Acumulacin y tolerancia del ostin Crassostrea gigas en condiciones perturbadas por sulfato de cobre

Eva Daniela Ruiz Ortega, lafunambulista_@hotmail.com Departamento de Investigaciones Cientficas y Tecnolgicas, Universidad de Sonora, Blvd. Luis Encinas y Rosales S/N Col. Centro, Sonora, Mxico.

Resumen Crassostrea gigas es un molusco bivalvo de gran importancia en Mxico, tanto en el mbito ecolgico como el comercial. En el presente estudio se propone que, dadas las estrategias adaptativas desarrolladas por C. gigas, la asimilacin o acumulacin del cobre produce alteraciones histopatolgicas relacionadas con la toxicidad y el tiempo de exposicin. El objetivo fue preparar concentraciones, empleando sulfato de cobre, equivalentes a 200 y 600 partes por billn (ppb) en agua de mar (salinidad de 34 %) para introducir 10 organismos en recipientes con 10 litros de agua, con renovacin de 0.60 del volumen de agua cada 24 horas, durante un periodo de 24, 48 y 72 horas. La toxicidad de cobre ha sido evaluada en trminos de mortalidad, dao tisular y acumulacin en tejido blando; encontrndose que hay relacin directa entre mortalidad, concentracin, acumulacin y tiempo de exposicin. Los valores promedios de mortalidad se mantuvieron constantes entre las 24 y 48 horas y los valores ms altos de cobre acumulado correspondieron a 165 g /g en ostiones expuestos a 72 horas, con una mortalidad promedio de 78% para un equivalente de 600ppb. Palabras clave: Crassostrea gigas, toxicidad, sulfato de cobre.

Introduccin Todos los organismos pertenecen a un medio ambiente determinado, constituido tanto por el conjunto de seres vivos como por factores fsicos y qumicos que los rodean e influyen directa o indirectamente. Todos los seres vivos deben alimentarse, respirar, sintetizar nuevas molculas orgnicas y eliminar los productos metablicos no requeridos, as como crecer y reproducirse. Existe un flujo de materiales dentro y fuera

de cada ser vivo, por lo que los organismos se encuentran en continua interaccin con el medio. Los contaminantes son sustancias txicas o condiciones ambientales que al alcanzar niveles elevados alteran las condiciones originales de los ecosistemas y daan a los organismos reduciendo su desempeo. Los metales engloban un amplio conjunto de elementos que se caracterizan por no ser degradables, tener elevada persistencia y susceptibilidad a incorporarse en el medio, as como ser acumulados por organismos marinos filtradores (vila P. P., 1988). El cobre es un elemento traza esencial para la vida de los organismos por su funcin como parte estructural de 30 enzimas y otras molculas (Harris, 1991), sin embargo, altas concentraciones pueden ser txicas y potencialmente letales en organismos bivalvos, puesto que son ms susceptibles y sufren alteraciones fisiolgicas e histopatolgicas. Todos los metales, incluyendo los micronutrientes esenciales, son potencialmente txicos para los organismos acuticos y para los seres humanos si los niveles de exposicin son lo suficientemente altos (Lowe, 1981). A travs del proceso de concentracin biolgica, el cobre es acumulado por los organismos vivos filtradores, alcanzando una concentracin de varios rdenes de magnitud en los macro invertebrados (Waldichuk, 1974 y Lowe, 1981). La toxicidad aguda del cobre difiere grandemente de acuerdo al nivel trfico del organismo y al estadio de su ciclo de vida. Las ostras son organismos ssiles incapaces de evadir condiciones desfavorables y se conoce que bio-acumulan contaminantes. Metabolizan el metal por estrategias adaptativas que incluye la regulacin activa de la absorcin del metal, distribucin, metabolismo y la excrecin; sin embargo,

determinadas concentraciones no pueden ser asimiladas y excretadas produciendo alteraciones que repercuten en los epitelios del organismo (Sarasquete et al., 1997). En la acuacultura el uso del sulfato de cobre es de gran importancia, dado que stas sales de los metales pesados poseen ciertas propiedades como biocidas (Waldichuk, 1974), su uso tiene gran utilidad en el control de plaga de algas, as como otros derivados de cobre que son utilizados para inducir la muda en el camarn, y estos desechos no son tratados antes de ser introducidos al sedimento o mar. Segn la FAO, la produccin mundial de ostiones alcanz en 1986, la cifra de 1 011 079 en pases como Japn, Francia, Espaa, Chile, Mxico y Australia. Dada la importancia comercial, el control de calidad en el medio ambiente en que el alimento se produce debe ser estrictamente regulado. La legislacin en Mxico, establece 100 g/m3 de cobre como Lmite Mximo Permitido en las descargas al ao, de aguas residuales y de bienes nacionales (Diario Oficial de la Federacin, 1997). Dicha legislacin debe tomar en cuenta la acumulacin en sedimentos de origen industrial, que provienen del flujo de aguas estuarinas, as como el acarreamiento de suelo contaminado por aire y ros. El estero La cruz en Baha de Kino, Sonora, se cultiva la semilla Crassostrea gigas para su venta local. Por su ubicacin, los esteros sirven como asentamientos urbanos, portuarios e industriales, que utilizan a estos sistemas acuticos como reas de vertimiento de desechos principalmente, por ejemplo en el Golfo de Mxico por la industria petrolera (Toledo 1982). Por la importancia de estos se ha sugerido por mucho tiempo evaluar la contaminacin, recurriendo a ciertos organismos que por su hbitat y ubicacin en la cadena alimenticia, sirvan como indicadores. En ostin es un buen indicador, y de fcil manejo, por su amplia distribucin geogrfica, caracterstica sedentaria e importancia econmica.

Este estudio sugiere a Crassostrea gigas, que por ser una especie importante por su valor nutritivo y posibilidades de cultivo, es un organismo con caractersticas fisiolgicas muy interesantes y sin embargo muy poco estudiada.

Materiales y mtodos Los organismos fueron obtenidos por colecta manual en el estero La Cruz en Baha de Kino. Se mantuvieron en acuarios con aireacin para aclimatacin durante 3 das, un total de 60 organismos. Se colocaron 10 organismos en acuarios de 10L, renovando 0.60 del volumen de agua cada 24 hrs, expuestos a concentraciones de entre 200 y 600 ppb. De forma paralela se tuvieron organismos control. El estudio se realiz por triplicado siguiendo la misma metodologa. Preparacin de concentraciones. Se prepararon concentraciones para el volumen requerido de 28 litros en total, utilizando 5.6 mg/l para una concentracin de 200ppb y 16.8 mg/l para una de 600ppb. Los ostiones que fueron removidos fueron colocados en bolsas hermticas marcadas y se llevaron al congelador. La obtencin de cenizas se obtuvo mediante secado en la muffla a 500C durante dos horas, hasta obtener cenizas blanca/ griscea. La ceniza remanente es el residuo inorgnico y la medicin de la ceniza total es til en el anlisis, ya que se pueden determinar diversos minerales contenidos en la muestra. Preparacin para digestin de cenizas. Se prepararon 50 ml de HCl 1N y 50 ml H2SO4 1N para preparar la solucin extrable, en una mezcla de 50 ml de HCl y 25 de H2S04 diluidos en 1l con agua desionizada. Se pesaron 2g de muestra seca y se colocaron en un vaso de precipitado de 250 ml. Adicionndole 20 ml de la solucin extrable. Seguido se agit mecnicamente durante un tiempo de 15 minutos. Tras la obtencin de las cenizas se procedi a la preparacin o digestin para el anlisis con
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espectrofotmetro de absorcin atmica, haciendo las diluciones apropiadas para el estndar de calibracin, usando solucin de nitrato de magnesio al 33.3%, para alcanzar las siguientes concentraciones de 5 ml de solucin en un volumen de 1000 g/ml en concentracin de 5. Se corri un blanco de reactivos, tejido blanco y muestra fortificada, por cada serie de digestin para despus leerse en el espectrofotmetro de absorcin atmica y registraron los valores de absorbancia. Anlisis histolgicos, segn el protocolo de Muetn et al (2000) y Humason (1967). El tejido se deposit en una canastilla metlica para dar inicio a la deshidratacin. El equipo es un procesador automtico de tejidos modelo TISSUE-TEK 11 de Sakura Finetechnical Co. Ltd. Programado para 12 horas de trabajo con las muestras en alcohol de concentracin creciente. Las muestras procesadas se llevaron a un inclusor Leica, modelo EG1160. A los moldes con el tejido se les agreg parafina a temperatura de 57 C, fueron llevados, despus, a la plancha fra del inclusor para que solidificaran y as obtener bloques para cortes del tejido en el microtomo rotatorio AO Scientific Instruments. Al obtener una tira larga, coloc sobre la superficie del agua contenida en el bao de flotacin a 40 C. Los cortes se montaron en portaobjetos previamente etiquetados, que posteriormente son colocados en una estufa a una temperatura de 60 a 70 C con el fin de desparafinar el tejido. Los portaobjetos son sumergirlos segn el tiempo requerido en las soluciones, colorantes y alcoholes preparados previamente. A las muestras teidas se les adiciona una gota de resina sinttica en la parte superior, para despus colocarle el cubre-objetos, cuidando de no formar burbujas de aire, dejndose secar por un perodo de 24 horas a temperatura ambiente.

Resultados y discusin

Tabla de mortalidad 24 hrs 200ppb 600ppb Control 0% 44% 0% 48 hrs 0% 44% 0% 72 hrs 11% 78% 0%

Tabla 1. El porcentaje de mortalidad muestra que no hubo ningn deceso en los organismos control, al contrario de lo que se obtuvo a partir de las 24 horas en la concentracin mayor. La probabilidad y correlacin indican que hay relacin directa entre la mortalidad, tiempo de exposicin y concentracin del medio, cosa que puede observarse en la grafica nmero 1.

Grafica 1. Los valores promedios de mortalidad en ambas concentraciones se mantuvieron constantes entre las 24 y 48 horas.

Grafica 2. Puede observarse que la cantidad de cenizas aumenta de manera significativa en las concentraciones de 600ppb en relacin al tiempo de exposicin.

Grafica 3. Los valores ms altos de acumulacin se encontraron en los ostiones expuestos a 72hrs con valores de 165 g /g a una concentracin equivalente a 600ppb.

El cobre, como sulfato de cobre en agua de mar, produce toxicidad en el ostin dependiendo de la concentracin y tiempo de exposicin. Los valores promedios de mortalidad en ambas equivalencias de ppb se mantuvieron constantes entre las 24 y 48 horas. En concentraciones de cobre equivalentes a 600ppb, result en mortalidad para ms del 50% de los organismos sometidos a 72 horas. Los valores ms altos de acumulacin se encontraron en los ostiones expuestos a 72hrs con valores de 165 g /g con una mortalidad promedio de 78% para una concentracin de 600ppb. En la concentracin de 200ppb, el valor de acumulacin ms alto fue de 78.4 g/g con una mortalidad promedio de 11%. La mortalidad mostr estar relacionada con el tiempo de exposicin y la concentracin de cobre en el medio, sin embargo, para evitar sugerir de manera incorrecta la causa a la exposicin de metales traza, un anlisis comparativo de cenizas es necesario para cuantificar niveles de cobre en el tejido blando. La obtencin de cenizas muestra la cantidad de materia inorgnica acumulada y los resultados obtenidos
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de correlaciones cercanas a 1, indican que las variables de tiempo y concentracin de cobre en el medio estn relacionadas de manera lineal. Siguiendo los mtodos descritos con anterioridad se realiz el anlisis de cuantificacin por absorbancia atmica, la cual, tras la calibracin especfica para el cobre, permiti obtener resultados en unidades de g/g. Como se ha mencionado antes, los ostiones son organismos capaces de metabolizar metales, por lo que datos arrojados en la cuantificacin de cobre, no indica las condiciones a las que los organismos filtradores estn expuestos. El anlisis histopatolgico muestra cambios significativos que sugieren respuesta a estrs causado por el cobre. Al comparar el dao tisular en branquia, manto, glndula digestiva e intestino de organismos representantes de cada muestra, se observ inflamacin de los epitelios en todas las muestras contra los organismos control. La respuesta inflamatoria en branquias y manto no fue significativa al compararse con los organismos control durante las 24 horas en concentraciones correspondientes a 200ppb; sin embargo, a partir de las 48 horas esta aumenta principalmente en el intestino y glndulas digestivas. En los organismos expuestos a 600 ppb, presentan la inflamacin caracterstica a partir de las 24 horas con un aumento de clulas teidas de color caf, mayormente visibles en intestino. Los organismos expuestos a la mayor concentracin, en las primeras 24 horas sufren una respuesta epitelial inflamatoria crtica, principalmente en glndula digestiva e intestino, en respuesta al medio.

Fig. La imagen a la izquierda muestra el tejido del intestino a partir de las 24 horas en concentraciones de 600ppb. La imagen a la derecha es tejido epitelial del intestino de una muestra control.

Los cambios bruscos en el medio inducen a los organismos a bajar su tasa metablica, pero en concentraciones tan altas, las clulas muestra alteraciones considerables que resultan letales casi para el 50% de los organismos. El intestino y la glndula digestiva forman parte de una de las principales vas de incorporacin de txicos, ms que como podra esperarse en branquias. La literatura no dice mucho sobre los efectos en este tipo de estudios en bivalvos, pero en C. virginica se ha sugerido que la regin del manto y branquia, por ser rganos ms externos, favorecen la eliminacin de las clulas. La aparicin de clulas cafs y hemocitos, en mayor cantidad en el intestino y glndula digestiva, indicando que la produccin de estas clulas, son resultado de una agresin subletal por exposicin. Segn Zaroogian y Yevich (1994), que han estudiado C. virginica en exposicin al cadmio, la actividad de clulas se relacionan con procesos de incorporacin, desintoxicacin y degradacin de material extrao de la hemolinfa, los cuales fagocitan partculas y envuelven solutos mientras, las clulas cafs embeben solutos eficientemente como un mecanismo de defensa.

Conclusiones Los estudios de contaminacin por metales pesados en el medio ambiente tienen el propsito de proteger los ecosistemas marinos y costeros, en general, y la salud humana, en particular. Los ostiones son organismos ssiles incapaces de evadir condiciones desfavorables y, dado que se alimentan por filtracin, tienden a acumular grandes cantidades de cobre y otros metales cuando el medio sufre alguna alteracin en sus concentraciones. Las alteraciones fisiolgicas, o patologas fisiolgicas, en

respuesta a las condiciones ambientales en su entorno, repercuten en los organismos de tal forma que el sistema celular colapsa por estrs que puede ser letal. Una tcnica de cuantificacin de metales traza subestima la realidad de un estudio de toxicidad, por lo tanto no es en vano sugerir que el uso de organismos marcadores o indicadores, no pueden ser tal cosa si no es evaluada la fisiologa del organismo, principalmente cuando se evala contaminantes. La abstraccin es fundamento de toda ciencia, y entre ms condiciones se dejan de lado en el proceso, ms general y sencilla se vuelve nuestra explicacin. Sin embargo, esto puede llevar a dejar de lado condiciones que han de tener influencia necesaria en la aplicacin de los principios. Las ciencias naturales constatan relaciones, sin comprender el significado interno de los fenmenos. Las correlaciones numricas que arrojan los datos de mortalidad y cuantificacin, muestran una realidad fundamentada por la estadstica de toda replicacin experimental. La abstraccin formal, fundamental en la ciencia, nos permite aprender lo que es una cosa, su forma o esencia, pero deja de lado la existencia, acercndola, ms que al del mundo de la realidad concreta, al mundo de las formas. La bsqueda de la realidad cientfica, podra ser vista como un compuesto tanto por las necesidades de formas, como de existencias individuales contingentes, no necesarias. La suma de la naturaleza en el sentido de esencia y el acontecimiento. Para poder conocer y predecir es necesario tomar en cuenta las individualidades que constituyen y forman los planos tecnolgicos (Baudrillard, 1968). Dicho esto, la abstraccin encaminada a la objetividad sugiere tomar de las formas el acontecimiento, es decir, el conocimiento de la naturaleza, mediante el estudio de las interacciones de los elementos bsicos del organismo y su entorno. Tras el experimento se pudo concluir que existe relacin directa entre las variables. Los resultados obtenidos para los porcentajes de mortalidad indican que a

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partir de las 72 horas, en la menor concentracin, el porcentaje es de un 11% de mortalidad contra un 44% en la concentracin ms alta a partir de las 24 horas y aumentando entre las 48 y 72 horas en esta ltima. El experimento puede considerarse breve por lo que se propone aumentar el tiempo de exposicin tenindose en cuenta que no muri el 100% de organismos en las corridas, sugirindose aumentar tanto el nmero de muestras como el tiempo de exposicin.

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