UNIVERSIDADE REGIONAL DE BLUMENAU

PROTOCOLOS DE AULAS PRTICAS DE MICROBIOLOGIA

Professora: Keila Zaniboni Siqueira Batista

Monitora: Rafaely Zeni

2013

SUMRIO

1. Boas prticas de laboratrio ............................................................................3 2. Desinfeco e esterilizao .............................................................................4 3. Meios de cultura ..............................................................................................9 4. Tcnicas de semeadura ...................................................................................11 5. Cultura de mos e objetos ..............................................................................13 6. Morfologia e colorao das bactrias ............................................................15 7. Catalase e coagulase ......................................................................................17 8. Provas bioqumicas de enterobactrias ..........................................................18 9. Colorao de Ziehl-Neelsen .........................................................................20 10. Tcnicas de anaerobiose ...............................................................................22 11. Antibiograma mtodo de Kirby-Bauer.......................................................23

1. BOAS PRTICAS DE LABORATRIO

LEMBRETES IMPORTANTES Durante a permanncia no laboratrio obrigatrio o uso do jaleco. No deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos prticos so realizados. No fume e no coma no laboratrio. Evite levar a boca qualquer objeto. No use frascos do laboratrio para beber gua. Comunique imediatamente ao monitor qualquer acidente (derramamento de cultura, ferimentos de qualquer espcie, aspiraes de cultura na boca, etc). 6. Coloque sempre o material contaminado nos recipientes adequados. 7. Antes de iniciar e depois de terminar suas atividades limpe com desinfetante e organize o seu local de trabalho. 8. Lave as mos com desinfetante antes de deixar o laboratrio. 9. Mantenha sempre os cabelos presos. 10. obrigatrio o uso de cala e sapatos fechados. 1. 2. 3. 4. 5.

CUIDADOS PARA EVITAR A CONTAMINAO DE CULTURAS 1. A ala e agulha de platina devem ser flambadas, isto , aquecidas na chama do bico de Bunsen, at se tornarem vermelhas, antes e depois de qualquer operao. A flambagem mais facilmente conseguida mantendo-se a agulha ou ala num ngulo de 45 em relao a mesa de trabalho. Antes da coleta do material, deve-se esfriar o instrumento na parede do tubo ou placa, no prprio meio estril, ou simplesmente aguardando o resfriamento natural por alguns segundos, sempre prximo chama do bico de Bunsen. 2. Com relao aos tubos de ensaio, exige-se flambar a boca dos mesmos aps a retirada e antes da colocao do tampo de algodo. O tampo de algodo deve ser segurado com o dedo mnimo da mo da coleta e nunca deixado sobre a mesa de trabalho, para no contamin-lo. 3. As pipetas de vidro ou plstico so previamente esterilizadas e embrulhadas em papel. Para sua utilizao e, ao mesmo tempo, evitar que se contaminem, deve-se torcer o papel na regio central, retirar primeiramente a parte superior do papel, depois a inferior, com cuidado para no encost-la em nenhum lugar. Depois de utilizada, deve ser colocada em recipiente adequado com soluo de desinfetante. 4. Todo recipiente (placa de Petri ou tubos de ensaio) com cultura ou meio estril dever ser manuseado com cuidado, de modo a no ficarem abertos e expostos ao ambiente. Com esta medida e mais a exigncia de abr-los somente prximo ao bico de Bunsen por tempo suficiente para a semeadura, colheita do material ou simples inspeo, ser evitada a sua contaminao por micro-organismos do ar. Uma vez semeados, devem ser incubados em estufa. As placas de Petri devem ser colocadas na estufa com as tampas voltadas para baixo.

2. DESINFECO E ESTERILIZAO
ESTERILIZAO: Processo que visa a destruio total de todas as formas de vida de um material ou ambiente, atravs de mtodos fsicos ou qumicos. DESINFECO: Consiste na destruio, remoo ou reduo dos micro-organismos presentes num material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfcie ou local. ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminao a um objeto, superfcie ou local. ANTI-SEPSSIA: Desinfeco de tecidos vivos, como pele e mucosas. LIMPEZA: Remoo de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de desinfeco ou esterilizao. ESTERILIZAO: A esterilizao o processo que inativa todos os micro-organismos presentes em determinado material ou ambiente, portanto o mtodo indicado para uso em itens que de forma alguma podem ser usados quando houver qualquer tipo de contaminao. Estes so classificados como crticos, ou seja, aqueles que durante o procedimento penetraro em pele e mucosa, ou sero introduzidos diretamente na corrente sangunea, sendo, portanto, de alto risco. A melhor maneira de garantirmos a destruio de micro-organismos presentes em instrumentos e equipamentos mediante o uso do calor. A maioria dos micro-organismos que causam infeces em seres humanos desenvolve-se em temperaturas prximas a do nosso corpo, ou seja, 37C. Assim, ao serem expostos a altas temperaturas, so destrudos; o que no acontece quando os colocamos em contato com baixas temperaturas, pois nesse caso o micro-organismo fica apenas inibido, e no destrudo. Alguns micro-organismos produzem esporos, que so formas de resistncia, podendo permanecer inativos por longos perodos e depois voltar ao estgio inicial de infectividade. Portanto as tcnicas de esterilizao devem destruir tanto a clula bacteriana, como os esporos. Existem diversos mtodos de esterilizao: Fsicos ou Qumicos. Mas definitivamente os mtodos de esterilizao mais empregados so os que utilizam o calor, seja este mido (autoclave) ou seco (estufa, ou forno de Pasteur), sendo que o desempenho do calor mido (autoclave) melhor. a) Esterilizao por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur) Este tipo de esterilizao realizado a temperaturas de 140C a 180C, com tempo de exposio de 60 a 120 minutos em estufas eltricas equipadas com termostatos. O calor seco ou ar quente em temperatura suficientemente alta levam a desnaturao e oxidao das protenas, que resultam na morte dos micro-organismos. A utilizao do calor seco leva mais tempo que o calor mido, mas como existem materiais que no podem ser esterilizados no calor mido, o calor seco o preferido. indicado para esterilizar vidrarias, instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presena do vapor da autoclave, e materiais impermeveis como ceras, pomadas e leos. Para ser eficiente, este processo depende de: - Aquecimento da estufa at a temperatura desejada antes da colocao do material. - Os materiais devem estar rigorosamente limpos e adequadamente embalados. - A colocao do material deve permitir a circulao do ar, portanto a estufa no pode estar abarrotada de material. Deve ser mantida uma distncia de 2 cm entre as caixas. 1.1.

- O tempo de esterilizao deve ser contado apenas aps a colocao do material na estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi atingida novamente. b) Esterilizao pelo Calor mido O calor mido pode ser utilizado para destruir micro-organismos presentes em materiais atravs das formas de: vapor dgua, gua fervente e gua aquecida abaixo de seu ponto de ebulio. - gua fervente: a gua levada a ponto de ebulio: 100C, este procedimento destri os micro-organismos vegetativos presentes no meio lquido. Entretanto, os materiais ou objetos contaminados no so esterilizados com segurana pois alguns esporos bacterianos podem resistir a 100C por mais de 1 hora. - Vapor dgua: O vapor dgua sob presso a mais prtica e segura aplicao do calor mido. O aparelho destinado a este fim a AUTOCLAVE. um processo mais eficiente para destruir os micro-organismos e os esporos, que o calor seco. A autoclavao feita a 121 C com tempo de exposio de 15 a 30 minutos. A penetrao do vapor no material garante maior nvel de destruio dos micro-organismos, e por este motivo mais rpido. Funcionamento da autoclave: 1- A cmara de parede dupla da autoclave lavada com vapor fluente para remover todo o ar; 2- ento preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e presso por um perodo especfico de tempo. essencial que todo o ar residual inicialmente presente na cmara seja completamente substitudo por vapor dgua, porque se o ar estiver presente reduzir a temperatura interna da autoclave; 3- A autoclave usualmente operada a uma presso de 15 lb./pol, na qual a temperatura do vapor de 121C. A eficincia do processo de esterilizao depende de alguns fatores: - Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente embalados. - O tempo deve ser contado a partir do momento em que a temperatura de 121C atingida. - A distribuio do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor atinja todo o material por igual. - Se o material sair mido da autoclave indica falhas no processo, neste caso deve ser novamente esterilizado. 1.2. DESINFECO Este processo pode ser realizado de forma fsica (pasteurizao) e qumica (desinfetantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfeco de alto, intermedirio ou de baixo nvel, dependendo da quantidade de micro-organismos inativados. a) Desinfeco de alto nvel: inativa todos os micro-organismos, exceto esporos. Ex: HBV, HIV e M. tuberculosis. Este tipo de desinfeco indicado para itens classificados como semicrticos, ou seja, que entram em contato com mucosas ntegras e pele no ntegra. b) Desinfeco de nvel intermedirio: aquela que inativa bactrias na forma vegetativa (M. tuberculosis), fungos e a maioria dos vrus. indicada para uso em itens classificados como no-crticos, ou seja, aqueles materiais que entram em contato apenas com a pele ntegra. (p. ex. estetoscpios, termmetros, gorro, mscara, refletor, etc.) c) Desinfeco de baixo nvel: inativa a maioria das bactrias na forma vegetativa, exceto M. tuberculosis, alguns fungos e vrus. indicada tambm para itens de uso no-crtico. 1.2.1. Desinfeco por agentes fsicos:

 Temperaturas abaixo de seu ponto de ebulio (100 C): Pasteurizao: o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para eliminar as clulas vegetativas de micro-organismos, mas no os esporos, portanto, um mtodo de desinfeco de alto nvel. indicado o uso de temperatura de 77C por 30 minutos. 1.2.2. Desinfeco por agentes qumicos: a) Mtodo de Desinfeco de alto nvel: Glutaraldedo: indicado qualquer objeto sensvel ao calor, e para rpida desinfeco de itens reutilizados. utilizado em soluo a 2% com pH alcalino (7,5-8,5) por 30 minutos. Formaldedo: Pode ser encontrado na forma slida (pastilhas formalina) ou como soluo aquosa 37-40% (diludo em lcool ou gua). A soluo deve ser usada por 30 minutos, sendo a concentrao de 8% em soluo alcolica e 10% em soluo aquosa. Perxido de Hidrognio: Age em presena de matria orgnica e deve-se fazer a imerso do material em soluo com concentrao de 3-6% por 15-30 minutos. cido Peractico: A concentrao de uso varivel para a desinfeco, sendo que o tempo de exposio deve ser no mnimo de 20 minutos. b) Mtodo de Desinfeco de nvel intermedirio: Compostos Clorados: Causa a inibio de reaes enzimticas intracelulares, desnaturao de protenas, e inativao de cidos nuclicos. Apresentam atividade antimicrobiana de amplo espectro, tem baixo custo e ao rpida, entretanto seu uso limitado, pois irritante, instvel por 24 horas, fotossensvel e voltil, alm de ser corrosivo para metais. Seu uso indicado para artigos de vidro e borracha, sendo contra-indicado para metais ( corrosivo). Apresenta-se na forma lquida (ex: Hipoclorito de sdio) e na forma slida (ex: Hipoclorito de Clcio), e o tempo de exposio dos artigos a estes compostos de aproximadamente 10 minutos. lcoois (Etlicos e Isoproplicos): Seu mecanismo de ao atravs da desnaturao de protenas. So usados em concentrao de 70% peso por 10 minutos, para a desinfeco de superfcies. O uso destas substncias contraindicado para materiais mdico-cirrgicos, borracha, plsticos e acrlico. Fenlicos: Seu mecanismo de ao atravs do rompimento da parede celular, precipitando protenas, quando usado em alta concentrao, e alterao dos sistemas enzimticos fundamentais, quando utilizado em baixa concentrao. Sua concentrao para uso de 0,4-5% sendo que o tempo de exposio deve ser menor ou igual a 10 minutos. Seu uso indicado para descontaminao de ambiente hospitalar, itens cirrgicos e mdicos no-crticos, sendo que devem ser consideradas as limitaes devido a toxicidade e ao residual em materiais porosos. Iodforos: Sua ao atravs de seu alto poder de penetrao na parede celular, levando a ruptura de protenas. So utilizados em concentrao de 30 a 50 ppm por um tempo menor ou igual a 10 minutos. c) Mtodo de Desinfeco de baixo nvel lcoois Compostos Clorados Fenlicos: em concentrao menor que 5% Iodforos: em concentrao menor que 30 ppm Compostos de Amnio Quaternrio: Age atravs da inativao de enzimas, desnaturao de protenas essenciais, ruptura da membrana celular. Sua concentrao para uso de 0,4 a 0,6% por um tempo de no mnimo 10 minutos. indicado para a limpeza de ambiente hospitalar (pisos, paredes e superfcies)

 Detergentes: So agentes tensoativos, com ao detergente, umectante e emulsionante. Podem ser classificados como Catinicos (p. ex. Quaternrios de Amnio), Aninicos (p. ex. sabes, detergentes sulfatados ou sulfonados), e Enzimticos. Este ltimo tem como princpio ativo enzimas proteinases, amilase e lpases, e, portanto, causam transformaes em protenas, polissacardeos e gorduras (ex: Endozime).

1.3.

Prtica:

1.3.1. Objetivos: Caracterizar e conhecer os diversos mtodos de esterilizao e desinfeco. 1.3.2. Procedimento: - preparao de materiais para serem autoclavados; - funcionamento da autoclave. - discusso quadro mtodos desinfeco e assepsia.

3. MEIOS DE CULTURA
Para crescer, todos os micro-organismos necessitam de uma variedade de elementos qumicos como nutrientes. Estes elementos so necessrios tanto para a sntese como para as funes normais dos componentes celulares. Eles existem na natureza em uma grande quantidade de compostos inorgnicos ou orgnicos. Quando os micro-organismos so retirados de seu meio e cultivados em laboratrio, necessrio o uso de meios que simulam as condies adequadas para o crescimento. Entre esses elementos temos o carbono, nitrognio, hidrognio, oxignio, enxofre e fsforo.

3.1. Classificao dos meios de cultivo: 3.1.1 Quanto consistncia: a) Meios lquidos: so aqueles em que os nutrientes esto dissolvidos em uma soluo aquosa. O crescimento bacteriano nesse meio muda seu aspecto, ou seja, o meio sofre uma turvao. b) Meios semisslidos: so aqueles que possuem na sua composio, alm dos nutrientes, uma pequena porcentagem de um polissacardeo proveniente de algas marinhas, chamado gar. So geralmente utilizados em tubos e a partir desse tipo de cultura possvel observar a motilidade bacteriana. c) Meios slidos: so aqueles que possuem uma porcentagem maior de gar (aproximadamente 15 g/litro de gua destilada), alm dos nutrientes. Podem ser dispostos em tubos ou em Placas de Petri, dependendo da finalidade. Atravs do meio slido em placas de Petri possvel, utilizando-se a tcnica do esgotamento, conseguir o isolamento de colnias bacterianas e, portanto, o meio ideal para que seja feito o estudo da morfologia colonial. J a cultura em gar inclinado fornece somente o crescimento bacteriano com a obteno de uma biomassa de microorganismos. 3.1.2. Quanto funo: a) Meios simples: possuem os componentes essenciais para o crescimento de microorganismos pouco exigentes. Ex: caldo simples. b) Meios de enriquecimento: so adicionadas ao meio simples substncias enriquecedoras como sangue, soro, ovo, extrato de leveduras, etc. Ex: gar sangue. c) Meios seletivos: aqueles que favorecem o desenvolvimento de determinados microorganismos em detrimento de outros, geralmente pela adio de substncias inibidoras. Ex: gar Salmonella-Shigella. d) Meios diferenciais: permitem o desenvolvimento de grupos de micro-organismos com caractersticas relativamente definidas, o que permite diferenciar um grupo ou uma espcie de microorganismo. Ex: gar MacConkey. e) Meios de manuteno: so aqueles destinados a manter a viabilidade de uma cultura bacteriana. Ex: gar Nutriente. 3.1.3. Quanto natureza: a) Meios animados: so constitudos de clulas vivas, como animais de laboratrio, tecidos vivos ou ovo embrionado. b) Meios inanimados: no possuem clulas vivas. Podem ser naturais ou sintticos. Naturais so aqueles que possuem substncias provenientes da natureza, e o sinttico contm substncias obtidas em laboratrio. Ainda podemos obter meios de cultivo semissintticos, que so resultantes da unio dos dois anteriores.

Os meios de cultivo so preparados e armazenados seguindo um rigoroso controle de qualidade, pois devem ser mantidas todas as suas propriedades nutricionais e garantida a esterilidade at o momento de sua utilizao. 3.2. Prtica: Objetivo: Preparar diferentes meios de cultura a serem utilizados para o cultivo de microorganismos. Material: gar Erlenmeyer placas de Petri e tubos de cultura - balana - algodo, gaze e papel para fechar Mtodo: - Pesar cada substncia, seguindo o protocolo indicado pelo fabricante, e adicionar separadamente gua destilada, tomando-se o cuidado de homogeneizar a cada componente adicionado. Os meios de cultura mais utilizados em laboratrios de microbiologia esto disponveis comercialmente, j na forma desidratada. - Deixar a cmara de fluxo laminar previamente ligada, com a luz UV acesa, para dispensar os meios preparados nos tubos e placas. Com o auxlio do bico de Bunsen, pipetar a quantidade estipulada (3ml para tubos pequenos, 6 ml para tubos grandes e 20 ml para placas de Petri) e dispensar em cada vidraria, tomando o cuidado para flambar cada uma delas adequadamente antes de fechar a tampa.

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4. Tcnic ! "# !#$# "%&

A escolha da tcnica para o cultivo de micro-organismos varia de acordo com o tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo. Regras que devem ser seguidas: - A agulha e a ala de nquel-cromo devem ser esterilizadas por flambagem antes e depois de qualquer cultivo. Tome cuidado e esfrie-as antes da coleta. - Os recipientes devem sempre ser abertos prximos chama do bico de Bunsen. - Evite perfurar ou rasgar o gar (meio de cultura), pois poder ocorrer acmulo de bactrias neste setor, alm de alterar as condies de crescimento bacteriano. 4.1. Tcnicas: 4.1.1. Meio lquido - Mergulhe a ala de Nquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana. - Mergulhe a ala carregada de bactrias no tubo com o meio de cultivo.

4.1.2. Meio slido (gar inclinado - tubo) - Mergulhe a agulha de Nquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana. - Faa uma aplicao com a ala carregada com bactrias no meio com movimentos circulares ou ziguezague por toda a extenso do meio de cultura, da base para a boca do tubo.

4.1.3. Meio slido (Placa de Petri tcnica de semeadura por esgotamento) - Mergulhe a ala de nquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana. - Realize movimentos de estria em um quadrante da placa, flambe a ala. - Gire a placa 90 e repita esses movimentos atingindo apenas um dos quadrantes. Flambe novamente a ala. - Gire novamente a placa, e repita o procedimento anterior.

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- No 3 quadrante da placa faa um zigue-zague largo em direo ao centro da placa.

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Os micro-organismos se encontram praticamente em todos os ambientes. No ar, gua e principalmente no solo. Destes locais podem ser arrastados por partculas de poeira e aerossis. Do ar, passam para nossa superfcie contaminando ainda a gua e alimentos. Uma vez que as condies que favorecem a sobrevivncia e o crescimento de muitos micro-organismos (nutriente, umidade e temperatura adequada) so as mesmas sob as quais vivem as populaes humanas, inevitvel que vivamos entre grande quantidade de micro-organismos.

5.1.

Prtica: 5.1.1. Objetivo: Avaliar a presena de micro-organismos nos mais diversos ambientes e verificar seu crescimento em diferentes meios. 5.1.2. Meios de cultura utilizados: a. gar Mueller-Hinton: meio universal b. gar MacConkey: meio seletivo e diferencial 5.1.3. Material utilizado: - Placa de Petri - Swab (zaragatoa) estril - Soluo salina estril - lcool 70% - lcool iodado 5.1.4. Tcnica 1 (primeiro quadrante): - Pegar uma placa de Petri contendo gar, e dividi-la em 4 partes iguais. Utilizar para isso a caneta de retroprojetor, fazendo a diviso na parte de baixo da placa;

- Coletar com auxlio do swab, amostras do ambiente (solo e bancada) e de roupas (sapatos, cala). - Aplicar o material coletado por toda a superfcie do primeiro quadrante, observando o cuidado de se manter na proximidade do bico de Bunsen. - Identificar a origem do material nas placas. - Levar a estufa 37C por 18 horas.

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5.1.5. Tcnica 2 (2 a 4 quadrante): o experimento tem por objetivo verificar a ao de antisspticos sobre a microbiota das mos, para tanto devem ser seguidas as seguintes etapas: - Identificar cada quadrante com os respectivos ttulos: Mo Suja (MS), lcool 70% (A70) e lcool Iodado (AI). A placa deve ser preparada seguindo o esquema abaixo: - No quadrante identificado como Mo Suja o aluno deve encostar o dedo (lavado apenas com gua e sabo) no gar por alguns segundos, tomando o cuidado de no rasgar o meio. - O mesmo aluno deve ento lavar as mos com lcool 70%, sec-las e encostar o mesmo dedo no quadrante do gar identificado como lcool por alguns segundos, tomando o cuidado de no rasgar o meio. - O mesmo aluno deve ento lavar as mos com lcool iodado, sec-las e encostar o mesmo dedo no quadrante do gar identificado como lcool iodado por alguns segundos, tomando o cuidado de no rasgar o meio. - A placa deve ser levada para incubao por 18 horas a 37C.

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..
6.1.

MORFOLO/IA E COLORAO DAS BACT0RIAS

Morfologia

a) As bactrias, de um modo geral, apresentam-se sob a forma de: a. Cocos: clulas esfricas; b. Bacilos: clulas cilndricas, em forma de bastonetes; c. Espirilos: clulas espiraladas; Estas formas bsicas esto sujeitas a variaes, caso em que so denominadas de formas pleomrficas ou formas de involuo. b) Agrupamentos Segundo o plano de diviso celular e a disposio das clulas entre si, as bactrias podem apresentar-se em: a. Diplococos b. Estafilococos c. Estreptococos d. Estreptobacilos 6.2. Colorao de Gram Este mtodo de colorao permite a classificao das bactrias em dois grandes grupos: a. Gram positivas: bactrias que se coram com o cristal violeta e no se deixam descorar quando submetidas a ao de solventes (lcool, ter, etc.) cor azul ou roxa b. Gram negativas: bactrias que se deixam descorar pelo solvente orgnico tomando a cor do corante de contraste (safranina ou fucsina) cor vermelha ou rsea 6.3. Tcnica: - coletar o material biolgico com uma ala de nquel-cromo ou platina, tomando o cuidado para no deixar cair e no encost-la nas bordas do tubo; - com auxlio da ala de platina fazer esfregaos bem finos sobre a lmina de microscopia. Esperar secar; - fixar os esfregaos, passando rapidamente a lmina 3x sobre a chama do bico de Bunsen; - deixar a lmina esfriar e cobrir os esfregaos com a soluo de violeta genciana. Esperar 1 min; - escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaos com lugol. Esperar 1 min; - escorrer o lugol e descorar os esfregaos com lcool. Para isso, deixe o lcool cair, gota a gota sobre a lmina mantendo-a inclinada. Considerar os esfregaos descorados quando o lcool no mais retirar o corante dos mesmos; - lavar a lamina em gua corrente; - cobrir os esfregaos com a soluo de fucsina, esperar de 30 seg. a 1 min; - lavar a lmina em gua corrente. Secar com auxlio de papel absorvente, pelos lados da lmina e observar ao microscpio.

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1. C ) ( !# # c+ 2%( !#
Identificar um dado organismo como espcie baseia-se no preenchimento das caractersticas atribudas quela espcie. O reconhecimento da fonte ou origem do espcime (ambiente, espcie animal, tipo de patologia e localizao) do organismo s vezes fundamental para identificao. A execuo inadequada de um teste preliminar pode confundir e prejudicar todo processo de identificao. Na rotina laboratorial so utilizados certos testes chaves para reduzir o trabalho, o custo e abreviar o tempo requerido para diagnstico. A investigao das atividades metablicas das bactrias in vitro chamada de Provas Bioqumicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou espcies de bactrias ou leveduras atravs da verificao das transformaes qumicas, que ocorrem num determinado substrato, pela ao das enzimas de um dado micro-organismo. Como muitas vezes um determinado micro-organismo possui um sistema enzimtico especfico, promovendo transformao bioqumica especfica, as provas bioqumicas podem ser utilizadas na prtica para a sua caracterizao. Duas das principais e mais utilizadas provas bioqumicas so: catalase e coagulase. 7.1. Produo de catalase - Esta enzima atua sobre a gua oxigenada (perxido de hidrognio 3 a 5%) desdobrando-a em oxignio e gua. A prova considerada positiva quando h borbulhamento ou efervescncia devido liberao do oxignio. A catalase produzida por muitos micro-organismos e usualmente empregada para diferenciar Staphylococcus, que so catalase positivos de Streptococcus, catalase negativos, ou os bacilos Gram positivos catalase negativos Lactobacillus e Erysipelothrix de Listeria e a maioria dos Corynebacterium catalase positivos.

7.2. Prova da coagulase tem a finalidade de verificar se o micro-organismo possui a coagulase (ou fator aglutinante) livre e ligada, que, reagindo com um fator plasmtico, forma um complexo que atua no fibrinognio do plasma formando a fibrina. A leitura acontece com a visualizao da formao de cogulo observada pela inclinao suave. Se h formao de cogulo inteira ou parcial, identifica Staphylococcus aureus; por outro lado, se no h formao de cogulo, identifica Staphylococcus coagulase negativa.

7.3. Procedimentos: 7.3.1. Prova da catalase: colocar algumas gotas de gua oxigenada sobre uma cultura crescida em BHI gar, em uma lmina, e verificar a ocorrncia de bolhas. Se sim, catalase positiva. 7.3.2. Prova da coagulase: retirar uma colnia da bactria em estudo e colocar em tubo com caldo BHI. Incubar a 37C por 18 a 24 horas. Retirar 0,1 mL dessa cultura e colocar em outro tubo contendo 0,5 mL de plasma-coagulase. Agitar levemente e incubar a 37C em banho-maria e observar num perodo de 4 a 24 horas. Se coagular o plasma, coagulase positiva.

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3. P&+4 ! ,i+5%6$ic ! "# #n)#&+, c)&i !

Sabemos que vrios agentes so capazes de causar doenas no aparelho digestivo, normalmente atravs de infeces exgenas. Dentre estes agentes, com exceo das espcies Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophila, Vibrio cholerae, vbrios no-colricos Pseudomonas aeruginosa entre os Gramnegativos e Clostridium perfringens, Clostridium difficile entre os Gram-positivos, os mais frequentes enteropatgenos encontrados no Brasil, pertencem famlia Enterobacteriaceae. Tal famlia se caracteriza por bastonetes Gram-negativos, anaerbios facultativos, mveis ou imveis, sendo, quando mveis, portadores de flagelos peritrquios, oxidase positivos, fermentativos (prova de OF), e redutores de nitratos a nitritos. O objetivo desta aula a identificao de um destes agentes conhecidos (Shigella, Salmonella, Yersinia e Escherichia coli, alm de outras enterobactrias), atravs de provas bioqumicas, que devero ser classificadas utilizando tabelas de identificao. Outras provas complementares (sorolgicas, testes biolgicos) so utilizadas na prtica, para complementao destas provas, principalmente no que diz respeito identificao de uma das cinco categorias de E. coli enteropatognicas para o homem: EPEC, EIEC, ETEC, EHEC e EAEC. 8.3. a) b) c) 8.4. Material Uma cultura pura em placa ou tubo contendo meio slido MacConkey; Tubos contendo as Provas bioqumicas; Alas e agulhas. Procedimento

a) Leitura da placa de MacConkey. Anotar morfologia. - gar MacConkey: colnias Lactose positiva: colorao vermelha. colnias Lactose negativa: colorao transparente. b) Com a agulha, tocar a colnia bacteriana isolada e inocular as provas bioqumicas. Incubar a 37oC por 24 horas. c) gar CITRATO DE SIMMONS: prova positiva: colorao azul prova negativa: colorao do meio inalterada Observe que quando no ocorre utilizao do citrato, na prova negativa, no temos crescimento bacteriano. d) Meio SIM: Usado para determinao da produo de sulfeto, indol e motilidade. O indol resultante da degradao do aminocido triptofano pela enzima triptofanase. A prova realizada inoculando-se o meio contendo excesso de triptofano. A prova positiva quando na poro superior, i.e. na interface da cultura e o reagente, desenvolve-se um anel de cor rsea dentro de no mximo 5 minutos. Este resultado devido complexao do indol com o aldedo, em meio cido, formando o composto colorido. A prova negativa com qualquer outra tonalidade de cor (original do meio ou marrom) Leitura: Produo de sulfeto: enegrecimento do meio ao longo da linha de picada. Motilidade: turbidez difusa do meio ao longo da linha da picada Produo de indol por meio dos reativos de Ehrlich ou de Kovacs: formao de um anel de colorao vermelha quando positivo.

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TABELA PARA IDENTIFICAO BIOQUMICA DAS ENTEROBACTRIAS EPM Bactrias

Lactose Glicose com produo de gs
H2S

MILI L-TD
Motili- Indol dade

CITRATO
Lisina Citrato Descarbo -xilase

Urease

Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Arizona Shigella sp Edwardsiella tarda Salmonella sp Serratia marcescens Proteus mirabilis Providencia rettgeri Yersinia enterocolitica
L-TD: L-triptofano desaminase

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As micobactrias so bacilos alcool-cido-resistentes (BAAR), ou seja, so bactrias na forma de bacilos que, aps terem sido coradas pela fucsina, no se deixam descorar por uma mistura de lcool e cido clordrico. Esta propriedade parece decorrer da firme fixao da fucsina a certos lipdeos presentes na parede das micobactrias. Esta colorao foi desenvolvida por Ziehl-Neelsen. Constitui um mtodo especfico para a colorao das micobactrias (bacilo de Hansen e bacilo da tuberculose). Tais bactrias se caracterizam por resistirem descolorao por uma mistura de lcool-cido clordrico, depois de tratadas com fucsina fenicada e azul de metileno, permanecendo com a cor do primeiro corante. Os BAAR so agentes etiolgicos de enfermidades que ocorrem em homens e animais. Neste ltimo caso tambm podem ser consideradas zoonoses. As espcies de maior importncia so: Mycobacterium tuberculosis (agente causal da tuberculose humana); Mycobacterium bovis, (tuberculose bovina, que pode ser transmitida ao homem pelo leite in natura) e Mycobacterium leprae (agente causal da Hansenase ou Lepra). Dentro deste gnero, existem outras espcies que so consideradas oportunistas, ou atpicas, ou ainda MOTT (Mycobacterium Other than Turbecle Bacilli). Geralmente, s causam doenas quando existe uma imunodepresso ou outras molstias intercorrentes afetando os pulmes, tais como: silicose, asbetose, ou qualquer outra patologia pulmonar. Atualmente, por causa da AIDS tem ocorrido um aumento significante de casos de tuberculose em pacientes HIV+, causados pelo M. tuberculosis e as Micobactrias oportunistas, em especial as do complexo MAIS (ou M. avium, M. scrofulaceum e M. intracellulare). O diagnstico, em qualquer dos casos de origem pulmonar, se faz pelo exame do escarro, corando-se pela tcnica de Ziehl-Neelsen, seguido de cultivo em meios especficos como Lwenstein-Jensen, ou Middlebrook 7H10 e identificao por mtodos bioqumicos especiais. Recentemente, tambm esta sendo empregado o PCR. 9.3. Colorao de Ziehl Neelsen: a) Cobrir os esfregaos com fucsina de Ziehl. Aquecer at a emisso de vapores (no deixar o corante secar). Esperar 5 minutos; b) Lavar com gua corrente; c) Descorar com lcool (97%), cido clordrico (1%); d) Lavar em gua corrente; e) Corar com azul de metileno por 1 minuto; f) Lavar e secar; g) Observar ao microscpio as lminas coradas; h) Como se apresentam os BAAR.

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9.4. Prtica: a) Observar lminas j fixadas, desenhar e anotar as caractersticas das bactrias

Morfologia ___________________ Colorao ___________________ Agrupamento___________________

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Incubao em anaerobiose Composio habitual 5% H2, 5% CO2, 90% N2 Sistemas produo de anaerobiose:

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Tcnica destinada determinao da sensibilidade bacteriana in vitro frente a agentes antimicrobianos, tambm conhecido por Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA). A realizao do antibiograma e sua interpretao no uma tarefa fcil, por suas limitaes e principalmente pela crescente descoberta de novos mecanismos de resistncia, o que exige cada vez mais atualizao e treinamento dos profissionais. A metodologia de Kirby e Bauer para antibiograma a mais difundida e utilizada at hoje na rotina de anlises clnicas, devido a sua praticidade de execuo, baixo custo e confiabilidade de seus resultados. Apesar de sua relativa simplicidade de execuo, a tcnica de Kirby e Bauer exige que as instrues sejam seguidas rigorosamente de forma que os resultados obtidos correspondam realidade e possam ser comparados com as tabelas internacionais. Fatores determinantes para realizao do TSA: - Material clnico cuidado no isolamento de microbiota normal de determinado stio anatmico, pois no indicada a realizao do TSA neste tipo de amostra; - Realizao da tcnica verificar se todos os passos esto sendo seguidos rigorosamente conforme prescrito; - Escolha dos antimicrobianos a escolha dos antimicrobianos deve ser adequado a realidade da instituio ou hospital; - Resistncia intrnseca cuidado ao reportar resultados errneos; - Pesquisa e confirmao de mecanismos de resistncia. - Atualizao das recomendaes dos grupos de antimicrobianos para cada grupo de microorganismo e de seus halos de interpretao conforme indicado nas atualizaes anuais das organizaes internacionais (CLSI ou EUCAST). No Brasil a ANVISA padroniza a utilizao do CLSI para os laboratrios. 11.3. Tcnica: Material: cepa bacteriana teste, placas de gar Muller-Hinton, tubo com caldo MuellerHinton, swab, ala bacteriolgica, salina estril, discos de antimicrobianos, pina e rgua. Procedimento: com a ala estril, retirar 3 colnias de pontos diferentes da placa e suspender no caldo Mueller-Hinton, fazendo uma suspenso fraca. Molhar o swab na suspenso, escorrendo o excesso na parede do tubo, e semear nas placas. A semeadura realizada com estrias bem juntas na placa toda. Esperar secar por 5 minutos. Com o auxlio da pina, colocar os discos nas placas semeadas. Incubar de 18-24 horas a 35-37 C. Resultados: examinar as zonas onde no h crescimento e medir os halos com a rgua, comparando as medidas na tabela (S, R ou I).

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