CTEDRA: BIOQUMICA Carreras: Farmacia Profesorado en Qumica Licenciatura en Qumica Licenciatura en Alimentos

SEPARACIN DE BIOMOLCULAS. 1) Suponga que desea purificar por cromatografa de intercambio inico una enzima del metabolismo del ADN, cuyo sustrato es precisamente ADN. Seleccionara una resina de intercambio aninico o catinico? Por qu? 2) La cromatografa de filtracin en gel o de tamiz molecular es un mtodo de separacin proteica basado en el tamao (o, ms precisamente, en el radio efectivo en solucin, el cual es proporcional, para protenas esfricas, a la raz cbica del peso molecular). Una solucin proteica se coloca en una columna empacada con pequeas esferas de polmeros suficientemente hidratados y entrecruzados (Sephadex). Las protenas de tamaos diferentes varan en su capacidad de penetrar los poros hidratados de las esferas. Las protenas pequeas penetran en estos poros y a medida que bajan en la columna lo hacen ms lentamente que las protenas de mayor tamao. Una segunda tcnica de separacin de protenas es la electroforesis en disco: aquellas se someten a un campo elctrico en un soporte en gel de poliacrilamida. Cuando se lleva a cabo la electroforesis en presencia de un agente desnaturalizante, el dodecil sulfato de sodio (SDS), las molculas proteicas se separan por tamao (Las ms pequeas migran ms rpidamente). (El SDS desnaturaliza las protenas unindose a ellas en forma no especfica y dndoles una relacin constante de carga/masa). Ambos procedimientos separan a las protenas segn el tamao y utilizan polmeros entrecruzados como medio de soporte. Cmo es posible que en la filtracin en gel las molculas pequeas se retardan con respecto a las mayores, mientras que en electroforesis en gel de poliacrilamida ocurre lo contrario? 3) Usted tiene una mezcla de tres protenas A, B y C, con pI de 3,5, 6,5 y 10,0 respectivamente, y quiere separarlas por una columna de DEAE-celulosa. Teniendo en cuenta que el grupo DEAE tiene un pKa = 9,5. Qu pH usara para la separacin? Qu orden de elucin esperara encontrar si agrega un gradiente de KCl entre 0 a 1 M? 4) La carboximetilcelulosa es una resina de intercambio catinico con un pKa de 4,5. Ud. tiene tres protenas A, B y C de pI 5, 8 y 10 (no estrictamente en ese orden). Al sembrarlas en esta resina y aplicando un gradiente de pH de menor a mayor eluyen en el siguiente orden: B- A- C. Estas mismas protenas, en una columna de Sephadex G-100 eluyen como de un peso molecular de 50.000, 100.000 y 75.000 y en el siguiente orden: A, B y C. En un gel con SDS A y C presentaron una nica banda de PM 50.000 y B present dos bandas de PM 50.000 y 25.000. Identifique A, B y C. 5) Escriba el orden de elucin de las siguientes protenas al aumentar el gradiente salino. Se utilizan columnas de intercambio inico: a) citocromo c (pI= 10,5), lisozima (pI= 11,0), albmina de huevo (ovoalbmina, pI= 4,6),
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mioglobina (pI= 7,0), de una columna de intercambio aninico. b) citocromo c (pI= 10,5), pepsina (pI= 1,0), ureasa (pI= 5,0) y hemoglobina (pI= 6,8) de una columna de intercambio catinico. Explique sus respuestas. 6) Tres protenas de puntos isoelctricos 5,2 , 7,3 y 6,3 se denominaron con las tres primeras letras del alfabeto griego segn su posicin en un isoelectroenfoque, siendo alfa la ms cercana al nodo y gamma la ms cercana al ctodo. a) Cul es el pI de cada una? b) Cul de las protenas eluir primero durante una cromatografa en carboximetilcelulosa a pH 6? Por qu? c) Si alguna protena quedara retenida, cul o cules seran y cmo las eluira? d) Durante una electroforesis en poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes a pH 8, beta present la mayor movilidad electrofortica. Es posible? Por qu? 7) Las protenas denominadas histonas juegan un papel clave en el empaquetamiento del ADN. Este se enrolla alrededor de las histonas para formar los nucleosomas, partculas engarzadas como las cuentas de un collar. Una mezcla de tres protenas globulares, entre ellas la histona H4, presenta la siguiente composicin de aminocidos: Protena A B C Asp y Glu 90 50 6 Nmero de Residuos Arg, Lys e His 5 10 27

Otros AA 105 60 69

Mediante un isoelectroenfoque se determinaron los puntos isoelctricos de las tres protenas obtenindose los siguientes valores: 3,0, 5,5 y 9,5. Los pesos moleculares obtenidos por cromatografa de exclusin molecular fueron de 15 kDa, 11,3 kDa y 21,5. a) lndique el punto isoelctrico, el peso molecular y el orden de elucin en la columna cromatogrfica de las tres protenas. b) En base a sus conocimientos, podra decir cuI de las tres protenas es H4? Fundamente su respuesta. 8) Usted necesita separar una mezcla de tres pptidos con actividad biolgica. Los mismos poseen la siguiente secuencia: I. Asp-Gly-Glu-His-Pro-Ala-Ala-Asp-Ser-Thr II. Gly-Tyr-Ile-Ala-Phe-Gly-Leu-Val-Trp-Ala III. Gly-Ala-His-Lys-Ser-Gln-Thr-Asn-Lys Para ello cuenta con los siguientes soportes para realizar cromatografa lquida: DEAE-celulosa (-O-CH2-CH2-N+(C2H5)2H), sulfometilcelulosa (-O-CH2SO3-), Butil Sepharosa (-CH2-CH2-CH2-CH3) y Sephadex G-50. Describa un protocolo adecuado para la separacin de estas tres biomolculas e indique el fundamento de su decisin. 9) Ud. est buscando afanosamente una sustancia presente en el esprrago violeta de la Antrtida, que cura (segn dicen) el resfro de los guanacos. En sus estudios termina purificando 2 protenas que no le curan el resfro a nadie, pero que dan cristales violetas muy bonitos. Ambas protenas tienen el mismo peso molecular en condiciones nativas (40.000), pero la composicin de aminocidos es muy distinta, salvo para las cistenas. Tanto la protena A como
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la B tienen 2 cistenas. El anlisis de la protena A pura indica que tiene un solo tipo de aminocido N-terminal (treonina), pero el anlisis de la protena B revel la existencia de 2 tipos de extremos N-terminales (alanina y serina). a) Qu le sugiere que las protenas corridas en un gel PAGE-SDS, no teido con azul de Coomassie, den bandas de color violeta? b) Qu le indica la presencia de un solo tipo N-terminal en la protena A y de dos tipos N-terminales en la protena B? Cuando Ud. trata a la protena A con urea, ya sea en presencia o en ausencia de mercaptoetanol, sta da una nica banda de 40.000 Daltons en un gel de poliacrilamida con SDS. La protena B, en cambio, se descompone en 2 subunidades (una de 30.000 y otra de 10.000 Daltons) slo cuando se la trata con urea y mercaptoetanol. Ni la urea ni el mercaptoetanol solos la disocian. c) Qu infiere de estos resultados respecto de la estructura terciaria y cuaternaria de las protenas A y B? d) Por qu es tan diferente la respuesta al mercaptoetanol pese a que ambas protenas tienen 2 residuos de cistena? e) Por qu no basta la urea para disociar la protena B? Por qu no basta el mercaptoetanol para disociar la protena B?

10) Una protena en su estado nativo tiene un peso molecular de 115.000. a) Deduzca su estructura cuaternaria (nmero de subunidades, PM de cada una de ellas, uniones que las estabilizan y glicosilacin de subunidades) a partir de los resultados de los siguientes geles de poliacrilamida en los que se sembr la protena pura, la cual fue previamente sometida a tres tratamientos (por separado) que se indican abajo. Al final de la corrida electrofortica, los geles fueron teidos con Coomassie Blue, que es un colorante azul que tiene afinidad por las estructuras peptdicas. Tratamientos previos: SDS mercaptoetanol ENDO-H (corta la unin protena-azcar) 1 SI NO NO 2 SI SI NO 3 SI SI SI

b) La sensibilidad del Coomassie Blue es tal que es capaz de detectar a partir de aproximadamente 0,2 g de protena/banda. Cree Ud. que es correcto afirmar que una protena est pura si da una sola banda en un gel teido con ese colorante?

11) Un investigador letn tiene serios problemas para caracterizar una enzima que ha purificado y la accin que tiene sobre ella el compuesto X, un aparente activador. En la Fig. 1 se ve una migracin en un gel nativo de poliacrilamida, teido con azul de Coomassie. En la calle 1, la protena se incub previamente con el compuesto X; en la 2, no. Figura 1

Con el material proteico eluido a partir de cada una de las tres bandas del gel nativo (A, B y C), l hizo un ensayo de actividad, en presencia y en ausencia del compuesto X (Tabla 1). Tabla 1 Fuente de enzima utilizada Banda C Banda A Banda B

Actividad enzimtica medida con X 100 100 2

Actividad enzimtica medida sin X 2 100 2

Ya bastante confundido, el cientfico letn decidi correr esos polipptidos anteriormente extrados a partir de cada una de las bandas (A, B y C) en un gel de poliacrilamida, pero esta vez con SDS (Fig. 2). Luego de ver el resultado, respir aliviado: Figura 2

a) Cmo es la estructura de la protena y cmo la afecta el compuesto X? b) Cmo explica que la banda A haya migrado ms rpido que la B en el gel nativo? 12) La protena heterodimerina est formada por 2 subunidades unidas por puentes disulfuro segn se indica en la figura. Se muestran tambin parte de la secuencia aminoacdica de la subunidad B, correspondiente a su porcin carboxi-terminal, y un esquema del mRNA que la codifica con una porcin de secuencia nucleotdica correspondiente.

a) Cuntas bandas y de qu tamao observara en dos electroforesis (una con y otra sin tratamiento previo de la muestra con mercaptoetanol) en gel de poliacrilamida con SDS de la heterodimerina pura? Justifique. La enfermedad hereditaria heterodimerosis es causada por una mutacin en el gen B que produce una terminacin prematura de la traduccin del RNA mensajero de la subunidad B en el punto donde indica la flecha. b) Cuntas bandas y de qu tamao observara en dos electroforesis (una con y otra sin tratamiento previo de la muestra con mercaptoetanol) en gel de poliacrilamida con SDS de la heterodimerina pura de un paciente homocigota para la mutacin arriba mencionada? Justifique. c) Cuntas bandas y de qu tamao observara en dos electroforesis (una con y otra sin tratamiento previo de la muestra con mercaptoetanol) en gel de poliacrilamida con SDS de la heterodimerina pura de un paciente heterocigota para la mutacin arriba mencionada? Justifique. 13) Un grupo de investigadores dedicados al estudio de diversos tipos de anemias hereditarias detect una hemoglobina con la movilidad electrofortica alterada. Una digestin con tripsina de esta hemoglobina demostr que la alteracin se hallaba en la cadena estando ausente el pptido amino terminal normal (Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys). Se encontr un nuevo pptido trptico formado por 6 residuos de aminocidos, siendo Val su residuo amino terminal. a) Qu sustituciones de aminocidos son consistentes con estos datos?

b) Qu cambio en una sola base en la secuencia del ADN puede ocasionar estas sustituciones de aminocidos? La secuencia del ADN que codifica para la regin amino terminal normal es 5-GTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAG-3. c) Cmo ser la movilidad electrofortica a pH 8 de esta hemoglobina comparada con la de la hemoglobina normal? d) Cuando se hace una electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes de la cadena de la hemoglobina normal se encuentra que migra con una relacin de frente de 0,65 Qu relacin de frente espera encontrar para la cadena de la hemoglobina alterada? e) La hemoglobina normal (PM 64.500) y la mutada fueron sometidas a una filtracin molecular en una columna previamente calibrada. Las protenas marcadoras y los volmenes de elucin se indican en la tabla; el volumen total de la columna fue de 260 ml y el volumen de exclusin determinado con azul de dextrano fue de 100 ml. Qu volmenes de elucin espera para los 2 tipos de hemoglobinas? Protena marcadora Ribonucleasa Quimotripsingeno Ovoalbmina Albmina Aldolasa Catalasa Volumen de elucin (ml) 250 230 210 195 165 150 MM (kDa) 13,7 25,0 43,0 67,1 158,2 231,9

14) El cromatograma de una muestra de protenas en Sephadex G-200 fue el siguiente:

G licera ld e h id o 3 -P -d e sh id ro g e n asa C o n ce n tra cin d e p ro te na e n e l e lu d o A ldo la sa M iog lo b in a C ata lasa O vo a lb m .

159

213

234

24 4

2 85

N d e fra cci n

Las protenas marcadoras fueron las siguientes: Protena PM (x10-4) N de fraccin Aldolasa 16 159 Catalasa 6 213 Ovoalbmina 4 234 Mioglobina 1,6 285

Kav = Ve - Vo Vt - Vo

Se recogieron fracciones de 1,6 ml y el volumen vaco de la columna previamente determinado con azul de dextrano fue de 200 ml. Vt = 500 ml.

Se quiere determinar el PM de la gliceraldehido-3-P-deshidrogenasa. Utilizando la misma columna, en las mismas condiciones se observ que la enzima aparece en la fraccin 244. Indique el peso molecular de la misma. 15) Se purific a homogeneidad una inmunoglobulina G (IgG), la cual posee cuatro cadenas polipeptdicas, dos de 215 residuos de aminocidos y dos de 500 residuos de aminocidos. Estas 4 cadenas estn unidas por puentes disulfuro. Esta IgG es sometida a una electroforesis desnaturalizante (SDSPAGE) en presencia de 2 mercaptoetanol. Las protenas marcadoras y sus movilidades en dicho gel se indican en la tabla. El colorante migr 5,3 cm desde el punto de siembra. Protena marcadora Inhibidor de tripsina Anhidrasa carbnica Gliceraldehido 3-P-deshidrog. Albmina de huevo Albmina srica bovina Fosforilasa B Migracin (cm) 4,4 3,5 3,0 2,5 1,6 1,0 PM 20000 29000 36000 45000 66000 90000

a) Cul ser la movilidad para cada subunidad de la IgG? b) Cul es la masa aparente de la IgG? c) Cuntos nucletidos codifican para esta protena? 16) Usted tiene tres muestras de tres protenas distintas a las que quiere caracterizar. Con este objeto las siembra separadamente en una columna de Sepharosa 6-B previamente calibrada con las siguientes protenas: Protenas Ribonucleasa de pncreas bovino Quimotripsingeno A Ovoalbmina Albmina de suero bovino Aldolasa de msculo de conejo Catalasa de hgado bovino Ferritina de bazo de caballo Tiroglobulina bovina Ve (ml) MM (kDa) 250 13,7 230 25 210 43 200 67 170 158 150 232 130 440 116 669

El volumen de exclusin determinado con azul de dextrano fue de 100 ml y los volmenes de elucin de las protenas fueron A: 134 ml, B: 120 ml y C: 134 ml. El volumen total de la columna fue de 260 ml. Posteriormente con muestras de las protenas se realiz una electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Los resultados fueron: Protena PEPC de maz Albmina Ovoalbmina Quimotripsingeno Migracin (cm) 0,4 2,8 4,8 7,4 kDa 110 67 43 25
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10,2 13,7 2,2 3,4 5,6 7,8 10,0 B (2 bandas) 3,6 9,8 C (1 banda) 0,8 En base a estos datos caracterice a A, B, y C lo mejor que pueda teniendo en cuenta que la corrida del frente es de 12 cm. 17) Ud. tiene 5 ml de una mezcla de triacilglicridos y una protena pura. Una alcuota de 0,1 ml se agit en benceno:agua (3 ml:2 ml). a) En qu fases se distribuyen los distintos componentes de la mezcla? Se sembr una alcuota de la fase que contena la protena en una columna de Sepharosa 6-B previamente equilibrada. Se recogieron fracciones de 2 ml. Las protenas marcadoras fueron de pesos moleculares 160, 90, 60, 40, 16 kDa y valores de Kav de 0,18; 0,36; 0,47; 0,60 y 0,87, respectivamente. El valor de Kav de la muestra se calcul en 0,32. Adems, se corri una electroforesis con SDS en las siguientes condiciones: I) La protena se hirvi sin DTT (agente reductor), II) La protena se hirvi previamente con agente reductor. El patrn electrofortico se muestra en la figura. b) Indique el peso molecular de la protena nativa. c) Infiera la composicin cuaternaria de la protena. II kDa Prot. testigo I Por otro lado se dos la concentracin de 72 protena espectrofotomtricamente a 280 nm, utilizando un testigo de BSA de 0,5 mg / ml, con 60 una alcuota de 1 ml y una cubeta de 0,5 cm de 40 paso ptico. Se obtuvo una Abs. de 0,400 para el testigo y de 0,295 para la muestra. d) Teniendo en cuenta que toda la protena pas a la fase correspondiente, determine la concentracin de la misma en la mezcla original.
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Ribonucleasa A (5 bandas)

SDS PAGE 18) Se quiere estudiar la estructura cuaternaria de una proten-quinasa (PKasa) dependiente de cAMP, purificada de hepatocito de rata. Una alcuota de PKasa pura (daba una sola banda proteica en electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones nativas) se cromatografi en una columna de exclusin molecular (Superosa 4 B). La columna tena un volumen de exclusin, medido con azul de dextrano, de 50 ml y un volumen total de 130 ml. La columna haba sido calibrada con protenas de peso molecular conocido mostradas en la siguiente tabla. El volumen de elucin para la PKasa purificada usando esta columna fue de 73 ml.

Testigo Albmina Aldolasa Catalasa CF1

Ve (ml) 110 85 75 59

PM 65.000 160.000 230.000 440.000

Con otra aIcuota de la PKasa se realiz una electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS), observndose dos bandas proteicas teidas con igual intensidad que migraron 2,0 cm y 7,7 cm. La tabla muestra la migracin electrofortica de distintas protenas de peso molecular conocido corridas en paralelo con el mismo gel. Testigo PEP carboxilasa Fosforilasa a Albmina Quimotripsina Migracin (cm) 0,6 1,1 4,2 11,1 PM 110.000 96.000 65.000 25.000

En base a estos datos: a) Calcule el peso molecular de la PKasa y la composicin en subunidades de la estructura cuaternaria de la enzima. b) Si la actividad especfica de la PKasa purificada, determinada en condiciones ptimas, es de 208 mol/min/mg de protena y la enzima tiene un sitio activo por subunidad pequea, calcule el ndice de recambio. 19) Las enzimas M y X tienen las siguientes propiedades: M es un heteropentmero (aIfa3- beta2) formado por 3 subunidades aIfa y dos beta. El peso molecular de alfa y beta es 50.000 y 15.000 respectivamente. El punto isoelctrico de M es de 7,8 y tiene un sitio activo por subunidad grande. X es un homodmero de peso molecular 50.000. Su punto isoelctrico es 5,2 y tiene un sitio activo por subunidad. Una mezcla de M (con actividad especfica de 90 mol/min/mg) y X (con actividad especfica de 200 mol/min/mg) fue resuelta por los diferentes procedimientos separativos mostrados en las siguientes figuras: La figura A muestra el perfil proteico de elucin al pasar la mezcIa por una columna de Sephadex G-100 a pH 8,5. La figura B corresponde al perfil de elucin obtenido al cromatografiar la mezcla en una columna de DEAE-celulosa realizada a pH 7,5. La figura C muestra los resultados de las bandas proteicas obtenidas al resolver la muestra por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en condiciones nativas realizada a pH 8.2. La figura D corresponde a una PAGE de la mezcla realizada a pH 8,2 y en presencia de dodecil sulfato de sodio (condiciones desnaturalizantes). a) Identifique cada pico o banda de las figuras en base a las propiedades y condiciones antes descriptas. b) Calcule el ndice de recambio para M y X.

20) A fin de caracterizar una enzima purificada, Ud. somete su preparacin a cromatografa de exclusin molecular en columna de Sephacryl S300 (SS300) y a electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE). Los resultados obtenidos son los siguientes: a) Volumen de elucin de la protena de inters en SS300: 70 ml b) SDS-PAGE: dos bandas de igual intensidad y (ver figura 1) La columna de SS300 tena un Vo de 50 ml y un Vt de 130 ml y fue calibrada con protenas de PM conocido como muestra la Tabla 1. La calibracin de los geles de SDS-PAGE se muestra en la Figura 1.

Tabla 1 Estndar Ovoalbmina Albmina ser. Fosforilasa Aldolasa Catalasa Apoferritina Ve (ml) 108 100 92 82,5 75 66 PM 43.000 66.000 100.000 158.000 232.000 440.000

Figura 1

Origen

116 .0 0 0 9 7 .4 0 0 7 0 .7 0 0 4 8 .5 0 0 2 9 .0 0 0

Frente

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Calcule el PM y la composicin en subunidades de la enzima en estudio. Cuando Ud. mide la actividad en una cubeta de 1 cm de camino ptico y 1 ml de capacidad, obtiene un cambio en la concentracin de sustrato de 0,2 mM/min cuando usa 10 g de la protena purificada. Calcule: a) La actividad especfica de la enzima. b) El ndice de recambio de la enzima. (La enzima posee un mol de Mg2+ por mol de subunidad grande donde se localiza el sitio activo, participando el catin en el proceso cataltico).

RESPUESTAS Prob 1: a) Resina de intercambio catinico. b) Al pH que se trabaja se podra suponer que el sitio activo de la enzima tiene carga neta positiva. Prob 2: La matriz entrecruzada de cada esfera de Sephadex, bajo ciertas condiciones de fabricacin, excluye las protenas grandes pero admite las protenas pequeas. Por consiguiente, las protenas mayores pueden pasar entre las esferas. Las protenas pequeas pasarn a travs del volumen total de la columna. Mientras ms grande sea la protena, menor es el tiempo que se retiene en las esferas y, como consecuencia, se eluye ms rpidamente. En el soporte para la electroforesis en gel de poliacrilamida no hay espacios inter-esferas y todas las protenas deben pasar por la matriz entrecruzada. Mientras ms pequea sea la protena, ms rpidamente migrar a travs de la matriz. Prob 3: pH= 8,0 , luego pH= 5,0, por ltimo 3,0. C B A. Prob 4: Prot A: PM 100.000; Homodmero; pI= 8,0. Prot B: PM 75.000; Heterodmero, con una subunidad de PM= 50.000 y otra con PM= 25.000; pI= 5,0. Prot C: PM 50.000; Monmero; pI= 10,0. Prob 5: a) lisozima- citocromo C- mioglobina- ovoalbmina. b) pepsina- ureasa- hemoglobina- citocromo C.

Prob 6: a) alfa: pI= 5,2 beta: pI= 6,3 gamma: pI= 7,3. b) alfa; a pH 6 carga neta (-). c) beta y gamma; aumentando la fuerza inica gradualmente el pH del buffer de elucin. d) Porque es la ms pequea de las tres. Prob 7: a) A: pI= 3,0 MM 21,5 kDa B: pI= 5,5 MM 15,0 kDa C: pI= 9,5 MM 11,4 kDa b) H4 es C. Orden 1. Orden 2. Orden 3.

Prob 9: a) Sugiere la presencia de un catin presente en la estructura de las protenas.

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b) Que A tiene una sola cadena polipeptdica (PM 40.000) y B dos (PM 30.000 y 10.000 unidas por puentes disulfuro). c) Que A es un monmero y B es un heterodmero. d) Que A tiene un enlace disulfuro intracadena y B tiene un enlace disulfuro intercadena. e) Porque la urea acta sobre interacciones hidrofbicas y puentes de H2, no sobre enlaces covalentes. Porque el betamercaptoetanol no puede ingresar dentro de las subunidades de esta protena para cortar el enlace disulfuro. Prob 10: a) Heterotrmero. Subunidades de 60, 30 y 25 kDa. Las subunidades de 60 kDa y 30 kDa estn unidas por puente disulfuro. La subunidad de 30 kDa est glicosilada con un hidrato de carbono de 10 kDa. b) Es incorrecto. En un gel se siembra normalmente de 1 a 2 ug de protena supuestamente pura. En el caso de menor cantidad (1 ug) se tendran 20 % de impurezas y no seran detectables. Prob 11) a) Protena C: heterodmero con 2 subunidades: A, cataltica de 50 kDa de masa molecular y B regulatoria de 30 kDa. El compuesto X separa la subunidad B de A, de esta forma se observa actividad enzimtica. b) En un gel en condiciones nativas el corrimiento electrofortico depende de la carga neta de la protena a ese pH y de la masa de la misma. Seguramente q/m de A fue mayor que B. (Diferenciar que sucedi cuando a las mismas subunidades se las hizo correr en un gel con SDS) Prob 12) a) Sin betamercaptoetanol: banda de 920 AA x 110 Da Con betamercaptoetanol: 2 bandas: 400 y 520 AA x 110 Da b) Sin betamercaptoetanol: 2 bandas: 400 y 500 AA x 110 Da Con betamercaptoetanol: igual que el anterior. c) Sin betamercaptoetanol: 3 bandas: 920, 400 y 500 AA x 110 Da Con betamercaptoetanol: 3 bandas: 520, 500 y 400 AA x 110 Da Prob 13: a) Lys por Glu. b) AAG por GAG. c) Menor. d) Aproximadamente el mismo. e) 198 ml. Prob 14: PM 34.000. Prob 15: a) Movilidad : 3,8 cm; 1,8 cm b) Masa aparente: 157.300 Da c) 2.145 (645 + 1500) Prob 16: A: PM: 400.000 c/ subunidades de PM= 70.000; 58.000; 36.000; 22.000; 14.000 (dos de cada una). B: PM: 560.000 c/subunidades de PM= 55.000 y 15.000 (ocho de cada una). C: PM 400.000 c/4 subunidades de PM= 100.000. Prob 17: a) Fase acuosa: protena; Fase bencnica: triacilglicridos. b) PM 100.000.

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c) Heterotrmero; 2 subunidades de PM= 30.000 y una subunidad de PM= 40.000 (las subunidades de 30.000 estn unidas entre s por puentes disulfuro). d) 7,5 mg/ml. Prob 18: a) PM= 250.000 Heterotetrmero con 2 subunidades 85.000 y 2 subunidades de PM= 40.000. b) ndice de recambio: 26.000/min. de PM=

Prob 19: a) FIG A: 1 pico: M; 2 pico: X. FIG B: 1 pico: M; 2 pico: X. FIG C: 1 banda: PM= 180.000 (Prot M); 2 banda: PM= 50.000 (Prot X). FIG D: 1 banda: PM= 50.000; 2 banda: PM= 25.000; 3 banda: PM=15.000. b) ndice de recambio de M= 5.400/min. ndice de recambio de X= 5.000/min. Prob 20: PM= 314.000. Heterotetrmero 22 c/ subunidades de PM 89.000 () y 68.000 (). a) Actividad especfica: 20 U/mg. b) ndice de recambio: 3.140/min.

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