PALESTRA Validao de mtodos analticos.

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VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS

Cleide Bassani de Barros CPTI Tecnologia & Desenvolvimento So Paulo SP
RESUMO Validao de mtodo analtico o processo de demonstrar que o mtodo adequado ao uso pretendido, um aspecto vital da garantia da qualidade analtica e tem recebido considervel ateno na literatura. A determinao das caractersticas de desempenho do mtodo somente uma parte do processo e os critrios de aceitao so baseados no uso intencional do mtodo. recomendado que o planejamento e execuo da validao de mtodo siga um plano mestre de validao. PALAVRAS-CHAVE: Validao de mtodo, caractersticas de desempenho do mtodo, qualidade assegurada. ABSTRACT ANALYTICAL METHODS VALIDATION. Analytical method validation is the process of demonstrating that analytical procedures are suitable for their intended use, it is a vital aspect of analytical quality assurance and it has received considerable attention in the literature. The evaluation of a method's performance characteristics is only part of the process. The preparation and execution of method validation should follow a validation master plan. KEY WORDS: Method validation, method's performance characteristics, quality assurance.

Milhes de medies analticas so efetuadas a cada dia em milhares de laboratrios ao redor do mundo. Uma forte infra-estrutura internacional de medies est sendo implementada e, verifica-se a necessidade progressiva de dados analticos comparveis e consistentes, para a eliminao de barreiras tcnicas entre os pases. Para atingir este processo de reconhecimento mtuo a nvel internacional, em que uma vez efetuada a medio esta aceita em qualquer pas, requisitos legais, de certificao e de credenciamento devem ser observados. As normas internacionais, nacionais e sistemas da qualidade destacam a importncia da validao de mtodos analticos e a documentao do trabalho de validao, para a obteno de resultados confiveis e adequados ao uso pretendido. Validao de mtodos um aspecto vital da garantia da qualidade analtica. Os mtodos de ensaios usados para avaliar a conformidade de produtos farmacuticos com especificaes estabelecidas devem atingir padres adequados de exatido, preciso e confiabilidade. (21 CFR 211.194(a)) A farmacopia americana (USP 25, 2002) na Seo de Ensaios Gerais apresenta recomendaes para a

validao de mtodos analticos de compndio. Esta seo de ensaios gerais no distingue entre mtodos cromatogrficos e no cromatogrficos. Apresenta tambm um sumrio das caractersticas de desempenho requeridas para os vrios tipos de mtodos de ensaios. Existe vasta literatura, na rea de medies qumicas e recomendaes publicadas por organizaes, internacionais e nacionais (ISO/IEC 17025, 1999; ICH Q 2B, 1996; USP 25, 2002; FDA, 2000; NATA, 1998; EURACHEM, 1998; NBR ISO/ IEC 17025, 2001; INMETRO DOQ-CGCRE-008, 2002). Destaca-se a apresentao bastante prtica para validao de mtodo analtico de produtos farmacuticos (GR E E N, 1996). Validao Validao do mtodo analtico a confirmao por exame e fornecimento de evidncia objetiva de que os requisitos especficos para um determinado uso pretendido so atendidos (NBR ISO/IEC 17025, 2001). A validao do mtodo analtico permite demonstrar que o mtodo "adequado ao uso" pretendido. A validao inclui a especificao dos requisitos do mtodo; determinao das caractersticas do mtodo; verificao de que os requisitos podem ser atendidos

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com o uso do mtodo e uma declarao sobre a validade do mtodo (NBR ISO/IEC 17025, 2001). Mtodos normalizados, como os de compndios, j so mtodos validados e no necessrio proceder ao processo completo de validao desde que no ocorram alteraes significativas dos mesmos e quando o produto em questo o indicado na monografia (USP 25, 2002). Entretanto, a conformidade dos mtodos normalizados usados deve ser verificada sob condies reais de uso. responsabilidade do analista/ laboratrio verificar se as caractersticas de desempenho prescritas no mtodo normalizado podem ser obtidas (EURACHEM, 1998). A validao de mtodos analticos desenvolvidos no laboratrio efetuada aps seleo, desenvolvimento, e otimizao dos mtodos (SWARTZ, 1997). O uso de ferramentas estatsticas adequadas, testes de hiptese: t de Student e F, rejeio de dispersos: Grubbs e Cochran, anlise de varincia e regresso linear, entre outras, indicado para demonstrao de evidncia objetiva da validade do mtodo. A validao do mtodo analtico deve ser documentada. Os procedimentos devem ser claros, objetivos e completos, de acordo com a norma ISO 78/2, 1999. A documentao consiste dos documentos: Plano Mestre, Protocolo, Planilhas de dados, Relatrio. O Plano Mestre de validao o documento estratgico e contem cronograma de atividades e responsabilidades pelo desempenho das tarefas inclusive elaborao, reviso e aprovao dos documentos. O objetivo do Plano Mestre garantir que as prticas de validao sejam efetuadas com eficincia e consistncia na organizao, para o atendimento dos requisitos do cliente, das normas e dos aspectos legais. O protocolo descreve como o processo de validao deve ser executado. O relatrio apresenta os resultados obtidos, os critrios de aceitao, comentrios e a declarao da validade, se os requisitos foram atendidos. Caractersticas de desempenho As caractersticas de desempenho investigadas no processo de validao, a fim de demonstrar o desempenho do mtodo so: Especificidade; Exatido; Preciso; Limite de deteco; Limite de quantificao; Linearidade; Faixa de aplicao; Robustez. Especificidade do mtodo analtico refere-se capacidade de medir com exatido o analito de interesse em presena de outros componentes ou interferentes que possam estar presentes na matriz da amostra. Especificidade do mtodo demonstrada como o desvio dos resultados obtidos pela anlise do analito de interesse em amostras fortalecidas com todos os interferentes e os resultados obtidos com amostras no fortalecidas, contendo somente o analito. Quando no se conhecem os interferentes, a especificidade do mtodo pode ser investigada

pela comparao dos resultados com outros mtodos/ tcnicas independentes. Exatido do mtodo analtico o grau de concordncia entre o valor mdio obtido de uma srie de resultados e o valor de referncia aceito.Exatido pode ser demonstrada pela comparao dos resultados obtidos com material de referncia certificado ou com outro mtodo validado cujo erro sistemtico sabidamente no significativo. Outra forma de investigao comparar a mdia dos resultados obtidos com a mdia obtida do programa interlaboratorial, ou ainda por meio de estudos de recuperao de quantidades conhecidas do analito adicionado na matriz limpa da amostra ou ainda na matriz da amostra. Preciso do mtodo analtico o grau de concordncia entre resultados de medidas independentes em torno de um valor central, efetuadas vrias vezes em uma amostra homognea, sob condies pr-estabelecidas. Preciso expressa em termos de desvio padro e desvio padro relativo. Para definir os critrios de aceitao no estudo de preciso, pode ser usada a equao de Horwitz, que indica que a preciso decresce quando a concentrao do analito decresce (HORWITZ, 1980) Limite de deteco (LD) a menor concentrao do analito em uma amostra, que pode ser detectada, mas no necessariamente quantificada, sob determinadas condies experimentais. Existem muitos critrios para definio do limite de deteco. Para mtodos analticos instrumentais, o critrio adotado a relao sinal/rudo de 3:1. Limite de quantificao (LQ) do mtodo analtico a menor concentrao do analito que pode ser determinada com preciso e exatido, aceitveis, sob determinadas condies experimentais. calculado como a concentrao do analito para o qual a relao sinal/ rudo de 10:1. indicado, ainda, uma outra opo baseada em clculo dos limites de deteco e de quantificao, pelo uso do desvio padro da resposta (s) e a inclinao da curva de calibrao (b) construda em nveis prximos dos limites. As equaes so: LD = 3,3 s/b e LQ = 10 s/b. O desvio padro da resposta pode ser baseado no desvio padro do branco, no desvio padro residual da linha de regresso ou no desvio padro da interseco da reta no eixo y. (ICH Q 2B, 1996) Linearidade a habilidade do mtodo analtico de produzir resultados que so diretamente, ou por uma transformao matemtica bem definida, proporcionais concentrao do analito dentro de uma dada faixa. Faixa de aplicao do mtodo analtico validada verificando se o mtodo fornece preciso, exatido e linearidade aceitveis quando aplicado a amostras contendo analito nos extremos da faixa e dentro da mesma. A robustez deve ser investigada na etapa de desenvolvimento do mtodo e normalmente feita avaliando os parmetros do mtodo, simultaneamente, aplicando

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tcnica estatstica de planejamento de experimento. Com os dados obtidos dos efeitos destes parmetros nos resultados, pode-se delimitar a faixa aceitvel de valores a ser includa no mtodo final. Indica confiabilidade do mtodo durante uso normal. Concluso Validao um processo dinmico e constante que comea nas fases de seleo, desenvolvimento e otimizao do mtodo e na qualificao dos instrumentos, materiais e pessoal e continua da fase de experimentos e transferncia do mtodo. Um processo de validao bem definido e documentado fornece evidncia objetiva de que o sistema e o mtodo so adequados ao uso pretendido.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS CFR Code of Federal Regulations, Title 21, part 211.194(a). (U.S. Government Printing Office, Washington, DC). EURACHEM. The Fitness for Purpose of Analytical Methods A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics.1.ed. 1998 FDA's Draft Guidance for Industry. Analytical Procedures and Methods Validation. 2000. (Center for Drug Evaluation and Research. CDER). GR E E N, M.J. A practical guide to analytical method validation. Anal. Chem. News and Features, p.305A309A, 1996.

HORWITZ, W. Quality Assurance in the Analysis of Foods for Trace Constituents. J. Assoc. Off. Anal. Chem., v.63, n.6, p.1344-1354, 1980. ICH Q 2B. Validation of analytical procedures: methodology. (International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Nov, 1996. Geneva, Switzerland) INMETRO DOQ-CGCRE-008 Orientaes sobre Validao de Mtodos de Ensaios Qumicos. 2002. RJ. Brasil. ISO 78/2. Chemistry Layout for Standards. Part 2: Methods of Chemical Analysis. 1999. International Organization for Standardization. ISO, Geneva. Switzerland. ISO/IEC 17025. General Requirements for the Competence of Testing and Calibration Laboratories. 1999. International Organization for Standardization. ISO, Geneva. Switzerland. NATA Technical Note 17. Format and Content of Test Methods and Procedures for Validation and Verification of Chemical Test Methods. National Association of Testing Authorities. Australia. 1998 NBR ISO/IEC 17025. Requisitos Gerais para a Competncia de Laboratrios de Calibrao e de Ensaios. 2001 ABNT. RJ. Brasil S WARTZ, M . & KRULL , I. (Ed.) Analytical Method Development. Marcel Dekker, NY. 1997. USP U.S. Pharmacopeia 25/National Formulary20. (U.S. Pharmacopeial Convention, Rockville, Maryland, 2002)

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