Faculdade de Medicina de Lisboa

MDULO I.I
Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento Humano e Gentica

Aulas Terico-Prticas

Curso de Mestrado Integrado em Medicina - Ano Lectivo 2012/2013 1 Semestre

Aula1
A MOLCULA DE DNA: ESTRUTURA, MANIPULAO E ANLISE. CLONAGEM MOLECULAR: CONCEITOS BSICOS.

Consultar no livro de texto recomendado: A molcula de DNA: estrutura e funo pg. 172-178 Do DNA protena pg. 231-235 Manipulao e anlise de DNA pg. 327-331 e 333-336

A MOLCULA DE DNA ESTRUTURA A estrutura da molcula de DNA foi descoberta conjuntamente por James Watson e Francis Crick em 1953, o que lhes conferiu o Prmio Nobel da Medicina e Fisiologia em 1962. Do ponto de vista qumico, o DNA um polmero de nucletidos. Cada um destes nucletidos constitudo por trs componentes: um grupo fosfato, uma pentose e uma base azotada (adenina, timina, citosina ou guanina). Cada novo nucletido liga-se pelo grupo fosfato ao carbono 3 da pentose do ltimo nucletido da cadeia por uma ligao fosfodiester, repetindo-se o processo na direco 5 3. De acordo com o modelo proposto por Watson e Crick, a molcula de DNA constituda por duas cadeias de nucletidos complementares e anti-paralelas, ou seja, com sentidos de crescimento inversos e dispostas em forma de hlice. Esta dupla hlice mantm-se unida devido complementaridade das bases azotadas, que se ligam atravs de pontes de hidrognio.

MANIPULAO Digesto de DNA com enzimas de restrio As enzimas de restrio so o bisturi dos biologistas moleculares pois permitem cortar o DNA de um modo preciso e reprodutvel. As enzimas de restrio fazem parte do grupo das nucleases, enzimas que clivam ligaes fosfodiester entre nucletidos adjacentes. As enzimas de restrio usadas em biologia molecular tm a grande vantagem de clivarem apenas as ligaes entre nucletidos inseridos numa sequncia especfica. Existem comercializadas mais de 230

enzimas de restrio, cada uma das quais reconhece e cliva uma determinada sequncia de nucletidos. As enzimas de restrio identificam-se por uma nomenclatura prpria. Por exemplo, EcoRI refere-se primeira (I) enzima isolada do gnero Escherichia (E) espcie coli (co), estirpe RY13 (R) e Hind III terceira enzima (III) isolada de Haemophilus influenzae, estirpe Rd.

Ligao de molculas de DNA A ligao entre duas molculas de DNA catalisada por enzimas denominadas ligases de DNA, que estabelecem ligaes fosfodister entre extremidades 5-fosfato e extremidades 3-hidroxilo adjacentes. Esta ligao ocorre preferencialmente quando as molculas de DNA possuem extremidades salientes e complementares entre si. Neste caso, ocorre emparelhamento das extremidades de ambas as molculas, facilitando a aco da ligase de DNA.

ANLISE Electroforese de DNA em gel de agarose A electroforese em gel de agarose o mtodo utilizado por rotina para separar, identificar e purificar fragmentos de DNA. A agarose um polmero natural extrado do agar. Os geis preparam-se fundindo a agarose na presena de um tampo apropriado. A soluo obtida colocada num molde e deixada arrefecer at solidificar. Ao solidificar forma-se uma matriz cuja densidade determinada pela concentrao da agarose. Quando se aplica um campo elctrico atravs do gel, o DNA carregado negativamente migra em direco ao nodo. A velocidade de migrao determinada por um conjunto de parmetros, entre os quais o tamanho da molcula e a concentrao da agarose. A velocidade de migrao inversamente proporcional ao log10 do tamanho do fragmento (em pares de bases, bp) e, para um mesmo tamanho de fragmento de DNA, a velocidade de migrao maior num gel com menor concentrao de agarose. A migrao das molculas de DNA atravs do gel, depende ainda da voltagem aplicada; quanto mais alta for a voltagem, mais rpida a migrao. Para visualizar o DNA nos geis de agarose utilizam-se corantes fluorescentes como por exemplo o brometo de etdio. Esta substncia possui grupos qumicos que se intercalam entre as bases do DNA. Em consequncia, o corante ligado ao DNA fluoresce com mais intensidade do que o
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corante livre, quando irradiado com luz ultravioleta. O brometo de etdio permite detectar cadeias simples e duplas de cidos nucleicos, tanto de DNA como de RNA. Por conveno, os geis de DNA so lidos da esquerda para a direita, com os poos colocados no topo. A rea do gel perpendicular ao poo designa-se pista ou lane. Portanto, ao olhar para uma pista analisam-se os fragmentos de DNA colocados no poo correspondente. Fragmentos de DNA com o mesmo tamanho migram a mesma distncia no gel dando origem a bandas. Por conveno, o tamanho de cada fragmento de DNA expresso pelo nmero de pares de bases que o constituem (bp).

CLONAGEM MOLECULAR

A manipulao gentica permite a criao de uma nova molcula de DNA, geralmente pela recombinao de DNA de diferentes organismos, por meios artificiais, utilizandose enzimas conhecidas como enzimas de restrio, e a consequente produo de muitas cpias de DNA recombinante. Este processo designa-se clonagem. Os passos bsicos numa experincia de clonagem molecular so os seguintes: 1. Insere-se o fragmento de DNA a ser clonado numa molcula de DNA com capacidade de auto-replicao, denominada vector, originando uma molcula de DNA recombinante. 2. O vector funciona com um veculo que introduz o DNA numa clula hospedeira, geralmente uma bactria, embora se possam usar outros tipos de clulas. 3. Uma vez no interior da clula hospedeira o vector multiplica-se, produzindo-se inmeras cpias idnticas, no s do vector mas tambm do fragmento de DNA que ele contm. 4. Quando a clula hospedeira se divide, as cpias das molculas de DNA recombinante so transmitidas descendncia e ocorre novo ciclo de replicao. 5. Aps um grande nmero de divises celulares, uma colnia ou clone de clulas hospedeiras geneticamente idnticas gerado. Cada clula do clone contm muitas cpias da molcula de DNA recombinante; o fragmento de DNA introduzido na molcula de DNA recombinante diz-se agora clonado. 6. Para alm da obteno de mltiplas cpias idnticas de um fragmento de DNA, a clonagem de um gene num vector adequado (vector de expresso) permite a obteno de grandes quantidades de protena recombinante.

Vectores de clonagem Os vectores de clonagem so molculas de DNA que tm como funo transportar o DNA de interesse para a clula hospedeira. A introduo de DNA em bactrias recorre normalmente utilizao de vectores plasmdicos. Estes vectores tm como base plasmdeos naturais que so posteriormente modificados por tcnicas de engenharia gentica, por forma a obter vectores de clonagem com as caractersticas mais vantajosas para diferentes tipos de aplicaes. As caractersticas mais importantes de um vector de clonagem so:

 Origem de replicao: permite que o vector, e consequentemente a molcula de DNA recombinante, se mantenha na clula e seja transmitida descendncia. Marca de seleco: a maioria dos vectores plasmdicos possui um gene que confere resistncia a um antibitico. Assim, apenas as bactrias que possuem o DNA recombinante sobrevivem quando crescidas em presena desse antibitico. Local de policlonagem: pequena sequncia de DNA (~100 pb) que contm locais de corte nicos para vrias enzimas de restrio. neste local que introduzido o fragmento de DNA que se pretende clonar. Promotor: presente apenas em vectores de expresso e adjacente ao local de policlonagem.

Exerccio 1 Qual dos seguintes nucletidos, quando incorporados pela DNA polimerase numa cadeia de DNA nascente, provoca uma paragem da elongao :

Exerccio 2 Considere o cDNA do gene X cuja sequncia apresentada na seguinte figura 1.1. Identifique na sequncia: a) b) c) d) e) extremidades 5 e 3 codo de iniciao (start) codo de finalizao (stop) 5UTR e 3UTR os primeiros 10 aa obtidos aps traduo (consulte o cdigo gentico apresentado na Fig 1.2)

1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601

acatttgtat tgactcctga ttggtggtga agtcctttgg atggcaagta gcacctttgc tcaggctcct ccccaccagt acaagtatca ctaagtccaa taataaaaaa

tcggatccac ggagaagtct ggccctgggc ggatctgtcc ttcgctcggt cacactgagt gggcaacgtg gcaggctgaa ctaagctcgc ctactaaact gctttatttt

tgtgttcact gccgttactg aggctgctgg actcctgatg gcctttagtg gagctgcact ctggtctgtg ttccagaaag tttcttgctg gggggatatt cattgc

agcaacctca ccctgtgggg tggtctaccc ctgttatggg atggcctggc gtgacaagct tgctggccca tggtggctgg tccaatttct atgaagggcc

aacagacacc caaggtgaac ttggacccag caaccctaag tcacctggac gcacgtggat tcactttggc tgtggctaat attaaaggat ttgagcatct

atggtgcatc gtggatgaag aggttctttg gtgaaggctc aacctcaagg gctgagaact aaagtattca gccctggccc cctttgttcc ggattctgcc

Figura 1.1 - cDNA do gene X

Figura 1.2 - Cdigo gentico

Exerccio 3 Qual das molculas de DNA II pode formar uma molcula de DNA recombinante com o DNA I? Que enzima necessria para a formao da ligao?

Exerccio 4 Como identificar locais de restrio na sequncia de DNA indicada?

1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 acatttgtat tgactcctga ttggtggtga agtcctttgg atggcaagta gcacctttgc tcaggctcct ccccaccagt acaagtatca ctaagtccaa taataaaaaa tcggatccac ggagaagtct ggccctgggc ggatctgtcc ttcgctcggt cacactgagt gggcaacgtg gcaggctgaa ctaagctcgc ctactaaact gctttatttt tgtgttcact gccgttactg aggctgctgg actcctgatg gcctttagtg gagctgcact ctggtctgtg ttccagaaag tttcttgctg gggggatatt cattgc agcaacctca ccctgtgggg tggtctaccc ctgttatggg atggcctggc gtgacaagct tgctggccca tggtggctgg tccaatttct atgaagggcc aacagacacc caaggtgaac ttggacccag caaccctaag tcacctggac gcacgtggat tcactttggc tgtggctaat attaaaggat ttgagcatct atggtgcatc gtggatgaag aggttctttg gtgaaggctc aacctcaagg gctgagaact aaagtattca gccctggccc cctttgttcc ggattctgcc

http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php

Exerccio 5 D um exemplo de um anlogo de um componente do DNA usado em Medicina. Explique o seu mecanismo de aco e indique qual a doena que trata.

Exerccio 6 Durante o estgio no laboratrio de Biologia Molecular, um estudante isolou DNA cromossmico de E. coli. RY13. Em seguida colocou a mesma quantidade desse DNA em dois tubos diferentes e fez uma digesto com enzimas de restrio. A um dos tubos adicionou Bam HI, e ao outro, Eco RI. Que resultados espera observar? Justifique.