Aislamiento, separacin y purificacin de protenas

Trabajo para concurso de oposicin C.CNI.a.001.10

Tania Et el Cuadra !elaya " de #unio de "010

Contenido
Contenido................................................................................................................ " Aislamiento, separacin y purificacin de protenas...............................................$ Introduccin.........................................................................................................$ 1. %btencin del e&tracto proteico.......................................................................' 1.1 Naturale(a y almacenamiento del material de inicio..................................' 1." E&traccin de protenas..............................................................................) ". *urificacin de la protena..............................................................................1" ".1 *urificacin no cromato+r,fica de protenas............................................1) "." *urificacin cromato+r,fica de protenas.................................................1$. Consideraciones finales................................................................................."" .iblio+rafa......................................................................................................... "$

"

Aislamiento, separacin y purificacin de protenas

Tania Ethel Cuadra Zelaya

Introduccin
El estudio de las protenas y sus funciones es b,sico no solo para el entendimiento de las c/lulas y or+anismos, sino tambi/n para un apro0ec amiento adecuado de ellas en los procesos biotecnol+icos. En los or+anismos, las protenas sir0en como catali(adores de los procesos metablicos, elementos estructurales, componentes de rutas de se1ali(acin, receptoras y con0ertidoras de informacin, componentes cla0e de la ma2uinaria 2ue determina 2ue +enes se e&presan y si los A3N4s son traducidos a protenas, en +eneral est,n in0olucradas en el flujo de la informacin +en/tica. 5adas estas importantes funciones, es 0alioso poder purificar y estudiar una protena aislada, ya 2ue de esta forma puede ser estudiada separada de otras protenas y sus funciones pueden ser e0aluadas en detalle 63oe 7. "0018. En el caso de los procesos biotecnol+icos, la produccin de protenas representa un mercado de productos de 9alto 0alor: bajo 0olumen;, usualmente son producidos por un +rupo de or+anismos +en/ticamente modificados bastante conocidos. Entre los or+anismos de produccin com<nmente usados est,n la Escherichia coli, c/lulas animales, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastorii, al+unos bacilos, c/lulas de insectos, etc. En un importante n<mero de casos, no ay sistemas de transporte celular 2ue secreten el producto desde la c/lula productora al ambiente de fermentacin. Consecuentemente las c/lulas deben romperse y el producto blanco 2uedar, disperso entre otras sustancias similares 6contaminantes8. Esta situacin ace de la recuperacin, separacin y purificacin acti0idades de e&trema importancia 6=eser y Ajenjo 1>>'8. ?ediante este trabajo se pretende presentar una 0isin +eneral de todas las tareas necesarias para el adecuado aislamiento, separacin y purificacin de protenas@ di0idiendo el contenido en dos ,reas principalesA la obtencin del $

e&tracto proteico y la purificacin de la protena de inter/s. En principio, con el objeti0o de su estudio a ni0el de laboratorio, y tambi/n tratando de produccin a +ran escala. acer una apro&imacin a la compleja seleccin de acti0idades necesarias para su

1. Obtencin del extracto proteico

1.1 Naturaleza y almacenamiento del material de inicio.
7e puede tener poca influencia en la eleccin del material de inicio para la purificacin de una protena. Bna fermentacin 2ue a sido pre0iamente re0isar las optimi(ada para producir una +ran cantidad de una en(ima en particular es un ejemplo cl,sico. 7in embar+o, se aconseja, cuando sea apropiado, opciones para el material de inicio, y en el caso de estar si+uiendo las instrucciones de una publicacin cientfica, no asumir 2ue el material utili(ado en la referencia sea necesariamente el mejor para usar en la in0esti+acin a reali(ar. El material para purificar una protena puede 0enir de una +ran 0ariedad de fuentes C tejidos animales, materiales de plantas, lec e, san+re, y productos de culti0os microbianos como se mencion antes 63oe "0018. En la mayora de los casos, el inter/s se enfoca en una acti0idad biol+ica en particular, tal como una en(ima, y el ori+en de esta acti0idad es a menudo de poca importancia. 7e debe tener, por lo tanto, un +ran cuidado en la seleccin de la fuente adecuada de esta en(ima@ ya 2ue puede aber considerables 0ariaciones respecto a la concentracin y estabilidad de /sta, la disponibilidad y costos de la materia prima, la presencia de acti0idades y protenas interferentes, y dificultades en el manejo de materias primas en particular 6#anson y 3yd/n 1>>D8. =as protenas son producto de la acti0idad ribosomal y por lo tanto est,n asociadas al metabolismo celular. Consecuentemente, sin importar la fuente, las protenas se locali(an ya sea dentro de la c/lula, formando parte de su estructura, o secretadas fuera de ella. =as protenas locali(adas dentro de la c/lula incluyen cuerpos de inclusin insolubles, en(imas solubles o protenas estructurales 2ue forman parte de una estructura celular tal como la membrana. =as protenas 2ue son secretadas por las c/lulas o locali(adas en el espacio peripl,smico tambi/n pueden pro0eer un proceso de purificacin m,s simple dado 2ue el ni0el de contaminantes proteicos es reducido en comparacin al de protenas '

intracelulares. Adem,s, las protenas e&tracelulares 6como la liso(ima y la amilasa son +eneralmente m,s robustas ya 2ue tienen 2ue operar en ambientes ad0ersos. =as protenas intracelulares son +eneralmente menos estables y presentan un mayor reto para los cientficos purificadores debido a su mayor labilidad y presencia de otras protenas contaminantes. Cuando las protenas est,n asociadas con material celular, es recomendable +enerar e&tractos clarificados 6Ej.A 7in partculas8 del material de inicio tan pronto sea posible a tra0/s de rompimiento celular, solubili(acin de la protena blanco en un amorti+uador apropiado y eliminacin de las celular y debris celular a tra0/s de filtracin o centrifu+acin. Cuando la protena es e&tracelular al material celular, se re2uiere una separacin inicial 2ue permita retirar las c/lulas y dejar un sobrenadante claro 2ue conten+a la protena blanco. A partir de entonces, la preparacin clara puede utili(arse inmediatamente para la purificacin o se pueden con+elar alcuotas para uso futuro 63oe "0018. =a frescura del material de inicio es muy importante dados los procesos de de+radacin natural y la contaminacin por microor+anismos 2ue ocurren r,pidamente y resultan en reduccin de los ni0eles de protena blanco y un material de inicio no representati0o. *or lo tanto a menos 2ue la purificacin inicie a oras de la obtencin del material de inicio, la de+radacin debe ser reducida a tra0/s de reduccin de la temperatura, a ) EC por un perodo de unas pocas oras, o mediante con+elamiento a :-0 EC por das. 7in embar+o, es necesario considerar 2ue durante el con+elamiento ciertos cambios pueden suceder en el material de inicio, los cuales, si no son 0erificados, pueden reducir subsecuentemente la eficiencia de la purificacin 63oe "0018. En la si+uiente seccin se detallan todos los cuidados a tomar en cuenta durante obtencin del e&tracto proteico y las precauciones a tomar para su mantenimiento ptimo antes y durante la purificacin de la protena deseada.

1.2 Extraccin de protena

Con el fin de aislar las protenas intracelulares, se debe reali(ar la ruptura celular. 7e encuentran disponibles 0arias t/cnicas de rompimiento celular, tanto mec,nicas como 2umicas 6Tabla 1.18. 7e debe desarrollar un protocolo de ruptura celular eficiente para liberar la protena en forma soluble desde su )

compartimiento intracelular. El protocolo de disrupcin debe ser lo m,s sua0e como sea posible para la protena, dado 2ue la etapa de e&traccin es el punto de partida para todos procedimientos posteriores. El /&ito de la ruptura celular depende de una serie de 0ariables, tales como la eleccin de buffers, la presencia de in ibidores proteasas, y la osmolaridad del buffer de resuspensin. tipo celular, de la protena de la blanco, y su aplicacin pre0ista 6A med "00)8. Bna buena parte de estrate+ia y e0aluacin se re2uieren para la seleccin de las condiciones adecuadas para la e&traccin. =os in0esti+adores necesitan tener una respuesta antes de la e&traccin para al+unas pre+untas frecuentesA FCmo se utili(ar, la protenaG F7e utili(ar, la protena para la secuenciacin de p/ptidos con el objeto de lle0ar a cabo la clonacin y secuenciacin del c5NAG F7e re2uiere la protena para la in0esti+acin de sus propiedades y acti0idades biol+icasG *ara la secuenciacin de p/ptidos, son adecuados unos pocos micro+ramos de protenas desnaturali(adas en +el de poliacrilamida o en membrana de difluoruro de poli0inildeno 6*H5I8. *ero si se pretende la in0esti+acin de las propiedades y acti0idades biol+icas de las protenas, se debe tener el cuidado de mantener la protena de inter/s en forma estable y acti0a. Tabla 1.1 Varias tcnicas de lisis celular Tcnica
5i+estin en(im,tica =isis por c o2ue osmtico Lomo+eni(acin manual Lomo+eni(ador de cuc illas ?olienda con alumbre o arena ?olienda con perlas de 0idrio

=a

condicin y constitucin del tampn de e&traccin depender, de la naturale(a del

Principio
5i+estin de la pared celular lle0ando a la disrupcin osmtica de la membrana celular. 5isrupcin osmtica de la membrana celular =as c/lulas son for(adas a tra0/s de un espacio estrec o, lo cual las lle0a al rompimiento de la membrana celular C/lulas +randes se rompen mediante accin de corte =as paredes celulares se rompen debido a superficies ru+osas microscpicas =as paredes celulares se rompen por la 0ibracin r,pida del 0idrio

Tiempo de lisis
1):$0 min

Ejemplo
.acterias Jram positi0as Jlbulos rojos Tejido de +ado

K ) min 10:1) min

):10 min ):10 min 10:"0 min

Tejido muscular, tejido animal, tejido de plantas .acterias .acterias

*rensa francesa

7onicacin

=as c/lulas son for(adas a pasar a tra0/s de un orificio pe2ue1o a una presin muy alta. =as fuer(as cortantes desbaratan las c/lulas =a disrupcin celular se reali(a debido a las fuer(as cortantes y ca0itacin causada por ondas snicas de alta presin

10:$0 min

.acterias y c/lulas de plantas .acterias

):10 min

1. .1 Amorti!uadores para e"traccin de protenas

=as protenas son macromol/culas biol+icas e&tremadamente etero+/neas. 7us propiedades pueden ser afectadas se0eramente por pe2ue1os cambios en la concentracin de iones un pL estable del ambiente proteico. 7e consideran 0arios factores durante la eleccin de un amorti+uador 6Tabla 1."8. Estos factores son el pNa y los efectos de la temperatura, interacciones con otros componentes 6tales como en(imas y iones met,licos8, compatibilidad con diferentes t/cnicas de purificacin, absorcin BH, permeabilidad a tra0/s de membranas biol+icas, y costos. Cuando se estudia las propiedades de una protena, una debe considerar determinar el pL ptimo de la acti0idad de la protena con el objeto de ele+ir el mejor amorti+uador. *ara determinar el pL ptimo, se aconseja empe(ar con una serie de amorti+uadores relacionados 2ue abarcan un amplio ran+o de pL. Bna 0e( 2ue el pL ptimo a sido determinado, diferentes amorti+uadores dentro del mismo ran+o de pL pueden ser e&aminados para un efecto amorti+uador especfico. Bna 0e( 2ue se a ele+ido el tampn apropiado, es mejor trabajar a la mnima concentracin ra(onable 6alrededor de )0 m?8 para e0adir efectos de 9fuer(a inica; no especficos. Amorti+uadores a concentraciones de )0 m? son normalmente no t&icos para las c/lulas 6Ier+uson y col. 1>D08. idr+eno, de tal forma 2ue es necesario

Tabla1.

#imitaciones de amorti!uadores com$nmente usados para Ventaja Compatible cromato+rafa permeacin %es&entaja con 5/bil capacidad amorti+uadora de dentro del ran+o de pL de D:11. +el *recipita en presencia de -

e"tracciones. Amorti!uador Iosfato

en

6cromato+rafa de e&clusin8 e intercambio catinico. Compatible con la mayora de reacti0os para entrecru(amiento. .arato. Tris Adecuado para la cromato+rafa de e&clusin y cromato+rafa de intercambio aninico. .arato

.orato Citrato Carbonato

.arato .arato .arato

Jood .uffers 3elati0amente libres de 6#edA ?E7, efectos secundarios. ?%*7, LE*E78 .aja absorbancia a la lu( BH Efectos mnimos de la temperatura y de la fuer(a inica

cationes poli0alentes. In ibe una amplia 0ariedad de en(imas, incluyendo las 2uinasas, fosfatasas y des idro+enasas. No adecuado para cromato+rafa de intercambio aninico Amorti+uador pobre debajo de pL -. *asa a tra0/s de membranas biol+icas Contiene una amina primaria reacti0a y por lo tanto forma aductos de bases de 7c iff con alde dos e in ibe la conju+acin por entrecru(amiento basado en aminas. Iorma complejos con los moti0os de ribosa de los ,cidos nucleicos, y otros mono y oli+osacaridos 7e une a al+una protenas y forma complejos met,licos 7olubilidad limitada. 5ado 2ue el carbonato est, en e2uilibrio con el C%", los estudios deben ser lle0ados a cabo en sistemas cerrados =a mayora de los amorti+uadores Jood 6LE*E7, *I*E7, etc.8 forman radicales bajo 0arias condiciones y por lo tanto no son adecuados cuando se estudian procesos redo&. Caros.

=a seleccin de buffer tambi/n depende de los m/todos de separacin empleados. *or ejemplo., en la cromato+rafa de permeacin en +el, casi cual2uier amorti+uador adecuado para la protena de inter/s puede ser ele+ido. *ero para la cromato+rafa de intercambio aninico, los buffers catinicos tales como el Tris 6y para la cromato+rafa de intercambio catinico, buffers aninicos tales como fosfato8 se prefieren. 7in embar+o estos amorti+uadores inor+,nicos tienen al+unos efectos secundarios. =os buffers de fosfato muestran in ibicin de muc as en(imas incluyendo la carbo&ipeptidasa, ureasa, 2uinasa, y des idro+enasa 6.lanc ard 1>D'8. Tris y otros buffers de aminas primarias D

pueden formas aductos de bases de 7c iff con alde dos y cetonas e in ibir la conju+acin de protenas mediante fijadores basados en aminas. =os buffer de borato pueden formar complejos co0alente con los moti0os de ribosa de los ,cidos nucleicos, y otros mono y oli+osac,ridos. 7in embar+o, los amorti+uadores Jood 6desarrollados por Jood y col 1>MM8 tales como ?E7, *I*E7 y ?%*7 a mostrado estar relati0amente libres de efectos secundarios. Tienen baja absorbancia al BH y son afectados mnimamente por la temperatura o la fuer(a inica. A diferencia de los buffers inor+,nicos, los amorti+uadores Jood tambi/n son <tiles respecto a la baja capacidad de uniones met,licas, reteniendo la mayora de los metales esenciales para la acti0idad en(im,tica.

1. .

'so de in(ibidores de proteasas y deter!entes para la e"traccin

=a protelisis puede ser un problema mayor despu/s de la e&traccin y en

cual2uier etapa de la purificacin de la protena deseada. Es un serio problema por2ue, adicionalmente a la completa inacti0acin de la protena deseada, la protelisis podra +enerar protenas de+radadas, reteniendo parcialmente la acti0idad biol+ica. Es aconsejable usar una me(cla de in ibidores cuando se trabaje con un nue0o e&tracto de protenas. =os in0esti+adores deben tener en mente 2ue los iones met,licos 6como el Cu"O8, si se utili(an para in ibidores de proteasa acidia, se oponen a la utili(acin simult,nea de 2uelantes 6tales como E5TA y EJTA8 2ue son re2ueridos para in ibir metaloproteasas. El uso de aprotinina es incompatible con los buffers de e&traccin 2ue contienen una +ran cantidad de a+entes reductores. =a aprotinina contiene tres enlaces disulfuro y por lo tanto el a+ente reductor podra inacti0ar la aprotinina. Bna me(cla de ben(amida y ben(amidina podra sustituir la aprotinina, debido a 2ue la me(cla es tan acti0a como la aprotinina. Bna 0e( se selecti0os de proteasas 6A med "00)8. =os deter+entes son a+re+ados +eneralmente al buffer de e&traccin y purificacin de protenas de membrana, las cuales usualmente son insolubles en amorti+uadores acuosos. =os deter+entes son una clase de compuestos caracteri(ada por su estructura anfifilica 6Tanto idrofbica como idroflica8. =a > an lo+rado las condiciones para mantener la protena deseada en una forma estable, se pueden usar in ibidores

9cola; de la mol/cula de deter+ente es

idrofbica, y usualmente consiste de un idroflica puede tener

idrocarburo ramificado o lineal, mientras 2ue la cabe(a

di0ersas estructuras 2umicas. =a consideracin m,s importante en la eleccin de un deter+ente apropiado es la propiedad no desnaturali(ante. =os deter+entes no inicos, tales como el Tritn P:100 y octyl+lucosido y deter+entes (Qitterionicos, tales como el CLA*7, son a menudo utili(ados para solubili(ar protenas de membrana. 7e deben considerar tambi/n las propiedades espectrales de los deter+entes, especialmente cuando la purificacin de la protena de membrana se reali(a a tra0/s de cromato+rafa de columna y se desea el monitoreo BH de la fraccin deseada. =os deter+entes con +rupos arom,ticos como el Tritn P:100 y el Tritn P:11' tienen una absorbancia ultra0ioleta sustancial a "D0 nm. =as sales biliares y sus deri0ados incluyendo CLA*7 y CLA*7% no tienen tal interferencia. =os deter+entes inicos interfieren con los procedimientos relacionados con car+a tales como la cromato+rafa de intercambio inico y el isoelectroenfo2ue. *or lo tanto, los deter+entes inicos deben ser e0itados si las t/cnicas de separacin basadas en diferencia de car+as 0an a ser empleadas. 7i las protenas 0an a separarse de acuerdo al tama1o por medio de cromato+rafa de filtracin en +el, se deben ele+ir los deter+entes con menor n<mero de tama1o de a+re+acin micelar 6K$08. Estos deter+entes dan mejor resolucin, por2ue diferencias en tama1o entre micelas 2ue contienen protenas y micelas 2ue no las contienen son mayores 6A med "00)8.

1. .) #isis *umica y mec+nica para la e"traccin de protenas

=a lisis 2umica incluye el tratamiento de las c/lulas con ,lcali, en(ima o deter+ente. =os m/todos de lisis 2umica minimi(an la desnaturali(acin y e&ponen la membrana citopl,smica interna mediante la de+radacin de la pared celular de peptido+licanos de las bacterias. =a pared celular de bacterias J6O8 es +ruesa, y contiene 0arias capas interconectadas de peptido+licano 6M0:>0R de la pared celular8. En contraste, la pared celular de las bacterias J6:8 aparece del+ada, conteniendo dos o tres capas de peptido+licano 610:"0R de la pared celular8. Adicionalmente, las J6:8 contienen una membrana e&terna compuesta de lipopolisacaridos, fosfolpidos, y lipoprotenas. =a liso(ima es una en(ima ampliamente usada para lisar c/lulas J6O8 en presencia de E5TA y deter+ente 10

.rij )D,

idroli(a los enlaces N:acetilmuramicos produciendo la de+radacin de la

pared celular. En contraste, las bacterias J6:8 son menos susceptibles a la liso(ima y deter+entes debido a la presencia de una bicapa lipdica asim/trica. =a membrana e&terna de peptido+licano act<a como una barrera permeable a las mol/culas +randes, de tal forma 2ue la membrana e&terna necesita ser permeabili(ada para e&poner la capa de peptido+licano para una lisis en(im,tica e&itosa. Adicionalmente a la lisis 2umica, la lisis celular se puede lo+rar mediante c o2ue osmtico cuando las c/lulas se suspenden en una solucin ipotnica 6Ej.A de una menor fuer(a inica 2ue la membrana citopl,smica8. =as c/lulas 2ue no est,n prote+idas por pared celular son sensibles al c o2ue osmtico. =os +lbulos rojos son un ejemplo de este tipo. =a lisis mec,nica si+nifica disrupcin de las c/lulas utili(ando sonicacin, presin celular, omo+eni(ador, o molino de perlas. =os m/todos de lisis mec,nica son econmicos y preferibles para preparaciones a +ran escala por2ue no re2uieren la adicin de 2umicos. 7in embar+o la lisis mec,nica produce calor, el cual necesita ser controlado. 7e debe tener cuidado de e0itar la formacin de espuma, para pre0enir la desnaturali(acin de la superficie y la o&idacin. =os m/todos de lisis mec,nica son de dos tiposA a+itacin, y m/todos de corte en l2uido. =a a+itacin con abrasi0os es com<nmente reali(ada en molinos de perlas 6tales como el 5ynomill8. 7u c,mara se llena con perlas de 0idrio para moler, las cuales rompen las c/lulas durante la rotacin de las perlas. =a suspensin de c/lulas rotas sale de la c,mara, reteniendo las perlas dentro de la c,mara. =a eficiencia del la lisis celular, a pesar de todo, depende de la 0elocidad de a+itacin, concentracin celular, concentracin y di,metro de las perlas de 0idrio, tiempo de lisis y temperatura. =a lisis de rompimiento en l2uido reali(ada mediante prensa francesa o prensa de ?anton:Jaulin es el m/todo de lisis mec,nica m,s com<n. =as c/lulas son lisadas mediante alta presin 6M000 a 10000 psi8 se+uidas por una s<bita liberacin de presin. Este cambio r,pido de presin ace 2ue las c/lulas estallen. =as operaciones de alta presin ele0an la temperatura, y se debe tener cuidado de controlarlo. *ara el lisado de pe2ue1as cantidades de c/lulas, la sonicacin 11

si+ue siendo una t/cnica con0eniente. =isa las c/lulas por medio de rompimiento con l2uido y por ca0itacin. *ara controlar el calentamiento durante la sonicacin, se reali(an pulsos de $0 a '0 se+undos, con pausas por unos pocos minutos en ielo. Bsualmente, los m/todos de lisis mec,nica liberan ,cidos nucleicos 2ue deben ser eliminados del e&tracto por medio de particin de fases o por tratamiento con 3NAsas o 5NAsas. =a omo+eni(acin en licuadora o en omo+eni(ador de cristal son +ado, omo+eni(acin usualmente ielo

procedimientos comunes y simples para romper tejidos sua0es como cora(n, cerebro, y m<sculos. =os m/todos de enfriados a ' EC. =a 6A med "00)8.

producen calor, por lo 2ue la licuadora y los contenedores asociados deben ser omo+eni(acin debe ser reali(ada en cuarto frio o en

2. !uri"icacin de la protena
En la purificacin de protenas, es importante adoptar procedimientos 2ue no causen su desnaturali(acin, especialmente de la protena de inter/s. =a eleccin de los m/todos de purificacin tambi/n est,n influenciados por factores tales como la forma en 2ue se utili(ar, la protena en estudios, la cantidad de protena purificada necesaria, y los costo de materiales y reacti0os utili(ados en la purificacin. Bn paso de purificacin 2ue pueda desnaturali(ar la protena no es adecuado para estudios de sus propiedades biol+icas, pero puede ser adecuado para la determinacin de su estructura primaria, tama1o de subunidad, etc. =os protocolos de purificacin para obtener un ni0el en micro+ramos de protena purificada 6para una secuencia parcial de p/ptido con el objeto de construir una sonda +en/tica8 pueden ser diferentes de a2uellos 2ue produ(can +randes cantidades de protena purificada. El costo de los li+andos utili(ados para la inmo0ili(acin de matrices y para elucin de una protena unida en cromato+rafa de afinidad pueden ser factores limitantes para purificaciones a +ran escala. Lay 0arias propiedades 6tales como peso molecular, car+a, idrofobicidad,

etc.8 2ue pueden ser e&plotadas para purificar o aislar una protena de una me(cla. .as,ndose en estas propiedades, 0arios procedimientos cromato+r,ficos y no cromato+r,ficos 6electroforesis, precipitacin, filtracin por membrana8 est,n disponibles 6Her tabla ".18. 1"

Bna protena puede ser purificada en un paso simple 6*or ejemplo, cromato+rafa de afinidad8 o por una combinacin de 0arios pasos 6por ejemplo, fraccionamiento con sales, intercambio inico, filtracin en +el, etc.8. En +eneral, la cromato+rafa de intercambio aninico se emplea para la purificacin de protenas ,cidas. 7imilarmente, para la purificacin de una protena b,sica, la cromato+rafa de intercambio catinico es la mejor eleccin. =a cromato+rafa de fase re0ersa es adecuada para una familia de protenas acti0as de car+a similar 6A med "00)8.

Tabla
Tcnica

.1 Varias tcnicas para la purificacin de protenas

Propiedad re*uerida
Tama1o molecular

,bser&aciones
Tanto para el fraccionamiento como para la concentracin de la muestra. *erdida de protenas por adsorcin no especfica Com<nmente usad para fraccionamiento celular =as protenas precipitan en la c,mara de rotofor

Cuando usar -recomendaciones de aplicacin.

Al principio del procedimiento de purificacin. *articularmente <til para concentrar +randes 0ol<menes de medio de culti0o.

Iiltracin por membrana

Centrifu+acin

Isoelectroenfo 2ue preparati0o Electroforesis preparati0a E&clusin por tama1o

Tama1o molecular, forma y densidad *unto isoel/ctrico 6pI8 Car+a *eso molecular

Intercambio inico Iase re0ersa

Car+a Lidrofobicida d

Bsualmente tiene baja resolucin, pro0ee informacin acerca del peso molecular de la protena Capacidad de unin de protena usualmente alta =a resolucin 0ara de acuerdo al tama1o del +el. Com<nmente utili(ada para la separacin de p/ptidos

Al final del purificacin

proceso

de

Lidrofbica

Lidrofobicida d

Al principio del proceso de purificacin Btili(ada para la separacin de p/ptidos, protenas purificadas di+eridas, y otras aplicaciones. Cuando la p/rdida de la acti0idad biol+ica de la protena no es una preocupacin. 5espu/s del fraccionamiento por sulfato de amonio, pero antes de la cromato+rafa de

1$

intercambio inico. Lidro&iapatita Afinidad Car+a Bnin li+ando a 7eparacin usualmente especfica. =imitada por la disponibilidad de li+ando inmo0ili(ado. Cara de escalar =imitada a las protenas 2ue contienen tioles Al inicio del procedimiento de purificacin

Co0alente Isoelectroenfo 2ue

Jrupos tilicos Car+a, pI

*ara protenas 2ue contienen tioles Stil para separar isoformas con puntos isoel/ctricos muy cercanos. Btili(ar despu/s de la cromato+rafa de afinidad.

=os in0esti+adores deben desarrollar un ensayo para la determinacin de la acti0idad de la protena a ser purificada para monitorear la purificacin. =os pasos de purificacin di0iden el total de protenas en el e&tracto crudo en 0arias fracciones, cada una de las cuales en e0aluada en cuanto a la acti0idad y contenido de protena. Bna fraccin con alta acti0idad especfica y alta concentracin de protena indica el /&ito de la fase de purificacin. =a acti0idad especfica se define como la acti0idad total por mili+ramo de protena por mililitro en una fraccin. Jrado de concentracin es el ran+o de acti0idad especfica de una fraccin en relacin con el e&tracto crudo. =a tabla "." muestra un ejemplo de una tabla tpica de purificacin de protenas 6A med "00)8.

Tabla . Purificacin de una lectina unida a +cido si+lico procedente de placenta (umana -A(med y /abius 1010..
Paso Prote na total 1,$'0 de >"D Acti&idad especfic a 0.M 0.D Acti&ida d total 2ecuperac in -3. Purificaci n -&eces.

E&tracto crudo D0' 100 1 Cromato+rafa -'" >" 1.$ Intercambio aninico en celulosa:5EAE Cromato+rafa de 0.> '"$D' 'D -1" afinidad en sefarosa:.7? Cromato+rafa de 0.1" D00 >M 1" 1.$$$ filtracin en +el con Bltro+el AcA '' NotaA la acti0idad especfica est, e&presada como ttuloTm+ de protenaTm=. Ttulo es el recproco de la mayor dilucin de lectinas mostrando a+lutinacin 0isible. 1'

A1os de trabajo pr,ctico de cientficos de separacin an deri0ado ciertas re+las para ayudar a minimi(ar problemas en la purificacin de protenas 63oe "0018A 1. ?antener la purificacin simple C minimi(ar el n<mero de pasos y e0itar manipulaciones difciles 2ue no se reproducir,n. ". ?antenerla barata C e0itar t/cnicas costosas cuando una t/cnica m,s econmica puede ser i+ual de <til. $. Adoptar una apro&imacin por pasos C y optimi(ar cada paso en el camino. '. =a 0elocidad es importante C e0itar retrasos y e2uipo lento. ). Btili(ar t/cnicas y aparatos confiables. M. Jastar dinero en pie(as y accesorios pe2ue1os C Ej.A tubos de ensayo, pipetas, etc. -. Escribir los m/todos antes de iniciar y re+istrar lo 2ue se ace con precisin. D. Ase+urar 2ue los ensayos se reali(an de tal forma 2ue se pueda monitorear la purificacin. >. ?antener notas completas de rendimientos y acti0idad. 10. Tener siempre en mente los objeti0os C alta produccin, escala final de la operacin, reproducibilidad, uso econmico de reacti0osTaparatos, con0eniencia, rendimiento, etc.

2.1 !uri"icacin no cromato#r$"ica de protena

*re0io a las t/cnicas cromato+r,ficas ay 0arios procedimientos de separacin disponibles 2ue permiten concentrar f,cilmente la protena deseada.

.1.1 4raccionamiento.
El fraccionamiento de las protenas mediante precipitacin con sulfato de amonio es el m/todo m,s com<nmente usado para enri2uecer una protena particular. =as protenas de alto peso molecular usualmente precipitan debajo de ")R de saturacin de sulfato de amonio. =os e&tractos crudos pueden ser sujetos a fraccionamiento en tres etapasA 0:$0R, $0:M0R y M0:D0R de saturacin de sulfato de amonio. 7e e0al<a la acti0idad de las protenas precipitadas de cada etapa m,s el sobrenadante del D0R 6A med "00)8.

.1.

'ltrafiltracin por membrana

=a ultrafiltracin del e&tracto crudo a tra0/s de una membrana con un peso especfico de corte 6?UC%8 es una forma alternati0a de 1)

molecular

enri2uecimiento de una protena deseada sin una p/rdida si+nificati0a de acti0idad biol+ica. En esta t/cnica, los solutos son for(ados a tra0/s de una membrana, usualmente mediante presin de nitr+eno. No se utili(a aire, para e0itar la o&idacin de la protena. 7olutos pe2ue1os pueden pasar a tra0/s de los poros de la membrana, dejando retenidas las mol/culas m,s +randes. =as propiedades de retencin de las membranas son normalmente e&presadas como un ?UC% 2ue rec a(a apro&imadamente el >0R de una protena +lobular de un determinado peso molecular. 7i la ultrafiltracin se reali(a primero con el propsito de ya sea concentrar o desalar la protena purificada, entonces es importante reali(ar e&perimentos piloto para 0erificar la capacidad de retencin de la membrana pre0io al uso 6A med "00)8.

.1.) Centrifu!acin diferencial

El principio de separacin por medio de centrifu+acin diferencial se basa en las propiedades de tama1o molecular, forma y densidad de las diferentes protenas. 7i se centrifu+a en condiciones sua0es 6poco tiempo, poco fuer(a de aceleracin8 sedimentar,n las partculas mayores yTo m,s densas. Cuando el sobrenadante de la primera centrifu+acin es centrifu+ado de nue0o en condiciones de m,s tiempo y m,s fuer(a de aceleracin, sedimentan de nue0o las partculas m,s densas presentes, y as sucesi0amente. Esta t/cnica es ampliamente usada para el fraccionamiento subcelular de un tejidos 6A med "00)8. omo+eni(ado de

.1.5 Electroforesis preparati&a

=a electroforesis preparati0a es una poderosa t/cnica, en la cual las protenas son primero separadas por electroforesis y subsecuentemente eluidas del +el de poliacrilamida. 5ependiendo de la naturale(a de los estudios de protenas purificadas un *AJE nati0o o 757:*AJE se reali(a. *ara la electroforesis preparati0a, se utili(a un peine especial preparati0o 2ue contiene un solo po(o amplio y un po(o an+osto de referencia para la protena est,ndar de referencia. 5espu/s de la electroforesis, se corta una porcin del +el 2ue contiene una banda proteica, y la protena es e&trada por difusin simple en un amorti+uador apropiado mediante electroelusin 6A med "00)8.

1M

.1.6 7soelectroenfo*ue preparati&o

El principio de isoelectroenfo2ue es 2ue las mol/culas anfteras se separan mientras mi+ran a tra0/s de un +radiente de pL. Cuando la protena se coloca en un medio con pL 0ariable y en un campo el/ctrico, inicialmente se mo0er, acia el electrodo con la car+a opuesta. 5urante la mi+racin a tra0/s del +radiente de pL, la protena reco+er, o perder, protones. ?ientras esto pasa, la car+a neta y mo0ilidad disminuir,, y en su pI la protena dejar, de mo0erse. A pesar de 2ue el isoelectroenfo2ue se utili(a ampliamente como un procedimiento de an,lisis, los a0ances recientes en aparatos de electroforesis an permitido utili(ar esta t/cnica para purificar las protenas a +ran escala 6A med "00)8.

2.2 !uri"icacin cromato#r$"ica de protena

Todos los sistemas cromato+r,ficos consisten en dos fasesA =a fase estacionaria y la fase m0il 67copes 1>>$8. =a fase estacionaria puede ser un slido, un +el, un l2uido o una me(cla de solido y l2uido, mientras 2ue la fase m0il puede ser l2uida o +aseosa y fluye a tra0/s de la fase estacionaria. Todas las purificaciones cromato+r,ficas de protenas se basan en un e2uilibrio lo+rado entre la fase estacionaria y la fase m0il. =a tabla ".$ muestra el medio de la fase estacionaria y la fase m0il para la mayora de las cromato+rafas. =a mayora de sistemas cromato+r,ficos re2uieren cierto e2uipo en com<n. Este esA reser0orio para amorti+uador, tubera, bomba perist,ltica, columna, detector BH, +raficador, y colector de fracciones 6A med "00)8.

Tabla 5.6 8edios de la fase estacionaria y fase m&il para la mayora de cromato!rafas.
Cromato!raf a
Iiltracin en +el Cromato: enfo2ue de intercambio inico Iase re0ersa

4ase estacionaria
=2uido embebido perlas de +el 7lido en

4ase m&il
=2uido =2uido

,bser&aciones

E2uilibrio de intercambio inico. E2uilibrio de

=2uido

=2uido

1-

Lidrofbica Afinidad co0alente

7lido =i+ando inmo0ili(ado

=2uido =2uido

particin E2uilibrio adsorcin

de

. .1 Cromato!rafa de filtracin -e"clusin por tama9o. en !el

En la filtracin en +el, las protenas son fraccionadas bas,ndose en su tama1o relati0o. El t/rmino 9filtracin; es al+o en+a1oso, por2ue a diferencia de cual2uier procedimiento de filtracin, todas las protenas pasan a tra0/s de la columna, y no ay nin+una fraccin 9retenida;. =a cromato+rafa de filtracin en +el tambi/n es reconocida como la cromato+rafa de permeacin en +el, cromato+rafa de e&clusin por tama1o, y cromato+rafa de tami(ado molecular. Adem,s de utili(arse para purificacin, la cromato+rafa de permeacin en +el tambi/n se utili(a para determinar el peso molecular de la protena y para eliminar impure(as de bajo peso molecular 6desalacin8. *rincipio. En la filtracin en +el, el l2uido dentro de las partculas de +el 6fase estacionaria8 est, en e2uilibrio con una fase m0il. =as mol/culas de soluto 6protenas8 se difunden por medio de un mo0imiento .roQniano tanto a sus diferentes acia dentro como fuera del las partculas del +el. =as mol/culas son separadas debido abilidades de entrar a los poros de las partculas de +el. =as mol/culas muy +randes no pueden entrar en los poros de las partculas de +el y as 0iajan muy r,pido a tra0/s de los espacios intersticiales de las partculas de +el 6A med "00)8.

. .

Cromato!rafa de intercambio inico

=a cromato+rafa de intercambio inico es ampliamente usada al principio

de un es2uema de purificacin y est, dise1ada para la separacin de compuestos inicos o ioni(ables en la fase m0il mediante el colector de iones 2ue se encuentra del lado opuesto de la fase estacionaria 6empa2ue de la columna8. En la cromato+rafa de intercambio inico, los +rupos funcionales ioni(ables se unen co0alentemente a la fase estacionaria 6matri(8.

1D

*rincipio. =as protenas son anfot/ricas@ esto es, contienen tanto car+as positi0as como ne+ati0as. =a ioni(acin de los residuos de lisina y ar+inina producen car+as positi0as, mientras 2ue la ioni(acin de residuos de ,cido aspartico y +lut,mico producen car+as ne+ati0as. =a ioni(acin de tales +rupos es dependiente del pL, y por lo tanto la car+a neta de una protena ser, funcin del pL del amorti+uador. A un pL id/ntico al pI de la protena, la car+a neta de una protena es cero. A un pL mayor 2ue el pI, la protena est, car+ada ne+ati0amente, y a un pL menor 2ue el pI, la protena est, car+ada positi0amente. 5urante la cromato+rafa, las protenas de car+a similar 6ya sea positi0a o ne+ati0a8 interact<an con car+as opuestas en la fase estacionaria, liberando otras protenas de car+a id/ntica a las car+as de la fase estacionaria. =as protenas unidas pueden entonces ser eludas o despla(adas de de la fase estacionaria por un nue0o in 6Bsualmente NaCl8 con una mayor afinidad por las car+as fijas de la fase estacionaria 2ue la protena. =a cromato+rafa de intercambio inico se nombre en base al si+no de las car+as despla(ables. As, en la cromato+rafa de intercambio aninico las car+as fijas 6fase estacionaria8 son positi0as, y las car+as despla(ables 6protenas8 en la fase m0il son ne+ati0as. 7imilarmente, en la cromato+rafa de intercambio catinico, las car+as fijas son ne+ati0as y las car+as despla(ables son positi0as 6A med "00)8.

. .) Cromatoenfo*ue
El cromatoenfo2ue 6isoelectroenfo2ue mediante cromato+rafa de intercambio inico8 es un procedimiento en el cual las biomol/culas se separan de acuerdo a sus puntos isoel/ctricos en una columna de intercambio inico 6* armacia Iine C emicals 1>D0, y 7oderber+ y col 1>D"8.En este procedimiento, las protenas se unen al lec o de intercambio inico en un buffer e2uilibrado de baja fuer(a inica y eludas con un polibuffer a un pL menor 2ue el del amorti+uador de inicio. El polibuffer, conteniendo especies amorti+uadoras catinicas y anfot/ricas, produce un +radiente de pL, el cual es utili(ado para eluir las protenas unidas de la resina de intercambio inico en el orden de sus puntos isoel/ctricos. *rotenas con pI con diferencia tan pe2ue1as como de 0.0) unidades de pL pueden ser resueltas mediante cromatoenfo2ue.

1>

El cromatoenfo2ue es <til para separar las isoformas con pIs muy pr&imos entre s despu/s de una cromato+rafa de afinidad. *rincipio. En cromatoenfo2ue, una me(cla de protenas se car+a en una columna de intercambio inico 2ue se e2uilibra con un pL alcalino o un pL li+eramente arriba del supuesto pN de la protena blanco. Como en la cromato+rafa de intercambio inico con0encional, las protenas con una car+a neta opuesta a a2uella de la columna permanecen unidas en el buffer e2uilibrante, pero las protenas de car+a similar son la0adas. =a resina de intercambio inico 2ue contiene las protenas li+adas es entonces titulada con un polibuffer de un pL m,s ,cido. En la pr,ctica, un +radiente de pL se +enera en la columna mediante un flujo continuo de un polibuffer ,cido. En este proceso, cuando el pL del +radiente se apro&ima al pI de la protena blanco, empie(a a desorberse de la columna. 5ado 2ue la 0elocidad del flujo del buffer eluyente es mayor 2ue la formacin del +radiente de pL, una protena con una pI particular se desorbe a tra0/s de la lon+itud de la columna y eluye como un pico sencillo 6A med "00)8.

. .5 Cromato!rafa de interaccin (idrofbica

En la cromato+rafa de interaccin idrofbica 6LIC8, las protenas son idrofbicas con separadas en base a las fuer(as 0ariables de sus interacciones una fase slida conteniendo +rupos idrofbicos sin car+a. *rincipio. En esta cromato+rafa, las protenas y p/ptidos interact<an con las superficies idrofbicas de la matri( por adsorcin en un amorti+uador acuoso. En el buffer de e2uilibracin, el salado de los iones se mantiene a una concentracin alta para disminuir la disponibilidad de mol/culas de a+ua, lo cual en cambio incrementa las interacciones idrofbicas. El sulfato de amonio 60.D :1 ?8 es a menudo utili(ado como el buffer de e2uilibracin para incrementar la interaccin interacciones idrofbica de las protenas. =os aniones 2ue fa0orecen las idrofbicas son *%'$: V 7%'": V CL$C%%: V Cl: V .r: V N%$: V

Cl%': V I: V 7CN: y para cationes son NL 'O V 3bO V NO V NaO V CsO V =iO V ?+"O V Ca"O V .a"O 6AraWaQa y Timas eff 1>D'8.

"0

=a

idrofobicidad es la repulsin entre un compuesto no polar y un medio idrofbicas. idrofbicos

polar, Ej.A a+ua 6Nennedy 1>>08. =as +licoprotenas de membrana se unen a la bicapa lipdica de las membranas biol+icas mediante interacciones =as interacciones 2ue poseen moti0os idrofbicos. En las protenas los amino,cidos idrofbicas pueden ser utili(adas para separar biomol/culas

son el triptfano, tirosina, leucina, 0alina, metionina y alanina, en orden decreciente de idrofobicidad. En la cromato+rafa de idrofobicidad las protenas son usualmente adsorbidas en soportes fenil: o octil:inmo0ili(ados en presencia de altas concentraciones de sal. =a LIC puede ser con0enientemente desarrollada despu/s de

fraccionamiento con sulfato de amonio, pero antes de la cromato+rafa de intercambio inico. 5ado 2ue la protena blanco se eluye en un buffer bajo en sales, el eluido puede entonces 2uedar listo para someterse una cromato+rafa de intercambio inico sin la necesidad de un paso de di,lisis 6A med "00)8.

. .6 Cromato!rafa de fase re&ersa

En la cromato+rafa de fase re0ersa 63*C8, la matri( es slica 2ue a sido sustituida con cadenas n:al2uilicas, usualmente C', CD y C1D. =a fase m0il es usualmente una me(cla de a+ua y un sol0ente or+,nico menos polar. El nombre 9fase re0ersa; se introdujo para distin+uirla de la cromato+rafa de 9fase normal;, en la cual la matri( es slica y la fase m0il es un sol0ente no polar como el e&ano. En el sistema de fase re0ersa, el a+ua presente en la fase m0il es m,s polar 2ue la fase estacionaria, la slica deri0ati(ada con CD o C1D. 3*C raramente se usa para las purificacin de mol/culas proteicas biol+icamente acti0as. 7in embar+o, esta cromato+rafa es ampliamente utili(ada para separar p/ptidos obtenidos a partir de protenas purificadas y 2ue an sido di+eridas mediante m/todos 2umicos o en(im,ticos, y para otras aplicaciones donde la perdida de la acti0idad biol+ica de la protena no es un preocupacin 6A med "00)8.

. .: Cromato!rafa de afinidad
El procedimiento m,s poderoso para la purificacin de protenas es la cromato+rafa de afinidad. .ajo condiciones ideales la protena blanco puede ser purificada en un solo paso. Adem,s, la protena purificada se obtiene en una forma biol+ica acti0a, como la purificacin se basa en sus interacciones "1

bioespecficas con un li+ando inmo0ili(ado. El procedimiento in0olucra la adsorcin de un e&tracto de protena cruda en un soporte slido con un li+ando conju+ado 6com<nmente llamado matri(8. =as protenas en el e&tracto 2ue ten+an un sitio de unin complementario al li+ando permanecen unidas a la matri(, mientras 2ue los componentes 2ue no se unan son separados mediante la0ado de la matri( con un amorti+uador. =a protena unida es eluida con un buffer de elucin. *rincipio. En la cromato+rafa de afinidad, las protenas se unen

especficamente a un li+ando inmo0ili(ado. Cuando el e&tracto crudo pasa a tra0/s de la columna. Al la0ar la columna, las protenas no li+adas se eliminan de la columna. Iinalmente, la protena li+ada es despla(ada mediante la incorporacin del li+ando libre 2ue compite por sitios de unin de la protena. Alternati0amente, el despla(amiento de la protena unida puede ser lo+rado mediante cambio del pL o incrementando la fuer(a inica del amorti+uador o, en el caso de las protenas de unin a metales, mediante adicin de un 2uelante de metales, tales como el E5TA o EJTA 6A med "00)8.

%. Con ideracione "inale

Bn paso de primordial cuidado para la purificacin e&itosa de una protena consiste en la obtencin y preser0acin de la fuente de protena, esta fuente debe permitir obtener la protena deseada en suficiente cantidad y calidad para estudios posteriores. 7in embar+o, para poder e0aluar las fuentes de protenas ser, imprescindible contar un con una metodolo+a adecuada para la determinacin cuantitati0a de la presencia de esta. =a metodolo+a de deteccin de la protena de inter/s debera cumplir con dos criterios principalesA ser e&perimentalmente con0eniente, es decir lo m,s sencilla de reali(ar@ pero sobretodo, ser especfica para la acti0idad de inter/s 6 ttp 18. 5ado 2ue no todas las purificaciones son i+uales, y el cientfico de separaciones se enfrenta con una +ran 0ariedad de t/cnicas disponibles para lo+rar su meta, la mayora de purificaciones pretenden lo+rar los mismos resultadosA =iberacin de la protena blanco desde el material de inicio ""

Eliminacin de slidos para dejar la protena en un sobrenadante Eliminacin de a+ua para concentrar la protena Eliminacin de contaminantes para lo+rar la pure(a deseada Estabili(acin de la protena blanco

Bn proceso de purificacin bien dise1ado no debe solamente tener pasos optimi(ados para lo+rar los objeti0os mencionados, sino 2ue tambi/n estos pasos deben estar enla(ados en una secuencia 2ue permita 2ue el producto de un paso alimente al si+uiente con ajuste mnimos. Esto es particularmente importante cuando un proceso 0a a ser escalado 63oe "0018. =eser y Ajenjo 61>>'8 se1alan 2ue el complejo problema de seleccionar una secuencia ptima para el proceso de purificacin de protenas a partir de me(clas complejas puede ser simplificado. =a utili(acin de una apro&imacin racional basada en la e&plotacin de las propiedades fisico2umicas fundamentales de las mol/culas proteicas lle0ar, a decisiones co erentes y optimi(adas. *ara ayudar a cumplir esta tarea el uso de t/cnicas computacionales contempor,neas apoyadas por la computacin simblica a probado ser una erramienta e&tremadamente <til. Estas t/cnicas son desarrolladas para la consecucin de soluciones optimi(adas para aplicaciones de produccin a +ran escala, pero tambi/n para encontrar es2uemas de separacin simples y ptimos en el laboratorio de in0esti+acin.

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