Centro de Bachillerato Tecnolgico Industrial y de Servicios N 134

Manual de prcticas de Laboratorio MODULO II: Identifica microorganismos con base en tcnicas microbiolgicas para diagnostico clnico. SUBMODULO: Identifica microorganismos con base en tcnicas bacteriolgicas
Materia: BAC !"IOLO#IA

Especialidad: Tcnico Laboratorista Clnico

Chilpancingo, Gro. Agosto del 201

INDICE
PRACTICA

' ) / 1 2 3 0 ( 4 '5 '' ') '/ '1 '2 '3 '0 '( '4 )5 )' )) )/ )1 )2 )3 )0 )( )4 /5 /' /) // /1 /2

NOMBRE Ob$eti%os de la Creacin del Man&al Introduccin "ecomendaciones para el est&diante Bioseg&ridad en el laboratorio de microbiologa *reparacin de material para la esterili+acin por calor ,-medo . calor seco cnicas de esterili+acin *reparacin de medios de c&lti%o para sembrado microbiolgico . pr&ebas de esterilidad Conocimiento . &so del microscopio !laboracin de medios de c&lti%o para sembrado microbiolgico cnicas de sembrado microbiolgico Seleccin de colonias . morfologa colonial de los microorganismos Caractersticas de crecimiento de c&lti%os de microorganismos en t&bo *reparacin de frotis incin de #ram incin de 6ie,l 7eelsen *reparacin de medios de c&lti%o 8M&eller 9inton . So.a tripticasa !fectos bactericidas . bacteriost:ticos de los agentes ;&micos sobre La %ida microbiana cnica de antibiograma cnica de la coag&lasa cnica de la catalasa cnica de la o<idasa Identificacin del genero Stap,.lococc&s Identificacin del genero Streptococc&s . !nterococc&s Crecimiento microbiano en diferentes medios de c&lti%o especficos Identificacin . caracteri+acin metablica de bacterias de inters medico con pr&ebas bio;&micas con%encionales !<&dado farngeo Uroc&lti%o Coproc&lti%o !<&dado %aginal !<&dado &retral C&lti%o de !<&dado nasal C&lti%o de !<&dado oc&lar C&lti%o de esp&to C&lti%o de Secreciones= 9eridas . Abscesos C&lti%o de li;&ido sino%ial !spermoc&lti%o 9emoc&lti%o C&lti%o de li;&ido cefalorra;&ideo Ane<o I > Material de apo.o Ap?ndice 8Instr&cciones para preparar reacti%os . colorantes@ Bibliografia

PAG.

( ') '0 )/ /' /( 1' 1( 2/ 3) 32 30 05 02 04 (/ (3 (( 4' 4/ 40 '5' '51 '50 ''1 ''0 ')' ')1 ')0 '/5 '/1 '/( '1) '12 '25 '2/ '33 '3(

OBJETI O! GENERA"E!
Aprender a reali+ar correctamente= las tcnicas b:sicas microbiolgicas= ;&e se emplean en &n laboratorio de microbiologa= ;&e se aplicaran para el aislamiento= obser%acin e identificacin de microorganismos ca&santes de diferentes procesos infecciosos en los seres %i%os>

OBJETI O! PARTIC#"ARE!:

'> A&e el est&diante aprenda a reconocer los diferentes microorganismos 8&sando correctamente las tcnicas de laboratorio as como el mane$o correcto del microscopio@ )> A&e el est&diante aprenda a reali+ar la toma de m&estras= el transporte= la manip&lacin de estas= . s& correcta deposicin> As como la forma en ;&e se debe &sar el e;&ipo de laboratorio> /> Comen+ar a familiari+arse con la &tili+acin de reacti%os tpicos como el a+&l de metileno= la safranina= el aceite de inmersin entre otros= . la reali+acin de tcnicas empleadas en la elaboracin de medios de c&lti%os . dem:s sol&ciones ;&e generalmente se emplean en las practicas a desarrollar en el transc&rso del semestre>> 1> A&e los est&diantes aprendan a mane$ar de forma adec&ada las tcnicas microbiolgicas las c&ales les permitir:n tener &n dominio completo de los microorganismos para poder obtener s& aislamiento= el est&dio de s&s caractersticas fisiolgicas . morfolgicas= c&lti%o= identificacin= clasificacin= seleccin= modificacin= propagacin= &tili+acin . control> 2> Aprender a procesar correctamente= los c&lti%os microbiolgicos= ;&e se reali+an en &n laboratorio de microbiologa= ;&e se aplicaran para el aislamiento e identificacin= de microorganismos ca&santes de diferentes procesos infecciosos en los diferentes rganos . sistemas de los seres %i%os . establecer &n diagnstico oport&no para el control . erradicacin de estos agentes etiolgicos>

INTROD#CCION

La microbiologa es &na ciencia relati%amente reciente con respecto a otras ramas de la biologa> !l est&dio de los microorganismos se inici a partir de ;&e Antonie Ban Lee&Cen,oeD en '305 in%ento el microscopio . ;&e a partir de los est&dios de L&is *aste&r en '(03= se logr el ma.or desarrollo . reconocimiento de los microorganismos como actores de &na gran di%ersidad> !l ob$eti%o general del c&rso es ;&e el al&mno se inicie en el conocimiento de la biologa b:sica de los microorganismos= cmo son s&s caractersticas morfolgicas= n&tricionales de crecimiento= identificacin= control . ;&e ad;&iera las ,abilidades . destre+as necesarias para s& manip&lacin en el laboratorio= &tili+ando las tcnicas b:sicas ;&e son indispensables en estos procesos> !ste man&al est: dirigido a los est&diantes ;&e iniciaran s& e<periencia en el conocimiento de las tcnicas b:sicas microbiolgicas ;&e les ser:n de gran &tilidad para el mane$o posterior de los microorganismos a identificar en los procesos infecciosos ;&e estn ca&sando= por lo ;&e se consider de gran importancia incl&ir al principio del mismo &na serie de recomendaciones relacionadas con las reglas generales del laboratorio . los principales procedimientos ;&e el est&diante deber: aprender para ;&e manip&le en forma adec&ada a los microorganismos . garanti+ar tanto s& seg&ridad como la de s&s compaEeros> !n cada &na de las pr:cticas se presentan= el tt&lo= los ob$eti%os . &na bre%e introd&ccin para facilitar la comprensin de los mismos= desp&s se indica los materiales= reacti%os necesarios= el procedimiento a reali+arse en forma de instr&cciones n&meradas> Finalmente el man&al contiene pr:cticas diseEadas para ;&e el est&diante se familiarice grad&almente con las tcnicas bacteriolgicas b:sicas ;&e se aplicaran en la identificacin . obser%acin del crecimiento bacteriano en los medios de c&lti%o> !l orden de presentacin corresponde al programa del c&rso tericoGpr:ctico de la materia HIdentifica microorganismos con base en tcnicas bacteriolgicasI ;&e forma parte del plan de est&dios de la !specialidad de tcnico laboratorista clnico del ercer semestre= impartida en el CB is 7o> '/1= con sede en C,ilpancingo de los Bra%o #&errero>>

"!COM!7DACIO7!S *A"A !L !S UDIA7 !

Re$las $enerales de uso del la%oratorio

*ara el desarrollo de las pr:cticas es m&. importante tomar en consideracin alg&nas reglas elementales ;&e deben de c&mplirse con toda responsabilidad: '@ Antes . desp&s de cada sesin practica los est&diantes deber:n limpiar las mesas de traba$o con el desinfectante ;&e se le proporcionara para este fin>

)> Antes de reali+ar &na pr:ctica= debe leerse detenidamente el g&in para ad;&irir &na idea clara de s& ob$eti%o= f&ndamento . tcnica> 8Los res&ltados deben ser siempre anotados c&idadosamente apenas se cono+can@> /> D&rante las sesiones de laboratorio siempre deber: &sar &na bata de laboratorio planc,ada= abotonada . limpia= . ;&e deber: ;&itarse antes de abandonar el laboratorio> 1> El orden & la li'pie(a son esenciales en todas las e<periencias de laboratorio> !n consec&encia= al terminar cada pr:ctica se proceder: a limpiar c&idadosamente el material ;&e se ,a &tili+ado> 2> Cada e;&ipo de traba$o se responsabili+ar: de s& mesa de traba$o . de s& material> 3> odo el material= especialmente los aparatos delicados= como l&pas . microscopios= deben mane$arse con c&idado e%itando los golpes o el for+ar s&s mecanismos>

0> Siempre deber: de$ar perfectamente limpios todos los e;&ipos &tili+ados 8microscopios= balan+as= a&tocla%e= potencimetros= est&fas= refrigerador= etc>=@ . reportar al encargado c&al;&ier irreg&laridad en el f&ncionamiento> (> !%itar la ac&m&lacin sobre la mesa de traba$o de ob$etos no relacionados con la pr:ctica de laboratorio> Colocar todos los ob$etos personales 8libros= moc,ilas= etc>@ en el estante ;&e se enc&entra en la entrada principal del laboratorio> 4> Se pro,be ingerir .Jo almacenar c&al;&ier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio> '5> Se pro,be f&mar= aplicarse cosmticos o tocarse la cara con las manos o alg-n otro ob$eto> ''> Los prod&ctos inflamables 8gases= alco,ol= ter= etc>@ deben mantenerse ale$ados de las llamas de los mec,eros> ')> C&ando se &tilice el mec,ero= este deber: colocarse ale$ado del microscopio . otros e;&ipos as como de s&s c&adernos . prendas de %estir> '/> Se deber: la%ar metic&losamente las manos con $abn . ag&a antes de salir del laboratorio= si es posible &tili+ar gel antibacterial desp&s del la%ado de manos= incl&so c&ando salga por bre%es periodos>

'1> 7o se admitir:n %isitas personales ;&e distraigan la atencin . pongan en riesgo la seg&ridad en el traba$o ;&e se reali+a> '2> 7o deber: sacar del laboratorio ning-n e;&ipo= medios o c&lti%os microbianos>

To'ar en cuenta las si$uientes precauciones:

'> Si se mane$an mec,eros de gas se debe tener m&c,o c&idado de cerrar las lla%es de paso al apagar la llama> )> *or seg&ridad no deber: pipetear con la boca ning-n tipo de c&lti%os bacterianos= reacti%os & otras sol&ciones ;&e pongan en riesgo s& integridad fsica= estas acti%idades deber:n reali+arse con pipetas accionadas de forma mec:nica o a&tom:tica= tratando de e%itar la formacin de aerosoles> /> Las pipetas se tomaran de forma ;&e sea el dedo ndice el ;&e tape s& e<tremo s&perior para reg&lar la cada de l;&ido> 1> Antes de &tili+ar &n comp&esto ,a. ;&e fi$arse en la eti;&eta para aseg&rarse de ;&e el ;&e se necesita . de los posibles riesgos de s& manip&lacin> 2> Los t&bos de ensa.o ;&e contengan medios de c&lti%o o c&lti%os de microorganismos= n&nca deben abrirse en posicin %ertical= sino lo m:s ,ori+ontalmente posible 8inclinados@ . para ;&itar el tapn se mantendr:n inclinados con &na mano . se abrir:n con la otra= ;&e sostendr: a s& %e+ el asa> Una %e+ abierto= se flamea por alg&nos seg&ndos el orificio= repitiendo dic,a operacin &na %e+ reali+ada la siembra 8el tapn n&nca debe de$arse sobre la mesa@> 3> Antes de &tili+ar las asas ;&e sir%en para las siembras= stas deben flamearse al ro$o %i%o en posicin %ertical ba$o la accin de la llamaK tambin debe flamearse el mango> 0> Antes de efect&ar la siembra debe esperarse alg&nos seg&ndos a ;&e se enfren= p&diendo enfriarse tambin en el borde de la placa de *etri ;&e contiene el medio de c&lti%o> Inmediatamente desp&s de ,aberlas &tili+ado= deben flamearse n&e%amente> (> !n caso de prod&cirse &n incendio o &na ,erida personal= el al&mno deber: notificarlo de inmediato al profesor> !n el caso de derrame de c&lti%os o rot&ra de recipientes con c&lti%os acti%os= deber: conser%ar la calma . adem:s de informar al profesor= seg&ir las sig&ientes indicaciones: a@ Colocar toallas de papel sobre el material derramado para e%itar s& dispersin> b@ *oner ab&ndante sol&cin desinfectante sobre las toallas> c@ De$ar transc&rrir al menos '2 min&tos= retirar las toallas . tirarlas en el recept:c&lo destinado a la eliminacin de materiales contaminados> 4> Al concl&ir cada sesin el est&diante deber: aseg&rarse de ;&e los materiales de

desec,o ;&e ,a.an entrado en contacto con microorganismos 8como pipetas &sadas= ca$as de *etri . t&bos con c&lti%os bacterianos@ & otros ob$etos contaminados sean colocados en bolsas para a&tocla%e . proceder posteriormente a s& esterili+acin> Las pipetas *aste&r de %idrio= c&bres . portaob$etos &sados se colocaran en &n recipiente especial para %idrio>

Materiales indispensa%les en cada una de las sesiones de la%oratorio.

'@ Bata de laboratorio de manga larga limpia . con botones )@ !l protocolo de la pr:ctica . bit:cora de laboratorio> /@ Un peda+o de tela sin pel&sa= cerillos= ti$eras= colores= atomi+adores= marcador indeleble o eti;&etas pe;&eEas= papel parafilm> !tc>

)Practica N* +,

Biose$uridad en el "a%oratorio de Micro%iolo$-a O%.eti/o General:

Al finali+ar la pr:ctica el est&diante ser: capa+ de: Aplicar las reglas b:sicas de ,igiene . seg&ridad en el :rea microbiolgica .

O%.eti/os particulares: +.0 1.0 2.0 Introduccin

Un p&nto primordial al inicio del traba$o e<perimental es conocer . aplicar las reglas generales de seg&ridad e ,igiene ;&e deben c&mplirse con la finalidad de sal%ag&ardar la integridad . seg&ridad del personal ;&e a, labora> !n el caso del :rea microbiolgica el ob$eto de est&dio son seres %i%os ;&e no podemos percibir a tra%s de n&estros sentidos . m&c,os de ellos p&eden ser agentes ca&santes de enfermedades> !n '4'/ !.re p-blico &n libro de te<to en el ;&e incl&an por primera %e+ pr:cticas de seg&ridad para el laboratorio de microbiologa> !stas pr:cticas incl&an recomendaciones sobre la necesidad de '@ &sar g&antes= )@ la%arse las manos= /@ desinfectar todos los instr&mentos inmediatamente desp&s de &sarlos= 1@ ,&medecer los rt&los de las m&estras con ag&a en l&gar con sali%a= 2@ desinfectar todos los resid&os contaminados antes de desec,arlos . 3@ informar a todo el personal afectado sobre c&al;&ier accidente o e<posicin a agentes infecciosos> !stas pa&tas ;&e a-n se incorporan a los programas de seg&ridad del laboratorio del siglo LLI= se ampliaron ,asta incl&ir no solo la manip&lacin adec&ada de los materiales biolgicos peligrosos ,allados al procesar las m&estras o manip&lar microorganismos infecciosos sino tambin la seg&ridad en caso de incendio o problemas elctricos= la manip&lacin= el almacenamiento . la eliminacin seg&ra de comp&estos ;&micos . s&stancias radiacti%as . las tcnicas para le%antar o despla+ar con seg&ridad ob$etos pesados> Los programas de seg&ridad tambin incl&.en planes con preparati%os para los casos de desastre ;&e organi+an los pasos a seg&ir en &na emergencia> Si bien todos los microbilogos son responsables de s& sal&d . de s& propia seg&ridad= es preciso ;&e la instit&cin . los s&per%isores inmediatos les pro%ean entrenamiento sobre seg&ridad para contrib&ir a ;&e se familiaricen con los peligros conocidos . e%iten las e<posiciones accidentales> La seg&ridad del laboratorio se considera &na parte tan integral de los ser%icios generales ;&e seg-n la legislacin de los !stados &nidos es obligatorio el entrenamiento de seg&ridad

pre oc&pacional= seg&ido de ser%icios internos de seg&ridad con &na frec&encia mnima de tres meses> *oco deben temer los microbilogos mientras lle%an a cabo s&s tareas si se internali+an las reg&laciones de seg&ridad . se respetan de manera cabal> !n los traba$os de in%estigacin sobre las ca&sas de los accidentes se s&elen demostrar ;&e se prod&cen c&ando las personas reali+an s&s tareas sin tomar los reca&dos necesarios o c&ando no creen ;&e los afectara el inc&mplimiento de los est:ndares de seg&ridad> Material In%estigar las sig&ientes normas:
7OMG5)3 S *SG'44(> 7OMG55/ S!#OBG)55) 7OMG52)GS!MA"7A 7OMG5(0G!COLGSSA'G )55)

Metodolo$-a
!n gr&pos de traba$o= reali+ar la lect&ra . an:lisis del material asignado . e<ponerlo en &n perodo m:<imo de '2 min&tos= para ello reali+aran lo sig&iente: Disc&tir las normas generales de seg&ridad e ,igiene para c&al;&ier laboratorio . a;&ellas ;&e se aplican especialmente en el :rea microbiolgica> 9acer especial ,incapi en s& importancia> Ubicar las +onas de seg&ridad . controles maestros de s&ministro de ser%icios> !stablecer la &tilidad de los desinfectantes= antispticos . saniti+antes en el laboratorio de Microbiologa> Sim&lar los procedimientos a seg&ir en caso de accidentes= temblores= derrames . sobre la disposicin de desec,os en el laboratorio> *roponer otras g&as de obser%acin para %erificar el c&mplimiento de los reglamentos %igentes en los laboratorios>

*ara todas las sesiones de laboratorio llenar la sig&iente g&a de obser%acin 8c&adro '@:

Cuadro 1. #&a de obser%acin para e%al&ar el c&mplimiento de los "eglamentos de Seg&ridad e 9igiene>
3ec4a: Mesa: No'%re de 5uien e/al6a: E7#IPO:

NOMBRE!

PE S!N"#$
!ata li"pia #so de Co$ia #so de cubre bocas #so de lentes de seguridad Cal%ado cerrado Cabello recogido & alu"nas' Cabello corto &alu"nos' (in )o*era #+as cortas * sin es"alte &"u)eres' #+as cortas ho"bres T "B"%!$ Li"pie%a del rea de traba)o al iniciar la sesi,n -rden en las reas de Traba)o a.. Mesa b.. Ga/eta 0sterili%aci,n de "aterial conta"inado &Cuando se re1uiera' 0ntrega oportuna del "aterial en cada una de las prcticas. 2espeta las indicaciones 1ue dan para la reali%aci,n de cada prctica. Cu"ple con el "aterial indispensable para el desarrollo de sus practicas 3esarrolla su traba)o con responsabilidad 0ntrego puntual"ente su protocolo de la prctica a reali%ar Li"pie%a del rea de traba)o al $inali%ar la sesi,n -!(024AC5-60(

G Marcar &na 8 c&ando no se c&mpla la accin G Marcar &na c&ando se c&mpla la accin G Marcar adem:s con M c&ando e<ista &n comentario especial con respecto a la accin e%al&ada> G Anotar el comentario en la parte de obser%aciones= en caso de ser ins&ficiente el espacio anotarlo al re%erso con la fec,a de la e%al&acin>

RE!#"TADO!:
"epresentar de forma es;&emati+ada lo reali+ado en la metodologa:

DI!C#!I9N DE RE!#"TADO!
'> N*or ;& debemos seg&ir el reglamento de seg&ridad e ,igiene dentro del laboratorio de microbiologaO )> NCrees ;&e las medidas de seg&ridad e ,igiene ;&e se aplican en el laboratorio de microbiologa son las adec&adas para el traba$o pr:cticoO /> NC&:l crees ;&e sea la importancia a ni%el personal de c&mplir con las reglas de seg&ridad e ,igieneO 1> NA& medidas de seg&ridad e ,igiene crees ;&e no se c&mplen en las instalaciones del laboratorio de microbiologaO NCmo podras me$orarlasO

CONC"#!IONE!: BIB"IOGRA3IA:

)PRACTICA No. 1,
PREPARACION DE MATERIA" PARA "A E!TERI"I:ACION POR CA"OR !ECO ;#MEDO < CA"OR !ECO
OBJETI O GENERA": !l est&diante conocer: . preparara adec&adamente los di%ersos materiales de %idrio e instr&mental para s& esterili+acin . ;&e &tili+ara en desarrollo de s&s pr:cticas> OBJETI O! PARTIC#"ARE!: +.0 1.0 2.0

INTROD#CCION:
La esterili+acin es &n mtodo de eliminacin total de todo tipo de organismo . ;&e aseg&ra la a&sencia absol&ta de c&al;&ier forma %i%iente= mientras ;&e la desinfeccin es &n proceso ;&e solamente elimina formas %egetati%as de los microorganismos> !n microbiologa donde se &tili+an c&lti%os microbianos= aparatos . material en general= deben encontrarse microbiolgicamente limpios antes de ser &tili+ados en el material problema> Si se &tili+an medios o aparatos contaminados= los c&lti%os corresponder:n no solamente a los microbios de las m&estras= sino a los contaminantes> Los microorganismos se eliminan= in,iben o matan por medios de agentes fsicos o agentes ;&micos> Se c&entan con &na gran %ariedad de tcnicas . agentes ;&e act-an ;&e act-an de tal manera m&. diferente . cada &no en la pr:ctica tiene s&s propias limitaciones> La temperat&ra es &no de los mtodos m:s efecti%os para destr&ir microorganismos> Un re;&isito indispensable en el laboratorio de microbiologa es ;&e todo el material . medios de c&lti%o &tili+ados est:n estriles . protegidos adec&adamente para conser%ar la esterilidad d&rante s& &so . almacenamiento> !sto nos permite aseg&rar ;&e se traba$ara e<cl&si%amente con los microorganismos deseados> !n el traba$o cotidiano de &n laboratorio de microbiologa es necesario ;&e todo el material como pipetas= t&bos de ensa.e= ca$as de *etri de %idrio o de pl:stico= medios de c&lti%o . sol&ciones estn estriles> As antes de esterili+ar= a los matraces= t&bos . dem:s

recipientes se les pone &n tapn de algodn ;&e e%itara el acceso de microorganismos del ambiente al interior> ambin es necesario proteger este tapn con papel para e%itar ;&e se ,&mede+ca con ag&a de condensacin desp&s de esterili+ar con calor ,-medo> Alg&nos laboratorios &tili+an tapones de pl:stico o met:licos en l&gar de algodn con la misma finalidad> La esterili+acin con calor seco . ,-medo son los procedimientos de ma.or &tili+acin en microbiologa> !l calor seco desnat&rali+a las en+imas . destr&.e a los microorganismos por o<idacin= por e$emplo al ponerlos directamente a la flama de &n mec,ero o en &n ,orno a 5 '25 P '(5 C d&rante ) ,oras> !stos mtodos se aplican principalmente en la esterili+acin de asas de inoc&lacin . todo tipo de material de %idrio . ;&ir-rgico> Los procesos con calor ,-medo se aplican para esterili+ar medios de c&lti%o= sol&ciones . c&lti%os bacterianos ;&e se desec,an= el m:s recomendable es el a&tocla%e & olla de presin 5 en el ;&e se &tili+a %apor de ag&a a presin para alcan+ar temperat&ras de ')' C> !l material se de$a a esta temperat&ra d&rante '2 min&tos para aseg&rarse de la destr&ccin de endosporas= ;&e son las estr&ct&ras bacterianas m:s resistentes al calor> C&ando se re;&iere esterili+ar diferentes materiales sensibles al calor como las sol&ciones de %itaminas= amino:cidos= etc>= s esterili+an por filtracin en membranas estriles de 5>) micras de di:metro . para el caso de materiales pl:sticos es recomendable el &so de gases como o<ido de etileno o con radiaciones gamma> Las s&perficies generalmente se desinfectan con radiaciones U>B: o comp&estos c&aternarios de amonio 8al;&ildimetilbencilamonio@= formalde,ido= alco,oles= ,algenos . detergentes> Cada &no de estos procedimientos tienen %enta$as . des%enta$as de &so= los sistemas de filtracin son m&. eficientes . r:pidos para la esterili+acin pero solo se aplican en pe;&eEos %ol-menes> Los fenoles . comp&estos c&aternarios de amonio son m&. efecti%os para la desinfeccin de s&perficies pero son m&. corrosi%os> Los detergentes . los alco,oles tienen acti%idad limitada contra esporas bacterianas . alg&nos %ir&s por lo ;&e solo son desinfectantes>

MATERIA"
0 &bos de '/ < '55 mm> con tapn de rosca> / &bos de '/ < '55 mm> sin tapn> 3 ca$as de *etri de %idrio> / pipetas de ' 5 ) ml> / pipetas de '5 ml> ' *ipeta *aste&r / matraces !rlenme.er de )25 ml>

 ' a&tocla%e & olla de presin> ' ,orno de calor seco

' Mec,ero Fis,er o B&nsen Aplicadores Abateleng&as *apel de estra+a para en%ol%er> !scobillones para t&bos de ensa.e Fab li;&ido

MATERIA" TRAIDO POR E" E!T#DIANTE : Algodn en tiras8 ' pa;&ete@ *or e;&ipo Clips c,icos 8)@ MasDintape . cinta testigo 8por e;&ipo@ Una pipeta grad&ada de ' ml> *in+as para portaob$etos 8diseccin sin dientes@ i$eras Una regla con escala milimtrica 8/5 cm@ iras de papel al&minio de 1 < 25 cm 8)@ Cerillos o encendedor Una tela sin pel&sa Aplicadores 8'5@ Marcador de aceite de p&nto fino ) t&bos de ensa.e de '/ < '55 mm> Un frasco de %idrio de ')2 ml> Asa bacteriolgica con ag&$a recta para siembra *orta asa Alco,ol 8frasco c,ico@ *or e;&ipo

PROCEDIMIENTO:
'@ La%ar perfectamente el material de laboratorio= principalmente el material de cristalera 8como son las ca$as de *etri= t&bos de ensa.e= portaob$etos . pipetas@ con fab l;&ido> )@ !n$&agar con ab&ndante ag&a de la lla%e> /@ !sc&rrir el e<ceso de ag&a . en$&agar el material con ag&a destilada con &na pi+eta= por las paredes interiores> 1@ De$ar esc&rrir el material sobre &na toalla o papel de en%olt&ra> 7o debe secar el material por ning-n otro medio> 2@ Una %e+ seco el material= se proceder: al en%ol%er las ca$as de *etri . pipetas con

papel de estra+a> *ara los t&bos . matraces se elaboraran tapones de algodn . gasa= proc&rando ;&e a$&sten con ,olg&ra= sobre los ;&e finalmente se les colocara &n cap&c,n o gorros de papel>

A. Preparacin de tu%os de ensa&e de += > +?@ ''. apar cada t&bo con &n tapn de algodn 8 iras de algodn de / a 1 cm de anc,o por ( a '5 cm de largo@ proc&rando ;&e ;&ede bien a$&stado el tapn a la boca del t&bo> Colocar los t&bos en &n bote de l:mina . proteger la boca del bote con &n gorro de papel> Anotar los datos necesarios para la identificacin del material> 8esterili+ar por calor ,-medo@>

B. Preparacin de tu%os de ensa&e de +2 > +@@ ''. Colocar a cada &no de los t&bos &n tapn de algodn 8tiras de algodn de ) cm de anc,o por 3 cm de largo@> "epetir los pasos ) . / del inciso anterior> odos los t&bos con tapn de rosca -nicamente se aflo$a el tapn de pl:stico para esterili+ar>

C. Preparacin de Apipetas Colocar en la bo;&illa de las pipetas &n filtro de algodn de tal manera ;&e el aire pase libremente a tra%s de l= proc&rando ;&e el filtro ;&ede lo s&ficientemente apretado> 8Utilice &n clip o &na ag&$a de diseccin@> Flamear el e<tremo de las pipetas para ;&emar el e<ceso de algodn> !n%ol%er en tiras de papel estra+a de 1 cm de anc,o por 25 cm> de largo= iniciando por la p&nta . en forma de espiral= girando ,acia arriba ,asta el final de la pipeta> !n%ol%erla finalmente en papel de al&minio> Marcar el %ol&men de cada pipeta en la en%olt&ra> !sterili+ar por calor seco 8!n ,orno@>

NOTA: Las pipetas cuando se esterili%an con calor seco es pre$erible

colocarlas en cilindros "etlicos con aberturas 1ue per"ita el paso del aire caliente. D. Ca.as de Petri. Colocar las ca$as de *etri solas o en gr&po con las tapas ,acia aba$o> !n%ol%erlas con papel estra+a en forma de rect:ng&lo a$&stando el tamaEo adec&ado> Anotar los datos necesarios para la identificacin del material>

!sterili+ar por calor ,-medo o seco>

NOTA: Cuando las ca)as de 7etri se esterili%an por calor seco es pre$erible
colocarlas en cilindros "etlicos. E. Preparacin de 'atraces o Brasco de /idrio. Colocar a cada matra+ o frasco de %idrio &n tapn de algodn lo s&ficientemente apretado para e%itar ;&e se destape> 8 iras de algodn de apro<imadamente />2 a 2 cm de anc,o < )2 a /5 cm de largo seg-n la boca del matra+ o el frasco@> C&brir el tapn de algodn con &n gorro ,ec,o de papel estra+a> 8La tapa del frasco se en%&el%e por separado con papel de estra+a> !ti;&etar el matra+ o frasco de %idrio con los datos necesarios para la identificacin del material> !sterili+ar por calor ,-medo o seco> !n el caso de los frascos ;&e tengan tapn esmerilado= se procede de la misma forma ;&e en los frascos de %idrio= en%ol%iendo por separado el tapn con papel de estra+a . c&brir con algodn la entrada del frasco colocando s& respecti%o gorro de papel> !sterili+ar por calor ,-medo o seco>

3. Ela%oracin & preparacin de 4isopos & a%atelen$uas: +. ;isopos 9&medecer la p&nta del aplicador con ag&a C&brir la p&nta del aplicador con algodn !n%ol%er cada &no de los aplicadores por separado con tiras de papel estra+a de ) cm de anc,o por )5 o )2 cm de largo> !sterili+ar por calor ,-medo> 1. A%atelen$uas !n%ol%er cada &no de los abateleng&as con tiras de papel estra+a de 2 cm de anc,o por )2 o /5 cm de largo> !sterilice por calor ,-medo> Otros materiales &sados para la conser%acin de la esterilidad . comprobar la eficacia del proceso 8demostrati%o@> Se mostraran tapones de pl:stico= ,&le . corc,o para t&bos= pipe teros . recipientes met:licos para ca$as de petri &sados en a esterili+acin por calor seco> !sterili+ar los diferentes materiales mediante %apor &tili+ando la olla de presin o mediante aire caliente &tili+ando el ,orno> ome fotografas de los materiales ;&e preparo para s&s res&ltados disc&ta . relac el an:lisis de la concl&sin>

RE!#"TADO! DI!C#!ION:

CONC"#!IONE!: BIB"IOGRA3IA:

)PRACTICA No. 2,
TECNICA! DE E!TERI"I:ACI9N

O%.eti/o $eneral:
A&e los est&diantes cono+can las tcnicas de esterili+acin ;&e se &tili+an con ma.or frec&encia en el laboratorio de microbiologa.

O%.eti/os particulares:
'>G )>G />G INTROD#CCION !sterili+ar significa eliminar de &n ob$eto o s&stancia toda las formas de %ida microbiana= incl&idas las esporas bacterianas= ,ongos . %ir&s c&ales ;&ieran ;&e estas sean= se logra por medios fsicos . ;&micos> !n consec&encia= el e;&ipo de laboratorio ;&e se ,a esterili+ado ;&eda libre de microorganismos %i%os> Se entiende por m&erte la perdida irre%ersible de la capacidad reprod&cti%a del mismo> La desinfeccin es &n proceso con el ;&e se destr&.en microorganismos patgenos= a&n;&e no necesariamente todos los microorganismos ni todas las esporas> !l ig&al ;&e la esterili+acin= la desinfeccin se p&ede lograr con mtodos fsicos . ;&micos> !n el laboratorio microbiolgico propsitos principales: los materiales ;&e se esterili+an se reali+an con tres

'> *repararlos para la recoleccin de las m&estras ;&e deber:n ser esterili+adas> )> Destr&ccin de microorganismos mediante calor: La energa trmica es la forma m:s efecti%a de esterili+acin> !sta p&ede ser como calor seco o calor ,-medo /> !sterili+acin por medios mec:nicos:

Los mtodos de esterili+acin &tili+ados con m:s frec&encia en los laboratorios son: a@ b@ c@ d@ e@ Incineracin Calor ,-medo 8A&tocla%e@ Calor seco 89orno@ Filtracin "adiacin ioni+ante 8gamma@

La incineracin es el mtodo m:s com-n de tratamiento de los desec,os infecciosos> !l material peligroso se ;&ema literalmente ,asta ;&e se con%ierte en ceni+as a temperat&ras o 5 de (05 a 4(5 C> sin embargo= las emisiones de aire to<ico . la presencia de metales pesados en las ceni+as limitaron el &so de la incineracin en la ma.ora de las ci&dades de los !stados Unidos> !l calor 46'edo 8%apor ba$o presin@ se emplea para esterili+ar desec,os biolgicos peligrosos . ob$etos termoestablesK con este fin se &tili+a &na a&tocla%e= ;&e b:sicamente es &na olla de presin> !l calor ,-medo= ba$o la forma de %apor sat&rado a &na atmosfera de presin 8'>52 Dg de presin por centmetro c&adrado: '2 psi 8libras por pie c&adrado@@= pro%oca la desnat&rali+acin irre%ersible de las en+imas . protenas estr&ct&rales> !l tipo de esterili+ador de %apor m:s com-n en el laboratorio microbiolgico es el de despla+amiento de gra%edad> *ara lle%ar a cabo la esterili+acin por calor ,-medo es necesario en%ol%er los ob$etos en &n material ;&e permita el paso del %apor . ;&e adem:s los prote$a posteriormente de la contaminacin c&ando entren en contacto con el ambiente= de este modo los matraces= t&bos . pipetas deben taparse con algodn . este debe protegerse con papel para ;&e no se ,&mede+ca> !n el caso de las ca$as de *etri= estas se en%&el%en con papel de estra+aG !l calor seco re;&iere &n periodo de e<posicin m:s prolongado 8'>2 a / ,oras@ ;&e el calor ,-medo . altas temperat&ras 8'35 a '(5 C@> se &tili+an est&fas de calor seco para esterili+ar elementos como material de %idrio= aceites= %aselina o pol%os> C&ando esterili+amos con calor seco es preferible colocar las pipetas . las ca$as de *etri en cilindros de metal con abert&ras ;&e permitan el paso del aire caliente> La Biltracin es el mtodo de eleccin para sol&ciones de antibiticos= s&stancias ;&micas to<icas= radioistopos= %ac&nas e ,idratos de carbono= ;&e son todos sensibles al calor> *ara filtrar los l;&idos se f&er+a el pasa$e de la sol&cin a tra%s de &na membrana de acetato o nitrato d cel&losa por efecto del %acio> *ara filtrar el aire se &san filtros de alta eficiencia en el control de partc&las s&spendidas 8high&e''iciency&(articulate air) *EP"@ diseEadas para eliminar microorganismos de m:s de 5>/ Qm de ,abitaciones de aislamiento= ;&irfanos . cabinas de bioseg&ridad 8CBS@> La radiacin ioni(ante &tili+ada en ma;&inas de microondas . radiolgicas consiste en ra.os gamma de longit&d de onda corta . gran energaK se &tili+a para esterili+ar material

descartable como $eringas pl:sticas= catteres o g&antes antes de s& &so> !l agente esterili+ante ;&mico m:s com-n es el o<ido de etileno 8!tO@= ;&e se &tili+a en forma de gas para la esterili+acin de ob$etos sensibles al calor> Se ,an &sado %apor de formalde,ido . per<ido de ,idrogeno en fase de %apor 8agente o<idante@ par a esterili+ar filtros 9!*A en CBS> !l gl&taralde,ido= &n agente esporicida 8destr&.e esporas@ en /G'5 ,oras se emplea para e;&ipos mdicos como broncoscopios por;&e no corroe las lentes= el metal ni la goma> !l :cido paractico es efecti%o en presencia de material org:nico . se &tili+a para la esterili+acin de la s&perficie de los instr&mentos ;&ir-rgicos> !l &so del gl&taralde,ido o :cido paractico se denomina esterili(acin en Brio.

Material:
A&tocla%e 8olla de presin@ 9orno B&dineras de acero ino<idable con tapa@> Ag&a destilada Material a esterili+ar 8 &bos de %idrio= pipetas= ,isopos= portaob$etos= ca$as de *etri etc>@> o Cinta testigo o Mec,eros o Franelas o o o o o Material trado por el est&diante 8por mesa@: Material preparado anteriormente para esterili+ar Asa bacteriolgica . porta asa *apel estra+a 8' Dilo@ Una bolsa c,ica para g&ardar los materiales estriles>

Procedi'iento:
a, Esterili(acin en la olla de presin )Calor 46'edo,:

La olla de presin se &tili+a de manera r&tinaria para esterili+ar &tensilios en los laboratorios= medios de c&lti%o= dil&ciones . c&lti%os descartados> M&c,as %eces siempre se opera a &na presin de '2 librasJp&lgadas= apro<imadamente ')' C= el tiempo para alcan+ar la esterili+acin depender: de la nat&rale+a del materia para esterili+ar= el tipo de recipiente . el %ol&men= el tiempo m:s &tili+ado es de '2 min&tos> Los pasos a seg&ir son los sig&ientes: '> Colocar la olla sobre el tripie
5

)> "e%isar ;&e el ni%el del ag&a sea el adec&ado= no debe tocar la parrilla ;&e se enc&entra en el interior> /> rasladar los materiales ;&e se %an a esterili+ar 8Ca$as de *etri inoc&ladas con bacterias para desec,ar etc>= o material limpio@>

1> Colocar el material dentro de la olla de presin= el material debe colocarse correctamente para ;&e permita la correcta distrib&cin del %apor> *ara ello se deben tomar en c&enta las sig&ientes preca&ciones: 2> Distrib&ir el material en forma ordenada en toda la s&perficie interna disponible> !%itar amontonar el material en &n :rea especfica> 7o colocar el material &no sobre otro> !%itar ;&e el material to;&e las paredes de la olla> 7o preparar cestas con t&bos donde estos se enc&entren demasiado apretados> Colocar . cerrar la tapa de la olla ,ermticamente= en base a las flec,as seEaladas ;&e est:n grabadas en la tapa . en la misma olla 8indicando ABI!" OG C!""ADO@= . proc&re ;&e estn bien a$&stada>

3> !ncender los mec,eros para empe+ar a calentar la olla> 0> !sperar a ;&e salga el %apor a c,orro por el orificio de la tapa . ;&e la ag&$a del manmetro este marcando entre / a 2 librasJp&lgadas de presin> (> !n seg&ida colocar la %:l%&la giratoria> Alg&nas ollas de presin la %:l%&la esta fi$a sobre la tapa= en forma de pi%ote . al estar marcando entre / a 2 librasJp&lgadas= -nicamente ,acemos &n mo%imiento de la %:l%&la ,acia aba$o> 4> !sperar a ;&e la ag&$a del manmetro alcance la presin indicada para esterili+ar= es 5 decir la ag&$a del manmetro indicara ')' C 8'2 librasJp&lgadas@=a partir de este momento= deber:s tomar el tiempo de esterili+acin ;&e es de '2 min&tos> '5> Deber:s tener c&idado de ;&e la presin de la a&tocla%e= n&nca rebase los '2 libras= ni ;&e est por deba$o de las '2 libras= es decir la ag&$a del manmetro deber: 5 estar fi$a marcando ')' C DU"A7 ! '2 MI7U OS> !n caso contrario de ;&e la ag&$a descienda o s&pere la presin indicada se debe reg&lar el calentamiento con la flama de los mec,eros> ''> ransc&rridos los '2 min&tos= se apagan los mec,eros= . se de$an ;&e se enfri a temperat&ra ambiente ,asta llegar a cero libras de presin= ;&itar la %:l%&la de seg&ridad . la olla p&ede abrirse> CAntes no &a 5ue podr-a ocurrir un accidenteD

')> La a&tocla%e se abre desde atr:s= proc&rando ;&e nadie ;&ede de frente ,acia donde se abre la tapa= .a ;&e saldr: m&c,o %apor caliente ;&e ca&sa ;&emad&ras> Una %e+ ;&e se abri= con c&idado . con a.&da de &n trapo o de &n g&ante de asbesto sacar el material ;&e se esterili+o . de$ar ;&e se enfren . se se;&en &n poco antes de almacenarlos o reali+ar la acti%idad correspondiente> '/>Si .a no se %a a &tili+ar la olla n&e%amente= %aciar el ag&a ;&emarse= la%arla= secarla . g&ardarla> con c&idado de no

NOTA: LA( 702(-6A( 8#0 0(T025L5C06, T0632A6 LA 20(7-6(A!5L53A3 30 45G5LA2 0L T50M7- 8#0 3#20 0L 72-C0(-, (56 (07A2A2(0 30L L#GA2 5635CA3- 7A2A LA 0(T025L59AC5-6, 0(T- 0( C-6 LA :56AL53A3 30 045TA2 ACC5306T0(.

%, Esterili(acin en ;orno )Calor seco o por aire caliente,:

!l procedimiento de esterili+acin por aire caliente solo se p&ede emplear en &tensilios de %idrio o metal 8$eringas= ag&$as= pipetas= etc>@> "os pasos a se$uir son: '> *repare el material para esterili+ar del mismo modo ;&e para el mtodo del a&tocla%e & olla de presin>

)> Colo;&e el material en el ,orno= c&idando de ;&e no ;&ede apretado= de tal manera ;&e permita la circ&lacin del aire caliente> /> *onga el termostato a la temperat&ra adec&ada 8'35 P '(5 C@ . encienda el ,orno= si ,a. %entilador %erifi;&e ;&e est f&ncionando> 1> Bigile el termostato> C&ando lleg&e a la temperat&ra deseada 8'35 P '(5 C@= empie+a a c&idar el tiempo d&rante 35 min&tos> Si los materiales de laboratorio son de %idrio= pesados o %ol&minosos= o si ,a. pol%os= aceites= %aselinas= etc>= se o considera s&ficiente ) ,oras de e<posicin a '35 P '(5 C>
5 o o

2> Apag&e el ,orno= espere ,asta ;&e la temperat&ra descienda ,asta 15 C= abra la p&erta del ,orno= sa;&e los materiales estriles> !l papel empleado para en%ol%er deber: ,aber tomado &n color marrn obsc&ro> c@ E!TERI"I:ACION POR 3"AMEO )*rocedimiento indi%id&al 8Asa bacteriolgica o ag&$a recta para siembra@@> MATERIA": Asa bacteriolgica o ag&$a recta para siembra *orta asa Mec,ero *in+as para portaob$etos 8pin+as de diseccin sin dientes@ Alco,ol 8frasco c,ico@ Cerillos o encendedor

PROCEDIMIENTO:

!l asa de siembra bacteriana= se debe calentar en la flama ,asta ;&e se ponga al ro$o %i%o> Sostenga el asa de siembra inmediatamente arriba de la porcin a+&l de la llama del mec,ero> *onga el asa tan cerca de la porcin a+&l de la llama en forma %ertical> De$ar enfriar .a sea contando de )5 a /5 seg&ndos o bien enfriar en &no de los e<tremos del medio de c&lti%o en donde no e<ista crecimiento de microorganismos>

d, E!TERI"I:ACION POR 3"AMEOE )Material 'etFlico por e5uipo,.

!n caso de bist&r= ti$eras o material ;&ir-rgico en general 8a&n;&e no es con%eniente para &so general@ Colo;&e los materiales en &na bande$a met:lica AEada )5 o m:s gotas de etanol . encienda f&ego> D&rante el flameado incline la bande$a de &n lado a otro

NOTA: ambin estos materiales se en%&el%en con papel estra+a= . se esterili+an por calor ,-medo o seco>

R#TA DE TRABAJO: RE!#"TADO!: DI!C#!I9N: CONC"#!I9N: BIB"IOGRA3GA: C#E!TIONARIO:

)PRACTICA No. H,
PREPARACION DE MEDIO! DE C#"TI O < PR#EBA! DE E!TERI"IDAD OBJETI O GENERA": A&e los est&diantes aprendan a preparar los medios de c&lti%os adec&ados para ;&e los microorganismos al ser sembrados= se desarrollen . faciliten s& aislamiento= identificacin . c&antificacin= adem:s de someter los medios preparados a pr&ebas de esterilidad> OBJETI O! PARTIC#"ARE!:
1.2.3.-

INTROD#CCION: Los tipos b:sicos de medios de c&lti%o para el crecimiento de microorganismos incl&.en a los medios comple$os 8no definidos@ . sintticos 8;&micamente definidos@> !n &n medio comple$o= la composicin ;&mica no est: bien conocida= dado ;&e contienen n&trientes como e<tractos animales 8p> e$>= e<tracto de le%ad&ra@ ;&e son ricos en %itaminas= amino:cidos= minerales . otros constit&.entes como las peptonas 8digeridos proteicos@> !stos medios por lo general se enc&entran comercialmente de forma des,idratada . son reconstit&idos con ag&a destilada para obtener caldos n&triti%os ;&e fomenten el crecimiento microbiano> Los medios sintticos son generalmente &tili+ados para est&diar los re;&erimientos n&tricionales . caractersticas de &na bacteria= dado ;&e se conoce la composicin ;&mica e<acta> *ara est&diar debidamente a los microorganismos= se necesita como re;&isito indispensable el c&lti%arlos en condiciones adec&ados de laboratorio> *ara lograrlo es preciso conocer c&:les son los n&trientes . las condiciones fsicas ;&e se re;&ieren> Mediante in%estigaciones e<tensas se ,an determinado las necesidades n&tricionales de las bacterias=

esta in%estigacin ,a sido la ca&sa del desarrollo de n&merosos medios de c&lti%o> Los medios de c&lti%o p&eden ser slidos= semislidos . l;&idos= en los primeros crecen . se identifican f:cilmente las colonias> Se re;&ieren de diferentes s&stancias ;&micamente p&ras para el c&lti%o de microorganismos seg-n s&s necesidades n&tricionales= para esto se &tili+an ciertos materiales cr&dos como peptonas= e<tracto de carne= e<tracto de le%ad&ra . otros: . as el medio de c&lti%o ;&e se obtiene ,ace posible el desarrollo de &na gran %ariedad de bacterias . otros microorganismos> C&ando se desea &n medio solido se toma el agar como agente solidificante> !$emplos de medios l;&idos= slidos . semislidos realmente siempre ,acen posible el desarrollo de m&c,as bacterias com&nes> A&n;&e la ma.ora se desarrollan bien en estos medios . otros simplemente no se desarrollan debido a ;&e re;&erimientos n&tricionales m&. elaborados para n&trientes especficos= por e$emplo las %itaminas . s&stancias prec&rsoras del crecimientos= a estos organismos se les llama e<igentes> !stos medios de c&lti%o se preparan &sando los ingredientes indi%id&ales necesarios o de manera m:s pr:ctica agregando ag&a a prod&ctos des,idratados ;&e contienen todos los ingredientes> !n el comercio podemos encontrar todos los medios de c&lti%o en forma des,idratada> !n la preparacin de los medios de c&lti%o se debe de tomar en c&enta las sig&ientes consideraciones: a> Cada ingrediente o el medio des,idratado completo se deber: disol%er en &n %ol&men adec&ado de ag&a destilada> b> Se determinara el *, del medio . se a$&stara si es necesario> !l p9 se determinara por medio de indicadores o por el potencimetro> Los medios comerciales .a lo traen a$&stado> c> !l medio se pondr: en recipientes adec&ados= como t&bos= matraces . c&.as bocas se taparan con tapones de algodn= pl:stico o c&biertas met:licas>

d> Los medios se esterili+an generalmente en a&tocla%e= alg&nos sensibles al calor se filtran . otros nada m:s se dis&el%en> e> C&ando se re;&ieren se %ierten en ca$as de *etri en condiciones aspticas> MATERIA": Olla de presin Balan+a granataria Matra+ de 255ml 8 ' por e;&ipo@ *robeta grad&ada de 25 5 '55 ml 8 ' por e;&ipo@ &bos de ensa.e con . sin tapn de rosca 8 '( por e;&ipo@ Mec,eros Fab li;&ido . ' escobilln para t&bos por e;&ipo C&adros de papel al&minio Ag&a destilada *ipeta grad&ada 8 ' de 2 . '5 ml por e;&ipo@

#radilla met:lica 8 ' por e;&ipo@ !sp:t&las Ca$as de *etri desec,ables *apel estra+a MEDIO! DE C#"TI O DE!;IDRATADO! COMERCIA"E!: Caldo n&triti%o CN, Agar n&triti%o )AN, Agar papa de<trosa )PDA, Agar mnimo en sales 8AM!@

MATERIA" 7#E DEBERIN TRAER "O! A"#MNO! 8e;&ipo@: MasDintape Algodn Marcador de aceite de p&nto fino *in+as de diseccin sin dientes> Una regla con escala milimtrica de /5 cm Una tela sin pel&sa i$eras Cerillos o encendedor !spon$a Calc&ladora
PROCEDIMIENTO:

A. Preparacin de 'edios de culti/o en placas: '@ "e%isar ;&e todo el material ;&e se %a.a a &tili+ar este limpio= en b&en estado . completo> )@ La%ar s& material= el de cristalera se la%a &tili+ando detergente l;&ido= en$&agar con ab&ndante ag&a de la lla%e . desp&s con ag&a destilada= secar el material con &na tela ;&e no de$e pel&sa> /@ "e%isar las indicaciones de los instr&cti%os ;&e tienen cada &no de los medios de c&lti%o des,idratados . ;&e ser:n &tili+ados> 1@ 9acer c:lc&los para la preparacin de los medios de c&lti%o . del %ol&men de ag&a destilada ;&e se %a.a a &tili+ar= esto es mediante &na regla de tres> 2@ Se mide la cantidad de ag&a destilada con &na probeta grad&ada . colocar &na porcin del %ol&men calc&lado en el matra+ ;&e se %a.a a &tili+ar> 3@ Con &na esp:t&la tomar el medio de c&lti%o des,idratado de ac&erdo a los c:lc&los reali+ados . al peso obtenido= colocar este en &n c&adro de papel al&minio . pesarlo c&idadosamente con la a.&da de &na balan+a granataria> 0@ Colocar el medio de c&lti%o pesado en el matra+ ;&e contiene ag&a destilada=

agregar el resto de ag&a contenida en la probeta . en seg&ida colocar &n tapn de algodn a$&stado a la boca del matra+> (@ Mo%er el medio de c&lti%o c&idadosamente ,asta ;&e se dis&el%a en s& totalidad= en seg&ida calentarlo . esperar ;&e se dis&el%a e ,ier%a d&rante &n min&to a tra%s de la llama del mec,ero= tener c&idado de ;&e no se tire= posteriormente colocarle &n gorrito de papel= eti;&etar . esterili+ar por calor ,-medo en la olla de presin=8tome en c&enta a ;&e temperat&ra . tiempo seg-n especificaciones del fabricante@> 4@ Al terminar el proceso de esterili+acin enfriar el medio apro<imadamente ,asta o 12 C> #eneralmente se llega a esta temperat&ra c&ando se p&ede tolerar el calor del matra+ al ponerse en contacto con la s&perficie interna del antebra+o o el dorso de la mano> '5@ "eali+ar el %aciado en las placas> B. aciado en placas: '> Desinfectar el :rea de traba$o 8de ac&erdo al desinfectante ;&e se est &tili+ando@> )> Colocar &n c&adro de papel de estra+a 8de preferencia &n pliego completo . fi$arlo con cinta masDintape por la es;&inas a la mesa de traba$o@> /> *render los mec,eros 8de preferencia dos@ . esperar entre / a 2 min&tos con la finalidad de traba$ar en condiciones de esterilidad= es importante traba$ar dentro del :rea de seg&ridad ;&e proporciona la flama del mec,ero 8apro<imadamente /5 cm de di:metro por mec,ero@> 1> Agitar el contenido del matra+ . ;&itar el tapn de algodn= flamear el borde de la boca del matra+ con agar . le%antar la c&bierta de la ca$a de *etri con la mano i+;&ierda si es diestro o derec,a si es +&rdo= de manera ;&e la base de la ca$a de *etri repose sobre la palma de la mano . la tapa p&eda manip&larla ,acia arriba . ,acia aba$o con el p&lgar . dedo medio> 2> Berter apro<imadamente de '2 a '( cm de medio de c&lti%o . ,acer girar la ca$a de petri s&a%emente para distrib&ir &niformemente el agar> Si el medio presenta b&rb&$as de aire ,a. ;&e eliminarlas mediante &n pase r:pido con la flama del mec,ero= de$ar solidificar en &n tiempo de m:s o menos '2 a )5 min&tos> 3> Una %e+ ;&e se ,an enfriado . solidificado= eti;&etar . colocar las ca$as con la tapa ,acia aba$o . en seg&ida g&ardarlas en el refrigerador ,asta la sig&iente sesin de laboratorio>
NOTA: Antes de guardar las ca)as de 7etri en el re$rigerador debern so"eterse a

pruebas de esterilidad colocndolas en la estu$a bacteriol,gica durante 2; horas a < C, * despus de este tie"po se guardan en el re$rigerador. C. Preparacin de 'edios de culti/o en tu%o )caldo & a$ar nutriti/o,

'@ "epetir los pasos del ' al ( del inciso A> Los medios de c&lti%o en caldo . en agar= no es necesario f&ndirlos a la flama del mec,ero> )@ Colocar a cada t&bo de ensa.e de '/ < '55 mm de )>2 a / ml apro<imadamente del medio de c&lti%o indicado>

/@ Colocar a cada t&bo de ensa.e tapn de algodn= colocarlos en &n bote de lamina= c&brir el bote con &n gorro de papel estra+a= eti;&etar . esterili+ador por calor ,-medo> 1@ Al trmino de la esterili+acin= de$ar enfriar> Los t&bos con agar n&triti%o se de$an inclinados ,asta solidificarse totalmente> 2@ Desp&s de ;&e el medio de c&lti%o se ,a enfriado . solidificado 8m:s o menos '2 min&tos@ colocarlos en refrigeracin ,asta la sig&iente sesin de laboratorio donde se %an a &tili+ar> NOTA: *repara solamente la cantidad ;&e se necesite de los medios de c&lti%o mencionados anteriormente= sig&iendo cada &na de las instr&cciones )consultar el 'anual de 'edios de culti/o o el instructi/o ane>o en cada uno de los Brascos co'erciales,. Considerando ;&e cada placa re;&iere de '2 a '( ml de medio de c&lti%o= los t&bos de '/ < '55 ml de )>2 a / ml . los t&bos de '3 < '25 mm de 4 a '5 ml>
PROCEDIMIENTO A REA"I:AR:

3@ *reparar )5 ml de caldo n&triti%o 8C7@ en &n matra+ !rlenme.er de )25 ml> Baciar / ml> en cada t&bo= preparar oc,o t&bos con tapn de algodn . de rosca ;&e deber:n cerrar sin llegar al tope> 0@ *repara )25 ml> de agar n&triti%o 8A7@= calentar la me+cla con la a.&da de &n mec,ero Fis,er o b&nsen con agitacin constante ,asta llegar a eb&llicin= d&rante &n min&to 8c&idar ;&e no se pro.ecte ,acia af&era del matra+@ . %aciar en seg&ida / ml> de medio en oc,o t&bos con tapn de rosca> !n$&agar inmediatamente la pipeta para e%itar ;&e se solidifi;&e en ella el agar> !l resto del medio se esterili+a en la a&tocla%e & olla de presin>> (@ *reparar )25 ml> de medio de c&lti%o *apa de<trosa agar 8*DA@ en &n matra+ !rlenme.er de )25 o 255 ml> > 4@ Calentar la me+cla con la a.&da de &n mec,ero Fis,er o b&nsen con agitacin constante ,asta llegar a eb&llicin= d&rante &n min&to 8c&idar ;&e no se pro.ecte o se derrame ,acia af&era del matra+@> Baciar en seg&ida / ml> del medio en oc,o t&bos con tapn de algodn . de rosca> !l resto del medio se esterili+a en el a&tocla%e> '5@ *repara )55 ml> de medio de c&lti%o mnimo de sales 8MM@= en &n matra+ !rlenme.er de 255 ml 8seg&ir el mismo procedimiento de preparacin de los medios anteriores@ . esterili+ar en a&tocla%e>

Esterili(acin de 'edios de culti/o

'@ Los medios de c&lti%o se esterili+aran en a&tocla%e de ac&erdo a las sig&ientes instr&cciones: a@ Colocar la a&tocla%e sobre el tripie> b@ !ncender los mec,eros para empe+ar a calentar la a&tocla%e la c&al debe contener ag&a en s& interior> c@ "e%isar ;&e el ni%el del ag&a sea el adec&ado= no debe tocar la parrilla ;&e se enc&entra en el interior> d@ Coloca t& matra+ en el interior de la a&tocla%e> e@ Cirrala sig&iendo las indicaciones del profesor> > f@ Una %e+ ;&e empiece a salir %apor= coloca la %:l%&la= para ;&e la presin comience a s&bir> g@ iene ;&e llegar ,asta '2 libras de presin o ')' C>= seg-n las indicaciones de cada &no de los medios a esterili+ar>
5

,@ A partir de este momento= deber:s tomar el tiempo de '2 min&tos o el ;&e se indi;&e para cada medio de c&lti%o o material> i@ Deber:s tener c&idado de ;&e la presin de la a&tocla%e= n&nca rebase los '2 libras= ni ;&e est por deba$o de las '2 libras> !sto se p&ede controlar reg&lando la flama de los mec,eros seg-n te indi;&e el profesor> $@ ransc&rridos los '2 min&tos= apaga los mec,eros= . de$ar ;&e se enfri a temperat&ra ambiente ,asta llegar a cero libras de presin= ;&itar la %:l%&la de seg&ridad . la a&tocla%e p&ede abrirse CAntes no &a 5ue podr-a ocurrir un accidenteD

D@ La a&tocla%e se abre desde atr:s= proc&rando ;&e nadie ;&ede de frente ,acia donde se abre la tapa= .a ;&e saldr: m&c,o %apor caliente ;&e ca&sa ;&emad&ras> Una %e+ ;&e se abri con c&idado= con a.&da de &n trapo o de &n g&ante de asbesto= sacar el matra+ . de$ar ;&e ba$e s& temperat&ra ,asta ;&e este tibio . p&eda %aciarse en las ca$as de *etri>> l@ Si .a no se %a a &tili+ar la a&tocla%e n&e%amente= %aciar el ag&a con c&idado de no ;&emarse= la%arla= secarla . g&ardarla>

Preparacin de las ca.as de Petri & tu%os con 'edio de culti/o

'> Los t&bos con medios de c&lti%o con agar= se deber:n colocar en &na s&perficie inclinada de tal forma ;&e el medio solidifi;&e a &na distancia apro<imada de 'G) cm>= de la boca del t&bo> )> De$ar ;&e los medios de c&lti%o en matraces ;&e se ,an sacado de la a&tocla%e se 5 enfren a &na temperat&ra apro<imada de 15 G25 C ;&e coincide con la posibilidad de

sostener el matra+ en el dorso de la mano sin sentir &n calor e<cesi%o> /> Cerca del mec,ero= eti;&etar ( ca$as con A7= ( ca$as con *DA . ( ca$as con MM> Los medios de c&lti%o se %acan en las ca$as de *etri 8apro<imadamente '2 P '( ml@ en &na +ona asptica cerca del mec,ero o en campana de fl&$o laminar> 1> De$ar ;&e solidifi;&en los medios 8por lo menos /5 min&tos@= posteriormente en%ol%er las ca$as c&idadosamente con papel estra+a o acomodarlas en forma in%ertida en bolsas de pl:stico limpias 8de preferencia n&e%as@> 2> #&ardarlas en refrigeracin ,asta )1 ,oras antes de &tili+arlas> NOTA: Antes de g&ardar las ca$as en refrigeracin deben someterse a pr&ebas de esterilidad= durante 2; horas a < 0C,

Prue%as de esterilidad de 'ateriales

a, Colocar los t&bos con agar inclinado . las ca$as de *etri en forma in%ertida en &na

est&fa de inc&bacin a$&stada a /0 C d&rante )1G1( ,oras> %, "e%isar los t&bos . ca$as de *etri para detectar la presencia de contaminantes= por la aparicin de t&rbide+= nata s&perficial .Jo depsito de material en el fondo de los t&bos con medio l;&idoK as como la formacin de colonias microbianas en la s&perficie de los medios slidos> c, Si no ,a. contaminacin de los medios= se abrir: &na de las ca$as de *etri de cada medio d&rante ' min&to en el laboratorio o en +onas accesorias al mismo . se eti;&etaran como Hal aireI> d, La otra ca$a de cada medio de c&lti%o se abre d&rante /5 seg&ndos cerca del mec,ero . se eti;&etara Hen :rea aspticaI > e, La tercera ca$a se conser%ara sin abrir . se eti;&etara como HcontrolI> B, Inc&bar todas las ca$as . t&bos d&rante )1 ,oras . anotar los res&ltados> $, *ara los res&ltados ,acer la descripcin crecimiento obtenido en las ca$as con diferentes medios de c&lti%o 8A7= *DA . MM@ . con los distintos tratamientos en relacin a la ca$a control> 4, "eportar el crecimiento en forma c&alitati%a: 8G @ no ,a. crecimiento= 8 R @ poco crecimiento= 8 RR @ crecimiento reg&lar . 8 RRR @crecimiento ab&ndante> i, Disc&ta los res&ltados . determine si la esterili+acin en la a&tocla%e f&e la

adec&ada= as como el mane$o de los materiales . medios de c&lti%o en s& elaboracin> ., "eporte s&s res&ltados en &na tabla como la ;&e se presenta a contin&acin:

TAB"A + Descripcin morfolgica de microorganismos en ca$as de *etri con diferentes medios de c&lti%o:

M!DIO D! CUL IBO

Abierta al aire

Abierta en :rea asptica

Control

A#A" 7U "I IBO

*A*A D!L "OSA A#A"

MI7IMO !7 SAL!S

NOTA: !l tamaEo de la tabla de res&ltados ;&eda a s& consideracin= *ara reportar los res&ltados de los t&bos p&ede ,acerlo en &na tabla similar o como &sted lo considere correcto>

R#TA DE TRABAJO: RE!#"TADO!: 2eportar los clculos obtenidos en la elaboraci,n de los "edios de culti/o,
DI!C#!ION: CONC"#!IONE!: BIB"IOGRA3IA: la tabla de resultados inclu*endo $otogra$as del creci"iento en cada ca)a * tubos si es 1ue los obser/o.

C#E!TIONARIO:

+Practica N, -.
CONOCIMIENTO < #!O DE" MICRO!COPIO

O%.eti/o $eneral:
A&e el al&mno aprenda a mane$ar correctamente el microscopio= . conocer s& &tilidad en el laboratorio>

O%.eti/os particulares:
'> )> /

INTROD#CCION
!l microscopio simple &tili+ado por Anton Ban Lee&Cen,oeeD en el siglo LBII tena &na sola lente . era similar a &na l&pa pero Ban Lee&Cen,oeeD era el me$or tallador de lentes del m&do de s& tiempo> allaba s&s lentes con tanta precisin ;&e &na lente solo poda a&mentar &n microbio /55< . gracias a s&s microscopios simples f&e la primera persona ;&e p&do %er las bacterias> Los contempor:neos de Lee&Cen,oeeD= como 9ooDe constr&.eron microscopios comp&estos= con m-ltiples lentes= de ,ec,o se le ad$&dica al ptico ,olands 6ac,arias Sanssen la constr&ccin del primer microscopio comp&esto alrededor de '355> Sin embargo estos primeros microscopios comp&estos eran de ba$a calidad . no podan &tili+arse para obser%ar bacterias> "ecin en '(/5 Sosep, SacDson Lister 8el padre de Sosep, Lister@ constr&.o &n microscopio de &na calidad m&c,o ma.or >Barias me$oras del microscopio de Lister dieron como res&ltado el desarrollo del microscopio comp&esto moderno= ;&e es el tipo &tili+ado en la act&alidad en los laboratorio de microbiologa> Los est&dios microscpicos de m&estras de materia %i%a ,an re%elado interacciones espectac&lares entre los microbios> !l termino microscopia ptica se refiere al empleo de c&al;&ier clase de microscopios ;&e &tilice la l&+ %isible para obser%ar las m&estras> La microscopia es el mtodo ;&e se &tili+a con ma.or frec&encia tanto para la deteccin directa microorganismos en las m&estras mdicas como para la caracteri+acin de los microorganismos ;&e crecen en los c&lti%os> La microscopia se define como el empleo de &n microscopio para a&mentar de tamaEo 8es decir &n agrandamiento %is&al@ ob$etos demasiados pe;&eEos para ser obser%ados a simple %ista con el propsito de ;&e p&edan %erse con facilidad s&s caractersticas> Dado ;&e la ma.ora de los agentes infecciosos no p&eden detectarse a simple %ista= la microscopia desempeEa &n papel importante en el laboratorio> Los microscopios . los diferentes mtodos de obser%acin microscpica son %arios pero a;& solo se describir:n los m:s &tili+ados en el diagnostico microbiolgico>

Los tipos de microorganismos ;&e se %an a detectar= identificar . caracteri+ar determinan los tipos de microscopia ;&e es m:s apropiada emplear> Los c&atro tipos de microscopias m:s &tili+adas en el diagnostico microbiolgica son: Microscopia de campo claro 8conocida tambin como microscopia de l&+ & ptica@= Microscopia de fl&orescencia= Microscopia de campo obsc&ro . la Microscopia electrnica> 1. Estructura y /ane0o del /icrosco(io (tico Las partes esenciales ;&e componen &n microscopio ptico son:

Parte /ec1nica
Pie o soporte: Sir%e como base al microscopio . en l se enc&entra la f&ente de il&minacin> Platina: S&perficie sobre la ;&e se colocan las preparaciones> !n el centro se enc&entra &n orificio ;&e permite el paso de la l&+> Sobre la platina ,a. &n sistema de pin+a o similar= para s&$etar el portaob$etos con la preparacin= . &nas escalas ;&e a.&dan a conocer ;& parte de la m&estra se est: obser%ando> La platina presenta ) tornillos= generalmente sit&ados en la parte inferior de la misma= ;&e permiten despla+ar la preparacin sobre la platina= en sentido longit&dinal . trans%ersal respecti%amente> Tu%o: Cilindro ,&eco ;&e forma el c&erpo del microscopio> Constit&.e el soporte de oc&lares . ob$eti%os> Re/l/er porta o%.eti/os: estr&ct&ra giratoria ;&e contiene los ob$eti%os> Bra(o o asa: &ne el t&bo a la platina> L&gar por el ;&e se debe tomar el microscopio para trasladarlo de l&gar> Tornillo 'acro'Jtrico o de enBo5ue $rosero: Sir%e para obtener &n primer enfo;&e de la m&estra al &tili+arse el ob$eti%o de menor a&mento> Despla+a la platina %erticalmente de forma perceptible> Tornillo 'icro'Jtrico o de enBo5ue Bino: Sir%e para &n enfo;&e preciso de la m&estra= &na %e+ ;&e se ,a reali+ado el enfo;&e con el macromtrico> ambin despla+a %erticalmente la platina= pero de forma pr:cticamente imperceptible> !s el -nico tornillo de enfo;&e ;&e se &tili+a= &na %e+ reali+ado el primer enfo;&e= al ir cambiando a ob$eti%os de ma.or a&mento>

Parte (tica
Oculares: Son los sistemas de lentes m:s cercanos al o$o del obser%ador= sit&ados en la parte s&perior del microscopio> Son cilindros ,&ecos pro%istos de lentes con%ergentes c&.o a&mento se

reseEa en la parte s&perior de los mismos 8normalmente '5L en los microscopios ;&e se &tili+ar:n en esta pr:ctica@> Dependiendo de ;&e e<ista &no o dos oc&lares= los microscopios p&eden se mono o binoc&lares> O%.eti/os: Son sistemas de lentes con%ergentes ;&e se acoplan en la parte inferior del t&bo= mediante el re%l%er> !n esta estr&ct&ra se p&eden acoplar %arios ob$eti%os 8ordenados de forma creciente seg-n s&s a&mentos= en el sentido de las ag&$as el relo$@> Un anillo coloreado es distinti%o de los a&mentos de cada ob$eti%o= ;&e tambin %an reseEados en el lateral del mismo> Alg&nos ob$eti%os no enfocan bien la preparacin al aire= . se deben de &tili+ar con &n aceite de inmersin 8normalmente %an marcados con &n anillo ro$o@> !stos ob$eti%os de
inmersin no se &tili+ar:n normalmente en estas pr:cticas> Condensador:

Sistema de lentes con%ergentes ;&e capta los ra.os de l&+ . los concentra sobre la preparacin= de manera ;&e proporciona ma.or o menos contraste> Se reg&la en alt&ra mediante &n tornillo 8letra S de la fig&ra@> 3uente de ilu'inacin: !n los microscopios a &tili+ar= el aparato de il&minacin est: constit&ido por &na l:mpara ,algena de ba$o %olta$e 8')B@ sit&ada en el pie del microscopio> La l&+ procedente de la bombilla pasa por &n reflector ;&e en%a los ra.os l&minosos ,acia la platina> DiaBra$'a o iris: Sobre el reflector de la f&ente de il&minacin> Abrindolo o cerr:ndolo permite grad&ar la intensidad de la l&+> TransBor'ador: Ta ;&e el %olta$e de la bombilla es menor ;&e el de la red= es necesario para enc,&far el microscopio> Alg&nos modelos .a lo lle%an incorporado en el pie del microscopio> Adem:s= el transformador dispone de &n potencimetro para reg&lar la intensidad de la l&+> 2onta0e y en'o3ue de una (re(aracin /icrosc(ica Antes de obser%ar la preparacin al microscopio= esta debe de ser montada sobre %idrio> *ara ello e<isten dos pie+as de %idrio denominadas portaob$etos 8porta@= ;&e= como s& nombre indica= es el soporte sobre el ;&e %a la m&estra= . c&breob$etos 8c&bre@ ;&e siempre ,a de colocarse sobre la m&estra> Una %e+ colocada la m&estra en el porta= se debe aEadir &na gota de ag&a= o de la sol&cin ac&osa pertinente= antes de colocar el c&bre= para e%itar interfaces ag&aGaire= ;&e pro%ocan +onas ciegas> *ara enfocar la preparacin se ,a de seg&ir de forma min&ciosa el protocolo descrito deba$o de la fig&ra>)DE!ARRO""O, Conse.os prFcticos '@ !n los microscopios ;&e re;&ieren transformador= el enc,&fe a la red . desenc,&fe debe ,acerse sobre el transformador= . n&nca debe desenc,&farse el microscopio del transformador>

)@

Se debe mantener apagada la l&+ del microscopio siempre ;&e no se est &tili+ando= .a ;&e la %ida media de la bombilla es corta>

/@ Siempre se debe comen+ar el enfo;&e con el ob$eti%o de menor a&mento> H, Anotar siempre el n-mero de a&mentos con el ;&e se obser%a la preparacin> *ara calc&larlo basta m&ltiplicar el n-mero de a&mentos del ob$eti%o por el de los oc&lares> ;acer es5ue'as & di%u.os de lo o%ser/ado con cada au'ento. 2@ Sal%o ;&e se indi;&e lo contrario no &tili+ar n&nca el ob$eti%o de inmersin= .a ;&e se re;&iere &n aceite especial sin el ;&e= adem:s de no enfocar bien= e<iste &na gran probabilidad de daEar la lente al ro+ar con el c&breob$etos> 6) Una %e+ enfocada= proc&rar recorrer= con los tornillos de la platina= toda la preparacin> !l microscopio= adem:s de &na gran ,erramienta en biologa= es &n gran $&g&ete para disfr&tar de l desc&briendo el apasionante m&ndo de lo pe;&eEo= para ello= ,a. ;&e rastrear todo este m&ndo>

El Microscopio 9ptico:

A> B> C> D> !> F> #> 9> I> S> U> L> M> 7>

Oc&lares "e%ol%er Ob$eti%os *latina ornillos para despla+ar la preparacin sobre la platina Condensador ornillo macro mtrico ornillo micromtrico Diafragma o iris ornillo para reg&lar la alt&ra del condensador Interr&ptor "eg&lador de la intensidad de la l&+ *in+as para a$&star *ie o soporte

Material:
M&estra de ,eces fecales Ag&a estancada Microscopio *orta ob$etos c&bre ob$etos Franela *ipeta *aste&r L&gol

Desarrollo:
EnBo5ue Del Microscopio Los pasos a seg&ir para la perfecta &tili+acin del microscopio son las sig&ientes: a@ !nc,&far el microscopio al transformador . ste a la red> b@ Colocar la preparacin sobre la platina de forma ;&e la estr&ct&ra a obser%ar ;&ede en el orificio central de la platina> c@ *oner el ob$eti%o de menor a&mento c&.o amplio campo %is&al facilita el ,alla+go de estr&ct&ras importantes> d@ S&bir la pletina accionando el tornillo micromtrico . mirando la preparacin desde f&era ,asta alcan+ar el tope s&perior> !n ning-n caso tocar la preparacin con los ob$eti%os> e@ Mirando por los oc&lares= ba$ar lentamente la platina con el tornillo macro mtrico ,asta conseg&ir %er el ob$eto lo m:s ntido posible> f@ A$&star el enfo;&e con el tornillo micromtrico ,asta %erlo claramente> g@ *ara obser%ar la preparacin a ma.ores a&mentos cambiar de ob$eti%o con &n simple giro del re%l%er> Las pe;&eEas %ariaciones ;&e se obser%an en el enfo;&e se prod&cen al cambiar de ob$eti%o . se corrigen con el micro> ,@ *ara obser%ar otros campos= despla+ar la preparacin mo%iendo los tornillos de la platina> Para ca'%iar la preparacin: Ba$ar la platina> Colocar el ob$eti%o de menor a&mento A&itar la preparacin . colocar la sig&iente *ara desconectar el microscopio= adem:s de los tres pasos anteriores se reali+a lo sig&iente: Apagar . desenc,&far el transformador de la red apar el microscopio con s& f&nda !EG#NDA PARTE ACTI IDAD E8PERIMENTA":0 !n el desarrollo de esta acti%idad se &tili+aran ) tipos de preparaciones: a@ *reparaciones frescas o ,-medas b@ *reparaciones fi$as

Las primeras se reali+an &nos min&tos antes de s& obser%acin . se p&eden &tili+ar &na gran di%ersidad de materiales como> e$idos %egetales . animales= eritrocitos= bacterias etc>= pero e<iste &n incon%eniente este tipo de preparaciones no podemos g&ardarla por m&c,o tiempo> Una preparacin fi$a se p&ede g&ardar por &n tiempo indefinido= para prepararla podemos &tili+ar el material a obser%ar 8p&eden ser esporas= cl&las= microorganismos= cortes de te$idos etc>@= al c&al se le agrega resina sinttica= cera o b:lsamo de Canad: . finalmente se le coloca &n c&breob$etos> Al ,acer la fi$acin se debe e%itar ;&e ;&eden b&rb&$as de aire en la preparacin por;&e distorsiona la imagen

MATERIA" < E7#IPO Microscopio comp&esto *ortaob$etos c&breob$etos ' frasco gotero *apel absorbente *in+as de diseccin Ag&$as de diseccin Una ca$a de petri desec,able Colorantes Aceite de inmersin

M#E!TRA! BIO"OGICA! C&lti%os de bacterias . ,ongos saprofitos ' cabello r&bio . ' cabello obsc&ro Ag&a estancada ' ,o$a %egetal *reparaciones fi$as e$ido m&sc&lar de pollo 8m&estra pe;&eEa@ ' insecto pe;&eEo 8+anc&do pio$o= p&lga@

Desarrollo I.0Preparaciones 46'edas o Brescas:

"eali+a &n monta$e ,-medo con m&estras de c&lti%os bacterianos . de ,ongos por separado de la sig&iente manera: De las ca$as ;&e contiene los c&lti%os= tomar &na pe;&eEa m&estra . colocarla sobre &n portaob$etos= agregar &na gota de colorante . dil&ir la m&estra de c&lti%o con a.&da de &na ag&$a de diseccin= colocar &n c&breob$etos . obser%a al microscopio> !nfoca el microscopio como se menciono anteriormente . reali+a las obser%aciones correspondientes> !labora &n es;&ema de cada &na de las obser%aciones= anota en la parte inferior en n-mero de a&mentos con los ;&e obser%aste 8'5L . 15L@ ;&e corresponden al enfo;&e reali+ado>

"eali+a las preparaciones en fresco del insecto= te$ido %egetal= te$ido animal= cabellos . ag&a estancada sig&iendo el procedimiento reali+ado anteriormente>

Anota t&s obser%aciones . dib&$os correspondientes>

Preparaciones Bi.as
"eali+a las obser%aciones de las preparaciones fi$as ;&e te proporciones el profesor= con el ob$eti%o '5L= 15L . '55L 8en este ob$eti%o agregaremos &na gota de aceite de inmersin a la preparacin para obser%arla@> Anota las obser%aciones . dib&$a>

R#TA DE TRABAJO RE!#"TADO!:

Dib&$os de cada &na de las preparaciones= en fresco . fi$as= con los a&mentos &tili+ados . con los sig&ientes datos: Microscopio: Fec,a: M&estra: A&mento otal incin: incin RDescripcin:

DI!C#!ION: CONC"#!ION: BIB"IOGRA3IA

)Practica N* =,
E"ABORACI9N DE MEDIO! DE C#"TI O PARA !EMBRADO MICROBIO"9GICO

O%.eti/o General.0
Aprender a elaborar correctamente medios de c&lti%o = dependiendo el medio ;&e se %a.a a &tili+ar> O%.eti/os Particulares.0 '>G )>G />G

INTROD#CCION
Un medio de c&lti%o es &n s&strato o sol&cin de n&trientes en los ;&e crecen . se m&ltiplican los microorganismos> Los medios de c&lti%o son necesarios para c&lti%ar a los microorganismos en el laboratorio . reali+ar procedimientos especiali+ados como identificacin de distintos microorganismos como lo son las bacterias= an:lisis de ag&a . aislamiento de microorganismos partic&lares> !<isten diferentes medios para lograr estos an:lisis . otros> Co/(osicin de un /edio de cultivo: A$ar. !l agar es &n agente solidificado por;&e &na %e+ ;&e se f&nde con ag&a> *olmero s&lfatado comp&esto principalmente de D galactosa= /G3 an,idrido L= galactosa . acido D> A&e es &n polisac:rido . ;&e se obtiene de ciertas algas marinas> !l agar es &n b&en agente solidificarte por;&e no se f&nde con ag&a ,ir%iendo= p&ede enfriarse ,asta &na temperat&ra de 15V C sin end&recerse> Peptonas. Son me+clas comple$as de comp&estos org:nicos nitrogenados . sales minerales ;&e se obtienen por digestin en+im:tico o ;&mico de protena animales o %egetales> Las peptonas son m&. ricas en pptido . amino:cidos pero p&eden ser diferentes en determinadas %itaminas . sales> E>tractos. *ara s& preparacin ciertos rganos o te$idos son e<trados con ag&a . alco,ol .

posteriormente concentrados ,asta la forma final de pasto o pol%o>

3luidos corporales. Sangre completa= sangre desfibrinada= plasma o s&ero sang&neo son frec&entemente aEadidos a los medios empleados para el c&lti%o de alg&nos patgenos> La sangre no p&ede ser esterili+ada . debe por tanto= ser obtenida en condiciones aspticas directamente de &n animal sano> !iste'as a'orti$uadores. Alg&nos componentes son incorporados a los medios de c&lti%o para mantener . sales como fosfato disdico o dipot:sico o s&stancias como las peptonas pre%ienen &na des%iacin del p9> Indicadores de p;. Los indicadores de p9 son incorporados en alg&nos medios de c&lti%o . dan e%idencia %is&al de los cambios de p9 ;&e oc&rren> A$entes reductores. Cisterinas= tioglicolato . otros ;&e se aEaden a los medios de c&lti%o para crear condiciones ;&e permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos . anaerobios> A$entes selecti/os. La adicin de determinadas s&stancias al medio de c&lti%o p&ede con%ertirlo en selecti%o= a la concentracin adec&ada act-an como medios selecti%os frente a determinados microorganismos>

Material:
' pa;&ete de ca$as de *etri sin di%isin ' pa;&ete de ca$as de *etri con ) di%isiones ' pa;&ete de ca$as de *etri con / di%isiones Medios de c&lti%o Mec,ero A&tocla%e Balan+a granataria ' franela !ncendedor o cerrillos Agar Algodn *apel destra+a Bata de laboratorio #asas i$eras

PROCEDIMIENTO:
'> *reparar el n-mero de ca$as ;&e se le indi;&e para cada medio de c&lti%o> )> Cons&ltar el man&al de medios de c&lti%o o el instr&cti%o ;&e %iene en el re%erso del frasco de cada medio de c&lti%o> /> Los medios de c&lti%o a preparar son los sig&ientes: Agar sal . manitol o agar ''5 !osina . a+&l de metileno> Agar so.a tripticaseina> Agar de Mar ConDe.> Agar M&eller 9inton> Agar salmonella sigella Agar %erde brillante Agar bigg.

R#TA DE TRABAJO: RE!#"TADO!:

"eali+ar los dib&$os= procedimiento= composicin . c:lc&los reali+ados de cada &no de los medios elaborados: Agar sal . manitol o agar ''5 !osina . a+&l de metileno> Agar so.a tripticaseina> Agar de Mar ConDe.> Agar M&eller 9inton> Agar salmonella sigella Agar %erde brillante Agar bigg.

DI!C#!I9N. CONC"#!I9N. BIB"IOGRA3GA!. C#E!TIONARIO

)PrFctica No. K,
TLCNICA! DE !EMBRADO MICROBIO"OGICO

O%.eti/o $eneral
A&e el est&diante aprenda a reali+ar correctamente las tcnicas de sembrado ;&e se &tili+an con m:s frec&encia en microbiologa> Ob$eti%os partic&lares> '>G )>G />G

Introduccin.
Un mtodo f&ndamental para est&diar las bacterias es c&lti%arlas en &n medio l;&ido o en la s&perficie de &n medio slido de agar> Los c&lti%os de bacterias pro%enientes de infecciones en di%ersos sitios corporales se lle%an a cabo mediante la siembra de m&estras procesadas directamente en los medios artificiales>los medios de c&lti%o . las condiciones de inc&bacin se seleccionan de ac&erdo con s& capacidad para fa%orecer el crecimiento de las bacterias con mas probabilidades de estar implicadas en el proceso infeccioso> Los medios de c&lti%o contienen distintos n&trientes ;&e %an= desde a+&cares simples ,asta s&stancias comple$as como la sangre o el e<tracto de caldo de carne> *ara aislar o p&rificar &na especie bacteriana a partir &na m&estra formada por m&c,os tipos de bacterias= se siembra en &n medio de c&lti%o slido= donde las cl&las ;&e se m&ltiplican no cambian de locali+acin tras m&c,os ciclos reprod&cti%os= cada bacteria indi%id&al genera por escisin binaria &na colonia macroscpica comp&esta por decenas de millones de cl&las similares a la original> Si esta colonia indi%id&al se siembra a s& %e+ en &n n&e%o medio crecer: como c&lti%o p&ro de &n solo tipo de bacteria> !l est&dio organi+ado de c&al;&ier microorganismo re;&iere ;&e se e<amine &na especie a la %e+= el mtodo analtico no se p&ede aplicar c&ando se trata de &na me+cla de %arias especies a la %e+> Uno de los problemas m:s frec&entes en microbiologa es el aislamiento de &n c&lti%o p&ro de &na especie bacteriana dada>

Sin d&da la tcnica m:s com-nmente &sada es la de estra cr&+ada= empleada para lograr &n c&lti%o p&ro= mtodo llamado tambin sembrado en estra> !l material ;&e se recomienda para la siembra es &n alambre de nicromo o platino en forma recta en forma de asa= &n e<tremo del alambre se inserta a &n mango cilndrico para facilitar s& mane$o> !sta tcnica incl&.e la diseminacin de &na a+ada de material microorganismos sobre la s&perficie de &n medio de agar ;&e se ,a solidificado> con los

!l propsito de esta tcnica es dil&ir el inoc&lo sobre la s&perficie del agar como para poder obtener colonias bacterianas bien aisladas a partir de Unidades Formadoras de Colonias 8UFC@> Las colonias aisladas se p&eden l&ego s&bc&lti%ar indi%id&almente transfirindolas a otros medios a fin de obtener c&lti%os p&ros ;&e p&eden ser est&diados> M&c,as especies bacterianas son tan parecidas morfolgicamente ;&e es imposible diferenciarlas solo con el &so de microscopioK en este caso= para identificar cada tipo de bacteria= se est&dian s&s caractersticas bio;&micas sembr:ndolas en medios de c&lti%o especiales> !n alg&nos medios se aEaden indicadores de p9 ;&e cambian de color c&ando &no de los n&trientes del medio es fermentado . se generan catablicos :cidos> Si las bacterias son capaces de prod&cir fermentacin= generan gases ;&e p&eden ser apreciados c&ando el c&lti%o se reali+a en &n t&bo cerrado>

Material.
Franela MasDing tape Marcador indeleble !ncendedor Asa bacteriolgica de ' en '55 9isopos estriles Abate leng&as #&antes #asas Cepas bacterianas

Procedi'iento
Aislamiento de &n c&lti%o bacteriano en placa por el Mtodo de estra cr&+ada '@ Desinfectar perfectamente el :rea de traba$o con el desinfectante ;&e se &tili+a r&tinariamente . en seg&ida prenda el mec,ero . espere ente /G2 min&tos para traba$ar dentro del :rea de seg&ridad ;&e proporciona la flama del mec,ero 8no ma.or de /5 cm de di:metro@> )@ "eali+ar el traba$o sentado= cerca del mec,ero= esterili+ar el asa por mtodo de flameo correspondiente ,asta lle%ar al ro$o %i%o>

/@ !nfriar el asa contando de )5 o /5 seg&ndos o bien en &no de los e<tremos de la placa de agar ;&e podr: ser%ir como p&nto inicial c&ando se desarrolle la tcnica de estra cr&+ada en cada &no de los e<tremos de la placa> 1@ Desp&s tomar &na a+ada de la m&estra 8c&lti%o bacteriano en ca$a de *etri= en t&bo de ensa.e= c&lti%o bacteriano mi<to en caldo o m&estra biolgica@>

2@ A contin&acin tomar con la mano i+;&ierda la ca$a de *etri si es diestro= o con la derec,a si es s&rdo= de manera ;&e la base de la ca$a repose sobre la palma de la mano . la tapa p&eda manip&larse ,acia arriba . ,acia aba$o con el dedo p&lgar . el dedo medio> 3@ Le%antar la c&bierta de la ca$a de *etri . colocar en la s&perficie del agar el inoc&lo de lado a lado= tra+ando 2 lneas paralelas contin&as como se m&estra en la fig&ra '> 0@ Ba$ar la c&bierta de la ca$a . flamear el asa de inoc&lar> (@ 9acer girar la ca$a de *etri &n c&arto de %&elta= le%antar la c&bierta . enfriar el asa de inoc&lar n&e%amente contando de )5 a /5 seg&ndos o bien tocando el agar del medio de c&lti%o le$os del con$&nto de estras recin ,ec,as> 4@ "eali+ar 2 lneas paralelas contin&as de lado a lado tocando la s&perficie del con$&nto original de estras con el asa de inoc&lar= formado de esta manera el seg&ndo con$&nto de estras 8%er fig&ra )@>

'5@ Ba$ar la tapa de la ca$a . repetir los pasos 3= 0=( . 4@= formando el tercer 8%er fig&ra /@> ''@ 7&e%amente ba$ar la tapar . repetir los pasos del 3 al '5= solamente ;&e para formar el c&arto gr&pos de estras estas ser:n m:s amplias . abiertas sin tocar ning-n gr&po de estras ;&e .a est:n ,ec,as= %er fig&ra 1> ')@ Finalmente flamear el asa de inoc&lar> '/@ Colocar las ca$as de *etri boca aba$o . eti;&telas con s& nombre= gr&po . e;&ipo> '1@ Inc&bar las ca$as de *etri a /0 C d&rante )1 G 1( ,oras en la est&fa bacteriolgica> '2@ ome fotografas frente al mec,ero para %er el estriado reali+ado res&ltados> . ane<ar a s&s
5

TJcnica de estr-a 'asi/a Con el asa pre%iamente esterili+ada= tomar &na a+ada de &na m&estra . tra+ar &na cr&+ en la ca$a con el medio de c&lti%o a &tili+ar= posteriormente esterili+ar el asa . estriar en toda la ca$a proc&rando ;&e las estras sean lo m:s cercanas &na de otra en toda la ca$a>8este mtodo se p&ede reali+ar con asa o con ,isopo@= como se m&estra en la sig&iente fig&ra:

TLCNICA DE "O! C#ATRO C#ADRANTE!:

'> Se di%ide la placa en c&atro c&adrantes> )> Se toma el inc&lo . se siembra consec&ti%amente en 'G)G/G1>Inc&bar> /> !n el c&arto c&adrante= al menos= obtendramos colonias aisladas>

!IEMBRA POR AGOTAMIENTO )O EN !#PER3ICIE,

Se realiza una descarga y se realiza estra por toda la placa.

SIE2B " P" "

Tcnica de Barry

EC4ENT!$

!n &na placa de *etri %aca se deposita &n pe;&eEo %ol&men conocido de m&estra . a contin&acin se aEade el medio de c&lti%o 8agar n&triti%o@ f&ndido . atemperado apro<imadamente a 12VC> Se me+clan ambos por rotacin s&a%e de la placa> De esta forma los microorganismos se distrib&ir:n de forma ,omognea en el medio de c&lti%o= permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar>

De inoculo a dilucin conocida & con asa de D&$rasMi )Barr& 'odiBicada,:

Depositar sobre la s&perficie de &na placa con agar n&triti%o &na gota 5=' ml de &na determinada dil&cin del c&lti%o de microorganismos problema . e<tenderlo con a.&da del ca.ado= pre%iamente esterili+ado= en todas las direcciones ,asta ;&e est completamente seco> Inc&bar la placa= en posicin in%ertida= a la temperat&ra deseada 8d&rante )1= 1( 0) ,oras@ seg-n el tipo de microorganismo> La posicin in%ertida e%itar: ;&e el ag&a de condensacin se deposite sobre la s&perficie del medio= dific&ltando la obtencin de colonias aisladas> !s &na tcnica &sada para el aislamiento de colonias= ;&e permite ig&almente el rec&ento de bacterias %iables en la m&estra= si conocemos e<actamente la dil&cin>

Diferencia entre aislar y extender

Ruta de tra%a.o:
"epresentar con dib&$os o tomar fotografas del procedimiento reali+ado> Ane<arlo a t&s res&ltados

RE!#"TADO!. DI!C#!I9N. CONC"#!I9N. BIB"IOGRA3GA.

)Practica No. N,
!E"ECCI9N DE CO"ONIA! < MOR3O"OGGA CO"ONIA" DE MICROORGANI!MO!

O%.eti/o $eneral

A&e el est&diante aprenda a seleccionar . describir la morfologa colonial bacteriana>>

O%.eti/os espec-Bicos.
'>G )>G />G

Introduccin.
Una de las caractersticas principales de las bacterias es s& apariencia 8caractersticas de s& desarrollo@ seg&ida del crecimiento en los diferentes medios de c&lti%o> Los microorganismos ;&e crecen sobre la s&perficie solida= tienden a formar agr&paciones ;&e se denominan colonias= las colonias s&elen ser de caractersticas constantes para el medio de c&lti%o &sado= la temperat&ra de inc&bacin . el microorganismo del ;&e se trate= por lo ;&e s& est&dio es de gran &tilidad tanto en la clasificacin como en la identificacin> Una colonia microbiana est: constit&ida por indi%id&os de la misma especie pro%enientes de &na cl&la . de &n gr&po de ellas= llamadas Unidades Formadoras de Colonias 8UFC@> Las colonias aisladas se p&eden s&bc&lti%ar indi%id&almente transfirindolas a otros medios de c&lti%o a fin de obtener c&lti%os p&ros . p&eden ser est&diadas en medios diferenciales> T la e%al&acin de las caractersticas macroscpicas de las colonias se lle%a a cabo &s&almente mediante el e<amen %is&al del desarrollo en la s&perficie de las placas de agar> La inspeccin de los c&lti%os se lle%a a cabo sosteniendo la placa con &na mano . obser%ando la s&perficie del agar para comprobar la presencia del desarrollo bacteriano> Las placas de c&lti%o com&nes tienen '55 mm de di:metro . son adec&adas . p&eden sostenerse en &na mano> Se debe est&diar con c&idado a cada placa debido a ;&e las bacterias aisladas inicialmente a partir de la m&estra= constit&.en a men&do c&lti%os mi<tos . p&eden ,aber &na gran %ariedad de tipos de colonias> La e%al&acin macroscpica de las colonias se lle%a acabo &s&almente mediante el e<amen %is&al del desarrollo en la s&perficie de las placas de agar>

Los t&bos ;&e contienen los medios primarios no se &tili+an com-nmente para e%al&ar la morfologa colonial pero &na e<cepcin a esto es el t&bo rotatorio con estra &tili+ado por el laboratorio= este sistema sir%e para el est&dio de anaerobios .a ;&e la e%al&acin de la morfologa de las colonias se p&ede efect&ar directamente a tra%s del %idrio de los t&bos sin e<poner los organismos al aire d&rante el e<amen> La interpretacin de c&lti%os primarios es &na ,abilidad ;&e se debe ad;&irir traba$ando con &n microbilogo= bien capacitado . generalmente se logra dominar solo l&ego de m&c,os aEos de e<periencia= la inspeccin de los c&lti%os se lle%a acabo sosteniendo la placa con &na mano . obser%ando la s&perficie de agar p&ro comprobar el desarrollo bacteriano> Las caractersticas consideradas para la descripcin de la morfologa colonial de las bacterias se describen a contin&acin:

TJr'inos utili(ados en la caracteri(acin colonial Tamao: Dimetro en mm. Forma: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, fusiforme. Elevacin: Plana, elevada, conve a, !ulvinada, em"onada, um"ilicada. Borde o Margen: #ntero, ondulado, lo"ulado, erosionado o lacerado, filamentoso, rizado. Color: $lanco, amarillo, negro, marr%n, anaran&ado, "eige, otros. Superficie: 'isa, rugosa o granular, "rillante, o!aca. Densidad: (!aca, translucida, trans!arente, etc. Consistencia: Suave: $utirosa )mante*uillosa, grasosa), mucoide o mem"ranosa, Dura: +ue"radiza o fria"le )*ue se rom!e con facilidad), seca NOT : Esta caracterstica se determina tocando la colonia con el asa de siembra o aguja de inocular por lo tanto debe ser la ltima en describirse. !u" refle#ada: $rillante o mate )*ue no "rilla). !u" transmitida: ,ranslucida ),rans!arente) u o!aca.

Material.
Bata #&antes C&bre bocas Asa bacteriolgica Mec,ero Cinta testigo

Tra%a.o a desarrollar:
!<aminar los diferentes c&lti%os proporcionados= &tili+ando los diagramas ;&e acompaEan a esta pr:ctica= seleccionar las colonias adec&adas de preferencia las ;&e se enc&entran aisladas . distrib&idas en el c&arto gr&po de estras . describir las caractersticas coloniales correspondientes de cada c&lti%o bacteriano>

Morfologa colonial:
Describir las colonias aisladas en cada medio de c&lti%o= indicando las caractersticas de la morfologa colonial antes descritas>

!n s& c&aderno de reportes de laboratorio= en la seccin de res&ltados ,acer . llenar la tabla ;&e m&estra a contin&acin:
CARACTERI!TICA!
MICROORGANISMO MEDIO DE CULTIVO TAMAO (mm) FORMA ELEVACION BORDE O MARGEN DENSIDAD COLOR SUPERFICIE ASPECTO LUZ REFLEJADA LUZ TRANSMITIDA CONSISTENCIA

CO"ONIA +

CO"ONIA 1

CO"ONIA 2

Si identifican otras caractersticas diferentes a las ;&e se mencionaron antes= anotarlas en la tabla>

I7DICACIO7!S:
La inspeccin de c&lti%os se lle%a a cabo sosteniendo la placa con &na mano . obser%ando la s&perficie del agar para comprobar la presencia del desarrollo bacteriano> Se deben est&diar con c&idado cada &na de las placas= debido a ;&e las bacterias aisladas inicialmente a partir de m&estras= constit&.en a men&do c&lti%os mi<tos . p&ede ,aber &na %ariedad de diferentes tipos de colonias> Las colonias p&ntiformes p&eden pasar inad%ertidas entre las de ma.or tamaEo> Se debe inclinar la placa en distintas direcciones con il&minacin brillante directa> Se p&eden a.&dar con &na l&pa de mano de gran a&mento= para detectar colonias pe;&eEas= el asa de siembra . la ag&$a de inoc&lacin nos a.&da a conocer la consistencia de las colonias> Siempre reporte el medio de c&lti%o . el tiempo de inc&bacin>

Ruta de tra%a.o. Resultados.0 Dib&$ar la morfologa colonial del crecimiento bacteriano en los sig&ientes medios:
1.&E2B

5.&Sal y 2anitol

Discusin. Conclusin. Bi%lio$raBias

)PRACTICA No. O,
CARACTERI!TICA! DE CRECIMIENTO DE C#"TI O DE MICROORGANI!MO! EN T#BO

OBJETI O!:
A&e el est&diante se familiarice con las tcnicas f&ndamentales empleadas en el c&lti%o de microorganismos en t&bo> !l est&diante aprender: a describir las caractersticas de la morfologa macroscpica de crecimiento en t&bo con medios l;&idos= slidos . semislidos.

INTROD#CCION: *ara determinar las caractersticas de desarrollo de &n c&lti%o p&ro en t&bo= es cost&mbre obser%ar los sig&ientes aspectos del c&lti%o: desarrollo en agar en t&bo inclinado= desarrollo en caldo . desarrollo en gelatina> Las tcnicas para ,acer crecer bacterias en &n c&lti%o p&ro f&eron desarrolladas por "obert Uoc,= mtodos ;&e son esencialmente &tili+ados en la misma manera en la act&alidad> !l propsito de esta tcnicas= es dil&ir el inoc&lo lo s&ficiente en el caldo o en la s&perficie del agar para obtener crecimiento bacteriano> Los medios de c&lti%o se p&eden distrib&ir en t&bos= .a sea como caldo o en forma de agar> !l agar p&ede ser semislido o solido= generalmente formando &n plano inclinado> Desp&s de la siembra del medio de c&lti%o . desp&s de la inc&bacin= se p&eden determinar las caractersticas de c&lti%o del microorganismo> !n los es;&emas de interpretacin del aspecto del desarrollo bacteriano describe el ,ec,o de ;&e se presentan m&c,as diferencias entre las bacterias en relacin a s& aspecto microscpico= adem:s sir%e de g&a para identificar los gr&pos principales de bacterias>

MA !"IAL:
Di%ersos ,oras> c&lti%os bacterianos con crecimiento masi%o en placa de )1

&bos de ensa.e de '/ < '55 mm con / ml de caldo n&triti%o &bos de ensa.e de '/ < '55 mm con / ml con gelatina n&triti%a &bos de ensa.e de '/ < '55 mm con / ml de agar n&triti%o inclinado Mec,eros Asa bacteriolgica recta . de inoc&lacin #radilla Una l&pa de mano 8traer para desp&s de la lect&ra@

PROCEDIMIENTO: +, Creci'iento en 'edios l-5uidos a> !ncender el mec,ero . colocar en &na gradilla todos los t&bos de ensa.e ;&e contengan los medios de c&lti%o a &tili+ar en &na posicin adec&ada en la ;&e se p&edan alcan+ar sin ning&na dific&ltad . sin peligro de ;&emarse> b> c> omar con &na mano la ca$a con c&lti%o bacteriano> omar el asa de inoc&lar con la otra mano . flamear por completo ,asta ;&e se ponga al ro$o %i%o . enseg&ida enfriar contando de )5 a /5 seg&ndos . tomar &na a+ada del c&lti%o>

d> A&itar el tapn al t&bo de ensa.e= tom:ndolo con los dedos libres de la mano ;&e s&$eta el asa= tener c&idado de no acercar demasiado los tapones al mec,ero> e> Flamear el borde de los t&bos= introd&cir la p&nta del asa e insertar el inoc&lo dentro del medio de c&lti%o estril= s&mergiendo el contenido del asa dentro del caldo>8B!" FI#U"A '@> f> "etirar el asa del caldo n&triti%o> g> Flamear de n&e%o el borde de los t&bos . colocar n&e%amente los tapones a s&s respecti%os t&bos de ensa.e= flamear el asa de inoc&lar ,asta ;&e se ponga al ro$o %i%o . desp&s retirar> ,> Marcar los t&bos= colocando el nombre del medio ;&e &tili+o= fec,a= s& nombre= gr&po= e;&ipo . n&mero de la mesa donde traba$o> i> Inc&bar los t&bos a /0 C d&rante )1 P 1( ,oras> $> *osteriormente en la sig&iente sesin de laboratorio re%isar los t&bos . anotar s&s res&ltados>
5

FI#U"A ' 1, Creci'iento en tu%o con a$ar inclinado )estr-a 6nica a%ierta so%re la superBicie del 'edio,. a> !fect&ar los pasos aspticos preliminares de flameado . remocin de

tapones como se describi en el inciso anterior> b> Flamear el asa de inoc&lar= de$ar enfriar . tomar &n inoc&lo del c&lti%o bacteriano ;&e se enc&entra en la placa de *etri> c> Introd&cir el asa sobre la s&perficie del agar inclinado= ,asta el fondo del t&bo de ensa.e> d> Desli+ar el asa sobre la s&perficie del agar inclinado de lado a lado ,aciendo &na estra abierta -nica e ir retirando el asa poco a poco del interior del t&bo= sin romper la s&perficie del agar>8 ER 3IG#RA 1@ e> Flamear los bordes de los t&bos antes . desp&s de la inoc&lacin . taparlos> f> !ti;&etar los t&bos= como se describi en el inciso anterior> g> Inc&bar a /0 C= de )1 a 1( ,oras> ,> "e%isar el crecimiento en la sesin pr<ima de laboratorio . reportar lo obser%ado>
5

3IG#RA 1

2, Creci'iento en tu%o con a$ar inclinado )sie'%ra por picadura & estr-a, a> !<aminar la placa con c&lti%o p&ro . escoger &na colonia aislada= marcar s& posicin con &n crc&lo por el lado e<terior de la ca$a> b> Flamear la ag&$a de siembra ,asta ;&e se ponga al ro$o %i%o . enfri> c> Le%antar la parte s&perior de la ca$a de *etri para tomar la porcin del c&lti%o bacteriano seleccionado> d> Desp&s de ,aber obtenido el inoc&lo= ;&itar el tapn= flamear el borde del t&bo e introd&cir la ag&$a de inoc&lacin en el agar inclinado por picad&ra= c&idando ;&e el tra.ecto de entrada sea el mismo ;&e el de la salida= ,asta &na prof&ndidad de ) a / mm del fondo del t&bo sin tocar el %idrio> e> Sin sacar la ag&$a de siembra= desli+ar c&idadosamente sobre la s&perficie inclinada del agar ,aciendo &na estra abierta -nica= es decir el t&bo de agar inclinado presentara la siembra por picad&ra . estra>8 ER 3IG#RA 2@> f> Finalmente %ol%er a flamear el borde del t&bo . flamear la ag&$a de siembra ,asta el ro$o %i%o>

g> !ti;&etar el t&bo con los datos necesarios . ;&e se mencionaron en los incisos anteriores> ,> Inc&bar a /0 C= de )1 a 1( ,oras i> Desp&s de la inc&bacin 8sesin pr<ima de laboratorio@ reportar lo obser%ado>
5

3IG#RA 2 H, !ie'%ra en $elatina )sie'%re por picadura, a> !fect&ar los pasos aspticos preliminares de flameado . remocin de tapones como se describi en el inciso anterior> b> Flamear la ag&$a de siembra . tomar &n inoc&lo de &n c&lti%o de microorganismo>
c>

Introd&+ca la ag&$a de siembra en el medio de gelatina por picad&ra= c&idando ;&e el tra.ecto de entrada sea el mismo ;&e el de la salida= ,asta &na prof&ndidad de ) a / mm sin tocar el %idrio del fondo del t&bo>8 ER 3IG#RA H@>

d> "etirar la ag&$a de inoc&lacin> e> Flamear el borde de los t&bos de ensa.e . taparlos> f> Flamear otra %e+ la ag&$a de siembra . eti;&etar los t&bos con los datos necesarios> g> Inc&bar los t&bos inoc&lados a /0 C d&rante )1 P 1( ,oras> ,> Desp&s de la inc&bacin reporte lo ;&e obser%o>
5

FI#U"A 1

NOTA: L-( T#!-( C-6 G0LAT56A, A6T0( 30 L002(0, (0 C-L-CA6 06 AG#A 30 =50L3#2A6T0 > - 10 M56#T-( 7A2A -!(024A2 LA 20ACC5-6.

IN!TR#CCIONE!: Cada est&diante 3 t&bos conteniendo= medio de c&lti%o en caldo= medio de c&lti%o de agar inclinado . agar gelatina: Obser%e la fig&ra:

*A"A LA I7 !"*"! ACIO7 D! SUS "!SUL ADOS U ILI6A !L SI#UI!7 ! MA !"IAL: 1. Caracter6sticas de creci/iento de /icroorganis/os en tu7o con /edio de cultivo en caldo$ ". Cantidad$ 0scaso Moderado Abundante B. 8istri7ucin del desarrollo en caldo$ a. *o/og9neo$ uni$or"e"ente distribuido. b. :loculante? $or"aci,n de cogulos o coalescencia de partculas $ina"ente di/ididas, puede ser esca"osa o lanosa en el "edio de culti/o en caldo. c. :or/acin de (el6cula? 3esarrollo con$inado en la super$icie del caldo. d. :or/acin de anillo? :or"aci,n circular alrededor de una abertura. e. :or/acin de /e/7rana? :ina capa 1ue se desarrolla en la super$icie del caldo. '. Puede (resentarse$ Sedi/ento$ Desarrollo ;&e se ac&m&la en el fondo en el fondo ;&e p&ede ser gran&lar o %iscoso> Tur7io$ Falta de claridad 8neb&losa@ Sin creci/iento$ 7o ,a. cambios= el medio permanece ig&al como se

inoc&lo inicialmente>

C. !lor$ 7@trido, a $rutas, i"perceptible &sin olor', o bien sola"ente p@trido. 5. 8esarrollo del creci/iento en agar inclinado (or estr6a si/(le$ Cantidad$ escaso) /oderado o a7undante. Borde o /argen del desarrollo$ "r7orescente o ra/i'icado Perlado E3uinulado :ili'or/e o liso i;oide Es(arcido

Pig/entacin$ #as colonias (ueden estar coloreadas o sin color. Consistencia$ a> Suave$ B&tirosa 8mante;&illosa@= m&coide o membranosa> 7. 8ura$ A&ebradi+a o friable 8;&e se rompe con facilidad@= esta caracterstica se determina tocando la colonia con el asa de siembra o con &na ag&$a de inoc&lar= por lo tanto debe ser la -ltima en describirse> 3. 8esarrollo del creci/iento en agar inclinado (or (icadura$ A. 0l desarrollo puede ser li"itado a la lnea de picadura. !. 0l desarrollo puede haberse eApandido "as all de la %ona de picadura, por lo tanto pueden presentarse las siguientes caractersticas? Filiforme *erlado papilar Bellosa Arborescente

FILIFO"M!

#"A7ULOSA *A*ILIFO"M! A"BO"!SC!7 ! O *!"LADO

B!LLOSA

4. 8esarrollo del creci/iento en agar gelatina en tu7o$ 8igestin de la gelatina<$ NE="TI>" 8Sin lic&efaccin@> !l medio de c&lti%o permanece semislido= sin cambio= ig&al como se inoc&lo> 8igestin de la gelatina$ P!SITI>" +Con lic&efaccin.) cambia de &n estado semislido a &na forma l;&ida>8B!" FI#U"A AB@

3IG#RA AB

INDICACIONE! < OB!ER ACIONE!:8toma de fotografas= ane<arlas a los dib&$os reali+ados de s&s obser%aciones> a> Obser%ar . anotar el tipo de desarrollo en caldo n&triti%o= se p&eden destapar los t&bos . ,acer llegar aire con la mano para detectar el olor> b> ener c&idado de no sac&dir los c&lti%os en caldo .a ;&e esto p&ede cambiar los crecimientos s&perficiales> c> Obser%ar . anotar las caractersticas del c&lti%o en agar inclinado primero por estra . l&ego por picad&ra . estra> d> Obser%ar . anotar res&ltados en cada &no de los t&bos 8caldo= gelatina . agar inclinado@> e> Llenar con lo ;&e se pide en la sig&iente tabla . an<ela a s&s res&ltados: Descripcin de c&lti%o en t&bo con caldo C" "CTE ISTIC"S -antidad Distri"uci%n del desarrollo (lor CARACTERISTICA S DEL ESTRIAD -antidad $orde o margen Pigmentaci%n -onsistencia RESULTADO ES4#T"8!

Descripcin de cultivo en tu$o con agar inclinado%estr&a 'nica( o %picadura ) estr&a( CARACTERISTI CAS .e o"serva *ue esta limitado MEDIANTE
a la zona de la .e o"serva el!icadura crecimiento mas all de la zona de la !icadura /orma *ue !resenta la l0nea de la !icadura

RESULTADO

Descripcin de cultivo con gelatina mediante picadura

CARACTERISTI CAS forma li*uida Digesti%n de la gelatina con licuefacci%n, Digesti%n de la gelatina, sin licuefacci%n, el medio !ermanece igual, sin cam"io )semis%lido) RESULTADO

R#TA DE TRABAJO RE!#"TADO! CONC"#!IONE! BIB"IOGRA3IA C#E!TIONARIO!

)PRACTICA No. +@,

PREPARACI9N DE 3ROTI! OBJETI O GENERA" : A&e el est&diante aprenda a reali+ar frotis de bacterias . a disting&ir las bacterias #ram> *ositi%as de las #ram> negati%as= &tili+ando la tcnica adec&ad apara cada tipo de bacteria ;&e se desea obser%ar>> '> )>G />G

I7 "ODUCCIW7
La tcnica de coloracin de #ram es de gran &tilidad en Bacteriologa= .a ;&e permite diferenciar las bacterias en #ram *ositi%as . #ram 7egati%as> Casi la mitad de las bacterias= son #ram positi%as . el resto #ram negati%as> Dado ;&e por lo general las bacterias no tienen pigmentos . son incoloras en estado nat&ral en s& forma real> Alg&nos in%estigadores como "obert Uoc,= *a&l !rlic, . otros %encieron esta dific&ltad &sando mtodos de fi$acin 8preparacin de frotis@ . tincin de bacterias .a ;&e es necesario teEirlas para poder obser%ar s& morfologa as como tambin poner de manifiesto alg&nas caractersticas de s& estr&ct&ra> Los mtodos de tincin p&eden ser simples o diferenciales> a@ inciones Simples: son a;&ellas en las ;&e solo se &tili+a &n colorante .a ;&e m&c,as bacterias tienen material :cido 8"7A o D7A@ distrib&ido en s& cl&la= por lo ;&e se colorea intensamente con colorantes b:sicos estos son colorantes n&cleares e$emplo: f&csina b:sica= cristal %ioleta= a+&l de metileno entre otras> b@ Las tinciones diferenciales son a;&ellas en las ;&e se &tili+an dos o m:s colorantes ;&e ponen de manifiesto alg&na8s@ estr&ct&ra 8s@ o &n tipo de cl&las se tiEen de &n color . el resto de otro> !l mtodo de tincin m:s &tili+ado es el de la tincin del #ram>= .a ;&e es la coloracin m:s importante para bacterias f&e ideada por 9ans Cristian #ram en '((1= permiti disting&ir entre %arias especies de bacterias ;&e p&eden presentar morfologa colonial similar> C&ando las bacterias retienen la combinacin cristal %ioletaGiodo . se tiEe de %ioleta= son bacterias gram 8R@= las bacterias ;&e se tiEan de ro$o por la safranina son gram negati%as> Las cl&las bacterianas gram 8R@ se les ad,iere el cristal %ioleta= por;&e ,a. dismin&cin de la permeabilidad de la pared cel&lar ca&sada por el efecto des,idratante del alco,ol= mientras ;&e las gram 8G@ el comple$o sale por el a&mento de la permeabilidad ca&sada por la sol&bilidad de los lpidos de la pared cel&lar al alco,ol> !<isten tambin bacterias gram %ariables 87eisseria spp@ . bacterias gram no reacti%a

MA !"IAL!S > C&lti%os de: !sc,eric,ia coli= Stap,.lococc&s epidermidis= . a&re&s A+&l de metileno Cristal %ioleta 5>'X en sol&cin ac&osa Todo l&gol Alco,olGcetona 8':'@ Safranina Aplicador estril 8s el instr&ctor lo cree necesario@> Ag&a destilada Aceite de inmersin *apel seda Asa bacteriolgica Marcador permanente Alco,ol . algodn para limpiar s& mesa #oteros . micro pipeta Mec,eros *ortaob$etos Microscopio comp&esto

PROCEDIMIENTO
a, Preparacin de un 3rotis a partir de un culti/o en 'edio solido. '> Limpiar con alco,ol o con acetona el portaob$etos donde se reali+ara el frotis= de$arlo secar . &na %e+ seco pasarlo por el mec,ero de ) a / %eces> )> !n &no de los e<tremos marcar con &n l:pi+ graso o con &n l:pi+ de p&nta de diamante los portaob$etos limpios donde se reali+aran los frotis> /> Con el asa bacteriolgica o con &n gotero= colocar &na gota m&. pe;&eEa de ag&a destilada en el centro del portaob$etos> 1> Calentar el asa de siembra en la flama del mec,ero ,asta ;&e se ponga al ro$o %i%o> 2> !nfriar contando ,asta )5 seg&ndos o bien en &no de los e<tremos de las ca$as en donde no ,a.a crecimiento> 3> Con a.&da del asa pre%iamente flameada= tomar &n pe;&eEo inoc&lo del c&lti%o bacteriano . distrib&ir de manera ,omognea sobre la gota de ag&a> 0> !<tender s&a%emente la s&spensin bacteriana para formar &na pelc&la m&. delgada girando el asa del centro a la periferia . posteriormente &na %e+ ;&e ,a.a terminado %ol%er a flamear el asa> (> De$ar secar la preparacin a temperat&ra ambiente> 4> Fi$ar la reparacin al calor= pasando el portaob$etos / %eces sobre la flama del mec,ero con la m&estra ,acia arriba= calentando la preparacin a &na temperat&ra ;&e sea soportable en el dorso de la mano> '5> Utilice las pin+as de diseccin para sostener el portaob$etos> ''> De$ar enfriar la preparacin antes de reali+ar la tincin correspondiente> b@ Ela%oracin de un Brotis de un culti/o en 'edio li5uido> !n &n portaob$etos limpio . desengrasado marcar en &no de los e<tremos con &n l:pi+ graso o l:pi+ con p&nta de diamante el l&gar donde s reali+ara el frotis> Calentar el asa de siembra en la flama del mec,ero ,asta ;&e se ponga al ro$o %i%o>

!nfriar el asa contando ,asta )5 o /5 seg&ndos> SI7 COLOCA" A#UA= tomar con el asa estril &na alc&ota del c&lti%o . colocar de ' a / gotas en el centro del portaob$etos> !<tender la s&spensin bacteriana para formar &niformemente &na pelc&la delgada= ,aciendo girar el asa del centro a la periferia= . %ol%er a flamear el asa al terminar> De$ar secar la preparacin a temperat&ra ambiente> Fi$ar la reparacin al calor= pasando el portaob$etos / %eces sobre la flama del mec,ero con la m&estra ,acia arriba= calentando la preparacin a &na temperat&ra ;&e sea soportable en el dorso de la mano> Utilice las pin+as de diseccin para sostener el portaob$etos> De$ar enfriar la preparacin antes de reali+ar la tincin correspondiente>

7O A: LOS F"O

IS D! CUL IBOS LIAUIDOS AMBI!7 S! *U!D!7 FISA" CO7 M! A7OL O ALCO9OL ABSOLU O> CUA7DO S! "!ALI6! !S ! *"OC!DIMI!7 O LOS M!C9!"OS D!B!"A7 !S A" A*A#ADOS>

R#TA DE TRABAJO RE!#"TADO! DI!C#!ION CONC"#!ION BIB"IOGRA3IA

)PRACTICA No. ++,

TINCI9N DE GRAM.

O%.eti/o $eneral:
A&e el est&diante aprenda a disting&ir las bacterias #ram> *ositi%as de las #ram> negati%as= &tili+ando la tcnica de #ram>

O%.eti/os particulares:
'>G )>G />G

Introduccin
La tcnica de coloracin de #ram es de gran &tilidad en Bacteriologa= .a ;&e permite diferenciar las bacterias en #ram *ositi%as . #ram 7egati%as> Casi la mitad de las bacterias= son #ram positi%as . el resto #ram negati%as> !l mtodo f&e desc&bierto por C,ristian #ram 8Dans@= en '((1= ;&ien obser% ;&e en cortes ,istolgicos ;&e contenan bacterias coloreadas con %ioleta de genciana . tratadas con sol&cin ac&osa de .odo= este colorante podra ser remo%ido del corte ,istolgico con el empleo de alco,ol= pero no de las bacterias> *osteriormente desc&bri ;&e no todas las bacterias retenan al %ioleta de genciana sino ;&e alg&nas eran decoloradas por accin del alco,ol> A las primeras las llam Gra' positi/as . a las seg&ndas Gra' ne$ati/as. !stas ;&e ;&edan incoloras son teEidas l&ego mediante el empleo de &n colorante de contraste como la safranina= para ,acer posible s& obser%acin> !<isten m&c,as modificaciones de esta coloracin= pero f&ndamentalmente es lo mismo>

Material:
Tincin GRAM Tinte Pri'ario: Cristal %ioleta= tiEe la bacteria de color %ioleta A$ente Mordiente: L&gol= forma &n comple$o insol&ble con cristal %ioleta> A.&da a ad,erir el tiente a la cl&la> A.&da a resistir la decoloracin>

 A$ente Decolori(ante: Alco,ol acetona o alco,ol= el c&al sir%e como sol%ente de lpidos . agente des,idratante de protenas> Contratinte: Safranina ;&e tiEe de ro$o a la bacteria> T9cnica de = "2 Preparacin del Brotis. Cristal /ioleta )2@ se$undos0+ 'inuto, "a/ar con a$ua. "u$ol )+ 'inuto,. "a/ar con a$ua. Alco4ol et-lico al O?P sua/e'ente. "a/ar con a$ua. !aBranina )H? se$undos,. "a/ar con a$ua. !ecar & o%ser/ar al 'icroscopio R#TA DE TRABAJO: RE!#"TADO!:

Dib&$ar la morfologa microscpica de los microorganismos desarrollados en los sig&ientes medios de c&lti%o
Medio De Sal T Manitol Medio de !MB

DI!C#!I9N: CONC"#!I9N: BIB"IOGRA3GA: C#E!TIONARIO

)PRACTICA No. +1,

TINCI9N DE :IE;"0NEE"!EN

O%.eti/o General:
Obser%ar la morfologa . la capacidad de tincin de las bacterias acido alco,ol resistente &tili+ando la tcnica de 6ie,l 7eelsen>

O%.eti/os Particulares:
'>G )>G />G

Introduccin
La tincin de 6ie,l 7eelsen 8BAA"@ es &na tcnica en ;&e la paredes cel&lares de ciertos= es &na tcnica de tincin diferencial r:pido . econmico= ;&e se basa en ;&e las paredes cel&lares de ciertas bacterias contienen :cidos grasos> *or eso se denomina bacilos acidoGalco,ol resistente o BAA"> Las micobacterias>la coloracin cl:sica de 6ie,l 7eelsen re;&iere calentamiento para el colorante atra%iese la pared bacteriana ;&e contiene ceras> La tincin f&e descrita por primera %e+ por dos mdicos &n bacterilogo . Friedric, 7eelsen &n patlogo> Alemanes Fran+ 6ie,l

Al obser%ar la preparacin al microscopio= los organismos acidoGalco,ol resistentes aparecen teEidas de ro$o mientras ;&e el resto de las bacterias aparecen de color a+&l> Las especies del genero M.cobacteri&m= 7ocadias . alg&nos Acitnomicetos= retienen las coloraciones a&n desp&s de los procesos de decoloracin con :cidos= o con sol&ciones de acidoGalco,ol= acidoGacetona= por lo ;&e son M>O denominados acidoGresistentes> Dic,o caracteres es atrib&ido a &n componente lpido 8acido micolitico@ en las especies bacterianas de las especies del genero M.cobacteri&m=en los casos de los Criptosporidi&m . de las endosporas se atrib&.e a factores de impermeabilidad> Los componentes . factores mencionados ,acen m:s difcil la penetracin del colorante en la cl&la microbiana= por lo ;&e los procederes para estos colorantes necesitan de la a.&da del calor= de sol%entes org:nicos o de detergentes>

!ntre los mtodos de coloracin para demostrar la acidoGresistencia se enc&entra este mtodo>

Material:
C&lti%os bacterianos mi<tos de )1 ,oras de inc&bacin 8!n ca$as de *etri@> Microscopios Aceite de inmersin *apel seda para oc&lares *&ente para tincin 8Micro@ *i+eta con ag&a destilada Asa bacteriolgica Mec,ero

Reacti/os:
F&csina fenicada o b:sica 8de Uin.o&n@ A+&l de Metileno Alco,ol acido

Material tra-do por el alu'no o e5uipo

*in+as para diseccin Alco,ol Lapi+ graso o l:pi+ con p&nta de diamante Colores Asa bacteriolgica indi%id&al Cerillos ' pa;&ete de algodn c,ico ' pa;&ete de gasas para c&racin *ortaob$etos

Desarrollo:
'> Se toma la m&estra . se ,ace el frotis en el portaob$etos e<tendindolo de forma giratoria> 8"eali+ar ) frotis= &no de cada colonia@> )> Se fi$a la m&estra pas:ndolo el portaob$etos / %eces por la llama del mec,ero= a &na temperat&ra adec&ada> 1> Con &nas pin+as se toma el porta ob$eto . se coloca sobre el p&ente o gradilla de tincin>

1> Se c&bre la preparacin con &na sol&cin de 3#C!INA 3ENICADA O 3#C!INA BA!ICA D#RANTE ? MIN#TO! A EMI!ION DE APORE!. 2> Calentar s&a%emente el portaob$etos con la flama del mec,ero o bien pase la flama &tili+ando &n rollo de algodn ,&medecido con alco,ol . sostenido con &nas pin+as de diseccin> 9asta ;&e empiece a desprender %apores> 3> Mantener la emisin de %apores d&rante 2 min&tos= tenga c&idado de ;&e el colorante de la preparacin no se se;&e ni ,ier%a= si es necesario agreg&e mas colorante> 0> Desp&s de este proceso de$e enfriar el portaob$etos= esc&rra el colorante . la%e con &n c,orro s&a%e de ag&a> (> Colocar &nas gotas de A"CO;O"0ACIDO como sol&cin decolorante . de$arlo sobre el porta ob$etos por /5 a 35 seg&ndos= ,asta ;&e no se obser%e m:s colorante . la preparacin tome &n color rosa claro> 4> La%ar con ag&a s&a%emente para detener la decoloracin> '5>Agregar a la preparacin A:#" DE METI"ENO d&rante &n min&to> ''>La%ar con ag&a el e<ceso de colorante> ')>De$ar secar la al aire en forma %ertical '/>!<aminar al microscopio con el ob$eti%o de '55L= agregando antes a la preparacin &na gota de aceite de inmersin > '1> Anotar . dib&$ar lo ;&e se obser%e en la preparacin> >

Ruta de Tra%a.o: Resultados: Dib&$ar la morfologa microscpica de los microorganismos teEidos> Discusin Conclusin Bi%lio$raB-as:

)PRACTICA N* +2,
PREPARACI9N DE MEDIO! DE C#"TI O 8 M&eller 9inton= Agar sal . manitol>!osina . a+&l de metileno= Agar so.a tripticaseina= Agar Mac ConDe.= @

O%.eti/o General.0
Aprender a elaborar correctamente los medios de c&lti%o ;&e se %a a &tili+ar> en la siembra de m&estras biolgicas> O%.eti/os Particulares.0 '>G )>G />G

Introduccin
Uno de los sistemas m:s importantes para la identificacin de microorganismos es obser%ar s& crecimiento en s&stancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio> !l material alimenticio en el ;&e crecen los microorganismos es el Medio de C&lti%o . el crecimiento de los microorganismos es el C&lti%o> Se ,an preparado m:s de '5>555 medios de c&lti%o diferentes> *ara ;&e las bacterias cre+can adec&adamente en &n medio de c&lti%o artificial debe re&nir &na serie de condiciones como son: temperat&ra= grado de ,&medad . presin de o<geno adec&adas= as como &n grado correcto de acide+ o alcalinidad> Un medio de c&lti%o debe contener los n&trientes . factores de crecimiento necesarios . debe estar e<ento de todo microorganismo contaminante> La ma.ora de las bacterias patgenas re;&ieren n&trientes comple$os similares en composicin a los l;&idos org:nicos del c&erpo ,&mano> *or eso= la base de m&c,os medios de c&lti%o es &na inf&sin de e<tractos de carne . *eptona a la ;&e se aEadir:n otros ingredientes> n los diferentes medios de c&lti%o se enc&entran n&merosos materiales de enri;&ecimiento como ,idratos de carbono= s&ero= sangre completa= bilis= etc>

Los ,idratos de Carbono se adicionan por dos moti%os f&ndamentales: para incrementar el %alor n&triti%o del medio . para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos ;&e a.&den a identificarlos> !l s&ero . la sangre completa se aEaden para promo%er el crecimiento de los microorganismos menos resistentes> ambin se aEaden colorantes ;&e act-an como indicadores para detectar= por e$emplo= la formacin de :cido o como in,ibidores del crecimiento de &nas bacterias . no de otras 8el "o$o Fenol se &sa como indicador .a ;&e es ro$o en p9 b:sico . amarillo en p9 :cido> La Bioleta de #enciana se &sa como in,ibidor .a ;&e impide el crecimiento de la ma.ora de las bacterias #ramGpositi%as@> Condiciones generales "icroorganis"os para el culti/o de

!l desarrollo adec&ado de los microorganismos en &n medio de c&lti%o se %e afectado por &na serie de factores de gran importancia . ;&e= en alg&nos casos= son a$enos por completo al propio medio> +0 Disponi%ilidad de nutrientes adecuados Un medio de c&lti%o adec&ado para la in%estigacin microbiolgica ,a de contener= como mnimo= carbono= nitrgeno= a+&fre= fsforo . sales inorg:nicas> !n m&c,os casos ser:n necesarias ciertas %itaminas . otras s&stancias ind&ctoras del crecimiento> Siempre ,an de estar presentes las s&stancias adec&adas para e$ercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones ;&micas ;&e tengan l&gar> odas estas s&stancias se s&ministraban originalmente en forma de inf&siones de carne= e<tractos de carne o e<tractos de le%ad&ra> Sin embargo= la preparacin de estas s&stancias para s& aplicacin a los medios de c&lti%o pro%ocaba la prdida de los factores n&triti%os l:biles> Act&almente= la forma m:s e<tendida de aportar estas s&stancias a los medios es &tili+ar peptona ;&e= adem:s= representa &na f&ente f:cilmente ase;&ible de nitrgeno . carbn .a ;&e la ma.ora de los microorganismos= ;&e no s&elen &tili+ar directamente las protenas nat&rales= tienen capacidad de atacar los amino:cidos . otros comp&estos m:s simples de nitrgeno presentes en la peptona> Ciertas bacterias tienen necesidades n&triti%as especficas por lo ;&e se aEade a m&c,os medias s&stancias como s&ero= sangre= l;&ido asctico= etc> Ig&almente p&eden ser necesarios ciertos carbo,idratos . sales minerales como las de calcio= magnesio=

manganeso= sodio o potasio . s&stancias promotoras del crecimiento= generalmente de nat&rale+a %itamnica> M&. a men&do se aEaden al medio de c&lti%o ciertos colorantes= bien como indicadores de ciertas acti%idades metablicas o bien por s&s capacidades de e$ercer de in,ibidores selecti%os de ciertos microorganismos> 10 Consistencia adecuada del 'edio *artiendo de &n medio l;&ido podemos modificar s& consistencia aEadiendo prod&ctos como alb-mina= gelatina o agar= con lo ;&e obtendramos medios en estado semislido o slido> Los medios solidificados con gelatina tienen el gran incon%eniente de ;&e m&c,os microorganismos no se desarrollan adec&adamente a temperat&ras inferiores al p&nto de f&sin de este solidificante . de ;&e otros tienen la capacidad de lic&arla> Act&almente los medios slidos son de &so &ni%ersal= por s& %ersatilidad . comodidad= pero ,a. tambin gran cantidad de medios l;&idos c&.o &so est: ampliamente e<tendido en el laboratorio> 20 Presencia )o ausencia, de o>-$eno & otros $ases #ran cantidad de bacterias p&eden crecer en &na atmsfera con tensin de o<geno normal> Alg&nas p&eden obtener el o<geno directamente de %ariados s&stratos> *ero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollar:n adec&adamente en &na atmsfera sin o<geno ambiental> !n &n p&nto intermedio= los microorganismos microaerfilos crecen me$or en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias 8tensin de o<geno m&. red&cida@= mientras los anaerobios fac&ltati%os tienen &n metabolismo capa+ de adaptarse a c&al;&iera de las citadas condiciones> H0 Condiciones adecuadas de 4u'edad Un ni%el mnimo de ,&medad= tanto en el medio como en la atmsfera= es imprescindible para &n b&en desarrollo de las cl&las %egetati%as microbianas en los c&lti%os> 9a. ;&e pre%er el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las est&fas de c&lti%o a /2G/0VC proporcionando &na f&ente adec&ada de ag&a ;&e mantenga la ,&medad necesaria para el crecimiento de los c&lti%os . e%itar as ;&e se dese;&e el medio>

?0 "u( a'%iental La ma.ora de los microorganismos crecen m&c,o me$or en la osc&ridad ;&e en presencia de l&+ solar> 9a. e<cepciones e%identes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos> =0 p; La concentracin de iones ,idrgeno es m&. importante para el crecimiento de los microorganismos> La ma.ora de ellos se desarrollan me$or en medios con &n p9 ne&tro= a&n;&e los ,a. ;&e re;&ieren medios m:s o menos :cidos> 7o se debe ol%idar ;&e la presencia de :cidos o bases en cantidades ;&e no impiden el crecimiento bacteriano p&eden sin embargo in,ibirlo o incl&so alterar s&s procesos metablicos normales> K0 Te'peratura Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperat&ras entre '2 . 1/VC> Otros como los psicrfilos crecen a 5VC . los termfilos a (5VC o incl&so a temperat&ras s&periores 8,ipertermfilos@> !n lneas generales= los patgenos ,&manos crecen en rangos de temperat&ra m&c,o m:s cortos= alrededor de /0VC= . los saprofitos tienen rangos m:s amplios> N0 Esterilidad del 'edio odos los medios de c&lti%o ,an de estar perfectamente estriles para e%itar la aparicin de formas de %ida ;&e p&edan alterar= enmascarar o incl&so impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especmenes inoc&lados en dic,os medios> !l sistema cl:sico para esterili+ar los medios de c&lti%o es el a&tocla%e 8;&e &tili+a %apor de ag&a a presin como agente esterili+ante@

Material:
' pa;&ete de ca$as de petri Mec,ero A&tocla%e Balan+a granataria ' franela !ncendedor o cerrillos Agar Algodn *apel de estra+a

Procedi'iento:
A$ar Mueller ;inton. S&spender /0 g del medio des,idratado en &n litro de ag&a destilada> De$ar embeber de '5 a '2 min&tos> Calentar con agitacin frec&ente . ,er%ir d&rante ' min&to> !sterili+ar a ')'YC d&rante '2 min&tos> !nfriar a 12YG25YC . distrib&ir a ca$as de *etri 8o agregar los s&plementos ;&e se desee@ ,asta &n ni%el de 1 mm sobre &na s&perficie ,ori+ontal 8)2G/5 ml en placas de 4 cm de di:metro@> Form&la por litro: Inf&sin de carne *eptona :cida de casena Almidn Agar p9 final: 0>/ Z 5>' /55>5 '0>2 '>2 '2>5

7O A: *ara la preparacin de los dem:s medios de c&lti%o cons&lte s& man&al de medios= ;&e se enc&entra en el C>D> de traba$o@ o bien en el instr&cti%o ane<o en cada &no de los frasco ;&e contiene el medio>

Ruta de tra%a.o: Resultados: Dib&$ar las ca$as preparadas con estos medios de c&lti%o:
Agar sal . manitol> !osina . a+&l de metileno> Agar so.a tripticaseina> Agar de Mac ConDe.> Agar M&eller 9inton> DI!C#!I9N. CONC"#!I9N. BIB"IOGRA3GA!.

)Practica No +H, EBectos Bactericidas < BacteriostFticos De "os A$entes 7u-'icos !o%re "a ida Micro%iana O%.eti/o General:
Los al&mnos obser%aran el efecto de los diferentes agentes ;&micos al entrar en contacto con> las bacterias en &n c&lti%o bacteriano>

O%.eti/os particulares:
'>G )>G />G

Introduccin
9a. antibiticos ;&e son bacteriolticos= bactericidas= 8destr&.en bacterias@> 9a. otros antimicrobianos ;&e in,iben la m&ltiplicacin= no destr&.en= son antibiticos bacteriost:ticos de tal manera ;&e c&ando el microorganismo desaparece p&ede %ol%er a crecer= el fin es ;&e el sistema inm&ne acabe con ellos desp&s de ,aber tomado el antibitico> La ra+n de emplear &nos & otros depende del paciente 8s&s caractersticas@> Los ;&e %amos a introd&cir en el organismo tienen ;&e re&nir &nas condiciones ideales de &so terap&tico: G 9a. ;&e tender a la to<icidad selecti%a= en los antibiticos frente a los microgramos: deben ser t<icos contra el microorganismo no contra el paciente> Un b&en antibitico debe tener &na to<icidad selecti%a alta> G Importante accin in %itro con &na apro<imacin e<acta o similar en %i%o= esto es esencial> G Obtencin de &na concentracin adec&ada en te$idos . rganos> G B&ena absorcin . eliminacin lenta> G !scasa o n&la to<icidad> G *, ptimo pr<imo al sang&neo> G !stabilidad en el tiempo sin prdida apreciable de potencia> 3ORMA! CONCRETA! DE ACT#ACI9N: Los ;&e act&aran contra las bacterias son los m:s desarrollados> Antibacterianos: '> In4i%en la s-ntesis del peptido$lucanoE pared celular %acteriana> A;&ellos prod&ctos 8f:rmacos o medicamentos@ ;&e in,iben la sntesis del peptidogl&cano= es decir de la pared cel&lar bacteriana>

Caracter-sticas: ienen &na to<icidad selecti%a alta= afectan f&ndamentalmente a bacterias . nada a las cl&las del ,ospedador por;&e s&s cl&las no tienen peptidogl&cano> Son bacteriolticos b:sicamente por;&e la acti%idad del peptidogl&cano es ,acer ;&e resista la diferencia de presin osmtica= si afecta a esto la bacteria se lisa> Slo son acti%os frente a bacterias en crecimiento por;&e c&ando crece la bacteria necesita sinteti+ar pared> La penicilina pertenece a este gr&po> !<isten 1 tipos de f:rmacos en esta categora: a, La fosfomicina . la cicloserina= in,iben a ni%el del citoplasma= impidiendo ;&e se forme la s&b&nidad m:<ima> %, La bacitracina= in,ibe la sntesis de pared bacteriana impidiendo ;&e la s&b&nidad m:<ima atra%iese la membrana plasm:tica> c, La bancomicina= in,ibe la sntesis del peptidogl&cano= impidiendo ;&e la s&b&nidad m:<ima se colo;&e en s& sitio= genere la pared bacteriana> d, Los betalact:micos= in,iben la sntesis de la pared bacteriana impidiendo ;&e se formen los enlaces en la pared bacteriana de amino:cidos in,iben las relaciones de los pptidos> 1.0Anti%iticos 5ue in4i%en la s-ntesis de prote-nas: A;&ellos antibiticos ;&e act-an in,ibiendo la sntesis de protenas 8no destr&.en= sino impiden ;&e se formen@= !stos act-an &nindose a los ribosomas bacterianos> Caractersticas generales: La in,ibicin de la sntesis de protenas no destr&.e la bacteria= tienen accin bacteriost:tica= pero si esta se prolonga en el tiempo p&ede dar l&gar a la m&erte bacteriana> ericamente tienen &na to<icidad selecti%a no m&. alta= por;&e al act&ar en ribosomas bacterianos 8distintos de los e&cariticos@ no deber:n tener nada ;&e %er pero el ribosoma mitocondrial tiene el ribosoma= por lo ;&e si el ribosoma llegara a este ni%el= ,abra problemas en la respiracin cel&lar> *&eden act&ar sobre cl&las ;&e no estn en crecimiento> A este ni%el ,a. dos tipos: A;&ellos ;&e act-an &nindose a la s&b&nidad pe;&eEa del ribosoma: . A;&ellos ;&e act-an &nindose a la s&b&nidad grande del ribosoma> Lo m:s importante es ;&e el crecimiento se detiene>

*or lo tanto los gr&pos son: !l de los Aminogl&cosdicos ;&e act&a sobre la s&b&nidad pe;&eEa .: Las etraciclinas= la Clinamicina . el Cloranfenicol>;&e act-an sobre la s&b&nidad grande>

2.0In4i%en la s-ntesis de Icidos Nucleicos> Caractersticas: Son antibiticos de sntesis ;&mica> Son bacteriost:ticos> G S& to<icidad selectica es ba$a= act-a sobre las en+imas ;&e act-an en el proceso> Mecanismos de accin: *or blo;&eo de la transcripcin:G Impide ;&e act& la A"7 polimerasa bacteriana ;&e es la ;&e sinteti+a el A"7> G "ifampicina> *or blo;&eo de la d&plicacin del AD7:G Act&an in,ibiendo la accin de las en+imas ;&e enrollan . desenrollan la cadena de AD7= estos antibiticos impiden ;&e la cadena se desenrolle> G A&inolonas: Oflo+acino= cino<acino= norflo<acino> G 7o%obiocina: Ben+amida> *or interferencia en la sntesis de bases nitrogendas:G Impiden la sntesis de bases nitrogenadas= Adenina= timina= etc> 8mtodo e<cl&si%o de las bacterias@> S&lfamidas G Diaminopirimidinas> 1>G Alteran las Bunciones de la 'e'%rana plas'Ftica: La alteracin es la rot&ra de la membrana plasm:tica> Caractersticas: G Son bacteriolticos= la destr&ccin de la membrana *lasm:tica destr&.e la membrana> G o<icidad selecti%a ba$a> G S&elen ser cremas de &so tpico> Son: G *olimi<ina B> . G Colistina>

Procedi'iento:
Se toma &na ca$a de petri ;&e contenga &n c&lti%o de !> coli > !n otra ca$a se siembra por estra cr&+ada o por estra masi%a seg-n el medio ;&e se %a.a a &tili+ar> Una %e+ reali+ada la siembra de las cepas problemas se colocan los papeles remo$ados con agentes ;&micos de limpie+a= distrib&.ndolos por toda la ca$a>> Se de$a inc&bar la siembra con los discos a /0VC d&rante )1 ,rs> "ot&lar las ca$as n&merando cada agente ;&mico para saber e identificar r:pidamente . as no e;&i%ocarse> Desp&s de la inc&bacin= se obser%a . se mide el crecimiento report:ndolo en mm= el ,alo formado alrededor del disco>

R#TA DE TRABAJO RE!#"TADO! DI!C#!I9N: CONC"#!I9N: BIB"IOGRA3GA:

)PRACTGCA No. +?,

ANTIBIOGRAMA

O%.eti/o General:
A&e el est&diante cono+ca el comportamiento ;&e tienen las bacterias ante los antimicrobianos ;&e se &tili+an en la terapia de enfermedades infecciosas>>

O%.eti/os Particulares:
'>G )>G />G

Introduccin
Las tcnicas de antibiograma son las &tili+adas en el laboratorio de microbiologa para est&diar la acti%idad de los antimicrobianos frente a los microorganismos responsables de las infecciones> Se considera como antimicrobiana c&al;&ier s&stancia con capacidad de matar o al menos de in,ibir el crecimiento de los microorganismos . ;&e sea s&sceptible de &tili+acin como tratamiento en los pacientes> *&eden ser nat&rales= sintticos o semisintticos 8modificacin ;&mica de &n comp&esto nat&ral@> La ,istoria moderna de los antibiticos comien+a con el desc&brimiento de s&stancias presentes en &nos microorganismos capaces de matar a otros microorganismos> La &tili+acin de antibiticos s&p&so &n a%ance enorme en la esperan+a de %ida de las personas ;&e padecas procesos infecciosos= a&n;&e desgraciadamente tambin s&p&so &n a&mento en los ni%eles de resistencia antibitica> !l antibiograma tiene c&atro &tilidades principales: La &tilidad b:sica del antibiograma es la insta&racin de &n tratamiento antibitico correcto al paciente> !s necesario conocer si el microorganismo responsable de la infeccin posee mecanismos ;&e le confieran inm&nidad frente a alg-n antibitico para no incl&irlo como terapia> !n c&anto al tratamiento el antibiograma no slo es necesario en la insta&racin= tambin res&lta -til en el seg&imiento e incl&so en la confirmacin de tratamientos empricos> !n ocasiones la enfermedad infecciosa res&lta gra%e . se comien+a el tratamiento antes de conocer los datos de sensibilidad de la cepa> !l antibiograma tiene ;&e confirmar= o en s& caso corregir el tratamiento> Otra aplicacin de las tcnicas de est&dio de resistencia es la epidemiologa> !s necesario detectar el a&mento de los ni%eles de resistencia en los aislamientos clnicos para tomar medidas correctoras> *or otro lado tambin p&ede tener &tilidad diagnstica por;&e el perfil de resistencia p&ede en alg-n caso orientar en la identificacin bacteriana>

!<isten m&ltit&d de antimicrobianos en el mercado . el n-mero sig&e creciendo por;&e el desarrollo de m:s mecanismos de resistencia por parte de los microorganismos se trad&ce en &n esf&er+o ma.or por fabricar m:s . me$ores antibiticos> 7o es necesario contrastar la eficacia de todos los antibiticos para cada aislamiento bacteriano>

Los criterios ;&e se sig&en para seleccionar ;&e antimicrobianos se ensa.an respondes a factores de di%ersa ndole: Factores microbiolgicos: ipo de agente infeccioso . mecanismos de resistencia descritos pre%iamente en s& especie> Factores farmacolgicos: ipo de antimicrobiano . par:metros de absorcin= distrib&cin . eliminacin> Factores del paciente: ipo de infeccin> Factores de riesgo . estado general de sal&d> Sit&acin inm&nolgica e ,ipersensibilidad> !<periencia anterior referente a los patrones de resistencia antibitica m:s ,abit&ales para cada especie> La determinacin de la Concentracin In,ibidora Mnima 8CIM@ es la base de la medida de la sensibilidad de &na bacteria a &n determinado antibitico> La CIM se define como la menor concentracin de &na gama de dil&ciones de antibitico ;&e pro%oca &na in,ibicin de c&al;&ier crecimiento bacteriano %isible> !s el %alor f&ndamental de referencia ;&e permite establecer &na escala de acti%idad del antibitico frente a diferentes especies bacterianas> 9a. diferentes tcnicas de laboratorio ;&e permiten medir o calc&lar de r&tina= . de manera semic&antitati%a= las CIM 8mtodos man&ales . mtodos a&tomati+ados o semia&tomati+ados@> !stos diferentes mtodos de r&tina permiten categori+ar &na cierta cepa bacteriana en f&ncin de s& sensibilidad frente al antibitico probado> !sta cepa se denomina Sensible 8S@= Intermedia 8I@ o "esistente 8"@ al antibitico> *ara &n determinado antibitico= &na cepa bacteriana es= seg-n 7CCLS: Sensible= si e<iste &na b&ena probabilidad de <ito terap&tico en el caso de &n tratamiento a la dosis ,abit&al> "esistente= si la probabilidad de <ito terap&tico es n&la o m&. red&cida> 7o es de esperar ning-n efecto terap&tico sea c&al f&ere el tipo de tratamiento> Intermedia= c&ando el <ito terap&tico es impre%isible> Se p&ede conseg&ir efecto terap&tico en ciertas condiciones 8f&ertes concentraciones locales o a&mento de la posologa@> Ciertas molc&las son representati%as de &n gr&po de antibiticos> Los res&ltados 8S= I= "@ obtenidos con estas molc&las p&eden ser ampliados a los antibiticos del gr&po= ;&e en ese caso no es necesario ensa.ar 8!$emplo: !;&i%alencia entre la cefalotina ;&e se ensa.a . las restantes cefalosporinas de '[ generacin ;&e no es necesario probar= .a ;&e el res&ltado p&ede ded&cirse del obtenido en la cefalotina@> !ste ,ec,o permite ensa.ar &n n-mero red&cido de antibiticos= sin limitar por ello las posibilidades terap&ticas>

Material necesario: E5uipo de la%oratorio:

Crc&los de papel filtro o discos para antibiograma *in+as C&lti%o bacteriano Bata C&brebocas #&antes Asa bacteriolgica Cinta ad,esi%a= franela= cerillos= pl&mn de aceite= Cloro= $abn antibacterial etc>

Procedi'ientoQ
!n condiciones aspticas= tomar con el asa de inoc&lacin &na porcin de la colonia a probar= introd&cirla en &n t&bo de ensa.e ;&e contenga sol&cin salina fisiolgica . reali+ar &na s&spensin de la colonia bacteriana . a$&starla ,asta &na densidad comparable con el est:ndar 7Y 2 de s&lfato de bario 8corresponde apro<imadamente a '5( microorganismosJml= ,asta alcan+ar &na t&rbide+ ;&e se compara con el t&bo 7o> 2 del nefelmetro de Macfarland@> 9&medecer con la s&spensin &n ,isopo estril= ;&itar el e<ceso de la s&spensin presionando . girando el ,isopo sobre la pared interna del t&bo= por arriba de la s&spensin> Con este ,isopo estriar de forma masi%a sobre la totalidad de la placa ;&e contiene agar= se efect-a por &ltimo &n barrido del ,isopo sobre el reborde de la ca$a de petri . el agar> De$ar secar el inoc&lo de / a 2 min&tos= . colocar los discos con pin+as estriles= presionar ligeramente para aseg&rar el contacto de os discos con la s&perficie del agar deber: pre%enirse &na sobre posicin de las +onas de in,ibicin con &na distrib&cin adec&ada de los discos . con &n lmite no menor de '2 mm> De los bordes de la placa> Desp&s de '2 min&tos de ,aber colocado los discos= in%ertir las ca$as de petri e inc&bara /05C d&rante )1 ,oras>> Desp&s del periodo de inc&bacin reali+ar la medicin de los ,alos de in,ibicin con compases de calibracin %ernier= regla o plantilla diseEada para ese propsito= por el fondo de la ca$a= la c&al se il&mina con l&+ refle$ada> Las cepas se clasificaran en resistentes 8"@= intermedias 8I@ o s&sceptibles sensibles 8S@= dependiendo del ,alo de in,ibicin= seg-n la tabla de referencia 8ane<a al e;&ipo proporcionado@>

R#TA DE TRABAJO:

RE!#"TADO!: DI!C#!I9N: CONC"#!I9N:

BIB"IOGRA3GA!:

)PRACTICA N* +=, TECNICA DE "A COAG#"A!A O%.eti/o General.0

A&e el est&diante aprenda a determinar la presencia de la en+ima coag&lasa ;&e permite diferenciar las especies del genero !stafilococos>

O%.eti/os Particulares.0 +.0 1.0 2.0

Introduccin
Fermento secretado por ciertos microorganismos= . en partic&lar por la ma.ora de Stap,.lococc&s patgenos= la Coag&lasa pro%oca trombosis en los focos de s&p&racin . la formacin de &n re%estimiento protector de fibrina alrededor de los grmenes la Coag&lasa en+ima prod&cida por el !stafilococos A&re&s= es relati%amente termoestable= .a ;&e es resistente a temperat&ras ,asta 35 grados centgrados>se desconoce el mecanismo e<ado . la estr&ct&ra ;&mica de la Coag&lasa> Sin embargo se sabe ;&e esta en+ima desempeEa cierto papel en la coag&lacin> Act-a sobre alg-n componente ;&e se enc&entra en el s&ero para prod&cir &n coag&lo o trombo= in %itro= la coag&lasa= a&menta la %elocidad de coag&lacin del plasma . el res&ltado final es la formacin de &n coag&lo de Fibrina> OginsD. . Unbreit afirman ;&e ,a. pr&ebas de ;&e la Coag&lasa ind&cir: &n mecanismo acti%ado alterno= .a sea como &na en+ima o como &n acti%ador de &n componente plasm:tico> Smit, . Col s&gieren ;&e la Coag&lasa en &na s&stancia seme$ante a la protrombina ;&e reacciona con los factores plasm:ticos normales para formar &na s&stancia seme$ante a la trombina= ;&e a s& %e+= acti%a el Fibringeno para formar Fibrina> La Coag&lasa ligada o factor de agl&tinacin con%ierte al Fibringeno en Fibrina directamente sin inter%encin de los factores plasm:tico= . no es in,ibida por los antic&erpos de la Coag&lasa libre>

La f&ncin real de la Coag&lasa In%itro no ,a sido a&n aclarada> "ogers . ompsett efect&aron est&dios sobre la accin de la estafilocoag&lasa= c&ando ,a. &na barrera de fibrina locali+ada en las lesiones estafiloccicas

Material:
Ag&$a %ac&tainer Soporte para ag&$a orni;&ete &bo con !D ASeringas 2 ml C&lti%os bacterianos #ram positi%os . #ram negati%os *ortaob$etos Asa bacteriolgica #&antes C&bre bocas #orro ;&ir-rgico #afas de proteccin Bata

Procedi'iento: TJcnica En Portao%.etos Colocar &na gota de plasma 8*referentemente plasma de cone$o con !D A@= sobre &n portaob$eto limpio . seco> Colocar &na gota de ag&a destilada o sol&cin fisiolgica al aldo de la gota de plasma como control> Con &n asa bacteriolgica de alambre recto o &n palillo de madera= em&lsionar &na porcin de &na colonia aislada a probar en cada gota= primero en el ag&a o sol&cin fisiolgica= . posteriormente en la gota de plasma> Me+clar bien tratando de obtener &na s&spensin ,omognea> 9acer mo%imientos s&a%es de oscilacin con el portaob$etos d&rante 2 a '5 seg&ndos> Obser%ar . reportar s&s res&ltados>

Interpretacin:
Prue7a (ositiva= formacin de gr&mos macroscpicos en '5 seg&ndos o menos en la gota de plasma . ning&na formacin en la gota de sol&cin salina o en el ag&a destilada #a (rue7a es negativa= no ,a. formacin de gr&mos en ning&na gota> Prue7a dudosa>GLa formacin de gr&mos en ambas gotas indica ;&e el microorganismo se a&toagl&tina . es inadec&ado para la pr&eba de coag&lasa en portaob$etos> NOTA:G odas las pr&ebas negati%as en portaob$etos deber:n confirmarse mediante la pr&eba en t&bo> TJcnica en Tu%o '> !n &n t&bo de '/ < '55 estril me+clar 5>2 ml de plasma ,&mano o de cone$o 8con !D A@ em&lsionar %arias colonias a probar ,asta obtener &na s&spensin lec,osa>> )> Inc&bar a /2 grados C de 1G3 ,oras= obser%e cada /5 min&tos> /> Berificar la formacin de gr&mos> NOTA>GLas pr&ebas p&eden ser positi%as a las 1 ,oras . l&ego re%ertir a negati%as desp&s de )1 ,oras> 1> Si el res&ltado es negati%o a las 1 ,oras= inc&bar a temperat&ra ambiente d&rante &na noc,e . %erificar de n&e%o la formacin de gr&mos>8coag&lo@>
5

Interpretacin Prue%a positi/a.0#r&mos de c&al;&ier tamaEo> Prue%a ne$ati/a.G7ing&n gr&mo>

R#TA DE TRABAJO: RE!#"TADO!: DI!C#!I9N CONC"#!I9N BIB"IOGRA3GA:

)PRACTICA N* +K, TECNICA DE "A CATA"A!A O%.eti/o General.0

A&e el est&diante aprenda a reali+ar la pr&eba de catalasa para determinar la presencia de esta en+ima en los organismos %i%os principalmente en bacterias anaerobias . aerobias fac&ltati%as>

O%.eti/os Particulares.0
'>G )>G />G

Introduccin
La catalasa es &na en+ima ;&e se enc&entra en organismos %i%os . catali+a la descomposicin del per<ido de ,idrgeno 89)5)@ en o<geno . ag&a> !l per<ido de ,idrgeno es &n resid&o del metabolismo cel&lar de m&c,os organismos %i%os . tiene entre otras &na f&ncin protectora contra microorganismos patgenos= principalmente anaerobios= pero dada s& to<icidad debe transformarse r:pidamente en comp&estos menos peligrosos> !sta f&ncin la efect-a esta en+ima ;&e catali+a s& descomposicin en ag&a . o<geno> Adem:s la catalasa se &sa en la ind&stria te<til para la eliminacin del per<ido de ,idrgeno= as como en menor medida se emplea en la limpie+a de lentes de contacto ;&e se ,an esterili+ado en &na sol&cin de per<ido de ,idrgeno> La a&sencia congnita de catalasa es ca&sante de &na acatalasemia 8o acatalasia@= la enfermedad de aDa,ara ;&e se manifiesta con se%eras infecciones gangrenosas de la ca%idad b&cal= p&diendo prod&cir la prdida de los dientes . gra%es destr&cciones de loa ma<ilares . regiones blandas ;&e los c&bre> !nfermedad congnita del Sapon 8) de '55>55 ,abitantes s&fren de este trastorno@> La en+ima se presenta en forma de ,omotetr:mero . se locali+a en los pero<isomas> !sta en+ima p&ede act&ar como &na pero<idasa para m&c,as s&stancias org:nicas= especialmente para el etanol ;&e act-a como donante de ,idrgeno> Las en+imas de m&c,os microorganismos= como el *enicilli&m simplicissim&m= ;&e e<,iben acti%idad de catalasa . pero<idasa= son frec&entemente llamadas catalasasGpero<idasas> La deficiencia en catalasa prod&ce acatalasia> !sta enfermedad est: caracteri+ada por la

a&sencia de acti%idad de la catalasa en los glb&los ro$os . se asocia con las lesiones orales &lcerantes> Se &tili+a para comprobar la presencia del en+ima catalasa ;&e se enc&entra en la ma.ora de las bacterias aerobias . anaerobias fac&ltati%as ;&e contienen citocromo> La principal e<cepcin es (treptococcus> Originariamente= esta pr&eba era &tili+ada para diferenciar los sig&ientes gneros:

(treptococcus 8G@ de Micrococcus 8R@ .Jo (taph*lococcus 8R@> !acillus 8R@ de Clostridiu" 8G@> L*steria "onoc*togenes 8R@ .Jo Cor*nebacteriu" 8R= con las e<cepciones de C.p*ogenes . C.hae"ol*ticu"= ambos G@ de 0r*sipelothriA 8G@

Material:
o o o o o o o Ag&a o<igenada C&lti%os bacterianos #ram positi%os . #ram negati%os *ortaob$etos Asa bacteriolgica #&antes C&bre bocas Bata

Procedi'iento:
+. MJtodo del portao%.etos )reco'endado,:

Con el asa de siembra recoger el centro de &na colonia p&ra de '(G)1 ,oras . colocar sobre &n portaob$etos limpio de %idrio> Agregar con gotero o pipeta *aste&r &na gota de 9)O) al /5X sobre el microorganismo sin me+clarlo con el c&lti%o> Obser%ar la formacin inmediata de b&rb&$as 8res&ltado positi%o@> Desec,ar el portaob$etos en &n recipiente con desinfectante> Si se in%ierte el orden del mtodo 8e<tender la colonia sobre el ag&a o<igenada@ p&eden prod&cirse falsos positi%os>

)> MJtodo del tu%o de ensa&o:

Agregar 'ml de 9)O) al /X directamente a &n c&lti%o p&ro de agar densamente inoc&lado> Obser%ar la formacin inmediata de b&rb&$as 8res&ltado positi%o@>

"U A D! "ABASO

"!SUL ADOS: DISCUSIW7>G CO7CLUSIW7>G BIBLIO#"AF\A>G

)Practica N* +N,
!C7ICA D! LA OLIDASA
OBJETI O GENERA": Determinar la presencia microorganismos> de la en+ima o<idasa en diferentes

OBJETI O! PARTIC#"ARE!: '>G )>G />G INTROD#CCION Los citocromos son ,emoproteinas ;&e contienen ,ierro . act-an como el &ltimo eslabn de la cadena respiratoria aerobia= transfiriendo electrones 8,idrogeno@ al o<igeno= con formacin de ag&a> !l sistema citocromo se enc&entra en los organismos aerobios o anaerobios fac&ltati%os= de modo ;&e la pr&eba de o<idasa es importante para identificar a;&ellos organismos ;&e carec de la en+ima o son anaerobios obligados> La pr&eba citocromo o<idasa &tili+a ciertos reacti%os colorantes como el dicloro,idrato de pG fenielendiamina ;&e act&a como aceptor artificial de electrones s&stit&.endo al o<igeno= este reacti%o es incoloro en estado red&cido pero en presencia de citocromo o<idasa . o<igeno atmosfrico se o<ida formando asi indofenol> La pr&eba de o<idasa se basa en la prod&ccin bacteriana de &na en+ima o<idasa intracel&lar> !sta reaccin de o<idasa se debe a &n sistema de citocromo o<idasa ;&e acti%a la o<idacin del citocromo red&cido por el o<geno molec&lar= el ;&e s& %e+ act-a como &n aceptor de electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de electrones> odas las bacterias aerobias obtienen s& energa a partir de la respiracin= &n proceso responsable de la o<idacin de %arios s&stratos> La cadena respiratoria es &na sec&encia de en+imas . transportadores 8carriers@ responsables del transporte de e;&i%alente red&ctores desde los s&stratos al o<igeno molec&lar> !l o<geno es el aceptor final de ,idrogeno . prod&ce ag&a o per<ido de ,idrogeno a partir del ,idrogeno= lo c&al depende de las especies bacterianas . de s&s sistemas en+im:ticos> Las o<idasas catali+an la eliminacin del ,idrogeno de &n s&strato pero solo &tili+an o<igeno como aceptor de ,idrogeno> !l sistema citocromo= por lo com-n presente solo en los microorganismos aerobios= permite a estos &tili+ar el o<geno como aceptor final de ,idrogeno para red&cir el o<geno molec&lar a per<ido de ,idrogeno= el -ltimo eslabn en la cadena de la respiracin aerobia>

MATERIA":
C&lti%os bacterianos #ram positi%os . #ram negati%os *ortaob$etos Ca$a de petri desec,able *apel filtro #radilla "eacti%o de Uo%acs Asa bacteriolgica #&antes *ortaob$etos #orro ;&ir-rgico #afas de proteccin C&bre bocas Bata

PROCEDIMIENTO: 1. 29todo en (laca directo$ Agregar directamente )G/ gotas de reacti%o a alg&nas colonias ;&e estn aisladas en la placa de medio de c&lti%o= no in&ndar toda la placa . no in%ertirla> Obser%ar los cambios de color= con el reacti%o de Uo%acs la reaccin se prod&ce en &nos '5G'2 seg&ndos= mientras ;&e con el de #ordon . McLeod es dentro de los '5G /5 min&tos> 5. 29todo indirecto so7re (a(el Colocar &n c&adro de papel filtro de / < / cm apro<imadamente en placa de *etri> Agregar )G/ gotas del reacti%o de Uo%acs en el centro del papel> !<tender con el asa de siembra &na colonia sobre el papel impregnado> La reaccin de color positi%a se prod&ce a los 2G'5 seg&ndos>

Interpretacin:
+. Prue%a positi/a La +ona del papel inoc&lada con la bacteria se torna de morado p&rp&ra en '5 seg&ndos

1. Prue%a ne$ati/a 7o ,a. cambio de color en los primeros '5 seg&ndos>

Otra Bor'a de interpretar la prue%a: A. Colonias o?idasa (ositivas: la colonia se %&el%e de color rosa= l&ego marrn 8ro$o obsc&ro@ . por &ltimo negro 8negro p&rp&reo@> a. Colonias rosa: Bacterias fiables Fase ]para s&bc&lti%os %. Color ne$ras: Dentro de los '5 '2 seg&ndos> Bacterias no %iables B. Colonias o>idasa ne$ati/a: Sin cambios de color en la colonia o &n color rosa m&. p:lido debido al reacti%o> *&ede oc&rrir &n cambio de coloracin al negro en el medio circ&ndante> Con el reacti%o de Uo%acs= &n res&ltado positi%o se manifiesta por &n color negro p&rp&ra ;&e se desarrolla dentro de los '5 seg&ndos= &na reaccin positi%a en '5 G35 seg&ndos se considera &n res&ltado tardo> "eportar s&s res&ltados ane<ando dib&$os . fotografas de lo reali+ado>

R#TA DE TRABAJO: RE!#"TADO!: DI!C#!I9N CONC"#!I9N BIB"IOGRA3GA

)PRACTICA No +O,
IDENTI3ICACION DE" GENERO !TAP;<"OCOCC#! OBJETI O!: Los est&diantes reali+aran la identificacin de las especies del gnero estafilococos &tili+ando los procedimientos m:s com-nmente &tili+ados en la pr:ctica diaria> OBJETI O! PARTIC#"ARE!:
'>G )>G />G

INTROD#CCION:
Dentro de este gnero se locali+an act&almente )0 especies= pero 3 son las ;&e poseen &n ma.or significado en el campo de la sal&d p-blica ;&e son: S> a&re&s= S> epidermis= S> ,aemol.tic&s= S> saprop,.tic&s= S> l&gd&nensis . S> sc,leiferi> La primera especie es la -nica coag&lasa positi%a . es la especie mas . es la especie m:s %ir&lenta= en tanto ;&e las dem:s especies ;&e integran el gr&po de los estafilococos coag&lasa negati%a 8!C7@= de las c&ales %arias cepas ,an mostrado &n marcado incremento en padecimientos infecciosos= en especial c&ando el paciente anali+ado se enc&entra sometido a procedimientos mdicos in%asi%os o es tratado con c&erpos e<traEos tales como sondas= catteres= etc> !<isten otros !C7 como son S ,ominis= S sim&lans= S> co,nii= S> Carneri= S> sacc,arol.tic&s= S> capitis= . S> <.los&s= ;&e act&almente aparecen con m&. ba$a frec&encia en di%ersas infecciones ,&manas . podran ad;&irir ma.or rele%ancia en &n f&t&ro cercano

MATERIA":
#radilla Mec,eros Asas bacteriolgicas Discos de bacitracina 5>551 U . 7o%obiocina de 2 Qg *in+as de diseccin 9isopos estriles

MEDIO! DE C#"TI O < PR#EBA! BIO7#IMICA!

) ca$as de sal . manitol T sembrara por estra cr&+ada> ) ca$as de gelosa sangre para sensibilidad de bacitracina . no%obiocina en la mitad de la ca$a . en la otra parte sembrar por estra cr&+ada para %er ,emolisis . morfologa colonial> ) t&bos de caldo ro$o de fenol con <ilosa= sacarosa= tre,alosa= fr&ctosa= manosa= maltosa . lactosa> ) t&bos con caldo &rea

) t&bos con caldo nitrato> ) t&bos esteriles ) t&bos con sol&cin salina esteril ) ml>

PROCEDIMIENTO:
'> )> /> 1> Se entregaran a los al&mnos ) cepas diferentes por mesa> "eali+aran frotis de cada &na . teEir con la tcnica de #ram "eali+ar morfologa macroscpica a cada &na de las cepas> "eali+ar pr&eba de catalasa= coag&lasa= o<idasa . la pr&eba de sensibilidad a la no%obiocina . bacitracina> 2> Fermentacin de carbo,idratos 3> *r&eba de &rea . de caldo nitrato

RE!#"TADO!: "eportar de las diferentes cepas de estafilococos 8 ABLAS T DIBUSOS@ :

Morfologa microscpica 8tincin de #ram@ Morfologa macroscpica o colonial en los diferentes medios de c&lti%o &tili+ados> Morfologa colonial en el agar sal . manitol "es&ltados de la pr&ebas bio;&micas "es&ltados de ls pr&ebas de coag&lasa= o<idasa . catalasa> "es&ltados de las pr&ebas de no%obiocina . bacitracina

DI!C#!ION. CONC"#!ION BIB"IOGRA3IA C#E!TIONARIO

>

)PRACTICA No. 1@,

IDENTI3ICACION DE" GENERO !TREPTOCOCC#! < ENTEROCOCC#!
OBJETI O GENERA" : A&e el est&dante aprenda a reali+ar la identificacin de las especies del gnero estreptococos . del genero enterococos &tili+ando los procedimientos m:s com-nmente &tili+ados en la pr:ctica diaria> OBJETI O! PARATIC#"ARE!: +.0 1.0 2.0 H.0

INTROD#CCION: !l gnero streptococc&s pertenece a la familia Streptococcaceae . s&s especies m:s importantes son las sig&ientes: S> p.ogenes= S> agalactiae= S>e;&isimilis= S> canis= S>sang&is= S> sali%ari&s= S> pne&moniae= S> bo%is= . S> faecalis> !s importante precisar ;&e las dos -ltimas especies ,an sido transferidas al gnero !nterococc&s por lo ;&e es m:s preciso referirse a ellas como !nterococc&s bo%is . !nterococc&s faecalis> Sin embargo ambas comparten caractersticas con los estreptococos por lo ;&e con%iene est&diarlos $&ntos> Los estreptococos son cocos gran positi%os c&.o di:metro %ara entre 5>2 . ' 2 Qm= inm%iles= se agr&pan en pare$as o en cadenas largas= c&ando la preparacin pro%iene de m&estras biolgicas o de c&lti%os l;&idos

MATERIA": 2 ca$as de petri con gelosa sangre> 2 t&bos de '/ < '55 con / ml de caldo B9I R 3>2 X de 7a Cl 2 t&bos con agar bilis esc&lina #radilla Mec,eros Microscopios

*in+as para diseccin Asa bacteriolgica Discos de bacitracina de 5>5) G5>51 U= . opto;&ina de 2 U

CEPA!: : S> p.ogenes= S> agalactiae= S> pne&moniae !> bo%is= !> faecalis= !> faeci&m= . Stap,.lococc&s a&re&s> PROCEDIMIENTO: '> "eali+ar &n frotis . teEirlo con la tcnica de #ram . reali+ar morfologa microscpica . morfologa macroscpica> )> 9acer a las colonias seleccionadas la pr&eba de o<idasa . catalasa> /> Inoc&lar &n t&bo de bilis esc&lina . caldo B9I con 7aCl al 3>2X con cada &no de los microorganismos proporcionados> 1> Inoc&lar el t&bo con caldo B9I ,asta alcan+ar &na t&rbide+ ig&al al t&bo 5>2 de la escala de Mc Farland> 2> Introd&cir &n ,isopo estril al t&bo inoc&lado en el p&nto 1 . presionar el ,isopo contra las paredes del t&bo para e%itar ;&e contenga &n e<ceso de inoc&lo . sembrar por estra masi%a la mitad de la ca$a con gelosa sangre= esperar 2 min&tos a ;&e se;&e . colocar los discos de bacitracina . opto;&ina> 3> !n la otra mitad de la ca$a reali+ar la pr&eba de CAM*> 0> Inc&bar a /0 5C d&rante )1 a 1( ,oras>

TECNICA! DE IDENTI3ICACION PARA E" GLNERO !treptococcus: a, Prue%a de CAMP

!sta pr&eba se &tili+a para identificar a los estreptococos del gr&po B= beta ,emoltico> !l principio de la pr&eba se basa en la acti%idad ,emoltica de la betaGlisina estafiloccica sobre los eritrocitos es incrementada por &n factor e<tracel&lar prod&cido por los estreptococos del gr&po B= denominado factor CAM*> *or lo tanto la acent&acin de la reaccin betaG,emoltico oc&rre c&ando los dos reacti%os se s&perponen en &na placa de agarGsangre de carnero> La pr&eba de CAM* se reali+a efect&ando &na siembra -nica de los estreptococos 8a ser identificados@ perpendic&lar a &na siembra de stap,.lococc&s a&re&s prod&ctora de betaGlisina> Las dos lneas de siembra no deben tocarse= las placas inoc&ladas deben inc&barse en atmosfera ambiental= no deben c&lti%arse en ambiente anaerobio por;&e m&c,os estreptococos del gr&po A son positi%os en a&sencia de o<geno> INTERPRETACION: La +ona de lisis a&mentada toma la forma de &na cabe+a de flec,a en la &nin de las dos lneas de siembra> C&al;&ier estreptococo ;&e sea BACI "ACI7A negati%o= CAM* positi%o . BILIS !SCULI7A negati%o debe informarse como estreptococos del gr&po B= pres&nti%o por CAM*>

%, Prue%a de sensi%ilidad a la OPTO7#INA

!s &na pr&eba ;&e nos permite diferenciar Streptococc&s pne&moniae 8ne&mococo@ ;&e es sensible a la opto;&ina= de otras especies de Streptococc&s alfaG,emoliticos= en especial del gr&po %iridans= ;&e son resistentes>

Procedi'iento:
Inoc&lar la mitad de &na placa de agar sangre con ) 5 / colonias sospec,osas> !n la +ona restante reali+ar &na siembra por agotamiento> Colocar &n disco de opto;&ina en el centro de la mitad de la placa donde se ,aba reali+ado la siembra masi%a> Inc&bar de '( P )1 ,oras a /0 5C con '5 X de CO)>

INTERPRETACION: Discos de 3 mm: ,alo de in,ibicin ma.or a '1 mm: *"U!BA *OSI IBA= . ,alo de in,ibicin 3 P '1 mm: *"U!BA DUDOSA Discos de '5 mm: ,alo de in,ibicin ma.or a '3 mm: *"U!BA *OSI IBA . ,alo de in,ibicin de '5 P '3 mm: *"U!BA DUDOSA>

!n caso de res&ltado d&doso se recomienda reali+ar otra pr&eba= como la sol&bilidad en la bilis>

c, Prue%a de la sensi%ilidad la BACITRACINA

!sta pr&eba nos permite diferenciar estreptococos betaG,emolticos del gr&po A 8Streptococc&s p.ogenes@= ;&e son sensibles a la bacitracina= del resto de estreptococos betaG,emolticos ;&e son resistentes> Solo &n porcenta$e m&. pe;&eEo de estreptococos BK C T # son sensibles a la bacitracina>

Procedi'iento:
Inoc&lar en forma masi%a la mitad de &na placa de agar sangre de las colonias sospec,osas 8betaG,emolticas@= en la +ona restante reali+ar &na siembra por agotamiento> Colocar &n disco de bacitracina en el centro de la siembra masi%a> Inc&bar de '( P )1 ,oras a /0 5C con '5X de CO)>

I7 !"*"! ACIO7: C&al;&ier ,alo de in,ibicin del crecimiento 8'5 mm@ alrededor del disco de bacitracina permite identificar pres&nti%amente el microorganismo aislado como estreptococos betaG,emolitico del gr&po A>

d, !olu%ilidad en presencia de !A"E! BI"IARE!

Solo los ne&mococos presentan &na ectoen+ima a&toltica= ;&e se conoce como la LGalaninaG m&ramilamidasa= la c&al se acti%a en presencia de sol&ciones de sales biliares 8deso<icolato o ta&rocolato sdicos@ al '5 X> La consec&encia de ;&e se acti%e dic,a en+ima es la destr&ccin de cl&las ne&mococcicas . sec&encialmente= la perdida de la t&rbiedad de los c&lti%os li;&idos p&ros de este microorganismo>

La pr&eba consiste en obtener &n c&lti%o li;&ido p&ro de )1 ,oras en B9I del probable ne&mococo= traspasar 5>2 ml de dic,o c&lti%o a otro t&bo de ensa.e . agregar 5>2 ml de sol&cin de deso<icolato sdico al '5 X . se inc&ba d&rante / ,oras a /0 5C> se reali+a la lect&ra de la pr&eba= consider:ndose como positi%a c&ando el contenido del t&bo se aclara por completo 8pierde s& t&rbiedad@>

*reparar &n t&bo testigo con 5>2 ml de sol&cin salina estril . 5>2 ml del c&lti%o e inc&bar> !n este t&bo testigo= la t&rbiedad no debe desaparecer> !sta pr&eba ,a sido s&stit&ida por la sensibilidad a la opto;&ina>

RE!#"TADO!: DI!C#!ION: CONC"#!ION: BIB"IOGRA3IA:

)PRACTICA No. 1+,

CRECIMIENTO MICROBIANO EN DI3ERENTE! MEDIO! DE C#"TI O E!PECG3ICO! )Entero%acterias,.
OBJETI O GENERA":

A&e el est&diante realice el aislamiento . obser%e= las caractersticas . el desarrollo de alg&nas bacterias en diferentes medios de c&lti%o=
OBJETI O! E!PECI3ICO!: '>G )>G />G INTROD#CCION: La familia !nterobacteriaceae= son las ;&e m:s frec&entemente se ,allan en el laboratorio de Microbiologa Clnica> 9o. en da las !nterobacterias se p&eden rec&perar en infecciones de casi todos los sitios anatmicos . se debe estar preparado para aislarlos de c&al;&ier material ;&e se en%i al laboratorio> !stos microorganismos son bacilos #ram negati%os= anaerobios fac&ltati%os= fermentan la gl&cosa= carecen de acti%idad citocromo o<idasa= red&cen los nitratos a nitritos . son catalasa positi%os> Se desarrollan de manera ab&ndante en la ma.ora de los medios de c&lti%o de r&tina . forman colonias distinti%as en los medios selecti%os ;&e dependen principalmente de s& acti%idad metablica . de los componentes del medio> *ara la rec&peracin de !nterobacterias a partir de m&estras clnicas ;&e potencialmente contienen bacterias mi<tas= se disponen de tres tipos generales de medios: a@ Medios de aislamiento primario: Agar MacConDe. Agar !osina A+&l de Metileno Agar Deso<icolatoGCitrato 8ADC@ Agar !ndo Son medios capaces de seleccionar ciertos gr&pos de bacterias gramnegati%as . adem:s permiten la identificacin preliminar de ciertas caractersticas metablicas . bio;&micas> Son moderadamente in,ibidores= in,iben el desarrollo de casi todas las especies de microrganismos#rampositi%os . permiten el desarrollo de casi todas las enterobacterias . de otros bacilos #ramnegati%os>

ienen la capacidad de diferenciar microorganismos ;&e &tili+an la lactosa de los ;&e no la &tili+an> !n el agar MacConDe. . deso<icolato las colonias de bacterias &tili+adoras de lactosa aparecen de color ro$o= esto es debido a la prod&ccin de :cidos= las bacterias &tili+adoras de la lactosa mas dbiles forman colonias de color rosa o bien claras en la periferia con centros rosados= las bacterias ;&e no &tili+an la lactosa forman colonias incoloras> !n !7DO . !MB ;&e son grandes prod&ctoras de :cidos en estos medios forman colonias ;&e presentan &n brillo met:lico> b@ Medios de aislamiento selecti%o Los medios de c&lti%o se ,acen selecti%os c&ando se aEade a s& form&la &na gran %ariedad de in,ibidores= generalmente en ma.or concentracin ;&e la ,allada en los medios de aislamiento primario> !stos medios in,iben el desarrollo de ciertas bacterias= permitiendo solo el crecimiento de especies de importancia clnica> Los medios selecti%os &sados para el aislamiento de enterobacterias est:n ,ec,os para in,ibir el crecimiento de ciertas bacterias grampositi%as . retardar el grado %ariable de desarrollo de ciertos bacilos coliformes> !sto permite la rec&peracin de salmonellas . S,igellas a partir de m&estras donde se ,allan en escaso n-mero en comparacin con la concentracin masi%a de otros organismos entricos> Los medios m:s com-nmente empleados son: Agar Salmonella P S,igella 8SS@ Agar Lilosa P Lisina P Deso<icolato 8LLD@ Agar s&lfito de Bism&to 8ASB@ !n SS la colonias ;&e &tili+an la lactosa se colorean de color ro$oGrosa por el ro$o ne&tro> !n LLD las colonias de las bacterias ;&e &tili+an m:s de &n 9idrato de carbono forman colonias de color amarillo= las ;&e no &tili+an ning-n ,idrato de carbono forman colonias transl&cidas> Los microorganismos lisina positi%os forman colonias inicialmente amarillas por ;&e &tili+an la Lilosa . colonias tardas ro$as por la descarbo<ilacion de la lisina> !l ASB es altamente selecti%o para Salmonella t.p,i= s&s colonias son negras con brillo met:lico> c@ Caldos de enri;&ecimiento: Se &san para acrecentar el desarrollo de ciertas especies bacterianas in,ibiendo el de los microorganismos s&perfl&os> Act-an sobre la base del principio de ;&e la flora entrica normal es mantenida en la fase de retardo del desarrollo= mientras ;&e las especies de Salmonella . S,igella son desin,ibidas . entran en &na fase logartmica normal de crecimiento> !l desarrollo obtenido dentro de 3 a ') ,oras en el caldo de enri;&ecimiento se s&bc&lti%a en los medios selecti%os> Los caldos m:s &tili+ados son: Caldo selenito Caldo tetrationato MA !"IAL:

Mec,ero b&nsen Asa bacteriolgica *ortaob$etos Microscopio Aceite de inmersin C&bre bocas #&antes de l:te< #afas de proteccin Cinta masDin L:pi+ graso #asas #radilla "eacti%os para la tincin de gram *ara la lect&ra: l&pa de mano *ortaob$etos Marcador de aceite de p&nto fino raer por escrito el mtodo de gram . la morfologa colonial>

M!DIOS D! CUL IBO:: 0 *lacas de agar !7DO 0 *lacas de agar !MB 8Agar !osina . A+&l de Metileno@ 0 *lacas de agar MacConDe. 0 *lacas de agar SS 8Agar para Salmonella . S,igella@ 0 *lacas de agar LLD 8Agar Lilosa Lisina Deso<icolato@ 0 *lacas de agar Agar Berde Brillante 0 *lacas de Agar #elosa Sangre C&lti%os bacterianos de )1 ,oras con las sig&ientes cepas con crecimiento masi%o: !> coli St,ap,.lococc&sa&re&s !nterococc&sfaecalis Ulebsiella> pne&moniae !nterobactercloacae S,igella Salmonella Citrobacter Serratiamarcescens *rote&s

*se&domonaaer&ginosa

PROCEDIMIENTO: '> Sembrar por estra cr&+ada cada &na de la bacteria en los diferentes medios de c&lti%o proporcionados= inc&bar )1 ,oras a /2 G /0 oC> 8Utilice m&. poco inoc&lo bacteriano para lograr colonias aisladas@> )> Obser%ar la morfologa colonial de las bacterias en cada &no de los medios &tili+ados /> 9acer &n frotis de cada bacteria . teEirlos con la tcnica de #ram para obser%ar la morfologa microscpica 1> "eali+ar la pr&eba de Catalasa . O<idasa a cada bacteria>

R#TA DE TRABAJO :8Im:genes o dib&$os@ RE!#"TADO! :8 Dib&$os . fotografas del crecimiento de cada bacteria en los diferentes medios de c&lti%o>@ DI!C#!ION: 8Descripcin= e<plicacin . el por;& de los res&ltados@ CONC"#!ION: BIB"IOGRA3IA:

)PRACTICA No. 11,

IDENTI3ICACION < CARACTERI:ACION METABO"ICA DE BACTERIA! DE INTERE! MEDICO CON PR#EBA! BIO7#IMICA! CON ENCIONA"E!

OBJETI O GENERA": Identificar distintos gneros pertenecientes a la familia 0nterobacteriaceae partir de distintas pr&ebas bio;&micas indi%id&ales>
OBJETI O! E!PECI3ICO!Q '>G )>G />G

INTROD#CCIONQ

La identificacin de las especies re;&iere la determinacin de caractersticas metablicas ;&e refle$an el cdigo gentico . la identidad clnica del organismo en est&dio> Se dispone de &na gran %ariedad de pr&ebas diferenciales . de n&merosos es;&emas para la identificacin final de especies de !nterobacterias> Las pr&ebas bio;&micas son reacciones ;&e ponen en e%idencia la presencia o a&sencia de &na en+ima= %a metablica o alg&na otra propiedad caracterstica de &na especie> La sig&iente serie de pr&ebas es la ;&e se &tili+a ampliamente en los laboratorios clnicos . permiten la determinacin de las caractersticas metablicas por las c&ales se p&eden identificar todas las !nterobacterias sal%o especies raras o atpicas> Utili+acin de ,idratos de carbono *rod&ccin de indol "eaccin del ro$o de metilo *rod&ccin de acetoina 8Bog&es*rosDa&er@ Utili+acin del citrato *rod&ccin de &reasa Descarbo<ilacion de la lisina= ornitina . arginina *rod&ccin de fenilalanina desaminasa *rod&ccin de gas s&lf&ro de ,idrogeno Mo%ilidad Utili+acin del malonato combinados

*ara la determinacin de estas pr&ebas bio;&micas se p&eden &tili+ar medios -nicos o simples 8Dem&estran &na determinada caracterstica del microorganismo@ o medios m-ltiples 8Destacan %arias caractersticas en forma sim&lt:nea@>

!n la pr:ctica se &tili+an preferentemente medios combinados . los m:s &tili+ados para la identificacin de !nterobacterias son: Agar citrato de Simmons Agar 9ierro de Uligler o SI 8Agar ,ierro triple a+-car@ Agar 9ierro Lisina 8LIA@ Agar medio MIO 8Mo%ilidad= Indol . Ornitina@ Agar medio ro$o de metilo P Bog&es*rosDa&er 8 M"GB*@ Agar medio SIM Agar fenilalanina Caldo Urea Caldo Malonato Caldo base ro$o de fenol mas carbo,idratos 8 Caldo ro$o de fenol con sacarosa 8C"FS@ . caldo ro$o de fenol con manitol8C"FM@@> Agar gelatina n&triti%a REACTI O! < MATERIA": Colorantes para la tincin de #ram "eacti%o de Uo%acs o !rlic, "o$o de metilo Alfa naftol al 2X en alco,ol etlico Sol&cin de UO9 al 15X *ortaob$etos

Asa bacteriolgica Mec,eros Microscopio comp&esto Aceite de inmersin

MATERIA" BIO"OGICO: C&lti%os de )1 ,oras de diferentes especies de !nterobacterias PR#EBA! BIO7#IMICA! EN T#BO : Agar citrato de Simmons Agar 9ierro de Uligler o SI 8Agar ,ierro triple a+-car@ Agar 9ierro Lisina 8LIA@ Agar medio MIO 8Mo%ilidad= Indol . Ornitina@ Agar medio ro$o de metilo P Bog&es*rosDa&er 8 M"GB*@ Agar medio SIM Agar fenilalanina Caldo Urea Caldo Malonato Caldo base ro$o de fenol m:s carbo,idratos 8Caldo ro$o de fenol con sacarosa 8C"FS@ . caldo ro$o de fenol con manitol 8C"FM@@> Agar gelatina n&triti%a

PROCEDIMIENTO:
'> De las cepas aisladas en el medio Mac ConDe. elegir &na colonia .a sea lactosa 8R@ o lactosa 8G@= sembrar en cada &na de las pr&ebas bio;&micas proporcionadas de ac&erdo a las instr&cciones ;&e se les den> )> Inc&bar de /2 5 C a /0 5C d&rante )1 ,oras> /> Desp&s del tiempo de inc&bacin reali+ar la lect&ra de cada pr&eba con a.&da de las tablaspara la identificacin bacteriana> 1> "eportar el gnero . especie de cada cepa> R#TA DE TRABAJO :8Im:genes o dib&$os@

RE!#"TADO!:8 Obser%aciones= dib&$os= tablas etc> @

DI!C#!ION: 8Descripcin= e<plicacin . el por;& de los res&ltados@ CONC"#!ION: BIB"IOGRA3IA:

)Practica N* 12,
!LUDADO FA"\7#!O O%.eti/o General:
o A&e el est&diante aprenda a reali+ar la toma de m&estra para lle%ar a cabo &n e<&dado farngeo= s& procedimiento . la identificacin de las bacterias ca&santes de faringoamigdalitis>

O%.eti/os Particulares:
'>G )>G />G

Introduccin
!l e>udado Bar-n$eo es la toma de m&estra ;&e se reali+a en el fondo de la garganta 8en las amgdalas= generalmente@= mediante el &so de &n ,isopo estril> Sir%e como ,erramienta de diagnstico de padecimientos de origen bacteriano> !l c&lti%o del e<&dado farngeo o frotis farngeo se reali+a &tili+ando &n ,isopo especial para detectar la presencia de estreptococo gr&po A= ;&e es la ca&sa m:s com-n de la faringitis estreptoccica> Una m&estra tomada de la pared posterior de la garganta se coloca en &n plato especial 8c&lti%o@ ;&e permite el crecimiento de las bacterias> !l tipo especfico de infeccin se determina &tili+ando an:lisis ;&micos> Si no ,a. crecimiento de bacterias= el c&lti%o es negati%o . la persona no tiene &na infeccin estreptoccica> La faringitis estreptoccica es &na infeccin bacteriana ;&e afecta la parte posterior de la garganta . las amgdalas= ;&e se inflaman e irritan= lo c&al pro%oca dolor de garganta partic&larmente molesto al tragar> !s posible ;&e la garganta . las amgdalas presenten manc,as o &na capa de color amarillo .= ;&i+:s= los ganglios linf:ticos del c&ello estn inflamados> La faringitis estreptoccica se presenta com-nmente en niEos en edad escolar> La infeccin p&ede pro%ocar dolor de cabe+a= dolor de estmago= n:&seas= %mitos . lang&ide+> Las infecciones estreptoccicas de la garganta no s&elen ir acompaEadas de sntomas de resfro= como tos= estorn&dos= congestin o m&cosidad nasal> Si bien los sntomas de la faringitis estreptoccica s&elen desaparecer en &nos pocos das sin tratamiento directo= los mdicos recetan antibiticos con el fin de e%itar complicaciones relacionadas= como la fiebre re&m:tica>

!l diagnostico de &na faringoamigdalitis e<&dati%a se ,ace principalmente a tra%s de &n c&lti%o de e<&dado farngeo= donde solamente se reportan como positi%os a estreptococos beta ,emolticos del gr&po A o estreptococos beta ,emolticos del gr&po A presentes> Otros microorganismos no son necesarios identificarlos> Si el mdico sospec,a de cierto microorganismo especfico indica s& c&lti%o !n el c&lti%o de garganta de r&tina se sig&en los sig&ientes pasos: '> OB !7CIO7 D! LA MU!S "A: !l paciente deber: estar en a.&nas= sin aseo b&cal= no debe ,aber tomado antibiticos 0) ,oras antes de la toma de m&estra> Se debe e%itar la contaminacin de sali%a . flora normal de las m&cosas= e%itando tocar la leng&a . los labios> )> F"O ! !^IDO CO7 #"AM> !s importante ,acer &n frote directo . teEirlo con gran> *&es es a;& donde se obser%a si ,a. reaccin inflamatoria e<&dati%a= las cl&las epiteliales . el tipo de flora bacteriana> /> CUL IBO>G*ara el c&lti%o se &tili+an placas de gelosa sangre= .a ;&e en este se

identificara la presencia o no de estreptococos betaG,emolticos del gr&po A> Sin embargo el &so de otros medios= especialmente selecti%os se ,a s&gerido> 1> LA ID!7 IFICACIO7 D!L !S "!* OCOCO>G Como .a se sabe= se basa en el &so de discos de bacitracina> Idealmente la obtencin de la m&estra la debera de efect&ar &n medico o &na enfermera capacitada= a&n;&e es posible ;&e se solicite al tcnico de laboratorista ;&e lo ,aga>

Material:
o o o o o o 9isopos estriles Abate leng&as *orta . c&breob$etos #&antes C&bre bocas Bata

Procedi'iento:
'> Sentar a la persona en &n sitio donde ,a.a s&ficiente l&+ )> La m&estra se toma con dos ,isopos estriles= se dirigen ,acia la faringe posterior> /> Se instr&.e al paciente para ;&e respire prof&ndo . emita &n _aa,_>La leng&a se desciende s&a%emente con abateleng&as> !l ,isopo entonces se desli+a en las amgdalas . por detr:s de la o%&la> 1> Inmediatamente con &n ,isopo se ,ace &n frote= rotando el ,isopo sobre el portaob$etos> Desp&s se fi$a al calor= se tiEe con gram . se obser%a al microscopio>

2> !l otro ,isopo ser%ir: para descargar r:pidamente en los medios proporcionados> Desp&s desec,ar los ,isopos> 3> Con el asa bacteriolgica diseminar el inoc&lo por estra cr&+ada> !n el agar sangre se ,acen alg&nas incisiones sobre las estras con el ob$eti%o de obser%ar me$or la ,emolisis> 0> Inc&bar la placa de gelosa sangre a /0YC d&rante )1 ,oras en tensin de CO)> Las dem:s placas en atmosfera ambiente ala misma temperat&ra> (> Desp&s del periodo de inc&bacin re%isar las placas e identificar las colonias sospec,osas de ser estreptococos beta ,emoltico del gr&po A> tambin los organismos ;&e presentes en los otros medios> REPORTAR E" E8#DADO 3ARINGEO DE "A !IG#IENTE MANERA 3ORMA:

'>G 7OMB"! D!L *ACI!7 ! )>G I*O D! !S UDIO />G !LAM!7 MIC"OSCO*ICO 8Frotis directo@ 1>G "!SUL ADO D!L CUL IBO

*+T

DE

T* B ,O *ES+!T DOS D-SC+S-ON CONC!+S-ON BIBIOGRA3IA

)Practica N* 1H,
#ROC#"TI O

O%.eti/o General:
o A&e el est&diante aprenda a reali+ar &n Uroc&lti%o correctamente ;&e le permita

identificar a los microorganismos ca&sales de infecciones en %as &rinarias>>

O%.eti/os Particulares: +.0 1.0

2.0 Introd&ccin
!l aparato &rinario est: formado por los riEones= &rteres= %e$iga . &retra> Los tres primeros son +onas estriles= solo en la &retra se p&ede encontrar infinidad de flora normal establecida> Ba$o el nombre de infeccin &rinaria se agr&pa c&al;&ier proceso infeccioso ;&e afecta las %as &rinarias altas> 9a. ;&e tener en c&enta ;&e la orina infl&.e a tra%s del meato d&rante la flora residente en la &retra> La simple precedencia de grmenes en la orina recogida . sin tener en c&enta s& n-mero no e;&i%alente a &na infeccin> Los sntomas f&ndamentales de los sndromes csticos . &retrales son: dis&ria . pola;&i&ria> La sintomatologa caracterstica de la piolenifritis= es dolor &retral= l&bar . fiebre alta> La %a ,abit&al de infeccin &rinaria es la ascendente a partir de la &retra> !n la m&$er la escasa longit&d de &retra es &n factor fa%orecedor para las infecciones en %as &rinarias= mientras ;&e en el ,ombre es la abstraccin pro%ocada por la ,ipertrofia piastatica> !n los niEos la e<istencia de refl&$o %esico&retral d&rante la miccin es &n ,ec,o m&. frec&ente> Los agente etiolgicos de la infeccin de las &rinarias son: !> coli= *rote&s Dlebsiella= !nterobacter= *se&donomas= st,ap.lococc&s= !nterococc&s . Candida> La obser%acin de sedimento en la orina constit&.e el primer pasa para el diagnstico de la infeccin= sin embargo la confirmacin definiti%a de la e<istencia de &na infeccin definiti%a= depende del c&lti%o de la orina recogida correctamente= de lo contrario los res&ltados no son fa%orables> *ara recolectar la orina= se debe limpiar perfectamente los genitales e<ternos= se recoge la miccin media en &n frasco estril> Debe ser la primera de la maEana . la m&estra debe ser transportada inmediatamente . procesarse en menos de &na ,ora o bien p&ede refrigerarse>

Material:
o o o o o o o o Orina Asa bacteriolgica Medios de c&lti%o *orta . c&breob$etos &bos Asa de 5>55' Microscopio Centrif&ga

2edio de cultivo$ Agar MacConDe. Agar ''5 Agar Sal . Manitol Agar Bigg. Agar gelosa sangre Agar sal . manitol

Procedi'iento:
!ie'%ra en 'edios de culti/o '@ Los medios de c&lti%o deber:n estar a temperat&ra ambiente )@ Sembrar por estra cr&+ada en el agar MacConDe.= Agar ''5= . en el agar de Sal . manitol /@ !n el agar Bigg. se siembra por estra masi%a> 1@ *ara la c&enta %iable se &tili+a el agar M&eller 9inton o el agar de So.a tripticaseina> 2@ Se siembra por estra masi%a de la sig&iente forma: 3@ 9omogeni+ar la orina

0@ Con el asa pre%iamente esterili+ada= tomar &na m&estra de orina . tra+ar &na cr&+ en la ca$a con el medio de c&lti%o a &tili+ar= posteriormente esterili+ar el asa . estriar en toda la ca$a proc&rando ;&e las estras sean lo m:s cercanas &na de otra en toda la ca$a> (@ !ti;&etar las ca$as con los datos necesarios> 4@ Inc&bar de )1 P 1( ,oras a /0 C en la est&fa bacteriolgica>
5

o MorBolo$-a 'acroscpica & 'icroscpica %acteriana.0

Desp&s del tiempo de inc&bacin= retirar las ca$as de la est&fa . lle%arlas a s& mesa de traba$o para reali+ar s&s obser%aciones MorBolo$-a 'acroscpica colonial Obser%ar el crecimiento colonial desarrollado en los medios de c&lti%o= b&s;&e &na colonia ;&e se enc&entre aislada . proceda a describir s&s caractersticas coloniales de ac&erdo a los sig&ientes datos: La identificacin colonial de las bacterias se reali+a sobre la s&perficie del agar= a;& las especies forman colonias con &na forma . aspecto caracterstico>

Morfologia microscpica: Se reali+a &na resiembra del c&lti%o p&ro para anali+ar . se inoc&la d&rante )1 a 1( ,oras= es decir el tiempo en el ;&e apro<imadamente la bacteria .a a crecido . formado colonias separadas> Desp&s de las c&ales de escoge &na colonia aisladaK para reali+ar las obser%aciones> Caracteri(acin colonial: Ta'aRo: Di:metro en mm> 3or'a: *&ntiforme= circ&lar= filamentosa= irreg&lar= ri+oide= f&siforme> Ele/acin: *lana= ele%ada= con%e<a= p&l%inada= embonada= &mbilicada> Borde o Mar$en: !ntero= ond&lado= lob&lado= erosionado o lacerado= filamentoso= ri+ado> Color: Blanco= amarillo= negro= marrn= anaran$ado= beige= otros> !uperBicie: Brillante= opaca> Densidad: Opaca= transl&cida= transparente= etc> Consistencia: B&tirosa= seca= membranosa= ;&ebradi+a> MorBolo$-a 'icroscpica: *ara las obser%aciones microscpicas se procede de la sig&iente manera: a@ Se ,ace &n frotis en fresco> b@ !n &n portaob$etos se pone &na gota de ag&a lo m:s pe;&eEa ;&e se p&eda 8p&ede ,acerlo con el aro del asa bacteriolgica@>

c@ Desp&s con a.&da del asa pre%iamente esterili+adaK se toma &na a+ada de la colonia aislada a anali+ar se e<tiende sobre la gota de ag&a ,aciendo giros rotatorios para dil&ir la bacteria> d@ *osteriormente fi$ar el e<tendido bacteriano pasando ) o / %eces por la flama del mec,ero> e@ Desp&s se procede a teEirlo con la tincin de #ram> Tincin de Gra'.0 Tinte Pri'ario: Cristal %ioleta= tiEe la bacteria de color %ioleta A$ente Mordiente: L&gol= forma &n comple$o insol&ble con cristal %ioleta> A.&da a ad,erir el tiente a la cl&la> A.&da a resistir la decoloracin> A$ente Decolori(ante: Alco,ol acetona o alco,ol= el c&al sir%e como sol%ente de lpidos . agente des,idratante de protenas> Contratinte: Safranina ;&e tiEe de ro$o a la bacteria> Procedi'ientoQ Preparar el Brotis %acteriano TeRir con cristal /ioleta + 'inuto "a/ar con a$ua el e>ceso de colorante cu%rir con lu$ol + 'inuto la/ar con a$ua el e>ceso de lu$ol Decolorar con alco4ol0acetona "a/ar con a$ua el resto del disol/ente TeRir con saBranina + 'inuto "a/ar con a$ua el e>ceso de colorante !ecar la preparacin O%ser/ar al 'icroscopio +@@8 "a calidad de la tincin estF inBluida por '6ltiples Bactores

Prue%a de la Coa$ulasa.0 omar &na m&estra de sangre con la a.&da de &na $eringa Calibrar la sangre en dos t&bos de ensa.e Centrif&gar omar el plasma . depositarlo en dos t&bos de ensa.o omar &na colonia . me+clarla con el s&ero 9acer girar el t&bo s&a%emente para lograr la s&spensin 87O A#I A"@ Inc&bar d&rante )1 ,rs= a temperat&ra ambiente . obser%ar si ,a. o la formacin de &n coag&lo> "eportar res&ltados Interpretacin: Formacin de &n coag&lo: *r&eba *ositi%a 7o formacin de &n coag&lo : *r&eba 7egati%a Prue%a de Catalasa.0 '>GMtodo del portaob$etos 8recomendado@:

Con el asa de bacteriolgica pre%iamente esterili+ada tomar &n poco de la colonia ;&e se %a a anali+ar . se coloca sobre &n portaob$etos limpio de %idrio> Agregar con gotero o pipeta *aste&r &na gota de 9)O) al /5X> Obser%ar la formacin inmediata de b&rb&$as 8res&ltado positi%o@> Desec,ar el portaob$etos en &n recipiente con desinfectante> Si se in%ierte el orden del mtodo 8e<tender la colonia sobre el ag&a o<igenada@ p&eden prod&cirse falsos positi%os>

)>GMtodo del t&bo de ensa.o:

Agregar 'ml de 9)O) al /X directamente a &na pe;&eEa m&estra de la colonia ;&e se %a anali+ar . ;&e coloco en el fondo de &n t&bo> Obser%ar la formacin inmediata de b&rb&$as 8res&ltado positi%o@> Anotar las obser%aciones correspondientes>

Reali(ar prue%as %io5u-'icas & la Prue%a de Anti%io$ra'a para las colonias sospec4osas a identiBicar.: R#TA DE TRABAJO> RE!#"TADO!:

DI!C#!I9N: CONC"#!I9N: BIB"IOGRA3GA:

>)PRACTICA No. 1? , COPROC#"TI O

OBJETI O GENERA":

A&e el est&diante aprenda a reali+ar el procesamiento de las m&estras de materia fecal . trate de identificar a los microorganismos de importancia clnica ca&santes de infecciones gastrointestinales>

OBJETI O! PARTIC#"ARE! '>G )>G />G INTROD#CCION: Las enfermedades del sistema digesti%o representa &na de las principales ca&sas de def&ncin en el m&ndo> Ciertos microorganismos afectan el tracto intestinal . prod&cen enfermedad= la c&al se manifiesta en la ma.ora de los casos por &n c&adro diarreico> Los microorganismos bacterianos mas frec&entes ;&e prod&cen enfermedades gastrointestinales son: Salmonella= S,igella . !sc,eric,iacoli 8solo alg&nos serotipos@> Son menos frec&entes Tersiniaenterocolitica= Bibrio para,aemol.tic&s . Camp.lobacter$e$&ni> !n casos de epidemias Bibrio c,olera . en m&. raras ocasiones Aeromonas . *lesiomonas> !ntonces para poder determinar c&al es el agente eetiologico de la enfermedad . sir%a como apo.o al diagnostico clnico= tenemos ;&e reali+ar &n coproc&lti%o> !ste procedimiento se lle%a a cabo en el laboratorio con &na m&estra de materia fecal= la c&al deber: ser reciente . colocarse en &n recipiente estril> *ara la siembra debe tomarse el inoc&lo de las porciones sang&inolentas o m&cosas= p&es estos sitio son ab&ndantes en microorganismos patgenos> C&ando se trata de lactantes= la m&estra se p&ede tomar directamente del recto rotando %arias %eces con &n ,isopo> !s necesario sembrar la m&estra in mediatamente desp&s de ,aber sido recolectada o en caso contrario refrigerala> MATERIA" < REACTI O!: Material biolgico: M&estra fecal en &n frasco estril> MEDIO! DE C#"TI O: *lacas de agar !MB 8Agar !osina . A+&l de Metileno@ *lacas de agar MacConDe. *lacas de agar SS 8Agar para Salmonella . S,igella@ *lacas de agar LLD 8Agar Lilosa Lisina Deso<icolato@

 *lacas de agar Agar Berde Brillante *lacas de agar ''5 *lacas de agar Bigg. *lacas de agar S&lfito de Bism&to Caldo de enri;&ecimiento Selenito o tetrationato Prue7as Bio3u6/icas$ Citrato de Simmons Agar de ,ierro Uligler 8UIA@ Agar de ,ierro lisina 8LIA@ Agar MIO Agar SIM Agar "o$o de Metilo Agar "o$o de Fenol con Manitol Agar "o$o de Fenol con Sacarosa Caldo Urea Agar Fenilalanina Agar #elatina REACTI O!: A+&l de metileno "eacti%o de Uo%acs "o$o de metilo Sol&cin de alfaGnaftol al 2X Sol&cin de UO9 al 15X

OTRO! MATERIA"E!: Mec,ero b&nsen Asa bacteriolgica *ortaob$etos Microscopio Aceite de inmersin C&brebocas #&antes de late< #afas de proteccin Cinta masDin Lapi+ graso #asas #radilla

PROCEDIMIENTO: '> !LAM!7 MAC"OSCO*ICO D! LA MU!S "A

Obser%ar el aspecto . la consistencia de la m&estra= si ,a. presencia de moco . sangre>

1. E8AMEN MICRO!COPICO DE "A M#E!TRA a@ Colocar &na pe;&eEa porcin de ,eces sobre &n portaob$etos con &n aplicador de madera= me+clar m&. bien agregando antes de ) a / gotas de a+&l de metileno>

b@ Colocar &n c&breob$etos . desp&s de ) a / min&tos obser%ar al microscopio con el ob$eti%o seco f&erte= tratar de identificar le&cocitos los c&ales se presentan c&ando alg&nas bacterias in%aden el colon como Salmonella= S,igella= Tersinia . !> coli enteroin%asi%a>

2. C#"TI O

'> Con &n ,isopo estril= se toma &na pe;&eEa porcin de materia fecal8 de preferencia de donde ,a.a moco . sangre@> )> Descargar el inoc&lo en cada &na de las placas con medio de c&lti%o para el aislamiento primario . &na placa para aislamiento selecti%o> /> Desp&s de ,aber descargado la m&estra en cada &no de los medios= el ,isopo &tili+ado se introd&ce en &n t&bo ;&e contiene caldo de enri;&ecimiento . se inc&ba de 3 P '( ,oras a /0 5C> 1> !n las ca$as con el inoc&lo sembrar la m&estra reali+ando estras cr&+adas para obtener el aislamiento de las colonias> 2> Inc&bar las placas a /0 5C d&rante )1 ,oras> 3> "esembrar la m&estra con el ,isopo ;&e se inc&bo en el caldo de enri;&ecimiento= en los medios SS . agar s&lfito de bism&to> 0> Inc&bar las placas a /0 5C d&rante )1 ,oras> (> "e%isar las placas= obser%ar la morfologa colonial= morfologa microscpica= b&scando las colonias de bacterias patgenas= sembrar pr&ebas bio;&micas . reali+ar las pr&ebas correspondientes para s& identificacin> Las pr&ebas bio;&micas se inc&ban a /0 5C d&rante )1 ,oras> 4> Leer las pr&ebas bio;&micas e identificar mediante las tablas correspondientes>

"U A D! "ABASO "!SUL ADOS DISCUSIO7 CO7CLUSIO7 BIBLIO#"AFIA

)PRACTICA No. 1=,

E8#DADO AGINA"
OBJETI O GENERA": A&e los est&diantes aprendan a reali+ar todo el procesamiento para &n c&lti%o %aginal e identifi;&e las bacterias patgenas de inters clnico> OBJETI O! PARTIC#"ARE! : '>G )>G />G INTROD#CCION:
!l tracto %aginal femenino se di%ide en dos porciones: el inferior= constit&ido por %&l%a= %agina . cr%i<= . el s&perior en donde se locali+a el -tero= las trompas de Falopio . los o%arios> Las afecciones infecciosas de la +ona inferior se deben com-nmente a microorganismos de transmisin se<&al . en la s&perior son ocasionadas con ma.or frec&encia por los integrantes de la flora ,abit&al= los c&ales llegan a despla+arse a partir del tracto inferior= apro%ec,ando di%ersas irreg&laridades ;&e fa%orecen esta sit&acin> Ba$o la infl&encia ,ormonal el epitelio de la %agina contiene sin ning-n riesgo &na gran cantidad de bacterias= entre las ;&e predominan los lactobacilos= estreptococos= bacteroides= enterobacterias . corinebacterias> !l fl&$o %aginal est: formado por moco endocer%ical= cl&las de descamacin . bacterias> Los agentes ca&sales de la %&l%o%aginitis mas com&nesK C:ndidasp= ric,omonas %aginalis= #ardnerella %aginalis . 7eisseria gonorr,oae> Menos com-n C,lam.dia trac,omatis>

La infeccin %aginal casi siempre %a asociada a la de la %&l%a e incl&so a men&do casi siempre a la +ona perianal= en general da l&gar a fl&$o= m&c,as %eces con pr&rito= esco+or al orinare incl&so %erdadero dolor espontaneo> `lceras . c,ancros p&eden deberse a reponema pallid&m o 9aemop,il&s d&cre.i> !n condiciones de sal&d los integrantes de la flora genital femenina solo coloni+an la regin inferior= destacando la constancia de los estreptococos del gr&po %iridans= los estafilococos coag&lasa negati%os 8!C7@= 7eisseria lactamic&s= Beillonella sp>= !streptococos agalactiae= difteroides= M.cobacteri&ms megmatis=Candida albicans . dada la cercana del recto= los !nterococ&s sp>=*se&domonas aer&ginosa . ciertas !nterobacterias= la obser%acin de las tres -ltimas se restringe a personas ;&e m&estran menores c&idados respecto a s&s ,:bitos de ,igiene> *ara el diagnstico es necesario &n interrogatorio c&idadoso= &na e<ploracin genital . de la regin perineal e ing&inal> !l e<amen de las m&estras femeninas es &n poco complicado por la aparicin de &na gran %ariedad da bacterias en la %agina normal= por tal moti%o es de gran importancia obtener material con la menor contaminacin posible> !n el laboratorio= el diagnostico se lle%a a cabo mediante el aislamiento e identificacin del microorganismo en las secreciones o los raspados &retrales o endocer%icales= deben recolectarse dos m&estras de cada paciente= &na de ellas para reali+ar &n frotis . teEir con gram . la otra mediante rotacin del ,isopo sobre la s&perficie del medio de c&lti%o ,a.er Martin . en &na gelosa c,ocolate debido a ;&e alg&nos gonococos res&ltan sensibles a la %ancomicina contenida en el ,a.er Martin= son colonias pe;&eEas gris:ceas de bordes reg&lares . resembrar '5 de ellas en otra placa de gelosa c,ocolate= para ;&e el crecimiento res&lte s&ficiente para reali+ar frotis . teEir con #ram= b&scar diplococos #ramnegati%os= O<idasa positi%a> !n el diagnstico de laboratorio se sig&en los sig&ientes pasos: omar el p9 del e<&dado %aginal= es importante p&es la acide+ de la %agina e%ita el desarrollo de grmenes infecciosos= si se detecta &n p9 alcalino podemos sospec,ar de &na posible infeccin> "eali+ar &n est&dio en fresco>G!ste procedimiento se &tili+a principalmente para la b-s;&eda de ric,omonas %aginalis= ;&e permite la obser%acin en %i%o del parasito> ambin p&ede obser%arse la flora bacteriana= le%ad&ras . las cl&las cla%e 8;&e son patognomnicas de gardnerella%aginalis@>

9acer &n frotis teEido con #ram>G!n este frote se debe b&scar principalmente si ,a. reaccin inflamatoria . obser%ar el tipo de flora bacteriana> !l c&lti%o>Gse ,ace com-nmente &tili+ando los sig&iente medios de c&lti%o: ,a.er martin= agar de Cassman= medio ''5 o sal . manitol= Agar Bigg.> *ero la seleccin de los medios depende de los frotis teEidos con #ram> La identificacin esta en base al microorganismo aislado> C&ando se sospec,a de reponema pallid&m ,a. ;&e reali+ar tcnicas especiales de identificacin> Sin embargo el &so de pr&ebas serolgicas 8BD"L@ simplifica el &so de estos mtodos> MATERIA": MEDIO! DE C#"TI O. Agar ,a.er Martin Agar ''5 o sal . manitol Medio Bigg. o 7icDerson Agar sangre de cassman Agar C,ocolate> Agar MacConDe. Agar M&eller9inton o so.a tripticasa Bateria de pr&ebas bio;&micas

REACTI O!.0

Colorantes para la tincin de #ram Sol&cin fisiolgica 8!n t&bo de '/ < '55 mm>@ "eacti%o para o<idasa "eacti%o para catalasa 9idr<ido de sodio al 5>2X *lasma Discos para antibiograma

OTRO! MATERIA"E!: 9isopos estriles !spec&lo bi%al%o estril 8espe$o %aginal@ irillas de p9 Microscopio comp&esto *ortaob$etos . c&breob$etos Aceite de inmersin Asa bacteriolgica !st&fa bacteriolgica Mec,eros Bata C&bre bocas #afas de proteccin #orro ;&ir-rgico #&antes de l:te<

PROCEDIMIENTO: A> "!COM!7DACIO7!S *A"A LA *ACI!7 ! '@ La paciente no debe &tili+ar= ni administrarse antes de la toma de m&estra sol&ciones antispticas %aginales 8d&c,as %aginales@= %&los ni pomadas )@ La paciente no debe encontrarse ba$o tratamiento antimicrobiano= s&spenderlo 0) ,oras antes de la toma de m&estra> /@ La paciente deber: ,acerse aseo e<terno antes de la toma de m&estra> B> OMA D! MU!S "A '> Colocar a la paciente en posicin ginecolgica e introd&cir el espe$o %aginal estril sin l&bricante 8si es necesario l&bricar= &tili+ar ag&a templada estril@= abrir el espe$o ,asta donde sea con%eniente para la toma de m&estra= locali+ando el cr%i<> )> Obser%ar el aspecto en general del c&ello &terino . la %agina= el aspecto del fl&$o= para locali+ar la infeccin 8%aginitis= cer%icitis o cer%ico%aginitis@> /> Introd&cir lo ,isopos 8)@ . obtener la m&estra de la +ona con ma.or e<&dado= o en s& defecto del fondo del saco %aginal posterior o de la +ona endocer%ical> C> *"OC!SAMI!7 O '> Con el primer ,isopo= tomar la m&estra del saco %aginal= posteriormente introd&cirlo en &n t&bo ;&e contenga ) ml de sol&cin salina estril e inc&bar a /0 5C= . b&scar en ella la

)>

/> 1>

2> 3>

presencia de ric,omonas %aginalis= colocando &na gota de la s&spensin en &n portaob$etos . colocar &n c&breob$etos= re%isar con los ob$eti%os de '5L . 15 L> Con el seg&ndo ,isopo frotar la tirilla de p9 . con este mismo rodarlo sobre &n portaob$etos para ,acer &n frote= posteriormente fi$arlo al calor= teEirlo con la tcnica de #ram . obser%ar al microscopio con el ob$eti%o de '55 <> !n esta preparacin se b&sca la presencia de cl&las cla%e= la resp&esta inflamatoria8presencia de le&cocitos@=in%estigar si e<isten 7eisserias intracel&lares= cabe seEalar ;&e = en caso de detectarse las estr&ct&ras correspondientes a 7eisseria gonorr,oeae= no se p&ede aseg&rar ;&e sea el agente ca&sal de la infeccin= .a ;&e en la flora normal de la %agina se enc&entra 7eisseria lactamic&s> Finalmente reporte el tipo de flora bacteriana presente> Con el &ltimo ,isopo tomado del endocer%i<= inoc&lar en cada &no de los medios de c&lti%o= en el medio de ,a.er Martin el inoc&lo es en forma de H6I . posteriormente se ,ace la diseminacin en forma cr&+ada con el asa bacteriolgica= en los dem:s medios se disemina el inoc&lo por estra cr&+ada> Inc&bar las placas a /0 C d&rante )1 ,oras> Las placas de agar sangre Cassman . ,a.er Martin se inc&ban en c:maras con tensin de CO)> "e%isar las placas e identificar los microorganismos aislados= a las colonias sospec,osas se les reali+an pr&ebas bio;&micas para s& identificacin>

REPORTAR E" C#"TI O DE" E8#DADO AGINA" DE "A !IG#IENTE MANERA: 7OMB"!:D!L *ACI!7 !: !DAD: S!LO: I*O D! !S UDIO: !LAM!7 MAC"OSCO*ICO: !LAM!7 MIC"OSCO*ICO: "!SUL ADO D!L CUL IBO:

A7 IBIO#"AMA F!C9A T "!S*O7SABL!

7O A: DIS!^! !L FO"MA O D!L "!*O" ! *A"A !7 "!#A" AL *ACI!7 !>

R#TA DE TRABAJO. RE!#"TADO!: DI!C#!I9N: CONC"#!I9N: BIB"IOGRA3GA:

)PRACTICA No. 1K,

E8#DADO #RETRA"
OBETI O GENERA":

A&e el est&diante aprenda a todo el procesamiento para reali+ar &n e<&dado &retral . logra la identificacin de las bacterias de inters medico . clnico ;&e afectan esta +ona anatmica>

OBJETI O! PARTIC#"ARE!: '>G )>G />G INTROD#CCION. !l aparato genital masc&lino esta constit&ido por: los testc&los= los canales del epiddimo= cond&cto deferente= %esc&las seminales= canales e.ac&ladores= la prstata . el pene> La &retra es la -nica regin ;&e posee flora bacteriana normal= todos los dem:s rganos son estriles> La flora normal de la &retra incl&.e !stafilococos epidermidis= Corinebacterias= di%ersos anaerobios= 7eisseriasp>= estreptococos> Deba$o del prep&cio del %arn no circ&ncidado p&ede albergar Micobacteri&msmegmatis= $&nto con otras bacterias grampositi%as>

La principal etiologa indi%id&al especifica de la &retritis ag&da es la 7eisseriagonorr,oeae> Se da la denominacin colecti%a de &retritis no gonoccica 8U7#@ a la inflamacin &retral de todas las otras etiologas= incl&.ndose la Clam.diatrac,omatis= Ureaplasma&real.tic&m . recientemente se ,a in%ol&crado a M.coplasmagenital&m> !ntre las ca&sas no com&nes de &retritis no gonoccica esta el %ir&s ,erpes simple<= ric,omonas%aginalis= #ardnerella%aginalis> !stas infecciones del tracto genital masc&lino se caracteri+an por presentar los sig&ientes signo . sntomas: secrecin &retral serosa o p&r&lenta= ardor &retral . ,emat&ria terminal= as como tambin &lceras> !l diagnostico de gonorrea p&ede establecerse en los ,ombres ;&e se presentan con &na &retritis s&p&rati%a ag&da= tambin p&eden estar presentes grados %ariables de epididimitis> C&ando la descarga &retral es esca+a . los diplococos intracel&lares no aparecen en &na m&estra al a+ar= la toma de la primera m&estra de la maEana= antes de orinar= s&ele ser -til> !l e<&dado p&ede e<traerse con s&a%idad por el orificio &retral mediante &na delicada presin del pene= si no se obtienen material con rapide+ p&ede insertarse la p&nta de &n ,isopo delgado de ra.n= dacron o algodn en &n soporte de al&minio o pl:stico de / o 1 cm en la &retra anterior> !s con%eniente ;&e el ,isopo permane+ca en el l&gar &nos pocos seg&ndos= para ;&e las fibras se sat&ren con el e<&dado> Si se esta obteniendo &na m&estra para el c&lti%o de clamidias= el ,isopo deber: rotarse /355C para despegar cl&las epiteliales> A diferencia de 7eisseriagonorr,oeae= ;&e ,abita en el e<&dado= C,lam.dia trac,omatis es estrictamente intracel&lar . se alo$a en las cl&las epiteliales &retrales> Si no se obser%an diplococos gramnegati%os intracel&lares= p&eden considerarse &na &retristis no gonoccica ca&sada por C,lam.dia trac,omatis>

MATERIA": MEDIO! DE C#"TI O. Agar ,a.er Martin Agar ''5 o sal . manitol Medio Bigg. o 7icDerson Agar sangre de cassman Agar C,ocolate> Agar MacConDe. Agar M&eller9inton o so.a tripticasa Bateria de pr&ebas bio;&micas

REACTI O!.0 Colorantes para la tincin de #ram Sol&cin fisiolgica 8!n t&bo de '/ < '55 mm>@ "eacti%o para o<idasa "eacti%o para catalasa 9idr<ido de sodio al 5>2X *lasma Discos para antibiograma

OTRO! MATERIA"E!:

9isopos estriles irillas de p9 Microscopio comp&esto *ortaob$etos . c&breob$etos Aceite de inmersin Asa bacteriolgica !st&fa bacteriolgica Mec,eros Bata C&bre bocas #afas de proteccin #orro ;&ir-rgico #&antes de l:te<

*"OC!DIMI!7 O: '> !l e<&dado p&ede e<traerse con s&a%idad por el orificio &retral mediante &na delicada presin del pene= si no se obtienen material con rapide+ p&ede insertarse la p&nta de &n ,isopo delgado de ra.n= dacron o algodn en &n soporte de al&minio o pl:stico de / o 1 cm en la &retra anterior> !s con%eniente ;&e el ,isopo permane+ca en el l&gar &nos pocos seg&ndos= para ;&e las fibras se sat&ren con el e<&dado> Si se esta obteniendo &na m&estra para el c&lti%o de clamidias= el ,isopo deber: rotarse /355C para despegar cl&las epiteliales> )> ambin se debe de reali+ar &n frote para teEirlo con gram del material obtenido>

/> *ara el caso de 9aemop,il&sd&cre.i= si en el e<tendido se obser%an cocobacilos gramnegati%os entreme+clados en cadenas o en largos cordones paralelos 8card-menes@= res&ltan patognomicos del c,ancro blando> 1> 9acer &n est&dio en fresco> 2> !n el c&lti%o de r&tina se emplean los medios: ,a.er Martin= medios ''5 o sal . manitol= gelosa sangre= Medio !MB= MacConDe.= Medio Bigg.> 3> Introd&cir &n ,isopo en &n medio de ransporte St&art . mantenerlo a temperat&ra ambiente= o preferentemente en est&fa a /25C ,asta s& procesamiento ;&e deber: ser antes de / P 3 ,oras> Con este ,isopo sembrar por estra cr&+ada cada &no de los medios de c&lti%o en placa e inc&bar a /25C d&rante )1 ,oras> 0> La identificacin depender: del microrganismo aislado> (> "eali+ar a las colonias sospec,osas o<idasa= catalasa= reportar morfologa microscpica . morfologa colonial> 4> 9acer pr&ebas Bio;&micas para la identificacin> '5> "eali+ar antibiograma "!*O" A" !L CUL IBO D!L !LUDADO U"! "AL D! LA SI#UI!7 ! MA7!"A:

7OMB"!:D!L *ACI!7 !: !DAD: S!LO: I*O D! !S UDIO: !LAM!7 MAC"OSCO*ICO: !LAM!7 MIC"OSCO*ICO: "!SUL ADO D!L CUL IBO: A7 IBIO#"AMA F!C9A T "!S*O7SABL!

7O A: DIS!^! !L FO"MA O D!L "!*O" ! *A"A !7 "!#A" AL *ACI!7 !>

R#TA DE TRABAJO. RE!#"TADO!: DI!C#!I9N: CONC"#!I9N: BIB"IOGRA3GA:

)PRACTICA No. 1N,

E8#DADO NA!A"
OBJETI O GENERA" A&e los est&diantes aprenda a reali+ar la toma de m&estra para reali+ar &n e<&dado nasal= s& procesamiento . la identificacin de microorganismos ca&santes infecciones nasales> OBJETI O! PARTIC#"ARE!: +.0 )>G INTROD#CCION: Las bacterias ;&e normalmente se enc&entran en la nari+= son estafilococos= ;&e generalmente se consideran como el refle$o de la piel facial> ambin se enc&entran con poca frec&encia corinebacterias como son 9> infl&en+ae= Bran,amellacatarr,alis> Las infecciones de la nari+= no afectan solamente a la nari+ propiamente dic,a= sino tambin a &nas ca%idades denominadas senos paranasales= ;&e se enc&entran a s& alrededor . c&.a inflamacin se denomina sin&sitis> La inflamacin de la m&cosa de las fosas nasales se denomina rinitis> !ntre los signos . sntomas ;&e nos indican la infeccin nasal tenemosK rinorrea= estorn&dos= obstr&ccin nasal= cefalea discreta . alg&nas %eces fiebre>

Los agentes ;&e se enc&entran como ca&santes de infecciones nasales tenemos a !stafilococos a&re&s=!streptococo= p.ogenes= estreptococos pne&moniae= Bacteroides= =!sc,eric,iacoli= 8solo en niEos pe;&eEos@= Ulebsiellar,inoscleromatis=*se&domonaaer&ginosa= Candidaalbicans . 7eisseriameningitidis . otros anaerobios de los senos ma<ilares> !ntre la microbiota normal de la nari+ se enc&entran !stafilococos coag&lasa negati%os= Streptococos%iridans= alg&nas especies de 9aemop,il&s= . especies de 7eiseria> MA !"IAL T "!AC IBOS: E5uipo: !st&fa bacteriolgica "efrigerador A&tocla%e Microscopio ptico Material: Mec,eros Asas bacteriolgicas 9isopos estriles L:pi+ graso *ortaob$etos Ca$as de *etri desec,ables estriles *ortaob$etos Cinta masDing tape &bos de ensa.e con tapn de rosca de '/ < '55 mm &bos de ensa.e sin tapn de '/ < '55 mm Bata de laboratorio C&bre bocas

#&antes de l:te< #afas de proteccin #orro ;&ir-rgico Man&al de *racticas Cerillos o encendedor #asas Atomi+ador Franela #radilla

Reacti/os: "eacti%o para o<idasa . catalasa "eacti%o de ro$o de metilo "eacti%o de Uo%acs Aceite de inmersin Colorantes para incin de #ram Discos para Antibiograma Clor&ro frrico al 2X 9idr<ido de *otasio al 15X

 Medios de culti/o: Agar gelosa sangre Agar ''5 Agar !MB Agar sal . manitol Agar MacConDe. Agar M&eller9inton Agar Bigg. Agar So.a tripticasa Prue%as Bio5u-'icas: Agar citrato de Simmons Agar LIA Agar UIA Agar MIO Agar "OSO D! M! ILO O M"GB* Caldo ro$o de fenol con sacarosa Caldo ro$o de fenol con manitol Agar difenildesaminasa Caldo &rea Agar gelatina Agar SIM

DE!ARRO""O: !l diagnostico de infecciones nasales se ,ace a tra%s de &n c&lti%o de e<&dado nasal= de la manera sig&iente: A> OMA D! MU!S "A !l e<&dado se obtiene con ,isopos ;&e se introd&cen en la nari+>

B>

I7CIO7 D! #"AM Al ig&al ;&e en el e<&dado farngeo= el frote es indicati%o de ;&e si ,a. o no infeccin>

C> CUL IBO !n el c&lti%o de r&tina la m&estra se siembra en los medios de #elosa sangre= Agar MacConDe. o Medio !MB= Medio ''5 o Sal . Manitol . Bigg. o 7icDerson> D> ID!7 IFICACIO7 '> Ser: de ac&erdo al organismo ;&e se aisl . ;&e sea sospec,oso de ser ca&sante de la infeccin> )> "e%isar las placas . si ,a. crecimiento identificar al microrganismo= relacionando con la obser%acin del frote> /> "eali+ar a las colonias sospec,osas o<idasa= catalasa= reportar morfologa microscpica . morfologa colonial> 1> 9acer pr&ebas Bio;&micas para la identificacin> 2> "eali+ar antibiograma

Ruta de Tra%a.o. Resultados: Discusin: Conclusin: Bi%lio$raB-a:

)PRACTICA No.1O,
C#"TI O DE E8#DADO OC#"AR
OBJETI O GENERA": A&e el est&diante aprenda a reali+ar la metodologa correcta para la toma de m&estra de &n e<&dado oc&lar= s& procesamiento e identificacin de bacterias de inters clnico> OBJETI O! PARTIC#"ARE!:
'>G )>G />G

INTROD#CCION

La recoleccin de m&estras en los casos de infecciones oc&lares son m&. difciles= p&esto ;&e la m&estra obtenida res&lta en general m&. pe;&eEa . p&eden e<istir pocos microrganismos> Los medios de c&lti%o se inoc&laran en el momento de recoger las m&estras para en%iarlas al laboratorio> odos lo medios se deben inc&bar d&rante &n mnimo de 2 das> A&n;&e la ma.ora de los patgenos oc&lares crecen con rapide+ 8por e$emplo Stap,.lococc&sa&re&s= Streptococc&spne&moniae= Streptococc&sp.ogenes= 9aemop,il&sinfl&en+ae= 9aemop,il&ssp>= *se&domonaaer&ginosa@= alg&nos re;&ieren inc&bacin prolongada 8por e$emplo estafilococos coag&lasa negati%os= 7eisseriagonorr,oeae@> Se deben reali+ar c&lti%os especiales si se sospec,a de infeccin oc&lar por C,lam.dia trac,omatis> A,ora se dispone de sistemas de deteccin de antgenos de clamidia ;&e &san antic&erpos monoclonales &nidos a fl&orescena> La presencia de c&erpos elementales caractersticos de C,lam.dia trac,omatis indica ;&e la pr&eba es positi%a> La sensibilidad de estas tcnicas es de apro<imadamente 42X . el res&ltado p&ede estar disponible en &na ,ora> Dado ;&e 9aemop,il&sinfl&en+ae . otras especies de 9aemop,il&s son ca&sa com-n de con$&nti%itis= se &sa agar c,ocolate para rec&perarlos al ig&al ;&e 7eisseriagonorr,oeae . especies de Mora<ella= ;&e en forma ocasional ca&san infecciones= sobre todo en recin nacidos . en niEos pe;&eEos> Se debe prestar atencin a la rec&peracin e identificacin inmediata de *se&domonasaer&ginosa de c&lti%o de o$os= .a ;&e este microrganismo p&ede ser altamente %ir&lento . pro%ocar &na ceg&era progresi%a> Bacill&ss&btilis= tambin p&ede ca&sar infecciones en el o$o l&ego de alg-n tra&matismo> Alg&nas infecciones tambin p&eden ser ocasionadas por C:ndidaalbicans> Dentro de la microbiota normal de la con$&nti%a podemos encontrar Stap,.lococc&scoag&lasa negati%os= Streptococc&s%arias especies> Signos . sntomas: Secrecin con$&nti%al= serosa o p&r&lenta= enro$ecimiento con$&nti%al 89iperemia@= o$o ro$o= dolor oc&lar . sensibilidad>

MATERIA"E REACTI O! <MEDIO! DE C#"TI O:

E5uipo:0 o !st&fa bacteriolgica o Microscopio ptico o A&tocla%es

Material.0 o Asas bacteriolgicas o "efrigerador o Matraces !rlenme.er o *robetas o *ipetas grad&adas o &bos de ensa.e de '/ L '55 mm con . sin tapn de rosca o *ortaob$etos o C&bre bocas o #afas de proteccin o #&antes de l:te< o Mec,eros o #asas o Algodn

 Reacti/os.0
o o o o o o Colorantes para #ram Aceite de inmersin "eacti%o para o<idasa . catalasa Alfa naftol UO9 Uo%acs= Clor&ro frrico= "o$o de metilo

Medios de culti/o: o Agar gelosa sangre o Agar C,ocolate o Agar a.er Martin o Agar ''5 o Agar !MB o Agar sal . manitol o Agar MacConDe. o Agar M&eller 9inton o Agar Bigg. o Agar So.a tripticasa Prue%as Bio5u-'icas: o Agar citrato de Simmons o Agar LIA o Agar UIA o Agar MIO o Agar "OSO D! M! ILO O M"GB* o Caldo ro$o de fenol con sacarosa o Caldo ro$o de fenol con manitol o Agar difenildesaminasa o Caldo &rea o Agar gelatina o Agar SIM

DE!ARRO""O:
!<&dados oc&lares: '@ Frotis con$&nti%ales Obtener la m&estra antes de la aplicacin de analgsicos locales= colirios o antibiticos> Con &na tor&nda de alginato c:lcico= ,&medecido con sol&cin salina estril= frotar sobre la con$&nti%a tarsal inferior . el frmi<= colocarlos en medio de transporte St&art= transportar inmediatamente . mantenerlos a temperat&ra ambiente> *ara la in%estigacin de C,lam.dia trac,omatis= %oltear el parpado . frotar con &n ,isopo la s&perficie con$&nti%al= &sar &n ,isopo para cada o$o> Se &tili+a &n medio de transporte especfico 8H)GS*I@>

)@ "aspados con$&nti%ales Colocar &na o dos gotas de anestsico local 8clor,idrato de propacaina al 5>2X= es el ;&e menos in,ibe el crecimiento bacteriano@> "aspar s&a%emente con &na esp:t&la de platino fle<ible de Uim&ra la con$&nti%a tarsal inferior= sin ind&cir al sangrado> !l material obtenido se colocara en &n portaob$etos limpio . se fi$ara con metanol al 42X d&rante 2 a '5 min&tos> Una %e+ fi$ados los portaob$etos no re;&ieren medidas especiales para s& transporte . conser%acin> eEir con #ram> /@ "aspados corneales Ig&al ;&e los raspados con$&nti%ales> "eali+ar el raspado de m-ltiples :reas de &lceracin> !s importante ;&e cada raspado se inoc&le directamente en los medios de c&lti%o> 1@ Inc&bar las placas a /05C d&rante )1 ,oras> La placa de agar sangre inc&bar en tensin de CO)> 2@ "e%isar las placas ,acer las pr&ebas de identificacin necesarias de las colonias sospec,osas de ser patgenas> "!*O" A" !L CUL IBO D!L !LUDADO OCULA" D! LA SI#UI!7 ! MA7!"A: 7OMB"!:D!L *ACI!7 !: !DAD: S!LO: I*O D! !S UDIO: !LAM!7 MAC"OSCO*ICO: !LAM!7 MIC"OSCO*ICO: "!SUL ADO D!L CUL IBO: A7 IBIO#"AMA F!C9A T "!S*O7SABL!

7O A: DIS!^! !L FO"MA O D!L "!*O" ! *A"A !7 "!#A" AL *ACI!7 !> R#TA DE TRABAJO. RE!#"TADO!: DI!C#!I9N: CONC"#!I9N: BIB"IOGRA3GA:

)PRACTICA No.2@,
C#"TI O DE E!P#TO
OBJETI O GENERA": A&e el est&diante cono+ca la metodologa para la toma de m&estras de esp&to para reali+ar &n c&lti%o= . adem:s identificara las bacterias de inters clnico . medico> OBJETI O! PARTIC#"ARE!: '>G )>G

/>G INTROD#CCION:
!l esp&to 8Secrecin broncop&lmonar@ es &n material clnico ;&e nos sir%e para establecer el diagnostico de infecciones en %as respiratorias ba$as= las c&ales son la laringe= tra;&ea= bron;&ios= bron;&iolos . al%eolos p&lmonares= siendo estas estr&ct&ras normalmente estriles> !l esp&to e<pectorado esta ine%itablemente contaminado 8 . es difcil e%itarlo@ con la flora orofaringea> *or esta ra+n= la m&estra se debe est&diar microscpicamente para %alorar el grado de contaminacin oral . el posible %alor de la m&estra La contaminacin de la m&estra en las %as areas altas se p&ede e%itar si se &sa &n broncoscopio protegido= la aspiracin transtra;&eal o la aspiracin p&lmonar directa>!l empleo de esta tcnicas in%asi%as para recoger &na m&estra sin contaminacin= es necesario en caso de infeccin broncop&lmonar por anaerobios> La ma.ora de los patgenos del tracto respiratorio ba$o crecen en ) o / dias= a&n;&e ;&is+as se necesite tiempo para el aislamiento . la identificacin de las bacterias> Se p&eden &tili+ar di%ersas tcnicas para recoger m&estras de las %as respiratorias inferiores= como la e<pectoracin espontanea o ind&cidad con sol&cin salina= labroncoscopia . el la%ado broncoal%eolar= la aspiracin transtra;&eal 8rara %e+ &sada ,o. en dia@ . la aspiracin directa a tra%s de la pared tor:cica> Los signos . sntomas ;&e nos p&eden indicar infecciones del tracto respiratorio de las %as ba$as son: tos sang&inolenta o intensa= dolor de pec,o . disnea= fiebre . escalofros> !l e<amenmicroscpico . el c&lti%o del esp&to e<pectorado sig&en siendo los pasos f&ndamentales de la e%al&acin del laboratorio de la ne&mona a pesar de la contin&a contro%ersia referente a s& sensibilidad . especificidad> !l e<amen de esp&to debe incl&ir la obser%acin del color= la cantidad= la consistencia . el olor de la m&estra> Se ,alla con ma.or frec&encia esp&to m&cop&r&lento en la ne&mona bacteriana o bron;&itis> La m&estra de esp&to debe e<aminarse ,aciendo &n e<tendido 8frote@ teEido con #ram= para determinar si la m&estra es o no con%eniente para el c&lti%o> Se ,an diseEado diferentes sistemas de clasificacin para e%al&ar la calidad de m&estras de esp&to en la coloracin de #ram= sobre la base del n-mero relati%o de cl&las epiteliales escamosas . ne&trfilos segmentados> Las m&estras con &n gran n-mero de cl&las epiteliales escamosas 8)2 cl&las o mas por campo de ba$a ampliacin@ . sin bacterias predominantes asociadas con le&cocitos= no deben ser &tili+adas para c&lti%o> Sin embargo la presencia de pocas cl&las epiteliales o ning&na . mas de )2 le&cocitos polimorfon&cleares indica ;&e se trata de &na m&. b&ena m&estra para reali+ar el c&lti%o> Se deben registrar las caractersticas morfolgicas . de tincin de todas las bacterias . se debe efect&ar &na estimacin de los microrganismos predominantes= ;&e orienta ,acia la etiologa de la infeccin> Los microrganismos ;&e se ,a.an relacionados con ma.or frec&encia con las infecciones bacteriana ag&das de las %as respiratorias ba$as son: 7e&mococos= !stafilococos a&re&s= 9aemop,.l&sinfl&en+ae= bacterias anaerobias mi<tas= !nterobacterias=*se&domonaaer&ginosa . especies de Legionella= Streptococospne&moniae= Ulebsiellapne&moniae= Mora<ellacatarr,alis=F&sobacteri&mn&cleat&m= *re%otellamelaninogenic&s . otros anaerobios= !species de Bordetella>

*ara el c&lti%o de r&tina se &tili+an los medios ;&e permitan el aislamiento de los microrganismos patgenos citados anteriormente= como el agar sangre= agar c,ocolate= medio ''5 . MacConDe.> "ecientemente se ,an introd&cido %arias tcnicas diagnosticas para la identificacin mas precisa . r:pida de los agentes etiolgicos de ne&mona= a&n;&e m&c,as de esta tcnicas son de gran inters= a&n no se ,a determinado s& aplicabilidad general>

MATERIA"E E7#IPOE REACTI O! < MEDIO! DE C#"TI O : MATERIA" BIO"OGICO M&estras de esp&to en frasco estril

 !;&ipo: !st&fa bacteriolgica "efrigerador A&tocla%e Microscopio ptico Material: o Mec,eros o Asas bacteriolgicas o 9isopos estriles o L:pi+ graso o *ortaob$etos o Ca$as de *etri desec,ables estriles o *ortaob$etos o Cinta masDing tape o &bos de ensa.e con tapn de rosca de '/ < '55 mm o &bos de ensa.e sin tapn de '/ < '55 mm o Bata de laboratorio o C&bre bocas o #&antes de l:te< o #afas de proteccin o #orro ;&ir-rgico o Man&al de *racticas o Cerillos o encendedor o #asas o Atomi+ador o Franela o #radilla Reacti/os: "eacti%o para o<idasa . catalasa "eacti%o de ro$o de metilo "eacti%o de Uo%acs Aceite de inmersin Colorantes para incin de #ram Discos para Antibiograma Clor&ro frrico al 2X 9idr<ido de *otasio al 15X

Medios de culti/o: Agar gelosa sangre Agar ''5 Agar !MB Agar sal . manitol Agar MacConDe. Agar M&eller9inton

 Agar Bigg. Agar So.a tripticasa Prue%as Bio5u-'icas: Agar citrato de Simmons Agar LIA Agar UIA Agar MIO Agar "OSO D! M! ILO O M"GB* Caldo ro$o de fenol con sacarosa Caldo ro$o de fenol con manitol Agar difenildesaminasa Caldo &rea Agar gelatina Agar SIM

PROCEDIMIENTO: '> Obser%ar el aspecto de la m&estra= color= cantidad= consistencia . el olor de la m&estra> )> *reparar &n frote directo de la m&estra . teEirlo con la tcnica de #ram= obser%ar la presencia de reaccin inflamatoria 8"I!@= flora bacteriana= cel&las epiteliales . determinar si la m&estra es o no con%eniente para el c&lti%o> /> Con &n ,isopo esteril= seleccionar las partc&las sang&inolentas= p&r&lentas o caseosas de la m&estra e inoc&lar en los medios proporcionados> *osteriormente ,acer estria cr&+ada> 1> Inc&bar las placas a /05C d&rante )1 ,oras> La placa de agar sangre inc&bar en tensin de CO)> 2> "e%isar las placas ,acer las pr&ebas de identificacin necesarias de las colonias sospec,osas de ser patgenas> "!*O" A" !L CUL IBO D! !S*U O D! LA SI#UI!7 ! MA7!"A: 7OMB"!:D!L *ACI!7 !: !DAD: S!LO: I*O D! !S UDIO: !LAM!7 MAC"OSCO*ICO: !LAM!7 MIC"OSCO*ICO: "!SUL ADO D!L CUL IBO: A7 IBIO#"AMA F!C9A T "!S*O7SABL!

7O A: DIS!^! !L FO"MA O D!L "!*O" ! *A"A !7 "!#A" AL *ACI!7 !>

R#TA DE TRABAJO. RE!#"TADO!: DI!C#!I9N:

CONC"#!I9N: BIB"IOGRA3GA:

)PRACTICA No. 2+,

C#"TI O DE !ECRE!IONE!E ;ERIDA! < ABCE!O!
OBJETI O GENERA":

A&e el est&diante cono+ca cmo se reali+a la toma de m&estras= procesamiento e identificacin de microorganismos patgenos ;&e se enc&entran en ,eridas . abscesos infectados> OBJETI O PARTIC#"ARE!: '>G )>G />G INTROD#CCION: La piel es el rgano m:s grande ;&e re%iste todo el organismo . se contin-a a ni%el de orificios nat&rales con las m&cosas> La piel c&mple con n&merosas e importantes f&nciones entre las ;&e tenemos: f&ncin de proteccin= rgano de los sentidos= reg&ladora de los sentidos . secretoria> La piel al estar en contacto con el medio ambiente no es estril> !ntre los microrganismos ;&e e<isten como flora normal tenemos> Stap,.lococ&sepidermidis 8con ma.or ab&ndancia@= S> a&re&s>!streptococos 8especialmente del gr&po %iridans@= Acinetobactercalcoacetic&s= Bacill&ssp>= Cor.nebacteri&msp>= Micrococc&ssp>= candidaalbicans= etc> Las infecciones de ,eridas . abscesos oc&rren como complicaciones de operaciones ;&ir-rgicas= tra&matismos o enfermedades ;&e p&eden interr&mpir la s&perficie de &na m&cosa o de la piel> La nat&rale+a de la flora infectante depender: del problema s&b.acente . de la locali+acin del proceso> !n general los microrganismos ,allados son: Stap,.lococosa&re&s= Streptococosp.ogenes= !nterobacterias= *se&domonassp>= Candidasp>= . bacterias anaerobias> La ac&m&lacin de p&s= dentro de &n absceso o la e<&dacin de la s&perficie moco c&t:nea= di%ersos grados de enro$ecimiento= dolor e ,inc,a+n son sntomas ;&e p&eden estar presentes en las infecciones de ,eridas . abscesos>

Infecciones de ,eridas e<genas son a;&ellas asociadas con tra&matismos= morded&ras de animales o ,&manas= ;&emad&ras o c&erpos e<traEos en la piel o en las membranas m&cosas> Las ,eridas endgenas o abscesos p&eden asociarse con apendicitis> Colecistitis 8inflamacin de la %esc&la biliar@= cel&litis= infecciones dentales= osteomielitis= empiema= artritis sptica= sin&sitis o m&c,as otras infecciones internas> M&c,as de estas infecciones son ,ospitalarias deri%adas de manip&laciones ;&ir-rgicas o colocacin de prtesis> Otras deri%an de la diseminacin ,em:tica desde otro sitio de la infeccin o por e<tensin directa de contaminantes bacterianos de &na %scera rota= en partic&lar el colon> !l diagnostico de las infecciones de ,eridas comprende lo sig&iente: '> La correcta recoleccin de m&estras>G Las ,eridas s&perficiales con frec&encia est:n coloni+adas por bacterias pro%enientes del medio ambiente . en consec&encia las m&estras recogidas no refle$an la %erdadera ca&sa del proceso infeccioso> Los materiales clnicos &tili+ados son: aspirados o drena$e de las secreciones= ,isopado prof&ndo o drena$e p&r&lento= ,isopados del borde de la ,erida o de la prof&ndidad de la &lceracin . biopsia de te$ido> La aspiracin del li;&idoca%itario o p&s de las prof&ndidades de las ,eridas post&lares o %esic&lares . abscesos se reali+an con ag&$a . $eringa estriles= es el mtodo mas apropiado para obtener material para el c&lti%o> !l sitio de donde se %a a tomar la m&estra se la%a con $abn ;&ir-rgico . l&ego se desinfecta con alco,ol al 05 X e isodine> Si demora para procesar la m&estra se debe colocar en medio de transporte> Si el material se obtiene con &n ,isopo= es necesario separar los bordes con el p&lgar . el ndice de &na mano 8&sando g&antes estriles@

,a. ;&e tener c&idado de no tocar los bordes ad.acentes de piel= inoc&lar los medios de c&lti%o inmediatamente> )> incin de #ram a los materiales clnicos>G La tincin de #ram nos sir%e para la obser%acin de reaccin inflamatoria e<&dati%a . presencia de cl&las> Adem:s para obser%ar la flora bacteriana . esto es importante por ;&e nos sir%e con frec&encia de g&a para los medios . procedimientos apropiados a &sar> !ste procedimiento p&ede ,acerse antes de inoc&lar los medios de c&lti%o> /> C&lti%o !l c&lti%o como .a se indico estar: en relacin con la obser%acin ,ec,a en el frote. de la locali+acin del proceso> "&tinariamente los medios &tili+ados son: #elosa sangre= Mac ConDe.= Sal . manitol . Bigg. en condiciones anaerobias> Los mtodos anaerbicos no son m:s difciles ;&e los empleados en bacteriologa aerbica= sin embargo en los laboratorios de r&tina es difcil conseg&ir el material para la atmosfera anaerbica> Los medios de c&lti%o para anaerobios son: ioglicolato enri;&ecido= Agar sangre contripticasa de so.a= Agar Col&mbia con colistina . :cidos nalidi<ico= entre otros> MATERIA"E E7#IPOE REACTI O! < MEDIO! DE C#"TI O : MATERIA" BIO"OGICO M&estras de l;&ido de secreciones= ,eridas . abcesos E7#IPO: !st&fa bacteriolgica "efrigerador A&tocla%e Microscopio ptico MATERIA": Mec,eros Asas bacteriolgicas 9isopos estriles L:pi+ graso *ortaob$etos Ca$as de *etri desec,ables estriles *ortaob$etos Cinta masDing tape &bos de ensa.e con tapn de rosca de '/ < '55 mm &bos de ensa.e sin tapn de '/ < '55 mm Bata de laboratorio C&bre bocas #&antes de l:te< #afas de proteccin #orro ;&ir-rgico

Man&al de *racticas Cerillos o encendedor #asas Atomi+ador Franela #radilla

REACTI O!: "eacti%o para o<idasa . catalasa "eacti%o de ro$o de metilo "eacti%o de Uo%acs Aceite de inmersin Colorantes para incin de #ram Discos para Antibiograma Clor&ro frrico al 2X 9idr<ido de *otasio al 15X MEDIO! DE C#"TI O: Agar gelosa sangre Agar sal . manitol Agar MacConDe. Agar M&eller9intos Agar Bigg. Agar So.a tripticasa PR#EBA! BIO7#GMICA!: Agar citrato de Simmons Agar LIA Agar UIA Agar MIO Agar "OSO D! M! ILO O M"GB* Caldo ro$o de fenol con sacarosa Caldo ro$o de fenol con manitol Agar difenildesaminasa Caldo &rea Agar gelatina Agar SIM

PROCEDIMIENTO:
A> OMA D! LA MU!S "A '> Limpiar la s&perficie de la ,erida con alco,ol al 05X )> 9acer &n ,isopado de las :reas de la lesin lo m:s prof&ndamente posible= e%itar si es posible la s&perficie de la lesin= p&es la m&estra se contaminara con la flora normal de la piel . podra darnos res&ltados no confiables> /> Si se desea ,acer &na aspiracin de las secreciones= ,a. ;&e &sar &na $eringa estril . aspirar de las :reas de la lesin lo mas prof&ndo posible>

B> *"OC!SAMI!7 O D! LA MU!S "A '> Con &n ,isopo ,acer &n frote . teEirlo con #ram> Obser%arlo al microscopio= b&scar reaccin inflamatoria e<&dati%a 8"I!@= cl&las . flora microbiana> )> Con el otro ,isopo inoc&lar cada &no de los medios de c&lti%o= diseminar el inoc&lo con el asa correspondiente por estria cr&+ada>

/> Inc&bar las placas a /0 5C d&rante )1 ,oras> Las placas de gelosa sangre se inc&ban en tensin de CO)> 1> "e%isar las placas . si ,a. crecimiento identificar al microrganismo= relacionando con la obser%acin del frote>

2> "eali+ar a las colonias sospec,osas o<idasa= catalasa= reportar morfologa microscpica . morfologa colonial> 3> 9acer pr&ebas Bio;&micas para la identificacin> 0> "eali+ar antibiograma

R#TA DE TRABAJO. RE!#"TADO!: 7O A: Adem:s de los res&ltados encontrados= diseEar &n reporte de res&ltado para entregar al
paciente= tomando en c&enta los sig&ientes datos:
7OMB"! D!L *ACI!7 !: C!DULA: !DAD: S!LO: I*O D! !S UDIO: "!#IO7 D! DO7D! S! OMO LA MU!S "A: "!ACCIO7 I7FLAMA O"IA: OBS!"BACIO7 MIC"OSCO*ICA "!SUL ADO D!L CUL IBO 8Microrganismo aislado@ A7 IBIO#"AMA:

LU#A" T F!C9A "!S*O7SABL!: 7ombre . firma@

DI!C#!I9N: CONC"#!I9N: BIB"IOGRA3GA:

)PRACTICA No. 21,

C#"TI O DE "G7#IDO !INO IA"
OBJETI O GENERA": Conocer el procesamiento de m&estras para el c&lti%o de li;&ido sino%ial= as como la identificacin de bacterias patgenas> OBJETI O! PARTIC#"ARE!: '>G )>G />G INTROD#CCION K Como resp&esta a &na infeccin= p&ede ac&m&larse l;&idos en c&al;&ier ca%idad del organismo> !l te$ido solido infectado con frec&encia presenta &n flemn o cel&litis o &n absceso> Los l;&idos ;&e con ma.or frec&encia se est&dian con ma.or frec&encia desde el p&nto de %ista microbiolgico 8adem:s de sangre . l;&ido cefalorra;&deo@= pro%ienen de areas ;&e incl&.en el tra<= ca%idad abdominal= artic&laciones . pericardio> La artritis infecciosa p&ede locali+arse en c&al;&ier artic&lacin del organismo= alg&nos de los agentes ca&sales bacterianos de la artritis infecciosa son: Stap,.lococc&sa&re&s= 9aemop,il&sinfl&en+ae tipo B= especies de estreptococos= bacilos gramnegati%os= 7eisseria= entre otros ;&e se rec&peran raramente de li;&ido sino%ial> !n la ma.ora de los casos ,a. fiebre ele%ada . dolor con impotencia f&ncional en el sitio de la lesin> !n la ma.ora de las artritis es posible obser%ar el a&mento de %ol&men> La aspiracin del li;&ido artic&lar de la artritis bacteriana es la m&estra a anali+ar> #eneralmente se presenta t&rbio o p&r&lento> !n &n tercio de la mitad de los casos= el rec&ento le&cocitario artic&lar es ma.or de '55 555Jml> Sin embargo= esta obser%acin no es especfica de la artritis bacteriana= .a ;&e ,a. otras infecciones artic&lares> La coloracin de #ram p&ede dar falsos positi%os 8*r&ebas positi%as no confirmadas no c&lti%os positi%os@> !s posible ;&e la tincin m:s confiable sea el a+&l de metileno> Deben c&lti%arse m&estras de sangre . li;&ido artic&lar en forma aerobia . anaerobia> MATERIA"E E7#IPOE REACTI O! < MEDIO! DE C#"TI O: MATERIA" BIO"OGICO: M&estra de l;&ido sino%ial E7#IPO: !st&fa bacteriolgica "efrigerador A&tocla%e Microscopio ptico

MATERIA":

Mec,eros Asas bacteriolgicas 9isopos estriles L:pi+ graso *ortaob$etos Ca$as de *etri desec,ables estriles *ortaob$etos Cinta masDing tape &bos de ensa.e con tapn de rosca de '/ < '55 mm &bos de ensa.e sin tapn de '/ < '55 mm Bata de laboratorio C&bre bocas #&antes de l:te< #afas de proteccin #orro ;&ir-rgico Man&al de *racticas Cerillos o encendedor #asas Atomi+ador Franela #radilla

MEDIO! DE C#"TI O: Agar gelosa sangre Agar sal . manitol Agar MacConDe. Agar M&eller9intos Agar Bigg. Agar So.a tripticasa Agar c,ocolate Caldo tioglicolato

PR#EBA! BIO7#GMICA!: Agar citrato de Simmons Agar LIA Agar UIA Agar MIO Agar "OSO D! M! ILO O M"GB* Caldo ro$o de fenol con sacarosa Caldo ro$o de fenol con manitol Agar difenildesaminasa Caldo &rea Agar gelatina Agar SIM

REACTI O! "eacti%o para o<idasa . catalasa "eacti%o de ro$o de metilo "eacti%o de Uo%acs Aceite de inmersin Colorantes para incin de #ram Discos para Antibiograma Clor&ro frrico al 2X 9idr<ido de *otasio al 15X

MATERIA": Mec,eros Asas bacteriolgicas 9isopos estriles L:pi+ graso *ortaob$etos Ca$as de *etri desec,ables estriles *ortaob$etos Cinta masDing tape &bos de ensa.e con tapn de rosca de '/ < '55 mm &bos de ensa.e sin tapn de '/ < '55 mm Bata de laboratorio C&bre bocas #&antes de l:te< #afas de proteccin #orro ;&ir-rgico Man&al de *racticas Cerillos o encendedor #asas Atomi+ador Franela #radilla

DE!ARRO""O '@ Centrif&gar la m&estra a )255 rpm d&rante )5 a /5 min&tos> )@ Decantar el sobrenadante /@ Del sedimento preparar &n frote . teEirlo con la tcnica de #ram= obser%ar la reaccin inflamatoria e<&dati%a= tipo de cl&las . flora bacteriana> 1@ Del mismo sedimento inoc&lar en los medios de c&lti%o= agar sangre= Agar c,ocolate= Agar MacConDe.= Agar ''5 o Sal . Manitol . Agar Bigg.> *osteriormente ,acer estras cr&+adas o masi%as seg-n el medio= e inc&bar las dos primeras placas de medio de c&lti%o en tensin de CO) . las dem:s en aerobiosis a /0 5C d&rante )1 ,oras> 2@ Adem:s sembrar otra placa de agar sangre . caldo tioglicolato= inc&bar en aerobiosis a /0 5C d&rante )1G1( ,oras>

3@ Obser%ar la morfologa colonial . microscpica de las placas . resembrar en los medios adec&ados para la identificacin de las bacteriasK inoc&lar en medios apropiados del t&bo con caldo tioglicolato en caso de ;&e se presente crecimiento sospec,oso de bacterias anaerobias e inc&bar en anaerobiosis . ,acer pr&ebas bio;&micas de identificacin>

R#TA DE TRABAJO. RE!#"TADO!: 7O A: Adem:s de los res&ltados encontrados= diseEar &n reporte de res&ltado para entregar al
paciente= tomando en c&enta los sig&ientes datos:
7OMB"! D!L *ACI!7 !: C!DULA: !DAD: S!LO: I*O D! !S UDIO: "!#IO7 D! DO7D! S! OMO LA MU!S "A: "!ACCIO7 I7FLAMA O"IA: OBS!"BACIO7 MIC"OSCO*ICA "!SUL ADO D!L CUL IBO 8Microrganismo aislado@ A7 IBIO#"AMA:

LU#A" T F!C9A "!S*O7SABL!: 7ombre . firma@

DI!C#!I9N: CONC"#!I9N: BIB"IOGRA3GA:

)PRACTICA No. 22,

E!PERMOC#"TI O
OBJETI O GENERA": Conocer la toma de prod&ccin para &n esperma c&lti%= el procesamiento . la identificacin de organismos bacterianos cas&ales de infecciones del aparato genital masc&lino= principalmente la prstata> OBJETI O! PARTIC#"ARE!: '>G )>G />G INTROD#CCI9N: !l espermoc&lti% es &n mtodo bacteriolgico ;&e consiste en el c&lti%o del li;&ido esperm:tico o esperma para el diagnostico de infecciones bacterianas= principalmente de la prstata> ambin p&ede &tili+arse solo li;&ido prost:tico= pero esta m&estra la obtiene solo medico por masa$e digital a tra%s del recto> La prstata es &na gl:nd&la c&.a forma . tamaEo se ,a comparado al de &na castaEa grande> Se ,alla deba$o de %e$iga= rodeando la parte s&perior de la &retra= a&n;&e esta no pase por s& centro sino cerca de s& cara anterior> S& cara posterior se ,alla en relacin con la cara anterior del recto> Segrega &n l;&ido 8con a.&da de la %esc&laseminal@ denominado l;&ido seminal ;&e sir%e del medio n&triti%o . dil&cin de los espermato+oides= l;&ido seminal . los espermato+oides forman el l;&ido esperm:tico o esperma> Las infecciones de la prstata son prod&cidas por los sig&ientes grmenes: Stap,.lococc&sa&re&s= !sc,eric,iacoli= Streptococc&ssp= 7eisseriagono,rroeae . C:ndidaalbicans> Los signos . sntomas ;&e caracteri+an &na prostatitis sonK dific&ltad para orinar= fiebre= dolor= . pesade+entre las bolsas . el recto> !l espermoc&lti%o de r&tina consiste en lo sig&iente: '@ "!COL!CCIO7: el paciente no debe ,aber tomado medicamentos ') ,oras antes . para tomar la m&estra debe ,acerse aseo pre%io para e%itar las contaminantes de los genitales e<ternos> La m&estra para el c&lti%o deben ser frescas . obtenerse por mast&rbacin en &n frasco estril> )@ !LAM!7 FISICO: en este debe %is&ali+arse el color= presencia de sangre . consistencia> /@ F"O ! D! !^IDO CO7 #"AM: *ara obser%ar la reaccin inflamatoria ;&e es el indicati%o de &n proceso infeccioso . la flora bacteriana> 1@ CUL IBO: La m&estra deber: sembrarse en los sig&ientes medios: ,a.erG Martin= gelosa sangre= bigg. o nicDerson= medio ''5 o sal . manitol= !MB o Mac ConDe.> 2@ ID!7 IFICACIO7: !star: en base a los microorganismos aislados= seEalados anteriormente con los agentes ca&sales= .a %istos pre%iamente>

MATERIA"E E7#IPOE REACTI O! < MEDIO! DE C#"TI O: MATERIA" BIO"OGICO L;&ido seminal

E7#IPO: !st&fa bacteriolgica "efrigerador A&tocla%e Microscopio ptico

MEDIO! DE C#"TI O EN P"ACA Medio ,a.er P Martin Medio ''5 o Sal manitol Agar !MB o MacConDe. Agar Bigg. o 7icDerson Agar Sangre Agar c,ocolate

PR#EBA! BIO7#GMICA!: Agar citrato de Simmons Agar LIA Agar UIA Agar MIO Agar "OSO D! M! ILO O M"GB* Caldo ro$o de fenol con sacarosa Caldo ro$o de fenol con manitol Agar difenildesaminasa Caldo &rea Agar gelatina Agar SIM REACTI O!: Colorantes para la tincin de #ram> "eacti%o para o<idasa . catalasa "eacti%o de ro$o de metilo "eacti%o de Uo%acs Aceite de inmersin Colorantes para incin de #ram Discos para Antibiograma Clor&ro frrico al 2X 9idr<ido de *otasio al 15X

MATERIA": Mec,eros Asas bacteriolgicas 9isopos estriles L:pi+ graso *ortaob$etos Ca$as de *etri desec,ables estriles *ortaob$etos Cinta masDing tape &bos de ensa.e con tapn de rosca de '/ < '55 mm &bos de ensa.e sin tapn de '/ < '55 mm Bata de laboratorio C&bre bocas #&antes de l:te< #afas de proteccin #orro ;&ir-rgico Man&al de *racticas Cerillos o encendedor #asas Atomi+ador Franela #radilla PROCEDIMIENTO: '@ *rimeramente ,acer la obser%acin %is&al de la m&estra= indicando el color= si ,a. presencia de sangre . s& aspecto> 9acer preparacin en fresco> )@ 9acer &n frote= tomando la m&estra preferentemente de +onas donde ,a.a sangre> eEir con gran . obser%ar> /@ Inoc&lar la m&estra en cada &no de los medios de c&lti%o proporcionados> 1@ Inoc&lar las placas a /0YC d&rante )1 ,oras> Las placas de gelosa sangre . ,a.erG Martin se inc&ban en tensin de CO)> 2@ "e%isar las placas e identificar las colonias aisladas como se indico anteriormente> R#TA DE TRABAJO RE!#"TADO! "!*O" A" !L !S*!"MOCUL IBO D! LA SI#UI!7 ! FO"MA: 7OMB"! D!L *ACI!7 !: F!C9A: I*O D! !S UDIO: !LAM!7 F\SICO: !LAM!7 MIC"OSCW*ICO 8F"O ! !^IDO CO7 LA I7CIW7 D! #"AM@: "!SUL ADO D!L CUL IBO: A7 IBIO#"AMA

LU#A" T F!C9A "!S*O7SABL!: 7ombre . firma@

DI!C#!I9N CONC"#!I9N BIB"IOGRA3GA

)PRACTICA No. 2H,

;EMOC#"TI O
OBJETI O GENERA": Conocer la toma de m&estra= procedimiento e identificacin de microorganismos de inters clnico en &n ,emoc&lti%o> OBJETI O! PARTIC#"ARE!: '>G )>G />G INTROD#CCION La sangre es normalmente estril= p&es no tiene flora normal establecida> !<iste &n gran n-mero de microorganismos ;&e se p&eden aislar de la sangre en caso de &na infeccin= entre los m:s com&nes tenemos: !nterobacterias= *se&domonaa&r&ginosa= !nterococc&s=Stap,.lococc&sa&re&s= S> epidirmidis= Streptococc&ssp =Cor.nebacteri&msp= Bacteroides= otros anaerobios . le%ad&ras> Un ,emoc&lti%o est: indicado c&ando en el paciente ,a. &n r:pido a&mento relati%o del p&lso . la temperat&ra= &n cambio sensorial . la aparicin de escalofros= postracine ,ipotensin> Otras indicaciones incl&.en fiebre prolongada= le%e e intermitente= asociada a &n soplo cardiaco> Los c&lti%os de sangre deben obtenerse antes de comen+ar el tratamiento con antibiticos o ;&imioterap&ticos> 7&nca debe de confiarse en &n solo c&lti%o de sangre para eliminar la posibilidad de bacteriemia> Las etapas de la enfermedad tambin es importante por e$emploK en fiebre tifoidea= c&lti%os de sangre positi%os p&eden obtenerse generalmente de la primera semana de la enfermedad . los organismos desaparecen al final de la seg&nda semana>*or lo reg&lar las m&estras deben tomarse d&rante el periodo febril> Solo se p&ede ,acer el diagnostico de &na bacteriemia por el crecimiento de agentes patagones en medios de c&lti%o de &na bacteriemia por el crecimiento de agentes patagones en medios de c&lti%o> *ara el e<amen bacteriolgico de la sangre ,abr: ;&e considerar alg&nos principios de importancia> '@ Una tcnica de e<traccin correcta ;&e red&+ca las mnimas posibilidades de contaminacin de la flora normal de la piel> )@ A&e las cantidades de sangre sean adec&adas para el c&lti%o= p&es m&. poca sangre no contiene s&ficientes bacterias para obtener &n b&en crecimiento> /@ *ara el c&lti%o deben &sarse mtodos de c&lti%o aerobios . anaerobios> Como m&c,as de las especies ;&e se enc&entran en la bacteriemia son e<igentes . crecen con dific&ltad en los medios de c&lti%o= deben &sarse medios ricos . m&. n&triti%os= !l medio base para ,emoc&lti%o contiene &n caldo n&triente . anticoag&lante> 9acer s&bc&lti%osde r&tina a ciegas en medios de c&lti%o adec&ados> !l procedimiento del ,emoc&lti%o %ara seg-n las indicaciones mencionadas . los medios de c&lti%os &tili+ados> MATERIA"E E7#IPOE REACTI O! < MEDIO! DE C#"TI O:

MATERIA" BIO"OGICO: M&estra de sangre tomada en pico febril

E7#IPO: !st&fa bacteriolgica "efrigerador A&tocla%e Microscopio ptico

MEDIO! DE C#"TI O!: Medios para C&lti%o en Sangre *lacas de Agar Mac ConDe. O !MB *lacas de #elosa Sangre *lacas de Medio ''5 O Sal T Manitol *lacas de Bigg. O 7icDerson *lacas de ,a.er Martin O Agar C,ocolate PR#EBA! BIO7#GMICA!: Agar citrato de Simmons Agar LIA Agar UIA Agar MIO Agar "OSO D! M! ILO O M"GB* Caldo ro$o de fenol con sacarosa Caldo ro$o de fenol con manitol Agar difenildesaminasa Caldo &rea Agar gelatina Agar SIM REACTI O!: Alco,ol al 05 X int&ra de .odo al ) X Colorantes para la tincin de #ram> "eacti%o para o<idasa . catalasa "eacti%o de ro$o de metilo "eacti%o de Uo%acs Aceite de inmersin Discos para Antibiograma Clor&ro frrico al 2X 9idr<ido de *otasio al 15X

MATERIA": Mec,eros Asas bacteriolgicas 9isopos estriles L:pi+ graso *ortaob$etos Ca$as de *etri desec,ables estriles *ortaob$etos

Cinta masDing tape &bos de ensa.e con tapn de rosca de '/ < '55 mm &bos de ensa.e sin tapn de '/ < '55 mm Bata de laboratorio C&bre bocas #&antes de l:te< #afas de proteccin #orro ;&ir-rgico Man&al de *racticas Cerillos o encendedor #asas Atomi+ador Franela #radilla

*"OC!DIMI!7 O: a@ oma de m&estra '@ !legir la %ena palpando la piel antes de desinfectarla )@ Limpiar la piel alrededor del l&gar donde se ,ar: la p&ncin= en crc&los de 2 cm de di:metro con alco,ol del 05X frotando %igorosamente> /@ Aplicar .odo al )X= en crc&los crecientes comen+ando por el centro ,asta c&brir con .odo toda la s&perficie anterior> De$ar de act&ar el .odo d&rante &n min&to> 1@ Si el sitio debe ser tocado por el tcnico= este debe desinfectar s&s dedos de la misma forma> 2@ Insertar la ag&$a en la %ena . e<traer la sangre> 3@ Una %e+ e<trada la ag&$a= debe limpiarse el :rea n&e%amente con alco,ol= .a ;&e m&c,os pacientes son sensibles al .odo>

b@ *"OC!SAMI!7 O: '@ Antes de e<traer la sangre= limpiar con alco,ol el tapn del medio de c&lti%o base para la sangre= de$ando secar> )@ Sin ;&itar la ag&$a de la $eringa= transferir la sangre al medio c&lti%o 8debe ,acerse cerca del mec,ero@ sin ;&itar el tapn> /@ Me+clar el contenido inclinado s&a%emente de ) a / %eces> 1@ Inc&bar el t&bo en tensin de CO) a /0YC d&rante &na semana> 2@ "e%isar el medio cada )1 ,oras= obser%ar si ,a. ent&rbiamiento> 3@ "eali+ar s&bc&lti%os de la sig&iente manera: a@ Me+clar el medio . limpiar el tapn con alco,ol= e<traer la m&estra 8dos gotas apro<imadamente@ e inoc&lar en los medios proporcionados= diseminando el inoc&lo por estra cr&+ada> b@ Si ,a. ent&rbiamiento del medio= ,acer frote . teEir con #ram= c@ Inc&bar las placas /0YC d&rante )1 ,oras= las placas de gelosa sangre . ,a.erGMartin en tensin de CO)>

d@ "e%isar las placas> Si ,a. crecimiento= ,acer frotis . teEir con #ram e identificar el microorganismo por las pr&ebas bio;&micas> "!*O" A" !L 9!MOCUL IBO D! LA SI#UI!7 ! FO"MA: 7OMB"! D!L *ACI!7 !: F!C9A: I*O D! !S UDIO: "!SUL ADO D!L CUL IBO: A7 IBIO#"AMA
LU#A" T F!C9A

"!S*O7SABL!: 7ombre . firma@

DI!C#!I9N CONC"#!I9N BIB"IOGRA3GA

)PRACTICA No 2?,
E!T#DIO DE "G7#IDO CE3A"ORRA7#GDEO
OBJETI O GENERA": Conocer el procedimiento de m&estras l;&idocefalorra;&deo= as como la identificacin de agentes patgenos> OBJETI O! PARTIC#"ARE!: '>G )>G />G INTROD#CCION !l l;&idocefalorra;&deo rodea completamente al encfalo . med&la espinal . c&mple di%ersas f&nciones> 7ormalmenteesestril= pero e<isten bacterias ;&e p&eden ca&sar meningitis= entre ellas las m:s importantes tenemos: Streptococc&spne&moniae= 9aemop,il&sinfl&en+ae= 7esseriameningitidis= Streptococc&s 8partic&larmente el gr&po B @= Listeria monoc.togenes= reponema pallid&m= Leptospiras= Stap,.lococc&sa&re&s= s> epidermis= *se&domonaaer&ginosa= bacilos gramnegati%os entricos= M.cobacteri&m t&berc&losis= as como ,ongos= %ir&s . par:sitos> Los sntomas menngeos son: %mitos= cefalea= ,ipersomnia= conf&sin o rigide+ de la n&ca> !l l;&ido cefalorra;&deo 8LC"@ obtenido por p&ncin l&mbar es la m&estra ;&e con m:s frec&encia se recibe en el laboratorio para el diagnsticode meningitis> !stas m&estras son obtenidas por el mdico con condiciones ;&ir-rgicas estriles> 9abit&almente se remiten / t&bos de LC" : &no para el rec&ento de cl&las . tinciones diferenciales= el seg&ndo t&bo para tincin de #ram . c&lti%o . el tercer t&bo para est&dio de protenas= gl&cosa o est&dios especiales como BD"L> !l LC" normalmente es claro como el ag&a= no tiene m:s de 2 linfocitos Jml>= en caso de meningitis bacteriana ag&ada= el rec&ento cel&lar p&ede %ariar entre 255 . )555 ne&trfilos segmentadosJml> !l ni%el de gl&cosa dismin&.e 8normal de '1 a 12 mgJdl> !l diagnostico de infecciones de LC" comprende: '@ *reparacin en fresco= para la conser%acin de tipos de cl&las> Las amibas se reconocen por el tpico mo%imiento lento en &na sola direccin . por;&e emiten pse&dpodos> )@ *reparacin de tinta c,ina> !l Cr.ptococc&sneoformans se %is&ali+a debido a &na gran caps&la> /@ Frotis de sedimento teEido con la tcnica #ram> para obser%ar la resp&esta inflamatoria . el tipo de flora bacteriana> 1@ Frotis del sedimento teEido con la tcnica 6ie,lneelsen> *ara la b-s;&eda de M.cobacterias>

2@ C&lti%o> Los medios de c&lti%o bacteriolgicos de r&tina deben incl&ir &na placa de agar c,ocolate= agar sangre= medio ''5 . Mac conDe.> MATERIA"E E7#IPOE REACTI O! < MEDIO! DE C#"TI O: MATERIA" BIO"OGICO M&estra de l;&idocefalorra;&deo

E7#IPO: !st&fa bacteriolgica "efrigerador A&tocla%e Microscopio ptico

MEDIO! DE C#"TI O: Agar c,ocolate Agar sangre de o%e$a Medio ''5 o sal manitol Agar MacConDe. PR#EBA! BIO7#GMICA!: Agar citrato de Simmons Agar LIA Agar UIA Agar MIO Agar "OSO D! M! ILO O M"GB* Caldo ro$o de fenol con sacarosa Caldo ro$o de fenol con manitol Agar difenildesaminasa Caldo &rea Agar gelatina Agar SIM REACTI O!: Colorante de #ram Colorantes de 6ie,l7eelsen inta c,ina Colorantes para la tincin de #ram> "eacti%o para o<idasa . catalasa "eacti%o de ro$o de metilo "eacti%o de Uo%acs Aceite de inmersin Discos para Antibiograma Clor&ro frrico al 2X 9idr<ido de *otasio al 15X

MATERIA": Mec,eros Asas bacteriolgicas 9isopos estriles L:pi+ graso *ortaob$etos Ca$as de *etri desec,ables estriles *ortaob$etos Cinta masDing tape &bos de ensa.e con tapn de rosca de '/ < '55 mm

&bos de ensa.e sin tapn de '/ < '55 mm Bata de laboratorio C&bre bocas #&antes de l:te< #afas de proteccin #orro ;&ir-rgico Man&al de *racticas Cerillos o encendedor #asas Atomi+ador Franela #radilla

PROCEDIMIENTO: '@ !l l;&ido cefalorra;&deo debe ser obtenido en condiciones de esterilidad= en%iando la porcin correspondiente al laboratorio clnico para el est&dio clnico> )@ Centrif&gar el LC" a )255 rpm d&rante '2 min= decantar el sobrante> /@ 9acer &na preparacin del sedimento fresco en tinta c,ina . obser%ar con el ob$eti%o seco f&erte= a fin obser%ar m>o caps&lados> 1@ 9acer &n frote . teEirlo con la tcnica de 6ie,l7ieelsen= para b&scar M.cobacterias > 2@ "eali+ar &n seg&ndo frote . teEirlo con la tcnica de #ram> 3@ Sembrar en los medios citados anteriormente= inc&bar a /0YC d&rante )1 a 1( ,oras> Las placas de agar sangre . agar c,ocolate se inc&ban en tensin de CO)> 0@ Obser%ar la morfologa colonial . microscpica las placas . sembrar en los medios adec&ados para s& identificacin> (@ Inoc&lar en caldo tioglicolato en caso de ;&e sospec,e de bacterias anaerobias e inoc&lar en anaerobiosis= padeces a la identificacin> "!*O" A" !L "!SUL ADO D!L CUL IBO D! LA SI#UI!7 ! MA7!"A: 7ombre del paciente: ipo de est&dio: !<amen microscpico: "es&ltado del c&lti%o:

DI!C#!I9N CONC"#!I9N

BIB"IOGRA3GA

ANE8O + INTERPRETACION DE PR#EBA! BIO7#IMICA! PR#EBA DE AGAR T!I O S"IG"ER

!n estos medios se determina la capacidad de &n organismo de atacar &n ,idrato de carbono especifico incorporado en &n medio de crecimiento b:sico con prod&ccin o no de gases= $&nto con la determinacin de posible prod&ccin de :cido s&lf,drico> !l agar se prepara en pico de fla&ta= esto determina ;&e ,a.a dos c:maras de reaccin dentro del mismo t&bo> La porcin inclinada ;&e s& s&perficie est:m:s e<p&esta al o<igeno atmosfrico= es aerobiaK la porcin inferior llamada fondo est: protegida del aire . es relati%amente anaerobia> La colonia en est&dio se inoc&la con alambre recto= por picad&ra . estra> Se inc&ba a /0 C de '( a )1 ,oras> INTERPRETACION: a@ Utili+acin de ,idratos de carbono

*ICO ALCALI7O 8"OSO@ J FO7DO ALCALI7O 8"OSO@ a UJU 7o ,a. fermentacin de a+&cares

*ICO ALCALI7O 8"OSO@ J FO7DO ACIDO 8AMA"ILLO@ a UJA #l&cosa fermentada= #l&cosa no fermentada

*ICO ALACALI7O 8"OSO@ J FO7DO ACIDO 87!#"O@ #l&cosa fermentada= lactosa no fermentada . prod&ccin de gas 9)S

 *ICO ACIDO 8 AMA"ILLO@ J FO7DO ACIDO 8AMA"ILLO@ a AJA #l&cosa . lactosa fermentada

b@ *rod&ccin de gas CO) . 9)

Se manifiesta de la sig&iente manera: Una sola b&rb&$a de gas B&rb&$a en el medio Desdoblamiento del medio Despla+amiento completo del medio ,acia arriba del t&bo= de$ando &n :rea clara

c@ *rod&ccin de acido s&lf,drico La capacidad de ciertas bacterias para liberar a+&fre de amino:cidos . otros comp&estos ;&e lo contienen= se detecta por la presencia de &n precipitado de color negro res&ltado de reaccionar el gas 9)S con &n indicador como el s&lfato ferroso> *&ede estar distrib&ido parcial o totalmente en toda la capa prof&nda o a lo largo de la picad&ra>

PR#EBA! EN E" MEDIO "IA !ste medio nos sir%e para medir la capacidad ;&e tienen las bacterias para ;&e a tra%s de en+imas sean capaces de descarbo<ilar el amino:cido lisina con liberacin de la amina cada%erina de reaccin alcalina> !l agar se prepara en pico de fla&ta . se siembra por picad&ra en estra cr&+ada> Se inc&ba a /0 o C d&rante '( a )1 ,oras>

INTERPRETACION:

'> Descarbo<ilacion de la lisina 8lisina positi%a@> *ico de fla&ta . fondo color morado= reaccin alcalina *ico de fla&ta color morado 8alcalino@ . fondo transparente= reaccin intermedia o ne&tra>

)> 7o descarbo<ilacion de la lisina 8lisina negati%a@ La presencia de c&al;&ier reaccin acida 8amarilla@ .a sea en el pico de fla&ta o en el fondo /> *rod&ccin de acido s&lf,drico !n este medio tambin se p&ede obser%ar la prod&ccin de acido s&lf,drico ;&e se ,ace %isible por el enegrecimiento del medio> 1> Desaminacion de la lisina !n pico de fla&ta reaccin acida= color ro$o> Capa prof&nda reaccin acida= color amarillo>

PR#EBA EN E" MEDIO MIO !n este medio se determinan las sig&ientes pr&ebas: Mo%ilidad= Descarbo<ilacion de la Ornitina e Indol> !s &n medio semislido= se inoc&la por picad&ra con asa recta Las lect&ras deber:n de reali+arse en el sig&iente orden: '> Mo%ilidad>Gse determina para saber si &n microorganismo es m%il o no> Mo%ilidad positi%a>GSe obser%a t&rbiedad en el medio= debido a ;&e los microorganismos migran de la lnea de siembra . se dif&nden> Mo%ilidad negati%a>GSe obser%a crecimiento nada m:s en la lnea de siembra . el medio circ&ndante se mantiene claro> )> Descarbo<ilacion de la ornitina>G!sta pr&eba nos indica la capacidad ;&e tiene &n microorganismodedescarbo<ilar la ornitina para formar &na amina 8p&trecina@con la consig&iente alcalinidad>

Ornitina positi%a>G!l color del medio se mantiene de color morado= ;&e indica la descarbo<ilacion de la ornitina> Ornitna negati%a>G!l color del medio ser: amarillo= lo ;&e nos indica ;&e no ,a. descarbo<ilacion de la ornitina>

/> *r&eba del indol>G!l indol es &no de los prod&ctos del metabolismo del amino:cido triptfano= esta pr&eba nos permitir: identificar a las bacterias ;&e poseen la en+ima triptofanasa . ;&e son capaces de degradar el triptfano con prod&ccin de indol>

*ara leer esta pr&eba se agregan 2 gotas del reacti%o de Do%acs 8*aradimetilaminoben+alde,ido@ directamente a &n t&bo inc&bado= agitar s&a%emente el t&bo e interpretar los res&ltados:

Indol positi%o>G Anillo ro$o en la s&perficie del medio> Indol negati%o>G7o cambia el color del medio c&ando se agrega el reacti%o de Uo%acs> Indol %ariable>GColor anaran$ado en la s&perficie del medio>

PR#EBA EN E" ROJO DE METI"O T OG#E! PRO!SA#ER )MR0 P,

!n este medio se lle%an a cabo dos pr&ebas bio;&micas: A> "OSO D! M! ILO>G7os sir%e para comprobar la capacidad ;&e tiene &n microorganismo de prod&cir . mantener estables los prod&ctos terminales acidos de la fermentacin de la gl&cosa> *r&eba %aliosa para la identificacin de especies bacterianas ;&e son f&ertemente prod&ctoras de :cidos> Agregar 2 gotas del indicador ro$o de metilo a &na alc&ota del medio M"GB* inc&bado d&rante )1 ,oras>

INTE P ET"CI!N$

 "OSO D! M! ILO *OSI IBO>G!l c&lti%o es lo s&ficientemente acido como para permitir ;&e el indicador de ro$o de metilo mantenga s& color original en la s&perficie del medio 8p9 1>1@> "OSO D! M! ILO 7!#A IBO>GColor amarillo en la s&perficie del medio 8p9 3>5@> "! A"DADA>G Color anaran$ado>

B> BO#!S *OSUAU!">G 7os permite determinar la capacidad de alg&nos microorganismos de prod&cir &n prod&cto final ne&tro= el acetilmetilcarbinol 8Acetoina@= a partir de la fermentacin de la gl&cosa>!sta pr&eba se basa en la con%ersin de acetoina en diacetilo por accin del UO9 . el o<igeno atmosfrico> !l diacetilo se con%ierte en &n comple$o ro$o por accin cataltica del alfaGnaftol>

!n &na alc&ota de )>2 ml del medio M"GB* inoc&lado e inc&bado )1 ,oras= agregar los reacti%os en el orden sig&ienteK 5>3 ml 8apro<imadamente ') gotas@ de la sol&cin de alfaGnaftol> 5>) ml 8apro<imadamente 3 gotas@ de UO9 al 15X>

Agitar el t&bo s&a%emente para e<poner el medio al o<igeno atmosfrico a fin de o<idar la acetoina . obtener &na reaccin de color> De$ar reposar el t&bo d&rante '5 a '2 min&tos para interpretar la pr&eba> B* *OSI IBA>G Color ro$o rosado en la s&perficie del medio> B* 7!#A IBA>GColor amarillo 8Mismo color del medio@>

PR#EBA DE #TI"I:ACI9N DE" CITRATO

Se lle%a a cabo en el medio citrato de Simmons . sir%e para determinar la capacidad de &n organismo de &tili+ar citrato de sodio como -nica f&ente de carbono para s& metabolismo . desarrollo>

!l medio se prepara en &n t&bo con agar inclinado= se estra la s&perficie del pico de agar con &n pe;&eEo inoc&lo tomado de &na colonia del microorganismo en est&dio> Inc&bar )1 ,oras a /2 5C>

INTERPRETACION: *"U!BA *OSI IBA>G *rod&ccin de &n color a+&l en el medio> *"U!BA 7!#A IBA>G!l medio permanece de color %erde 87o ,a. crecimiento del microorganismo@>

REACCI9N DE "A #REA!A

!sta pr&eba nos permite identificar a las bacterias ;&e poseen la en+ima &reasa . tiene la capacidad de ,idroli+ar la &rea con liberacin de amoniaco> !sta pr&eba se determina en el medio caldo &rea 8color canela@= el medio se inoc&la . se inc&ba )1 ,oras a /2 5C>

INTERPRETACION: "eaccin *ositi%a:>G Color rosado intenso en todo el medio "eaccin 7egati%a>G 7o cambia el color del caldo 8color canela@>

CA"DO ROJO DE 3ENO" )3ERMENTACI9N DE CARBO;IDRATO!, Se &tili+a generalmente para %er la capacidad de &n organismo para degradar &n carbo,idrato especifico incorporado al medio prod&ciendo acido o acido con gas> La tripteina es &n ,idroli+ado de casena ;&e se incl&.e en las frm&las de los medios para pro%eer carbono . nitrgeno= el clor&ro de sodio act-a como estabili+ador osmtico . como in,ibidor del desarrollo de m&c,as especies bacterianas ;&e son contaminantes com&nes del medio ambiente> !l ro$o de fenol es &n indicador de p9 ;&e ,ace %irar los medios al amarillo= si la prod&ccin de :cidos ,ace ;&e el p9 descienda por deba$o de 3>(> !l ,idrato de carbono en est&dio se aEade a esta base ,asta &na concentracin final de 5>2 al 'X

INTERPRETACION: *"U!BA *OSI IBA>G Color amarillo *"U!BA 7!#A IBA>GColor ro$o

> 3ENI" A"ANINA DE!AMINA!A La fenilalanina es &n amino:cido ;&e por desanimacin forma &n cetoacido= acidofenilpir&%ico> Alg&nas enterobacterias poseen la en+ima desaminasa necesaria para esta con%ersin> La pr&eba de fenilalanina depende de la deteccin del acidofenilpir&%ico en el medio de pr&eba desp&s del crecimiento del microorganismo en est&dio> Se inoc&la en el pico de fla&ta del medio= . desp&s de inc&bar )1 ,oras a /2 5C = se agregan de 1 P 2 gotas de clor&ro frrico al '5X directamente a la s&perficie del agar> A medida ;&e se agrega el reacti%o se ,ace girar el t&bo para ,omogeni+ar con la colonia ;&e se enc&entra sobre la s&perficie del t&bo> La aparicin inmediata de &n intenso color %erde indica la presencia del acidofenilpir&%ico . la pr&eba es positi%a>

"IC#E3ACCION DE GE"ATINA Se incorpora gelatina a di%ersos medios para determinar la capacidad de &n organismo de prod&cir en+imas de tipo proteoltico ;&e a s& %e+= son detectadas por la digestin o lic&efaccin de gelatina presente> !stas en+imas ;&e son capaces de la gelatinlisis= se denominan gelatinasas> Se inoc&la el medio de gelatina n&triti%a por p&ncin prof&nda . se inc&ban los t&bos de la pr&eba . &n control sin inoc&lar de )) a )2 5C> o a /2 5C por )1 ,oras o m:s> Se refrigeran los t&bos media ,ora antes de ,acer la lect&ra>

INTERPRETACION:

*"U!BA *OSI IBA>G #elatina li;&ida *"U!BA 7!#A IBA>G#elatina solida

PR#EBA DE CITOCROMO O8IDA!A

Los citocromos son ,omoproteinas ;&e contienen ,ierro= act-an como el &ltimo %inc&lo en la cadena respiratoria aerobia= transfiriendo electrones 8,idrogeno@ al o<igeno= con formacin de ag&a> !l sistema de citocromo= se ,alla en microorganismos aerobios= microaerofilos= . anaerobios fac&ltati%os> La pr&eba de o<idasa es importante para identificar microorganismos ;&e carecen de la en+ima> La pr&eba es m&. -til para e%al&ar colonias ;&e se sospec,an ;&e pertenecen a la familia !nterobacteriaceae . para identificar colonias ;&e pertenecen a otros gneros como: Aeromonas= pse&domonas= neisseria= Camp.lobacter . *aste&rella>

MA !"IAL:

C&lti%os bacterianos de )1 ,oras Mec,eros Aplicadores esteriles iras de papel filtro

"!AC IBOS:

Clor,idrato de tetrametilGpGfenilendiamina al 'X

!C7ICA DI"!C A !7 *LACA

Agregar ) o / gotas de reacti%o de o<idasa directamente a las colonias bacterianas aisladas>

!C7ICA I7DI"!C A CO7 I"A D! *A*!L FIL "O

AEada ) o / gotas del reacti%o de o<idasa a &na tira de papel filtro> !n la +ona de papel filtro donde se ,alla el reacti%o= se e<tiende con &n aplicador estril &na pe;&eEa porcin del c&lti%o bacteriano= dispersando con el aplicador esterilel inoc&lo con el reacti%o>

INTERPRETACION:

Las bacterias con acti%idad citocromo o<idasa desarrollan:

#6 56T06(- C-L-2 A9#L -!(C#2- 06 0L (5T5- 30 LA 56-C#LAC5-6.

PR#EBA DE "A CATA"A!A

La catalasa es &na en+ima ;&e descompone el per<ido de ,idrogeno 89 )O)@ en o<igeno . ag&a> La en+ima catalasa se enc&entra en la ma.ora de las bacterias aerobias . anaerobias fac&ltati%as ;&e contienen citocromo= por lo general los organismos ;&e no poseen el sistema citocromo carecen tambin de la en+ima catalasa . por lo tanto no p&eden descomponer el *er<ido de ,idrogeno> Alg&nas bacterias anaerobias por e$emplo Clostridi&m poseen la en+ima pero<idasa en l&gar de la catalasa> !l per<ido de ,idrogeno se forma como &n prod&cto terminal o<idati%o de la descomposicin aerbica de los a+&cares>

M! ODO D!L *O" AOBS! OS

Con el asa bacteriolgica tomar &na pe;&eEa porcin de c&lti%o bacteriano . colocarlo en el centro del portaob$etos limpio>

 Agregar ' o ) gotas de per<ido de ,idrogeno 89 )O)@ al /X sobre el c&lti%o del portaob$etos>8Usar &n gotero o &na pipeta *aste&r@> Obser%ar la inmediata formacin de b&rb&$as 8liberacin de gas O)@ . registra el res&ltado> Desec,ar el portaob$etos= coloc:ndolos en &n recipiente con desinfectante>

NOTA.0 E!TA PR#EBA TAMBIEN !E P#EDE REA"I:AR EN T#BO DE EN!A<E.

12/(345-162 -(4P'#4#2,5315 P535 '5. P37#$5. $1(+7141-5.)

12,#3P3#,5-1(2 D# '(. 3#.7',5D(. D# '5. P37#$5. $1(+7141-5.
1.& PRUEBA DE AGAR KLIGLER (KIA) LLAMADO AGAR HIERRO DE KLIGLER o AGAR TS1 LLAMADO AGAR HIERRO TRIPLE AZUCAR... I7OCULACIO7: *or picad&ra . estra simple= &tili+ando ag&$a de inoc&lacin

!n estos medios de c&lti%os= se determina la capacidad de &n organismo de atacar &n carbo,idrato especfico incorporado en &n medio de crecimiento b:sico con prod&ccin o no de gas, !"#o $o" %a de#e&'("a$()" de
*os(+%e *&od!$$()" de ,$(do s!%-./d&($o (H2S).

I7 !"*"! ACIO7!S: A, UTILIZACIO0 DEL CARBOHIDRATO Fermentacin de la gl&cosa SOLAM!7 !

!7 *ICO D! FLAU A: Color ro$o> "eaccin alcalina 8U@ !7 CA*A *"OFU7DA: Color amarillo> "eaccin acida 8 A @ S! "!*O" A: UJA Fermentacin A7 O de la gl&cosa COMO de la lactosa>

!7 *ICO D! FLAU A: Color amarillo> "eaccin acida 8A@ !7 CA*A *"OFU7DA: Color amarillo> "eaccin acida 8A@ S! "!*O" A: AJA 7O ,a. fermentacin de la gl&cosa 7I de la lactosa 8no enterobacterias@

!7 *ICO D! FLAU A: Color ro$o> "eaccin alcalina 8U@ !7 CA*A *"OFU7DA: Color ro$o> "eaccin alcalina 8U@ S! "!*O" A: K1K

Fermentacin de la gl&cosa> 7O fermentacin de la lactosa CO7 prod&ccin de :cidos&lf,drico o s&lf&ro de ,idr)ge"o (H S ) (*&ese"$(a de !" *&e$(*(#ado "eg&o e" e% -o"do de% #!+o 2!e e"'as$a&a %a a$(de3, es de$(& e% $o%o& a'a&(%%o).
2

!7 *ICO D! FLAU A: Color ro$o> "eaccin alcalina 8U@ !7 CA*A *"OFU7DA: *rod&ccin de 9)S (,$(do s!%-./d&($o o s!%-!&o de .(d&)ge"o)
e"'as$a&a %a a$(de3.

2!e es !" *&e$(*(#ado "eg&o 2!e

Co%o& a'a&(%%o. Rea$$()" a$(da (A) SE REPORTA4 K1A 5 *&od!$$()" de H2S

O "AS OBS!"BACIO7!S: La 7O fermentacin de la #l&cosa 7I de la lactosa se presentan otras obser%aciones como: 'Y Organismos aerbicos> 7o se obser%a crecimiento> 7o ,a. cambio de color> !l color es el mismo del t&bo no inoc&lado= color anaran$ado ro$i+o )o. O&ga"(s'o -a$!%#a#(6o4 Co%o& &o o. Rea$$()" a%$a%("a (K) 7O fermentacin de la gl&cosa ni la lactosa> (Bas#a"#e $o'7")

PICO DE 3"A#TA4 C&e$('(e"#o so%a'e"#e 0o .a5 $a'+(o de $o%o&. E% $o%o& es e% '(s'o de% #!+o "o ("o$!%ado. CAPA PRO3#NDA: Crecimiento solamente 7o ,a. cambio de color> !l color es el mismo del t&bo no inoc&lado> PROD#CCION DE GA! 1. A!"O#!7ICO: *rod&ccin de gases: CO25 H2 Se manifiesta por lo sig&iente: Una sola b&rb&$a de gas> B&rb&$as en el medio Desdoblamiento del medio Despla+amiento complete del medio del fondo del t&bo de$ando &n :rea clara= . se reporta: #as 8#@ 2. A7A!"O#!7ICO: 87o ,a. prod&ccin de gas@ PROD#CCION DE ACIDO !#"3;IDRiCO O !#"3#RO DE ;IDROGENO La presencia de &n precipitado negro 8s&lf&ro ferroso@ se manifiesta por:

(H2S)

Un color negro distrib&ido por toda la capa prof&nda . ;&e enmascara la acide+K p&ede ,aber

&na ligera e%idencia en el pico de fla&ta> Un anillo negro cerca de la parte s&perior de la capa prof&nda> Un precipitado negro distrib&ido por la capa prof&nda= pero ;&e no oc&lta totalmente la acide+ 8color amarillo@ La prod&ccin de :cido s&lf,drico se reporta as: =2(. *or e$emplo: UJA R =2(, 2!e

s(g"(-($a -e&'e"#a$()" de g%!$osa $o" *&od!$$()" de ,$(do s!%-./d&($o

II. PR#EBA EN E" MEDIO "IA )AGAR "I!INA ;IERRO,

I"o$!%a$()"4 P($ad!&a 5 es#&/a s('*%e (ag! a de ("o$!%a$()") EI 'ed(o LIA "os s(&6e *a&a 'ed(& %a $a*a$(dad e"3(',#($a de !" o&ga"(s'o *a&a des$a&+o8(%a& !" a'("o,$(do *a&a -o&'a& !"a a'("a, $o" %a $o"s(g!(e"#e a%$a%("(dad, o *a&a 'ed(& s! $a*a$(dad de desa'("a& !" a'("o,$(do $o" %a $o"s(g!(e"#e a$(de3.

INTERPRETACION: 5) D!SCA"BOLILACIO7 D! LA LISI7A (LISI0A POSITI9A) PICO DE :LAUTA4 Co%o& 'o&ado. Rea$$()" a%$a%("a (K) CAPA PRO:U0DA4 Co%o& 'o&ado. Rea$$()" a%$a%("a (K) ambin p&eden obser%arse reacciones as ;&e significan lo mismo: *ICO D! FLAU A: Color morado> "eaccin alcalina 8 U @ CA*A *"OFU7DA: ransparente> "eaccin intermedia S! "!*O" A ASI: UJ7 7a ne&tro NO DE!CARBO8I"ACION DE "A "I!I!NA )"I!INA NEGATI A,

*ICO D! FLAU A : Color morado> "eaccin alcalina 8 U @ CA*A *"OFU7DA: Color amarillo >"eaccin acida 8 A@ S! "!*O" A: UJA ambin se obser%a &na reaccin ;&e significa lo mismo: *ICO D! FLAU A : Color amarillo> "eaccin acida CA*A *"OFU7DA: Color amarillo >"eaccin acida S! "!*O" A: AJA DE!AMINACION DE "A "I!INA : Color ro$o> "eaccin acida 8U@ 8A@ 8 A@

*ICO D! FLAU A

 CA*A *"OFU7DA: Color amarillo >"eaccin acida S! "!*O" A: UJA PROD#CCION DE ACIDO !#"3;IDRICO );1!@

8 A@

La prod&ccin de );1!@ se denota= por el ennegrecimiento del medio 8precipitado negro@ S! "!*O" A ASI: ;1! PR#EBA! DE" MEDIO )MO I"IDADE INDOE ORNITINA, INOC#"ACION: *or picad&ra 8Ag&$a de inoc&lacin 8con el asa recta@

!n el medio MIO= se ,acen las sig&ientes pr&ebas: Mo%ilidad Descarbo<ilacion de la ornitina *r&eba del indol

MO I"IDAD: !sta pr&eba sir%e para determinar si &n organismo es m%il o inm%il: *"U!BA *OSI IBA 8MOBILIDAD@: Los organismos m%iles migran de la lnea de siembra . se dif&nden en el medio pro%ocando t&rbiedad> *"U!BA 7!#A IBA 8SI7 MOBILIDAD@: !l crecimiento bacteriano se acent-a sig&iendo la lnea de siembra= el medio circ&ndante se mantiene claro> DE!CARBO8I"ACION DE "A ORNITINA !s &na pr&eba ;&e nos indica la capacidad del organismo de descarbo<ilar la ornitina para formar &na amina= con la consig&iente alcalinidad> INTERPRETACION: *"U!BA *OSI IBA 8D!SCA"BOLILACIO7 D! LA O"7I I7A@>G el color del medio permanece de color morado> *"U!BA 7!#A IBA 87O D!SCA"BOLILACIO7 D! LA O"7I I7A@>G!l medio tomara &n color amarillo> PR#EBA DE" INDO"

Agregar / gotas de reacti%o de Uo%ac]s

La pr&eba del indol nos sir%e para determinar la capacidad de &n organismo de prod&cir indol del triptfano> INTERPRETACION: *"U!BA *OSI IBA:G*resencia de &n anillo de color ro$o en la s&perficie del medio> *"U!BA 7!#A IBA:G 7o se prod&ce color en la capa del medio= toma el color del reacti%o de Uo%ac]s BA"IABL! 8R o G@:G &n color anaran$ado en la s&perficie del medio> PR#EBA EN E" MEDIO ROJO DE METI"O0 OG#E! PRO!SA#ER )RM0 P, !n este medio de c&lti%o se lle%a acabo ) pr&ebas bio;&micas= las c&ales son las sig&ientes: A> *"U!BA D!L "OSO D! M! ILO 8"M@ Agregar 2 gotas del indicador de "OSO D! M! ILO>

!sta pr&eba sir%e para: Comprobar la capacidad de &n microorganismo de prod&cir . mantener estables los prod&ctos terminales :cidos de la fermentacin de la gl&cosa . %encer la capacidad amortig&adora del sistema> !s &na pr&eba c&alitati%a de la prod&ccin de :cido 8determinacin del p9@= alg&nos microorganismos prod&cen m:s :cido ;&e otros> INTERPRETACION: "OSO D! M! ILO 8"M@ *OSI IBA>G Color ro$o> !l c&lti%o es lo s&ficientemente acido como para permitir ;&e el reacti%o "OSO D! M! ILO 8"M@ mantenga &n definido color ro$o 8p9 1>1@ en la s&perficie del medio> "OSO D! M! ILO 8"M@ 7!#A IBO>G Color amarillo 8p9 3>5@ en la s&perficie del medio> "!ACCIO7 "! A"DADA>GColor anaran$ado> Contin&ar con la inc&bacin ,asta 1 das . repetir la pr&eba> B. PR#EBA REACCION DE OG#E! PRO!SA#ER ) P, Agregar 3 gotas de alfa naftol . ) gotas de UO9 al 15X> Agitar el t&bo s&a%emente para e<poner el t&bo al o<igeno atmosfrico a fin de o<idar la acetoina . obtener &na reaccin de color> De$ar reposar el t&bo a /0 5C d&rante '5 a '2 min&tos> !sta pr&eba nos permite determinar la capacidad de alg&nos microorganismos de prod&cir &n prod&cto final ne&tro= el acetilmetilcarbinol 8acetoina@= a partir de la fermentacin de la gl&cosa> INTERPRETACION:

La interpretacin se ,ace desp&s de agregar los reacti%os para esta pr&eba> "!ACCIO7 D! BO#U!S *"OSUAU!" 8B*@ *OSI IBA:GColor ro$o rosado en la s&perficie del medio 8*resencia de acetona@> "!ACCIIO7 D! BO#U!S *"OSUAU!" 8 B* @ 7!#A IBA>G Color amarillo en la s&perficie del medio 8 el mismo color del reacti%o@> *&ede formarse &n color cobri+o pero a&n asi la reaccin es negati%a 8debido a la accin de los reacti%os al me+clarse@> PR#EBA DE" CITRATO

INOC#"ACION:G!stra simple 8asa bacteriolgica o ag&$a de inoc&lacin 8con asa recta@@> !sta pr&eba se lle%a a cabo en el medio de Citrato de Simmons> 7os sir%e para determinar si &n organismo es capa+ de &tili+ar Citrato como -nica f&ente de Carbono para el metabolismo= pro%ocando alcalinidad> I7 !"*"! ACIO7: *"U!BA *OSI IBA>GCrecimiento con &n color a+&l intenso en el medio> *"U!BA 7!#A IBA>G!l medio permanece de color %erde> 7o se obser%a crecimiento= ni cambio de color>

PR#EBA DE" MA"ONATO )CA"DO MA"ONATO,

Inoc&lar &tili+ando el asa bacteriolgica>> !sta pr&eba se lle%a a cabo en el caldo malonato> 7os sir%e para determinar la capacidad de &n organismo de &tili+ar malonato de sodio como -nica f&ente de carbono= con la consig&iente alcalinidad> INTERPRETACION:0 *"U!BA *OSI IBA>G Color a+&l claro o a+&l intenso en todo el medio> *"U!BA 7!#A IBA>Gno ,a. cambio de color 8permanece %erde@> PR#EBA REACCION DE "A #REA!A )CA"DO #REA,.

Inoc&lar &tili+ando el asa bacteriolgica> Se determina esta pr&eba en el caldo &rea> !sta pr&eba nos permite determinar la capacidad de &n organismo de desdoblar la &rea= formando dos molc&las de amoniaco= por la accin de la en+ima &reasa> INTERPRETACION:G *"U!BA *OSI IBA:GColor ro$oGrosado intenso en todo el caldo> *"U!BA 7!#A IBA:G 7o cambia de color el caldo 8Color canela@> >PR#EBA DE "A 3ENI"A"ANINA.0

La fenilalanina es &n amino:cido ;&e por desaminacin forma &n ceto:cido= :cido fenilpir-%ico> De las !nterobacterias= solo miembros de los gneros *rote&s= Morganella . *ro%idencia= poseen la en+ima deaminasa necesaria para esta con%ersin> Se inoc&la en el medio con &n solo microorganismo aislado en c&lti%o p&ro> Desp&s de inc&bar a /0 5C d&rante )1G1( ,oras= se agregan de 1 a 2 gotas de clor&ro frrico directo al medio> INTERPRETACION:0 "!ACCIO7 *OSI IBA:GAparicin inmediata de &n intenso color %erde= ;&e indica la presencia del :cido fenilpir-%ico> "!ACCIO7 7!#A IBA:G>7o ,a. cambio de color>

PR#EBA! DE 3ERMENTACION DE CARBO;IDRATO! CALDO BAS! "OSO D! F!7OL R SACA"OSA CALDO BAS! "OSO D! F!7OL R #LUCOSA CALDO BAS! "OSO D! F!7OL R MAL OSA CALDO BAS! "OSO D! F!7OL R MA7I OL

I7OCULACIO7>GCon el asa bacteriolgica> !sta pr&eba se reali+a en el caldo ro$o de fenol al c&al se le agrega el carbo,idrato ;&e se desee> La pr&eba nos sir%e para determinar la capacidad de &n organismo de fermentar 8degradar@ &n carbo,idrato especifico integrado en &n medio b:sico= prod&ciendo :cido= o :cido con gas %isible> INTERPRETACION:0 "!ACCIO7 *OSI IBA>G Color amarillo> "eaccin :cida 8 A @ "!ACCIO7 7!#A IBA>G Color naran$a> "eaccin alcalina 8 U @ "!ACCIO7 "! A"DADA>GColor anaran$ado> Si no se tiene seg&ridad= comparar con &n t&bo no inoc&lado= . %ol%er a inc&bar>

5P#2D1-# 1

IN!TR#CCIONE! PARA PREPARAR REACTI O! < CO"ORANTE! '@ ALCO9OL AC! O7A Acetona bbbbbbbbb 25 ml Alco,ol !tlico al 42Xbbb>> 25ml Me+clar los ingredientes respecti%os> )@ ALCO9OL ACIDO 9Clconcentradobbbb> / ml Alco,ol etlico al 05 Xbb>>'55ml Agregar lentamente el acido en el alco,ol> /@ ACIDO SULFA7ILICO ccidos&lfanilicobbbbb> 5>(ml ccido acticobbbbbb>> '55ml Agregar el acidos&lfanilico al actico> 1@ ALFAG 7AF ILAMI7A AlfaG naftilaminabbbbb> 5>2ml ccido actico 827@= /5X bb'55ml Agregar el alfaGnaftilamina en el acido> 2@ ALFAG7AF OL Alfa P naftol bbbbbbbb 2 g Alco,ol etlico absol&tob>> '55ml

Disol%er el Alfa P naftol en el alco,ol> *roteger de la l&+ . refrigerar> 3@ A6UL D! M! IL!7O A+&l de metileno bbbbbb> 5>/g Alco,ol etlico al 42X bbb>>> /5ml Ag&a destilada bbbbbbb>>'55ml 0@ CA"BOLFUCSI7A Cristales de fenol bbbbbb>> )>2 g Alco,ol al 42Xbbbbbbbb 2 ml F&csia b:sica bbbbbbbb 5>2 g Ag&a destilada bbbbbbbb '55ml Disol%er la f&csia en alco,ol . en fenol en el ag&a= me+clar las dos sol&ciones> (@ C"IS AL BIOL! A Alco,ol etlico al 42X bbb> >)5ml O<alato de amoniobbbbb> 5>( gl Ag&a destiladabbbbbbb>'55ml

4@ CLO"U"O F!""ICO Clor&ro frricobbbbbbb '5 g 9CL concentradobbbbbbb )>2 ml Ag&a destiladabbbbbbbb> '55ml

'5@ 9ID"OLIDO D! *O ASIO UO9bbbbbbbbbbbbbb>>> 15 g Ag&a destiladabbbbbbbbb '55ml

''@ UOBAC *A"A I7DOL pGdimetilaminoben+al,ido bbbb '5 g alco,ol amlico o isoamilico p&rob '25 ml 9CL concentrado bbbbbbbbb>> 25 ml Disol%er al alde,do en alco,ol por calentamiento s&a%e en baEo mara= enfriar . agregar el acido> *roteger de la l&+ . refrigerar> ')@ UOBAC *A"A OLIDASA Clor,idrato de tetrametilG pG fenilendiaminab>>'>5 g Ag&a destilada bbbbbbbbbbbbbbbbbb> '55ml *roteger de la l&+= refrigerar . e%itar la o<idacin agregando acido ascrbico al 'X '/@ LU#OL Tod&ro de potasiobbbbbbbbb>> )>5g

Cristales de .odo bbbbbbbbbb> '>5 g Ag&a destilada bbbbbbbbbbb>> '55 ml Me+clar bien . conser%ar en frasco :mbar con tapn esmerilado> '1@ "OSO D! M! IL!7O Safranina Obbbbbbbbbbbbbb )>2g Alco,ol etlico al 42Xbbbbbbbb> '55ml Disol%er la safranina en alco,ol> La sol&cin de traba$o se prepara dil&.endo '5 ml de la sol&cin madre de '55ml de ag&a destilada>

BIB"IOGRA3IA
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