XXVIII Congreso Interamericano de Ingeniera Sanitaria y Ambiental Cancn, Mxico, 27 al 31 de octubre, 2002

BIORREMEDIACIN DE AGUAS CONTAMINADAS CON DERIVADOS DE HIDROCARBUROS UTILIZANDO CEPAS BACTERIANAS AUTCTONAS
Ismenia Araujo Vlchez (*) Centro de Investigacin del Agua (CIA). Coord. del Laboratorio de Microbiologa Industrial del CIA de la Universidad del Zulia (LUZ). Secretaria Ejecutiva de la Fundacin para el desarrollo de la Ciencia y la Tecnologa. Asesora de los Proyectos sobre Microbiologa de Petrleo en Convenio INTEVEP-LUZ, INPELUZ, y del Proyecto Lagunas de Estabilizacin, Convenio Fundacin Polar-LUZ. Coordinadora de la Maestra en Microbiologa. Gustavo Romero Estudiante Carmen Crdenas Centro de Investigacin del Agua Nancy Angulo Centro de Investigacin del Agua Gustavo Morillo Centro de Investigacin del Agua Judith Navarro Centro de Investigacin del Agua Mara Mndez Centro de Investigacin del Agua (*): Av. 21, Calle 67, Edificio Manatara, Apartamento 3B, Sector Indio Mara Maracaibo - Estado Zulia Cdigo Postal : 4005 -Venezuela. Telf.: 02617519022-02617597189 - FAX: 02617597181 - e-mail: ismenia_araujo@hotmail.com. RESUMEN Se tomaron muestras de agua de la ribera del Lago de Maracaibo, sector Capitn Chico, Edo. Zulia y se lograron aislar 16 cepas bacterianas, las cuales fueron probadas en su capacidad para degradar hidrocarburos, mediante un ensayo de factibilidad utilizando gasoil como nica fuente de carbono. Se seleccionaron 07 de las cepas que lograron degradar entre 50 a 70% de los hidrocarburos presentes en el gasoil y se realizaron pruebas de identificacin con el propsito de conocer algunas de sus caractersticas bioqumicas. Posteriormente, se prepar un cultivo mixto con las cepas previamente seleccionadas y se evalu su capacidad para degradar hidrocarburos a travs de un estudio de biotratabilidad en tanques plsticos de 25 L conteniendo: 2 L del cultivo mixto (10 % inculo), un aceite lubricante en una concentracin de 7000 mg/L y agua potable hasta un obtener un volumen de 20 L. En 04 de los tanques se instalaron sistemas de aireacin inducidos desde el fondo y adicionalmente, se evalu la incidencia del nitrgeno y fsforo (fertilizacin). Se determinaron mensualmente los contajes bacterianos, los hidrocarburos totales y el contenido de nitrgeno y fsforo total y las concentraciones de las fracciones de los hidrocarburos (SARA) se determinaron al inicio y al final del ensayo. Los resultados indicaron que en los tanques inoculados, fertilizados y aireados se lograron las mayores remociones, hasta un 89 % de los hidrocarburos totales y la transformacin de todas las fracciones presentes en el aceite, demostrando la eficiencia del cultivo bacteriano en la biorremediacin de agua contaminada con hidrocarburos. Palabras Claves: cepas bacterianas, hidrocarburos, biorremediacin.

INTRODUCCIN A comienzos de los aos 90, en Venezuela, importantes investigaciones han sido dirigidas al estudio de los microorganismos y sus actividades, con el propsito de ampliar su versatilidad metablica para la degradacin de contaminantes especficos principalmente los provenientes de las actividades petroleras. En tal sentido, se han desarrollado tecnologas fundamentadas en los procesos biolgicos como alternativas viables en la eliminacin parcial o total de diferentes compuestos orgnicos. Estos procesos utilizan principalmente bacterias que se encuentran en el mismo ambiente que se pretenda remediar, adems se adicionan los macro y micro nutrientes necesarios para el mantenimiento de las cepas bacterianas. La etapa de seleccin de las cepas bacterianas es muy importante, ya que cuanto ms especfica sea su capacidad degradativa ante los distintos tipos de desechos, mayor ser la capacidad de digerirlo y menor ser el tiempo de permanencia en el ambiente. La biorremediacin o saneamiento biolgico es una tecnologa basada en procesos naturales que utiliza la capacidad de algunos microorganismos, tales como bacterias y hongos, para transformar compuestos qumicos con la finalidad de disminuir o eliminar su condicin de peligrosidad (Cook & Westlake, 1972 ). La transformacin es tal, que hay un completo rompimiento de las molculas orgnicas en sustancias inorgnicas como dixido de carbono y agua, proceso que se denomina mineralizacin (Scherer, 1996). Si ocurre slo una degradacin parcial de compuestos secundarios, los cuales pueden ser o no menos txicos, se dice entonces, que ocurri una biotransformacin (Eweis et al, 1999 y Levin & Gealt, 1997). La descarga de petrleo y sus productos derivados a las corrientes naturales de aguas superficiales y subterrneas ha planteado un problema que, en la mayora de los casos, han adquirido bastante gravedad. En el caso de aguas superficiales la adicin de nutrientes se realiza sin menor complicacin en el rea a tratar con el objeto de aumentar la poblacin nativa para acelerar el proceso de biodegradacin, y la adicin de oxgeno muchas veces no es necesaria a menos que sea agua estancada sin movimiento pues el oleaje y el viento se encargan de proporcionar las condiciones ptimas para que el oxgeno atmosfrico penetre en el reservorio (Metcalf & Hed, 1996). El objetivo fundamental de esta investigacin fue determinar la eficiencia de cepas bacterianas provenientes de aguas contaminadas con hidrocarburos en la degradacin de los mismos. METODOLOGA El estudio del proceso de biorremediacin en esta investigacin se realiz en dos fases. La primera fase permiti aislar y seleccionar las cepas autctonas de agua contaminada con hidrocarburos ms eficientes en la utilizacin del gasoil como nica fuente de carbono. En la segunda fase se prepar un cultivo mixto con las cepas previamente seleccionadas y se prob su eficiencia en la degradacin de aceites lubricantes a escala piloto, con la adicin de nutrientes y aireacin. ESTUDIO DE FACTIBILIDAD El agua contaminada con hidrocarburo utilizada en este estudio fue obtenida de la ribera del Lago de Maracaibo, Sector capitn Chico, Maracaibo, Edo. Zulia, Venezuela. Los envases fueron trasladados al Laboratorio, donde se realiz el aislamiento de las cepas bacterianas presentes en las muestras de agua, utilizndose la tcnica de siembra en placa por estra (Kerr, 1970; Seeley & Vandemark, 1973 y Pareja, 1993). Una vez aisladas las colonias, se registraron sus caractersticas morfolgicas y cada una de las cepas fue guardada por duplicado en refrigeracin en tubos con agar inclinado cerebro corazn (Finegold & Martin, 1983). Las cepas aisladas preservadas, se activaron por transferencia a un medio nutritivo fresco, infusin cerebro-corazn y se incubaron a 37 C hasta alcanzar un crecimiento superior a 1x108 UFC/ml. A partir de estos cultivos se prepararon los inculos para el ensayo (APHA, 2000; Kerr, 1970). Los ensayos de factibilidad en el laboratorio se prepararon para cada cepa, utilizando medio mnimo mineral, modificacin del propuesto por Jobson et al en 1975, 1ml de gas oil y 5 ml inculo. Todas las fiolas fueron incubadas a 37C y 120 rpm de agitacin en un Incubator Shaker, modelo 625, durante 60 das. Este ensayo permiti seleccionar las cepas ms eficientes en la degradacin del gasoil. Cada dos semanas durante dos meses, se tomaron muestras de cada fiola para la determinacin de contajes bacterianos siguiendo la tcnica de contaje en placa vertida, 9215-B (APHA, 2000). Al inicio y al final del ensayo, se realiz la determinacin de hidrocarburos totales en todas las fiolas segn el mtodo 5520-F (APHA, 2000). A las cepas seleccionadas

se les realiz una serie de pruebas bioqumicas a saber: Tincin de Gram, Anaerobiosis, Ureasa, Citrato, Catalasa, Oxidasa, Motilidad y Triple Azcar Hierro (Kerr, 1970; Seeley & Vandemark, 1973 y Pareja, 1993). ESTUDIO DE TRATABILIDAD Se realiz un estudio a escala piloto el cual consisti en diferentes tratamientos que permitieron evaluar la eficiencia del cultivo mixto conformado por las cepas previamente aisladas y seleccionadas por su eficiencia en la degradacin de gasoil bajo distintos parmetros. Dentro de los tratamientos, se evalu el proceso de biodegradacin con la adicin de nutrientes y la inyeccin de aire, con el propsito de comparar la eficiencia en la biodegradacin del sustrato hidrocarbonado. Se seleccionaron las siete cepas ms eficientes en la degradacin de gasoil para conformar el cultivo mixto. Cada cepa seleccionada fue activada y posteriormente, transferida a caldo cerebro-corazn, se incubaron a 37 C hasta obtener una concentracin superior a 1x108 UFC/ml. Para preparar el cultivo mixto se agregaron al tanque con la mezcla estudio (agua contaminada con aceite) fracciones equivalentes de cada cepa, hasta alcanzar una concentracin de cultivo de 10%. La seleccin del hidrocarburo que se utiliz en el ensayo se realiz consultando a las empresas martimas de la zona objeto de estudio, acerca del producto que se verta con mayor frecuencia y cantidad en la zona seleccionada. La mayora coincidi que se trataba del aceite de motor empleado como lubricante en las embarcaciones. As qued seleccionado el sustrato utilizado como nica fuente de carbono. La mezcla estudio se prepar agregando al agua la cantidad de aceite equivalente al 35% p/v por cada litro de agua en cada tanque. Para este estudio se utilizaron tanques cilndricos plsticos con una capacidad de 25 L cada uno. El dimetro fue de 0,3 m y la altura de 0,36 m. Con el fin de mejorar la eficiencia del proceso de biorremediacin se adicion un fertilizante compuesto, el fosfato diamnico. Se trabaj con tres concentraciones diferentes de nutrientes, lo que permiti evaluar y comparar su efecto sobre el crecimiento bacteriano y la degradacin del aceite. Las concentraciones utilizadas fueron: 0,5; 0,75 y 1 gr/L de difosfato diamnico. El aire se suministr mediante un sistema de inyeccin en espiral de aire forzado, formado por una tubera plstica acoplada a un compresor que tuvo como funcin bombear el aire a travs de toda la tubera. El sistema en espiral con espaciamiento calculado de los puntos de inyeccin de aire en el fondo, permiti crear zonas alternas de transferencia y mezclado, evitando as la formacin de volmenes muertos (sin movimiento). Todos los orificios fueron colocados en el fondo ya que la profundidad mejora el tiempo de contacto (Cookson, 1995; Baker, 1987; Capone & Bauer, 1988).

Compresor

Tubera Plstica Puntos de Inyeccin de aire (Orificios)

Figura 1. Corte transversal de un tanque con sistema de aireacin.

Se prepararon tanques con las condiciones objeto de estudio (cultivo, adicin de aire entre otras) y sus respectivos controles, Tabla 1. El estudio piloto de tratabilidad tuvo una duracin de cinco meses y cada mes se tom una muestra de cada tanque para la realizacin de los anlisis microbiolgicos y fisicoqumicos. Para los parmetros microbiolgicos se utiliz el contaje de Hetertrofos Mesfilos por la tcnica de placa vertida (9215-B). Los parmetros fisicoqumicos fueron realizados utilizando los mtodos: SARA (ASTM D2007-75 Gravimtrico), Hidrocarburos Totales, 5520-F-Gravimtrico; Nitrgeno Total, 4500-NH3; Fsforo Total, 4500-C cido Ascrbico (APHA, 2000 y Finegold & Martin, 1983).

Tabla 1. Unidades Experimentales.

CULTIVO NUTRIENTES MIXTO 0,5 0,75 1 (g/L)

TANQUE Control 1 Control 2 3 4 5 6 7 8 9 10

ACEITE x x x x x x x x x x

AIREACIN

x x x x x x x x x x x x x x x x x x x

RESULTADOS Y DISCUSIN El aislamiento microbiolgico permiti la obtencin de 18 tipos de colonias a partir de las muestras de agua contaminada con hidrocarburos. Las caractersticas macromorfolgicas de las cepas fueron registradas segn la descripcin propuesta por Thomas J. Kerr. (1.981) Los valores de crecimiento de las cepas bacterianas al inicio del ensayo estuvieron entre 0,069 y 850x106 UFC/ml y al final entre 0,01 y 4.500 UFC/ml. Los primeros 15 das de incubacin, las densidades poblacionales de la mayora de las cepas disminuyeron y estuvieron por debajo de las obtenidas al inicio del ensayo. El crecimiento bacteriano de las cepas bacterianas aisladas mostr diferentes patrones a lo largo del tiempo. Para que un microorganismo sea recomendable de utilizar en procesos de biorremediacin es necesario que sea capaz de degradar al sustrato con un eficiencia de 30-40% durante 4 a 6 semanas (Eweis et al, 1999 y Flathman et al, 1995). Cada una de las cepas bacterianas aisladas fue probada en su eficiencia para degradar hidrocarburos en un medio mnimo mineral, con gasoil como nica fuente de carbono (Pareja, 1993 y Young & Gerniglia, 1995). Los resultados obtenidos en la determinacin de los Hidrocarburos Totales, mostraron que al final del ensayo, los valores fueron inferiores a los valores obtenidos inicialmente, es decir, todas las cepas fueron capaces de degradar el gasoil. Las cepas MI 9 y MI 15 fueron las ms eficientes en la remocin del hidrocarburo, 71,2% y 65,78% respectivamente, a los 60 das de tratamiento. Al comparar los resultados de crecimiento bacteriano en el medio con gasoil como fuente de carbono, con los valores de hidrocarburos, se pudo seleccionar las cepas que fueron utilizadas para integrar cultivos mixtos en el ensayo a escala piloto: MI 5, MI 7, MI 8, MI 9, MI 10, MI 11 Y MI 15. La micromorfologa de las 07 cepas bacterianas seleccionadas se obtuvo por microscopa de frotis con Tincin de Gram y stas presentaron las caractersticas que se enuncian: MI 5, MI 9, MI 10 y MI 11, bacilos delgados, aislados y en pares; MI 7, MI 8 y MI 15, cocos, aislados, agrupados o en pares. Todas las cepas seleccionadas presentaron reaccin de Gram negativa. Las pruebas bioqumicas aplicadas a las cepas bacterianas seleccionadas se presentan en la Tabla 2. Tabla 2. Pruebas Bioqumicas de las Cepas Bacterianas
CEPA MI 5 MI 7 MI 8 MI 9 MI 10 MI 11 MI 15 UREASA CITRATO + + + + + + CATALASA + + + + + + + OXIDASA MOTILIDAD TSI ANAEROBIO M K/K + M A/A + N K/K + M K/K + N A/A + N A/A + M K/K + -: Reaccin Negativa +: Reaccin Positiva K/K: Alcalino/Alcalino, sin gas , ni H2S A/A: cido/cido, sin gas ni H2S N: No Mtil M: Mtil

Los microorganismos alcanzaron densidades poblacionales durante los cinco meses del ensayo con diferentes tendencias. Las densidades poblacionales iniciales presentaron ttulos de 1x106 UFC/ml, mientras que los controles fueron de 1x102 UFC/ml. Los primeros 30 das de estudio, los microorganismos aumentaron su densidad en todos los tratamientos al igual que los controles. A los 150 das de tratamiento, todos los ttulos de crecimiento fueron superiores a los ttulos iniciales. Wrenn (1993), utiliz un cultivo mixto conformado por cepas degradadoras de hidrocarburos y probaron su eficiencia en la degradacin de crudo liviano en medio acutico, logrando valores de crecimiento hasta de 108 UFC/ml. En los tratamientos control, no inoculados, la densidad poblacional del control aireado fue ligeramente superior que en el control no aireado y esa diferencia se mantuvo durante todo el estudio. El crecimiento de microorganismos aerobios y el desarrollo de sus actividades metablicas especficas dependen principalmente de la disponibilidad de oxgeno molecular (Levin y Gealt, 1997), lo que explica el comportamiento obtenido en estos tratamientos, el oxgeno estimul las reacciones metablicas de los organismos presentes (Martin, 1994). Las curvas de crecimiento para los tanques fertilizados con fosfato diamnico (1,0; 0,75 y 0,5 g/L). La bioestimulacin con fertilizantes se ha utilizado con xito en la recuperacin de sitios contaminados con petrleo (Eweis et al, 1999), cuando las concentraciones apropiadas de nitrgeno y fsforo no estn presentes, la adicin de estos estimula el crecimiento microbiano facilitando la degradacin de los sustratos carbonados (Martin, 1994 y Westlake, 1993). Wrenn (1993) utiliz el nitrgeno en forma de amonaco y de nitrato y descubrieron que el proceso de biodegradacin se aceleraba cuando el nitrgeno era suplido en forma de amonio, tal como ocurri en estos tratamientos. Aggarwal et al (1991) encontraron que concentraciones muy altas de nitrgeno y fsforo pueden inhibir la actividad metablica de los microorganismos, por ello, es importante determinar las concentraciones de estos compuestos que sean ms apropiadas para estimular la actividad microbiana. A partir de los 30 das, los tratamientos con aireacin y fertilizados con nitrgeno, fsforo presentaron los valores ms altos de densidad poblacional (>1x109 UFC/ml).
1 ,E + 1 0
1

1 ,E + 0 9
2

1 ,E + 0 8 1 ,E + 0 7

3 4 5 6

UFC/ml

1 ,E + 0 6 1 ,E + 0 5 1 ,E + 0 4 1 ,E + 0 3 1 ,E + 0 2 0 30 60 90 120 150

7 8 9 10

T IE M P O (D A S )

Figura 2 . Curvas de crecimiento para tratamientos inoculados y controles no inoculados. A final del estudio los valores de hidrocarburos totales remanentes (HCT) provenientes de los tanques inoculados resultaron muy por debajo a los obtenidos en los controles no inoculados, los cuales no presentaron cambios representativos durante todo el estudio. La concentracin de los hidrocarburos disminuy rpidamente durante los primeros 60 das de tratamiento en los tanques inoculados con el cultivo mixto y luego el proceso de degradacin disminuy progresivamente en los mismos tanques hasta el final del estudio como se observa en la Figura 3. Las curvas de pendientes ms pronunciadas correspondieron a los tanques inoculados aireados y fertilizados (8, 9 y 10) con valores de hidrocarburos remanentes finales de 330,5; 935,7 y 490,12 mg/L respectivamente, lo que indic que el tratamiento aplicado en estos tanques fue eficiente para la remocin del aceite. En la Figura 3, se puede distinguir que el proceso present dos fases durante la degradacin: la primera probablemente correspondi a la degradacin de la fraccin lbil, fraccin fcilmente degradable, y la segunda, a la degradacin de una fraccin ms resistente al ataque microbiano y que por consiguiente fue ms lenta. Mesa y Lugo (2000) realizaron un estudio de Biorremediacin de suelos y encontraron una disminucin rpida de los hidrocarburos presentes durante las primeras nueve semanas, y luego una disminucin lenta de las concentraciones en las nueve semanas siguientes. Jamison y Hudson (1975), demostraron que el suministro de nutrientes y oxgeno estimul el metabolismo de los organismos

incrementando la degradacin de tal manera que se logr la eliminacin de hasta 1000 barriles de gasolina mediante la actividad microbiana estimulada.
8000 7000 6000 HTC (mg/L) 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 30 60 90 120 150 TIEMPO (DAS)

TANQUES

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Figura 3. Concentracin de los HCT durante el estudio para cada tanque.

La remocin de aceite en cada tratamiento se muestra en la Figura 4. Los tanques 8, 9 y 10 que fueron inoculados, fertilizados y aireados mostraron los porcentajes ms altos de remocin de 85,09; 76,24 y 82,75 % respectivamente.
90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

T A N QU E

Figura 4. Porcentajes de remocin de los hidrocarburos totales.

Los altos porcentajes de remocin de aceite logrados en este estudio concuerdan con lo reportado por LaDausse et al (1987) quienes demostraron la importante mejora que se produca en la biodegradacin de crudo en recipientes fertilizados, en los cuales lograron remover el 60 % de los hidrocarburos presentes. Adicionalmente, estos investigadores suministraron oxgeno a algunos recipientes y obtuvieron un incremento en la remocin superior al 70 % en el medio fertilizado. La Tabla 3 presenta los resultados de las fracciones de hidrocarburos remanentes. En todos los tratamientos se observ la remocin de hidrocarburos saturados y resinas, en los tratamientos fertilizados y aireados se encontraron los valores ms altos. Con respecto a los aromticos y asfaltenos la mayor remocin se observ en los tratamientos fertilizados y aireados. Baker (1987), demostr que niveles bajos de oxgeno limitaban la degradacin de compuestos carbonados saturados, aromticos y resinas; la biotratabilidad de hidrocarburos debe contar con la adicin de oxgeno, nitrgeno y fsforo.

Tabla 3. Fracciones de los hidrocarburos Saturados, Aromticos I y II, Resinas y Asfaltenos al inicio y al final del estudio.

Tanques 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tiempo (Das) 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150

Saturados (mg/L) 6057 6030 6074 5447 6083 3254 6083 604 6134 1173 6083 1250 5997 995 6096 104 5997 589 6057 222

Aromticos I (mg/L) 93,7 96,4 93,7 84,3 94,1 132,4 94,1 88,5 94,9 18,1 94,1 22,5 92,8 21,9 94,3 28,8 92,8 41,4 93,7 32,4

Aromticos II (mg/L) 26,3 24,1 26,4 23,6 26,4 24,5 26,4 20,1 26,6 42,5 26,4 36,2 26 49 26,4 14,3 26 13,5 26,3 12,5

Resinas (mg/L) 905 816 907 814 909 675 909 675 916 785 909 660 896 572 910 180 896 288 905 220

Asfaltenos (mg/L) 17,1 15,2 17,1 15,3 17,1 14,2 17,1 4,4 17,2 12,4 17,1 10,8 16,9 12 17,2 2,9 16,9 3,2 17,1 3,4

Durante todo el estudio se observ una disminucin de la concentracin de nitrgeno y fsforo en cada tanque. Los primeros 60 das se lograron las mayores disminuciones en los tanques aireados, lo que concuerda con los resultados de Venosa (1990) quien report que las mayores disminuciones de nitrgeno y de fsforo en medios acuticos contaminados con hidrocarburos tenan lugar en las primeras semanas de estudio; disminuyendo de manera secuencial pero en menor grado hasta el final del ensayo. La concentracin de nitrgeno va disminuyendo en mayor proporcin que la del fsforo durante los tratamientos, debido a que los microorganismos, necesitan una proporcin 10:1 de estos componentes para la asimilacin y la sntesis del nuevo material celular (Metcalf & Hed, 1996).

CONCLUSIONES El cultivo mixto de las cepas bacterianas seleccionadas logr una remocin eficiente de los hidrocarburos presentes en el aceite en todos los tratamientos. El proceso fue optimizado al controlar las variables de aireacin y fertilizacin, logrndose de esta manera la duplicacin de la remocin, la cual alcanz hasta un 85% en cinco meses de tratamiento. La aireacin increment la remocin del aceite notablemente, lo que se tradujo en una disminucin de todas las fracciones de hidrocarburos aromticos, asfaltenos y principalmente los saturados y las resinas, tanto en los tratamientos fertilizados como en los no fertilizados. En todos los tratamientos la adicin de nitrgeno y fsforo contribuy a la reduccin de las fracciones de resinas, asfaltenos, saturados y aromticos I. La aplicacin de fertilizante con aireacin produjo valores ms altos de remocin de los hidrocarburos que sin aireacin, lo que se tradujo en una mayor disminucin de todas las fracciones de hidrocarburos.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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