DETERMINACIN DE FENOLES TOTALES EN MATERIAL VEGETAL.

Felipe Cardoso de Almeida, Carolina Gmez Ros, Guadalupe Enrquez Lpez, Diana Mara Meja Cardona. Universidad de Caldas, Facultad de Ingeniera de Alimentos, Alimentos Funcionales. 2013.

RESUMEN.
La presente prctica fue realizada con el objetivo de evaluar la composicin de fenoles totales en material vegetal (t negro). La determinacin de fenoles totales se llev a cabo utilizando el mtodo de Folin-Ciocalteau. Como procedimiento se realiz la determinacin de humedad de dos muestras del mismo t, la cual fue de 5.47 % en promedio. Se midi la absorbancia de los extractos de las muestras, para posteriormente ser interpoladas en una curva de calibracin de cido glico, compuesto fenlico representativo presente en el t, y de esta forma hallar la concentracin del mismo. El mtodo implementado, permiti observar una variabilidad en el contenido de fenoles totales del orden del 148.91 g /Kg m.s a 171.57 g/Kg m.s. Los resultados obtenidos proveen informacin sobre la composicin fenlica y capacidad antioxidante de t negro, as como sus propiedades funcionales. Palabras clave: Fenoles totales, mtodo de Folin-Ciocalteau, absorbancia, capacidad antioxidante, propiedades funcionales.

ABSTRACT. The present practice was realized by the aim to evaluate the composition of total phenols in vegetable material (black tea). The determination of total phenols was carried out using Folin-Ciocalteau's method. Since procedure realized the determination of dampness of two samples of the same tea, which was 5.47 % in average. There measured up the absorbancia of the extracts of the samples, later to be interpolated in a curve of calibration of Gallic acid, phenolic representative present compound in the tea, and of this form to find the concentration of the same one. The implemented method, it allowed to observe a variability in the content of total phenols of the order of 148.91 g/Kg m.s to 171.57 g/Kg m.s. The obtained results provide information about the phenolic

composition and antirust capacity of black tea, as well as his functional properties. Key words: total Phenols, Folin-Ciocalteau's method, absorbancia, antirust capacity, functional properties.

RESUMO.
A presente prtica foi realizada com o objetivo de avaliar a composio de fenois totais em material vegetal (ch preto). A determinao de fonois totais levou em considerao utilizando o mtodo de Folin- Ciocalteau. Com o procedimento se realizou a determinaao de humidade de duas amostras do mesmo ch, a qual foram 5.47% em mdia. Se mediu a absorvncia dos extratos das amostras, para posteriormente ser imterpretadas em uma curva de calibrao de cido glico, composto fenolico representativo presente no ch, e desta forma encontrar a comcentrao do mesmo. O mtodo implementado, permitiu observar uma variabilidade no contedo de fonois totais de orden de 148.91 g /Kg m.s a 171.57 g/Kg m.s. Os resultados obtidos proveem informao sobre a composio fenlica e capacidade antioxidante de ch preto, assim como suas propiedades funcionis. Palavras chaves: Fenois totais, mtodo de Folin-Ciocalteau, absorvncia, capacidade antioxidante, propiedades funcionis.

INTRODUCCIN. Los compuestos fenlicos o polifenoles constituyen un amplio grupo de sustancias qumicas, con diferentes estructuras y propiedades qumicas y actividad biolgica, englobando ms de 8.000 compuestos distintos. Qumicamente, los compuestos fenlicos son sustancias que poseen un anillo aromtico, con uno o ms grupos hidrxidos. Como antioxidantes, los polifenoles pueden proteger las clulas contra el dao oxidativo y por lo tanto limitar el riesgo de varias enfermedades degenerativas asociadas al estrs oxidativo causado por los radicales libres. El estrs oxidativo se define comnmente como el desequilibrio entre las especies oxidantes y reductoras a nivel celular en un organismo [1].

Entre los componentes del t, que actan favorablemente sobre la salud humana, se encuentran la cafena, aceites esenciales y muy especialmente se destacan los compuestos fenlicos por su efecto funcional en prevencin de enfermedades, las propiedades saludables del t se han corroborado cientficamente, en estos estudios se ha determinado su relacin con la proteccin de enfermedades cardiovasculares, accidentes vasculares cerebrales. El consumo de t se ha correlacionado, de forma inversa, con el desarrollo y progresin de la arterioesclerosis. Se ha comprobado que reduce la tendencia a la formacin de trombos sanguneos y parece ser que los polifenoles actan inhibiendo la absorcin de algunas sustancias lipdicas y del colesterol. Se ha comprobado, mediante estudios in vitro, que la susceptibilidad de las lipoprotenas de baja densidad (LDL) al proceso de oxidacin disminuye en presencia de extractos de t negro y t verde, si bien en concentraciones que no parecen ser recomendables en ensayos in vivo. La cantidad de polifenoles en el t verde y negro es aproximadamente la misma. [2] Los mtodos usados comnmente para determinar y

cuantificar fenoles totales en alimentos y vegetales son el ensayo de la vainillina y el de Folin-Ciocalteu. El mtodo de Folin-Ciocalteu se basa en la capacidad de los fenoles para reaccionar con agentes oxidantes. El reactivo de FolinCiocalteu contiene molibdato y tungstato sdico, que reaccionan con cualquier tipo de fenol, formando complejos fosfomolbdico-fosfotngstico. La transferencia de electrones a pH bsico reduce los complejos fosfomolbdico-fosfotngstico en xidos, cromgenos de color azul intenso, de tungsteno (W8O23) y molibdeno (Mo8O23), siendo proporcional este color al nmero de grupos hidroxilo de la molcula. Los ts verdes y negros contienen poli fenoles con indudables efectos positivos sobre nuestro cuerpo. Protegen el corazn disminuyendo los niveles de colesterol y mejorando el metabolismo de los lpidos. Tambin protegen contra la aparicin de cncer al eliminar los radicales libres que pueden daar las clulas empujndolas hacia un crecimiento incontrolado. Los poli fenoles tambin tienen efectos antibacterianos. [3]

Altos niveles de polifenoles en el t, incluyendo la tearubigina y teaflavinas, pueden proteger a las clulas y los tejidos del dao oxidativo de los radicales libres del oxgeno. Por lo tanto, los fenoles del t pueden activar antioxidantes en el tracto digestivo y otros tejidos despus de su ingesta. La ingesta moderada de t negro mejora los niveles de los factores de riesgos independientes para contraer una enfermedad cardiovascular y las defensas antioxidantes en el plasma, Dicho efecto se atribuye principalmente al efecto sinrgico de los fenoles presentes en el t y en mayor medida con otros elementos antioxidantes (endgeno y exgeno). [4]

del reactivo por 5 mL de agua (1:5) Se Cubri el erlenmeyer con papel aluminio para proteger de la luz. Carbonato de sodio: En un beaker se mezclaron 7 g de carbonato de sodio con 50 mL de agua destilada, se homogeniz la solucin y se llev a un baln volumtrico de 100 mL para aforarlo. Solventes: etanol y acetona en una relacin 50:50, es decir, por cada 50 mL del solvente se adicion 50 mL de agua. Preparacin de la muestra: La muestra no requiri de ninguna preparacin previa para el anlisis. Se pes 1g de t negro, la cual fue inmediatamente utilizada. Primera Extraccin: Se pes 1g de t negro y se adicion a 25mL del solvente respectivo (etanol 50:50) en relacin 1:25. Se cubri la muestra de anlisis con papel de aluminio. Se llev a agitacin magntica durante una hora a 3000 rpm. Se filtr la solucin, obteniendo el lquido filtrado (extracto) y el material slido.

METODOLOGA. La cuantificacin de fenoles totales se realiz para una matriz de origen vegetal, en este caso particular se trat de t negro, marca xito. En primera instancia para realizar la prctica fue necesario preparar los reactivos que eran necesarios: reactivo de Folin, Carbonato de sodio al 7% y los solventes utilizados para la extraccin. Reactivo de FolinCiocalteu: Se tom 1 mL

Segunda Extraccin: Se recuper el slido de la primera extraccin y fue incorporado a 25mL del solvente respectivo (acetona 50:50). Se cubri la muestra de anlisis con papel de aluminio. Se agito durante una hora a 300rpm. Se filtr la solucin, obteniendo el extracto final.

segundo extracto y se adicion 1mL del reactivo de Folin, se dej en reposo durante 6 minutos. Posteriormente se adicion 2mL de carbonato de sodio. Se dej en reposo durante 1 hora a temperatura ambiente. Se ley en el espectrofotmetro a 750nm y por duplicado, la absorbancia de la muestra. Se utiliz como blanco fotomtrico una mezcla en partes iguales del solvente utilizado en la primera extraccin (etanol) y acetona.

Determinacin de contenido fenlico total: En un tubo de centrfuga se tom 1mL del primer extracto y se le adicion 1mL del reactivo de Folin, se dej esta mezcla en reposo durante 6 minutos. Transcurrido el tiempo, se adicion 2mL de carbonato de sodio a la muestra. Se dej en reposo durante 1 hora a temperatura ambiente. Cumplida la hora, se ley por duplicado la absorbancia de la muestra en el espectrofotmetro a 750nm. Se utiliz como blanco fotomtrico el solvente utilizado en la primera extraccin, el etanol. Para la determinacin del contenido fenlico del segundo extracto se mezcl 0,5mL del primer extracto con 0,5mL del

Contenido de humedad: Se pesaron 5g de t negro y se introdujeron en la estufa previamente calentada durante 1 hora. Pasado este tiempo se pes el crisol con el residuo slido contenido y se registr el dato. Se llev el crisol a la estufa por 15 minutos ms, luego se enfro en el desecador y nuevamente se pes. Se realiz esta operacin hasta que se obtuvo peso constante. Se determinara la humedad con la siguiente formula:

RESULTADOS Y DISCUCIN. Para realizar el anlisis del contenido de fenoles totales en la muestra de t, primero fu determinada su humedad.
Tabla 1. Datos obtenidos del proceso de secado de la muestras.

incurrir en errores de mayor magnitud. Por lo tanto se determin la humedad de la muestra de t como: Realizar la medicin de absorbancia a la muestra de t, permitira posteriormente determinar la concentracin de fenoles totales, ubicando dicha absorbancia en una curva de calibracin de cido glico; compuesto fenlico representativo presente en el t. Los siguientes fueron resultados obtenidos: los

Peso inicial de muestra Peso crisol vaco Peso 1 Peso 2 Peso 3 Peso 4

Muestra 1 4.965 g 83.1830 g 87.7900 g 87.7681 g 87.7640 g 87.7637 g

Muestra 2 7.002 g 89.9047 g 96.7627 g 96.6982 g 96.6157 g 96.6155 g

Tabla 2. La humedad de la muestra de t, expresada en gramos por cada muestra.

Tabla 3. Absorbancias para los extractos 1 y 2 por duplicado, es decir para la muestra 1 y para la muestra 2.

Peso inicial de muestra Humedad Porcentaje De Humedad

Muestra 1 4.965 g 0.33775 g 6.80 %

Muestra 2 7.002 g 0.2912 g 4.15 %

Muestra 1 Extracto Extracto 1 2 0.676 0.592 0.679 0.600 0.679 0.601 0.682 0.614 0.679 0.6005

Muestra 2 Extracto Extracto 1 2 0.681 0.667 0.684 0.682 0.692 0.682 0.697 0.684 0.688 0.682

Para determinar el valor de la humedad del t, fue tomado un promedio entre las dos humedades obtenidas, a pesar de ser valores significativamente diferentes por tratarse de la misma muestra, pero a su vez podra ser un valor representativo de la humedad, ya que tomar un valor u otro podra llevarnos a

La absorbancia fue medida en diluciones del orden de del extracto 1 y del extracto 2. Debido a la variabilidad de los datos, se decidi aplicar la medida de tendencia mediana para establecer el valor nico de absorbancia en cada extracto.

Curva de calibracin del cido glico por mtodo de Folin- Ciocalteu.

Tabla 4. Absorbancias para diferentes concentraciones de cido glico.

Concentracin cido glico [ mg/ mL] 0 0.005 0.01 0.02 0.025 0.035 0.04 0.045 0.05

Absorbancia.

concentracin de fenoles totales en la muestra se expresara en un rango determinado, y no con un valor concreto, rango representativo del extracto 1 y 2, de ambas muestras. Cabe mencionar que las muestras pudieron distar en sus resultado de absorbancia por varios factores, entre ellos: las muestras fueron preparadas por diferentes personas, y la masa de t tomada para realizar dichas extracciones no fue exactamente igual, variando entonces desde 1.0005 hasta 1.0095. Razn por la cual la concentracin de fenoles totales no ser exactamente igual en las dos muestras. Otro factor implicado son las diluciones, tanto al momento de preparar la solucin para extraccin, como para leer en el espectrofotmetro, en el caso de preparacin de la solucin, el aforo de las mismas no tiene exactamente el mismo volumen en ambas muestras, y para las diluciones seriadas ocurre el mismo fenmeno a pesar de utilizar pipetas de volumen exacto hay margen de error. La curva de calibracin del cido glico arrojo una tendencia lineal, es decir a mayor concentracin, mayor absorbancia, con un coeficiente de correlacin del 0.9962. A partir de la ecuacin de

0 0.087 0.138 0.235 0.289 0.387 0.432 0.481 0.529

Curva de Calibracin cido Glico 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 y = 10,212x + 0,0255 R = 0,9962

Absorbancia

0,02

0,04

0,06

Concentracin [ mg/mL]

[5].
Tabla 5. Absorbancias de los extractos de t, por duplicado.

Extracto 1 Extracto 2

Muestra 1 0.679 0.6005

Muestra 2 0.688 0.682

Los resultados de las absorbancias de los extractos de t, realizados por duplicado no mostraron valores similares como se esperaba, por tal motivo la

lnea recta arrojada por las determinadas concentraciones de cido glico, se puedo determinar la concentracin de fenoles totales en la muestra de t analizada.

relacin 50:50 con agua destilada en 25 mL.

Para la determinacin de fenoles totales se utiliz la absorbancia de los extractos 2, donde Determinacin de concentracin de Fenoles Totales: Muestra de Clculo. Extracto 1: Anteriormente se haba determinado que el t tena un 5.47 % de humedad, y el factor de dilucin para leer la absorbancia de la muestra en el espectrofotmetro fue 100, es decir dilucin de .
Tabla 6. Concentracin de Fenoles Totales para los Extractos de las muestras 1 y 2

A partir del valor de humedad obtenido para la muestra de t, se determin la concentracin de fenoles totales en la materia seca de la muestra, teniendo en cuenta que 1 g de t fue diluido en 25 mL de solucin, solucin de 12.5 mL de etanol y 12.5 mL de agua destilada, para el extracto 1. Y para el extracto 2, se utiliz solvente acetona

Extracto 1 Extracto 2

[ ] Muestra 1 169.23 148.91

[ ] Muestra 2 171.57 170.01

En los resultados obtenidos se pudo apreciar que el contenido de fenoles totales expresado por medio del cido glico, compuesto fenlico predominante en el t, estuvo en un rango de

Expresando el resultado el resultado en porcentaje, se obtuvo que el contenido de fenoles totales por materia seca de t, se encuentra en un rango de: [6]. De acuerdo a las investigaciones, el contenido de polifenoles estara vinculado con la edad de las hojas del t. Es decir que, cunto ms joven es la hoja, mayor es el contenido de polifenoles. El poder antioxidante de los polifenoles es la base de los poderes que encierra el t con respecto a la salud. Segn investigaciones cientficas, en 100 gramos de t seco se pueden encontrar las siguientes proporciones: Composicin del t: Polifenoles Vitamina B Vitamina C Vitamina E Beta caroteno Cafena Clorofila Fibras 35 % 11 mg 300 mg 100 mg 15 mg % 1% 20 %

Sin embargo la composicin de los polifenoles puede variar entre el 20 y 35 %, variacin debida a la edad de las hojas del t como se mencion anteriormente. Los resultados obtenidos en la determinacin del porcentaje de polifenoles totales en el t, valor comprendido entre aproximadamente, muestran un valor inferior al mostrado por la literatura, correspondiente a un mnimo de y un mximo de , dicho contenido de polifenoles en el t est determinado por la edad de las hojas del mismo, parmetro que no pudo ser controlado o identificado al momento de realizar el anlisis. Por lo tanto, se hace necesario realizar este anlisis con hojas de t de diferentes edades, para de esta manera cuantificar la composicin de polifenoles en funcin del factor que influye directamente en su deterioro o conservacin. Los resultados obtenidos, estn cercanos al contenido mnimo de polifenoles en t, pero se debern hacer una investigacin ms profunda y con ms factores para realizar un juicio sobre la calidad nutricional del t evaluado.

Conferencia de las Naciones Unidas sobre Comercio y Desarrollo (UNCTAD)Informe de mercado sobre productos bsicos: informacin sobre el t.[6].

CONCLUSIONES. Con la realizacin de la prctica determinacin de fenoles totales en el t, se logr estudiar la importancia de los compuestos fenlicos y sus propiedades funcionales. Se cumpli el objetivo de determinar la concentracin de fenoles totales en material vegetal, en este caso siendo el t negro la muestra a analizar.

The effect of black tea on risk factors of cardiovascular disease in a normal population. ELSIEVER. Vol 56. 1 May 2012. [5]. Natalia Medina Ramrez. Evaluacin de la cebolla de rama (Allium fistulosum Linnaeus.). Manizales. Universidad de Caldas. [6]. Angel Gil. Tratado de Nutricin. Tomo II. Composicin y calidad nutritiva de los alimentos. [Online]. Ed 2. Madrid: Panamericana. 2010.

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