del irus. En la 0ase sintom&tica el paciente padece in0ecciones oportunistas 7 se obser a un aumento de la car9a iral debido a la muerte de los lin0ocitos C"/B.

!$O DE LA P(L EN EL "RA"AMIEN"O CON AN"IRRE"RO(IRALE$ %e recomienda iniciar el tratamiento cuando la car9a iral est& entre 1E.EEE.)E.EEE copiasFml 7 si el recuento de C"/B es menor de )2E a 2EE por mm). "espu=s de / a 4 semanas desde el inicio del tratamiento se espera una reduccin de 1 o ! lo9 >la reduccin de la car9a iral se expresa en lo9 1E?. En caso que despu=s de conse9uir una importante reduccin del P1- la car9a iral uel a a aumentar6 'a7 que considerar la aparicin de mutantes 7 la necesidad de cambiar el tratamiento antirretro iral. %e debe tener en cuenta que todas las determinaciones de un mismo paciente se tienen que 'acer por el mismo m=todo que se us para medir la car9a iral basal6 no 'a7 que reali(ar nin9una medida 'asta pasado un mes de 'aberse acunado o su0rir una in0eccin oportunista 7 se considerar&n si9ni0icati as las ariaciones de car9a iral superiores a E.2lo9 para descartar la ariabilidad biol9ica indi idual. MEDIDA DE LA CAR A (IRAL EN PLA$MA Existen tres tipos de t=cnicas: Am+li-icaci.n del ARN +or R")PCR4 Am+licor &I()8 moni0or 0es0 Es la t=cnica m&s usada para cuanti0icar la ca9a iral en en0ermos de 1<;.1 7 es el $nico test aprobado por la *"A para estimar el pronstico de indi iduos a0ectados por esta en0ermedad. En primer lu9ar se a8sla el AR# 7 se a+ade un control interno para detectar posibles problemas en el aislamiento 7 ampli0icacin. Gracias a la A"#.polimerasa termoestable se lle a a cabo la transcripcin in ersa del 9en gag 7 se obtiene A"#c a partir del AR#. A continuacin se ampli0ica el A"#c por una PCR con encional >reaccin en cadena de la polimerasa? 7 una e( 0inali(ada6 se desnaturali(an las copias obtenidas de A"# bicatenario para pasar a la 'ibridacin con sondas oli9onucleot8dicas espec80icas para el 1<;.1 7 el control interno. *inalmente se a+ade el con5u9ado >;RP: a idin. 'orseradis' peroxidase?6 se detecta con 3MB que es un sustrato colorim=trico 7 se lee a /2E nm.

Am+li-icaci.n iso09rmica de ARN 4 NA$BA &I()8 RNA :" -a t=cnica #A%BA >#ucleic Acid %equence.Based Ampli0ication? consta de una ampli0icacin basada en la transcripcin 7 una deteccin basada en un m=todo de electroquimioluminiscencia. -a t=cnica ampli0ica selecti a 7 directamente el AR# del 1<;.1 >9en gag? en un solo paso del procedimiento de 'ibridacin isot=rmica >/1VC? utili(ando ! oli9onucletidos como primers6 ) en(imas >AM1.R36 AR#asa ;6 3H AR# polimerasa?6 nuclesidos tri0os0ato 7 los tampones adecuados.

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El mecanismo de ampli0icacin se di ide en ! 0ases6 una c8clica 7 una no c8clica. En la no c8clica se extrae 7 puri0ica el AR#. Al AR# se le une el primer1 a partir del cual una transcriptasa re ersa 9enerar& un '8brido A"#c.AR#. -a cadena de AR# se de9rada por la AR#asa 7 a la cadena A"#c sobrante se le une un primer! cre&ndose as8 una doble cadena de A"#. A partir de la doble cadena la 3H AR# polimerasa a sinteti(ando AR# que reinician el ciclo conocido como etapa c8clica. -a cantidad de AR# se determina por electroquimioluminiscencia6 es decir6 la deteccin se basa en la emisin de lu( por parte de &tomos de rutenio que se unen al AR#. Para dic'a cuanti0icacin se necesitan calibradores internos.

Am+li-icaci.n de la se;al +or <ibridaci.n molec/lar4 b)ADN= >/an0i+le? &I( RNA v2

-a t=cnica b."#A >branc'ed "#A o A"# rami0icado? permite cuanti0icar las mol=culas de AR# del 1<;.1 en el plasma partiendo de los iriones. Esta t=cnica consi9ue m&s sensibilidad en m=todos b."#A de se9unda 7 tercera 9eneracin. -os pasos a se9uir son: %e concentran los iriones por centri0u9acin6 a continuacin se libera el AR# >di9estin proteica? 7 se captura en placas 9racias a los oli9onucletidos complementarios que contienen. Posteriormente se a+aden sondas rami0icadas que 'ibridar&n con el 9en pol del 1<;.1 7 0inalmente6 unas nue as sondas marcadas >con 0os0atasa alcalina? nos proporcionar&n la luminiscencia al a+adir el sustrato >dioxietano?. -a quimioluminiscencia 9enerada ser& proporcional a la cantidad de 1<;.1 7 ser& cuanti0icada en un espectro0otmetro. Para esta cuanti0icacin tambi=n ser&n necesarios calibradores internos.

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RE$I$"ENCIA$ DEL (I& AL "RA"AMIEN"O AN"IRRE"RO(IRAL

Para el tratamiento de la in0eccin por el 1<;.1 se 'an aprobado 14 medicamentos antirretro irales: H son an&lo9os de nucletidosFnuclesidos >#R3<? como el Xido udine6 3eno0o ir6 AX36 que son in'ibidores de la transcriptasa re ersa >R3?C 4 son in'ibidores de la proteasa >P<? como el %aquina ir 7 ) in'ibidores no nuclesidos de la R3 como el #e irapine >##R3<?6 que son los m&s selecti os. -as pautas terap=uticas empleadas 9eneralmente consisten en la combinacin de al menos tres 0&rmacos6 de los cuales dos son in'ibidores de la R3 an&lo9os de nuclesido 7 el tercero es un no nuclesido o bien un in'ibidor de la proteasa. -as distintas combinaciones posibles de estos re98menes terap=uticos se en9loban dentro de la denominacin terapia de alto rendimiento o HAART >'i9'l7 acti e antiretro iral t'erap7? 7 'an demostrado producir un bene0icio irol9ico e inmunol9ico pro0undo 7 mantenido en aproximadamente dos tercios de los pacientes. El 1<; presenta una 9ran capacidad de adaptacin a los cambios introducidos en su medio natural6 7 0undamenta esta cualidad en di ersos mecanismos6 entre los que cabe destacar dos: la R3 carece de acti idad exonucleasa )T2T6 que act$a como correctora de errores 7 que el irus presenta una alta tasa de replicacin >1E1E nue os iriones cada d8a?. Estos procesos dar&n lu9ar a una alta tasa de mutacin6 que dar& paso a la seleccin de cuasiespecies en irtud de su capacidad de super i encia en un ambiente R'ostilS >presencia de antirretro irales? 7 se producir& por tanto una seleccin de aquellas que presenten caracter8sticas de super i encia m&s 0a orables en estas circunstancias. -a deteccin de ariantes resistentes nos puede permitir correlacionar dic'o 0racaso con los distintos 0&rmacos administrados 7 optimi(ar la terapia. "IPO$ DE "3CNICA$ PARA LA DE"ECCI#N DE RE$I$"ENCIA$ -as t=cnicas para la determinacin de las resistencias del 1<; a los distintos antirretro irales se pueden clasi0icar en dos 9randes 9rupos: 9enot8picas6 que detectan mutaciones en el 9enoma del irus6 7 0enot8picas6 que determinan la sensibilidad del irus a distintos 0&rmacos. Las 09cnicas geno0@+icas se basan en el an&lisis del 9enoma 7 por tanto detectar la presencia de mutaciones6 utili(ando la ampli0icacin por PCR de aquellas re9iones implicadas en el desarrollo de resistencias6 'abitualmente el 9en de la R3 7 el de la proteasa >PR?6 para el posterior an&lisis de su secuencia de nucletidos. Entre las distintas t=cnicas 9enot8picas actualmente en uso destacar8amos las si9uientes: secuenciacin de &cidos nucleicos6 ensa7os -iPA 3M 7 GeneC'ip3M. -a secuenciacin es el m=todo 9enot8pico de re0erencia que proporciona in0ormacin de todos los nucletidos de la re9in en estudio. Para secuenciar el 1<; de la muestra problema se pueden adoptar dos estrate9ias: la secuenciacin del 9enoma pro iral inte9rado en los lin0ocitos6 que 7a est& como A"#6 o la reali(acin de una retrotranscripcin pre ia de AR# plasm&tico. Actualmente la t=cnica m&s empleada es la secuenciacin c8clica >basada en la aplicacin de la tecnolo98a PCR al m=todo de %an9er? a partir de productos de PCR obtenidos de la ampli0icacin de los 9enes de la R3 7 de PR del irus del paciente. -os productos secuenciados mediante el uso de dideoxinucletidos marcados se detectan en el curso de una electro0oresis en equipos autom&ticos6 obteniendo as8 la secuencia del 1<; de la muestra problema en 0orma de electro0ero9rama 7 =sta se compara con la secuencia de una cepa sal a5e de 1<; mediante un pro9rama in0orm&tico acoplado al secuenciador. -os ensa7os -iPA3M 7 GeneC'ip3M son t=cnicas basadas en la 'ibridacin. -a -iPA 3M nos da directamente in0ormacin sobre la presencia de mutaciones conocidas que con0ieren resistencias a 0&rmacos antirretro irales. En el GeneC'ip3M6 el resultado 0inal es una secuencia del material ampli0icado del 1<; problema. En principio las t=cnicas 9enot8picas se caracteri(an por su sensibilidad6 son menos laboriosas6 m&s r&pidas 7 de coste in0erior a las 0enot8picas. -a existencia de cuasiespecies irales no detectadas6 el desconocimiento del e0ecto de al9unas mutaciones 7 sus resistencias cru(adas6 la comple5a interpretacin6 la ariable respuesta de los pacientes a los 0&rmacos 7 el 'ec'o de tratarse de un marcador indirecto >la presencia de mutaciones no siempre implica su expresin?6 a alan la precaucin de la comunidad cient80ica a su uso. Un nue o sistema de interpretacin del 9enotipo6 introducido por el 9rupo 1irco6 es el 0enotipo irtual6 que busca empare5amientos entre las mutaciones de un determinado 9enotipo 7 una amplia base de

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datos de muestras6 de las que se conoce el 9enotipo 7 0enotipo. -a respuesta del sistema es una sensibilidad 0enot8pica para un determinado 0&rmaco6 que es la media de los 0enotipos indi iduales de todas las muestras de la base de datos que presentan el 9enotipo de la muestra problema. Presenta la enta5a de reducir la interpretacin comple5a del 9enotipo a un 0enotipo sencillo. Permite reali(ar el 9enotipo en los laboratorios de los 'ospitales6 con independencia del sistema ele9ido 7 en iar lue9o los 0ic'eros de las secuencias obtenidas por <nternet de una 0orma r&pida 7 se9ura6 recibiendo en !/ o /A 'oras el posible 0enotipo deri ado de ellas. En cuanto a la limitacin principal6 encontramos que la 0iabilidad del resultado depender& del n$mero de empare5amientos que puedan producirse entre los codones de la muestra real 7 los de la bases de datos6 por lo tanto podemos decir que este m=todo proporciona in0ormacin menos real. Las 09cnicas -eno0@+icas permiten conocer si una determinada cepa del 1<; es sensible o resistente a un 0&rmaco6 teniendo en cuenta su capacidad de replicacin ante concentraciones decrecientes del 0&rmaco in vitro. El resultado que se obtiene se conoce como concentracin in'ibitoria del 2EK >C< 2E? o del @EK >C<@E?6 lo que indica la concentracin de 0&rmaco necesaria para reducir la capacidad de replicacin del 1<; en un 2EK o en un @EK6 respecti amente. Estas t=cnicas requieren el aislamiento 7 la cuanti0icacin del irus en san9re peri0=rica. -os aislamientos son culti ados con c=lulas mononucleares de san9re peri0=rica >CM%P? que se obtienen de donantes sanos 7 que son estimuladas en presencia de diluciones seriadas de un determinado 0&rmaco o de una combinacin de ellos. -a sensibilidad relati a del irus a un 0&rmaco se obtiene en 0uncin de la menor concentracin de 0&rmaco capa( de suprimir la replicacin iral determinada por la cuanti0icacin del ant89eno p!/6 lisis celular o induccin de sincitios6 se9$n sea el sistema de culti o celular utili(ado. Estos estudios tienen la enta5a de alorar con ma7or 0idelidad la sensibilidad del irus 0rente a cada 0&rmaco6 7a que son un marcador directo de la resistencia6 7 se9$n este 9rado de sensibilidad se podr8a alorar en un 0uturo la posibilidad de sobrepasar la resistencia aumentando los ni eles plasm&ticos del 0&rmaco. Adem&s in0orman de resistencia cru(adas 7 son de interpretacin m&s 0&cil. %in embar9o6 estos estudios deben considerarse por el momento como poco iables6 principalmente por la comple5idad6 laboriosidad de la t=cnica6 los altos costes 7 el tiempo necesario para la emisin de resultados. INDICACIONE$ DE LA$ PR!EBA$ DE RE$I$"ENCIA A 'ARMACO$ AN"IRRE"RO(IRALE$ EN LA PRAC"ICA CL%NICA -as recomendaciones para el uso de los estudios de resistencia en la eleccin del tratamiento antirretro iral6 est&n su5etas a ariadas opiniones. En Espa+a6 las recomendaciones reali(adas por el Grupo de Estudio de sida 7 el Plan #acional sobre el sida6 contemplan su uso en pacientes sin tratamiento pre io en tres supuestos espec80icos >in0eccin a9uda6 embara(o 7 pro0ilaxis postexposicin? 7 en pacientes pretratados en 0racaso terap=utico.

LIMI"ACIONE$ DE LA$ PR!EBA$ DE DE"ECCI#N DE RE$I$"ENCIA$ Una precaucin importante a tener en cuenta a la 'ora de tomar las muestras para estas determinaciones es ase9urar que en ese momento el paciente contin$a con el tratamiento que supuestamente 'a 0racasado6 pues el r&pido recambio de la poblacin iral conducir8a a un predominio de subpoblaciones sal a5es que dar8a lu9ar a 0alsos ne9ati os en la determinacin de resistencias. Otra limitacin de estas t=cnicas es la proporcin m8nima que debe representar una subpoblacin determinada respecto al 9lobal de la muestra6 necesit&ndose una proporcin de un !EK para que esa subpoblacin est= representada en el con5unto6 7 por tanto ser detectable. Adem&s6 se requiere un umbral de car9a iral m8nimo para 9aranti(ar la obtencin de resultados 0iables6 que 9eneralmente se establece en 2EE o 1EEE copias de AR#Fml6 dependiendo de la t=cnica utili(ada.

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PCR * PR!EBA$ DE DE"ECCI#N DE AN"I ENO$ (I&

-os irus se pueden e idenciar de 0orma indirecta >contacto del 'u=sped con el a9ente iral mediante la deteccin de anticuerpos espec80icos contra el irus? 7 de 0orma directa >e idencian al irus o a al9uno de los ant89enos irales que se pueden encontrar presentes en los te5idos o 0luidos 'umanos?. "3CNICA$ DIREC"A$ PARA LA DEMO$"RACI#N (IRAL -as pruebas para la demostracin de A9 irales son inmunoensa7os >R<A6 E-<%A6 <*A? 7 pruebas de l&tex. -as que isuali(an la part8cula iral o su e0ecto celular espec80ico son tinciones para microscop8a de lu( 7 electrnica6 culti os o aislamiento iral. U las que e idencian la presencia de material 9en=tico iral son ensa7os de ampli0icacin 9en=tica PCR6 e 'ibridacin >sondas6 A"# rami0icado?. Demos0raci.n de agen0es virales : Mediante esta t=cnica se pueden descubrir A9 irales circulantes 7 que se encuentran en los te5idos del 'u=sped. -a sensibilidad de estas pruebas depende de la cantidad de A9 presente 7 su especi0icidad depende de la cantidad de los antisueros disponibles a tal e0ecto. -as t=cnicas m&s utili(adas son: A9lutinacin con l&tex: las part8culas de l&tex son es0eras de poliestireno que se unen 0&cilmente al 0ra9mento cristali(able >*c? de la mol=cula de <9G o <9M. -os 0ra9mentos de unin al Ac >*ab? quedan expuestos 7 son capaces de unirse al A9 que se encuentra en la muestra cuando los A9 tienen arios ep8topos. -os Ac multi alentes acoplados a m$ltiples part8culas de l&tex se unen al A9 7 se produce un entramado de las part8culas de l&tex que dan como resultado una a9lutinacin isible. Es una t=cnica r&pida pero pueden darse reacciones cru(adas con otros A9 de la muestra. <nmuno0luorescencia directa ><*A?: utili(acin de un Ac espec80ico para el A9 que se quiere descubrir marcado con un 0luorocromo >con5u9ado?. %e extiende la muestra en la placa6 se 0i5a6 se coloca el con5u9ado con la 0luorescencia 7 despu=s de una incubacin 7 la ado6 la placa se obser a en el microscopio de 0luorescencia. <nmunoensa7os: son inmunoensa7os en 0ase slida donde se 0i5an los Ac espec80icos para el irus en la super0icie de una matri(6 tubo o microplaca 7 lue9o se pone el suero o muestra que contiene el A9 que se quiere detectarC una e( ocurre la reaccin A9.Ac6 se 'ace un la ado 7 se a9re9a un Ac marcado. Radioinmunoensa7o >R<A? o inmunoensa7o li9ado a en(imas >E-<%A O E<A?6 dependiendo del tra(ador que se utilice para e idenciar la reaccin. En el R<A >Ac marcado con un istopo radiacti o?6 el Ac que reacciona modo de sandOic' se pe9a a los ep8topos del A9 que 'an quedado expuestosC despu=s de arios la ados6 se mide o cuanti0ica la radioacti idad mediante un contador de centelleoC el n$mero de destellos por minuto es proporcional a la concentracin de A9 que reacciona 7 de acuerdo con una serie de est&ndares de concentracin conocida se reali(a una cur a 7 se extrapolan los alores de la muestra. En E-<%A6 el Ac se marca con una en(ima >0os0atasa alcalina o peroxidasa de r&bano? 7 para re elar la reaccin se coloca el sustrato espec80ico para la en(ima que es modi0icada por =sta 7 produce un compuesto coloreado. Para la cuanti0icacin se mide la absorbancia en una lon9itud de onda determinada en un espectro0otmetro. -a absorbancia ser& directamente proporcional a la cantidad de A9 descubierto. (is/ali,aci.n de la +ar0@c/la viral o s/ e-ec0o cel/lar es+ec@-ico4 aislamien0o de c/l0ivos -os irus son microor9anismos intracelulares 7 para e idenciarlos se deben utili(ar sistemas basados en l8neas celulares que permitan su desarrollo. -a in asin iral se e idencia a tra =s del cambio celular o e0ecto citop&tico 7 mediante t=cnicas complementarias. -os sistemas m&s utili(ados son culti os primarios6 cepas celulares diploides deri adas de te5idos normales 7 l8neas celulares. Para los culti os irales se utili(an monocapas celulares ad'eridas al lec'o de un tubo que contiene una solucin amorti9uadora6 p; adecuado 7 suero bo ino que 0a orece el crecimiento celular. El incon eniente de esta t=cnica est& en su e0icacia6 que depende del momento de toma de la muestra6 transporte6 7 tipo de c=lulas que son esco9idas para que sean permisi as. Cuando no se detecte el e0ecto citop&tico es posible identi0icarlo mediante t=cnicas que a7uden a identi0icar las propiedades irales como la 'emadsorcin. Presencia del ma0erial gen90ico viral : %on t=cnicas de dia9nstico molecular. E idencian el material 9en=tico espec80ico iral conser ado 7 replicable6 en 0luido6 c=lulas o te5idos6 acti o o latente6 son: Ensa7os de 'ibridacin: El conocimiento de los irus que causan in0ecciones importantes en la comunidad6 'an 'ec'o que se dispon9a de 0ra9mentos de A"# del material 9en=tico espec80ico 7 altamente conser ado de un determinado irus que se utili(a como sonda. Dsta6 0rente a sus secuencias

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complementarias se 'ibrida para 0ormar una mol=cula d$plex. %e utili(a para la con0irmacin de un irus en un culti o 7 para descubrirlo directamente en una muestra. %e pueden utili(ar c=lulas o te5idos 0i5ados con sustancias que conser en la mor0olo98a celular 7 la inte9ridad del A"# o AR#. Para estudios de AR# se requieren te5idos 0rescos con9elados r&pidamente con nitr9eno l8quido 7 para estudios de A"# se pueden emplear tanto te5idos 0i5ados como con9elados. -as sondas >tanto A"# como AR#? se someten a un an&lisis de 'ibridacin. %e pueden marcar con radioistopos6 en(imas6 a idita o mol=culas quimioluminiscentes para la re elacin. -as sondas radioacti as requieren empleo de autorradio9ra08a 7 las sondas con en(imas se demuestran por m=todos colorim=tricos. -a sensibilidad de las sondas depende de la cantidad de material 9en=tico para la 'ibridacin6 7 su especi0icidad depende de la calidad de la sonda. 3=cnicas de ampliacin del &cido nucleico:

PCR CUALITATIVA. -a deteccin de material 9en=tico del ant89eno o0rece in0ormacin 0uncional. Este material 9en=tico puede recuperarse de c=lulas6 te5idos o l8quidos acelulares con part8culas 8ricas circulantes. En la PCR tiene lu9ar una multiplicacin exponencial. En el caso del 1<;6 la deteccin de AR# requiere un paso pre io de AR# a A"# mediante la transcripcin in ersa lle ada a cabo por la en(ima retrotranscriptasa. En condiciones determinadas6 la presencia de un A"# molde permite la s8ntesis de una 'ebra complementaria a =sta: la doble cadena se abre por el calor del termociclador 7 la polimerasa empie(a a sinteti(ar la cadena complementaria usando unos cebadores de A"# 7 los oli9onucletidos que se encuentran libres en disolucin. %e necesita controlar otras condiciones como la temperatura 7 la concentracin de iones ma9nesio6 que a7udan a estabili(ar el proceso. Para esto6 el termociclador debe producir una serie de ciclos donde ocurran tres 'ec'os di0erentes a temperaturas tambi=n di0erentes: desnaturali(acin del A"# molde >@!.@4V?6 'ibridacin de los oli9onucletidos a un lu9ar complementario >/2.H!V? 7 extensin de la cadena complementaria >H!V?. Una e( ampli0icado6 el material 9en=tico debe detectarse6 7 para ello tambi=n existen di0erentes t=cnicas6 como la electro0oresis en 9el 7 la isuali(acin con lu( ultra ioleta una e( te+ido el material 9en=tico con bromuro de etidio >a9ente intercalante?6 autorradio9ra08a tras la 'ibridacin de una sonda marcada radioacti amente 7 t=cnicas de quimioluminiscencia6 similares a E<A. PCR CUANTITATIVA aqu8 los procesos de ampli0icacin 7 deteccin se producen de manera simult&nea. Adem&s mediante la deteccin por 0luorescencia se puede medir durante la ampli0icacin la cantidad de A"# sinteti(ado en cada momento. Puesto que los 0ra9mentos ampli0icados se detectan al 0inal de la PCR6 cuando la ma7or8a de reacciones 'an alcan(ado 7a la 0ase de saturacin6 la cantidad de A"# obtenido no suele 9uardar muc'a relacin con la concentracin inicial en la muestra. -a PCR tiene un crecimiento exponencial. Para e itar oscilaciones en la e0icacia de la ampli0icacin se 'a 'ec'o que el A"# diana compita durante la ampli0icacin con una cantidad conocida de control interno a+adida antes de iniciar el proceso > PCR.COMPE3<3<1A?. -os termocicladores para lle ar a cabo la PCR a tiempo real incorporan un lector de 0luorescencia 7 est&n dise+ados para poder medir en el tiempo6 la 0luorescencia emitida en cada uno de los iales donde se realice la ampli0icacin. -os sistemas de deteccin por 0luorescencia empleados en la PCR pueden ser a9entes intercalantes 7 sondas espec80icas marcadas con 0luorocromos. -os a9entes intercalantes son 0luorocromos que aumentan notablemente la emisin de 0luorescencia cuando se unen a A"#ds. El m&s empleado es el %UBR 9reen 1. -as sondas de 'ibridacin espec80icas son sondas marcadas con dos tipos de 0luorocromos. Un donador 7 un aceptor. El proceso se basa en la trans0erencia de ener98a 0luorescente mediante resonancia >*RE3? entre dos mol=culas. -as m&s utili(adas son las sondas de 'idrlisis6 molecular beacons 7 sondas *RE3. -as enta5as de la R3.PCR con respecto a la con encional se basan en la rapide( con la que tiene lu9ar6 7a que no necesita nin9$n proceso adicional de deteccinC utili(a sistemas cerrados con lo que se reduce el ries9o de contaminacinC permite cuanti0icar la concentracin inicial de &cido nucleico presente en las muestras de manera muc'o m&s sencilla 7 precisaC 7 determina de 0orma m&s sencilla las mutaciones puntuales que pueden estar relacionadas con resistencias a medicamentos antimicrobianos o con 0actores de irulencia.

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RE$OL!CI#N DEL CA$O

El caso que se nos presenta es el de un paciente 1<; positi o que desde el momento de la in0eccin 'a sido se9uido 7 tratado con antirretro irales. "esde el inicio del tratamiento las car9as irales siempre 'an sido indetectables pero la tendencia de las $ltimas determinaciones muestra un incremento si9ni0icati o de las copias de AR# iral 7 un descenso de los lin0ocitos C"/B en san9re. El m=dico descarta la posibilidad de una mala administracin del 0&rmaco por parte del paciente. Con toda la in0ormacin recopilada podemos considerar di0erentes 'iptesis que podr8an explicar el aumento de la car9a iral del paciente. Una posibilidad ser8a una pro9resin m&s r&pida 'acia la 0ase 0inal de la en0ermedad6 mientras que una se9unda explicacin ser8a la aparicin de resistencias al tratamiento administrado debida a una o arias mutaciones. El r&pido a ance de la en0ermedad puede erse condicionado por el tipo de 8a de in0eccin6 la car9a iral adquirida en el momento de la in0eccin 7 la e0icacia del sistema inmunitario de cada paciente. En caso que en el momento de la in0eccin 'ubiese recibido una cantidad ele ada de car9a iral 7 existiera un deterioro o ine0icacia del sistema inmunitario6 aunque el tratamiento 0uera el adecuado6 la en0ermedad e olucionar8a m&s r&pidamente 'acia la etapa de sida. #uestro paciente podr8a estar en una 0ase donde se detectan ele adas car9as irales pero a$n no presenta sintomatolo98a. Con la 'istoria cl8nica de Pere Ca aller6 la 'iptesis m&s probable ser8a que 'ubiese desarrollado una resistencia a los antirretro irales administrados. Para detectar esta resistencia podemos buscar mutaciones en el 9enoma del irus mediante PCR >9enotipo? o la resistencia a di0erentes 0&rmacos >0enotipo?. 3ambi=n6 mediante el 0enotipo irtual6 podemos comparar el 9enoma del irus con las mutaciones 7 las resistencias 7a estudiadas disponibles en una base de datos6 para saber el tipo de mutacin. As8 pues6 si se comprobara que existe una mutacin que 'ace que el irus sea resistente al 0&rmaco6 el m=dico deber8a alorar la posibilidad de cambiar el tratamiento.

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