Porras Sanjuanico Alberto Ingeniera Bioqumica

Secuenciacin de Sanger (utilizacin de didesoxinucletidos) En 1976, Frederick Sanger desarrollo un mtodo de secuenciacin del DNA, enzimticamente, utilizando la DNA polimerasa I de E.coli. El mtodo de sanger para secuenciar el DNA es aun utilizado muy ampliamente, aunque ahora se emplean otras DNA polimerasas procarioticas en lugar de la enzima de E.coli. El mtodo de secuenciacin de Sanger utiliza 2,3-didesoxinucleosido trifosfatos (ddNTP), que difieren de los sustratos desoxinucletidos de la sntesis del DNA por sustitucin del grupo hidroxilo en 3 por un hidrogeno. Los didesoxinucletidos son reconocidos por la DNA polimerasa y son adicionados en el extremo 3 en la cadena en crecimiento. Pero como estos nucletidos carecen de un grupo hidroxilo en 3, no pueden tener lugar las adiciones subsiguientes de nucletidos. Por tanto, su incorporacin hace que termine el crecimiento de la cadena de DNA. Cuando se incluye un nivel bajo de un didesoxinucletido en particular en una reaccin de sntesis de DNA, ocasionalmente ser incorporado en lugar del dNTP correspondiente y as ocasiona la terminacin. La longitud del fragmento resultante de DNA indica la posicin en donde el nucletido correspondiente debera haber sido incorporado. La secuenciacin del DNA, utilizando molculas de ddNTP, comprende varias etapas. El DNA que va a ser secuenciado se prepara como molculas de una sola cadena y se mezcla con un corto oligonucletido complementario del DNA. Este oligonucletido acta como un cebador para la sntesis del DNA catalizada por la DNA polimerasa I. El material oligonucletido-cebador se divide entonces en cuatro tubos de reaccin separados. Cada tubo recibe una pequea cantidad del DNA recin sintetizado para visualizarse por autorradiografia. Entonces cada tubo recibe un exceso de cuatro molculas no radioactivas de dNTP y una pequea cantidad de uno de los cuatro ddNTPs. Por ejemplo, el tubo de raccion A recibe un exceso de dTTP, dGTP, dCTP, y dATP no radioactivos mezclados con una pequea cantidad de ddATP. Cuando se adiciona la DNA polimerasa I a este tubo de reaccin, ocasionalmente ser incorporado un residuo de ddATP en lugar de uno de dATP y en esta forma hace terminar el crecimiento de la cadena. El resultado es la produccin de fragmentos recin sintetizados de DNA de longitudes diferentes. Como cada uno de los fragmentos termina con una A, la longitud del fragmento es la medida de la distancia del cebador a uno de los residuos de adenina en la secuencia. Adicionando un didesoxinucletido diferente a cada tubo de reaccin, se produce un conjunto de fragmentos diferentes: ddTPP produce fragmentos que

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terminan con una T, ddGTP con una G y ddCTP con una C. Las cadenas nuevas recin sintetizadas de cada reaccin de secuenciacin se someten a electroforesis en lneas adyacentes de gel de secuenciacin, en donde los fragmentos se resuelven por tamaos. Dado que cada nucletido de la cadena de DNA es el extremo 3 de un solo fragmento de la secuencia de la molcula de DNA es el extremo 3 de un solo fragmento de la secuencia de la molcula de DNA entera, se puede leer del gel.

Curvatura del ADN El primer modelo de la estructura del ADN propuesto por James Watson y Francis Crick supona que la doble hlice de ADN ocupaba el espacio de un cilindro regular cuyas bases nitrogenadas se apilaban en planos paralelos. Hoy en da sabemos, por resultados experimentales y tericos, que las bases nitrogenadas pueden presentar ciertos desplazamientos lineales y angulares que dan como resultado fragmentos curvos de ADN. La magnitud de esos desplazamientos puede evaluarse mediante el uso de matrices de rotacin y traslacin, cuyos valores han sido determinados

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experimentalmente. A este tipo de curvatura se le ha llamado curvatura esttica o curvatura intrnseca para diferenciarla de la curvatura del ADN introducida a travs de ciertas protenas. La relevancia de las regiones curvas en el ADN en diferentes procesos biolgicos, como recombinacin, replicacin y regulacin transcripcional, ha sido investigada por ms de 30 aos. En la mayora de estos estudios experimentales las regiones de ADN curvo analizadas han sido pequeas. El uso de algoritmos matemticos en la prediccin de la geometra del ADN abre la posibilidad de extender el estudio de curvatura del ADN de loci1 discretos a regiones de ADN de mayor longitud, incluyendo el anlisis de las secuencias de genomas enteros. Recientemente, estudios in silico2 de los genomas totalmente secuenciados han establecido que al curvatura promedio de los genomas vara considerablemente de organismo a organismo, y que es una funcin directa de la frecuencia global de los dinucletidos del genoma en cuestin. Cabe mencionar que la capacidad para evaluar el grado de curvatura del ADN a partir de su secuencia nucleotdica ha permitido corroborar su funcin como elemento activo del proceso de la regulacin transcripcional, y se ha podido demostrar que esta funcin del ADN curvo puede estar conservada entre genes ortlogos de organismos filogenticamente distantes, aunque estas regiones no presenten conservacin de secuencia, lo que implica que la propiedad geomtrica del ADn es biolgicamente significativa.
1

En gentica, a locus (plural loci) es la localizacin especfica de un gen o una secuencia de ADN o la posicin de un cromosoma.
2

In silico es una expresin que significa "hecho por computadora o va simulacin computacional".
3

Llamamos genes ortlogos a los que son semejantes por pertenecer a dos especies que tienen un antepasado comn
Bibliografia http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/libro_25_aniv/capitulo_07.pdf Horton R., Moran L., Ochs R., Rawn D., Scrimgeour G. Bioquimica. Editorial Prentice Hall. Pags:20.12-20.16