UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA E

ENGENHARIA DE ALIMENTOS





ENZIMAS E SUAS APLICAES
CINTICA ENZIMTICA







DISCIPLINA : ENGENHARIA BIOQUMICA
PROF: AGENOR FURIGO J UNIOR
COLABORAO: ERNANDES B. PEREIRA



FLORIANPOLIS
J UNHO 2001

2
1.INTRODUO
Enzimas so catalisadores biolgicos, formados por longas cadeias de
molculas pequenas, chamadas de aminocidos. So portanto, um tipo de protena com
atividade cataltica, sendo encontradas na natureza em todos os seres vivos. Sua funo
viabilizar a atividade das clulas, quebrando molculas ou juntando-as para formar
novos compostos. A singularidade desses compostos decorre do elevado grau de
especificidade ao substrato em condies moderadas, sob as quais atuam. Algumas
enzimas so especficas para determinado tipo de ligao qumica, como, por exemplo,
a capacidade da -amilase de romper unicamente as ligaes -1,4 das molculas de
amido. Outras so especficas para um tipo particular de ismero ptico, como, por
exemplo, a oxidao da -D-glicose pela glicose oxidase. So os catalisadores
potentes.
Toda enzima uma PROTENA, mas nem toda protena uma ENZIMA.

1.1. Consideraes iniciais
Protenas
So as molculas mais abundantes nas clulas, cerca de 30-70%. Contm
resduos de aminocidos unidos por ligaes peptdicas.

Constituintes bsicos:
Carbono 50%
Oxignio 23%
Nitrognio 16%
Hidrognio 7%
Enxofre 3%
A massa molecular das protenas: 6000 a 1.10
6
Da.
A classificao das protenas dividem-se em duas classes principais:
Protenas fibrosas e protenas globulares.
As estruturas das protenas so descritas em nveis: primria, secundria, terciria e
quaternria.
As enzimas pertencem a classe das protenas globulares, tendo como estrutura a
terciria.

3

As protenas tem vrias funes biolgicas, tais como:
. Enzimas
. Protenas transportadoras
. Protenas de armazenamento
. Protenas contrteis
. Protenas estruturais
. Protenas de defesa
. Protenas de regulagem

Aminocidos
So compostos qumicos que apresentam em sua frmula qumica grupo
carboxlico (-COOH) e grupo amino (-NH
2
).

Representao esquemtica de aminocidos:
H

R C* COOH

NH2
Os aminocidos so diferenciados de acordo com o grupo R ligado ao carbono
assimtrico.
Na natureza so encontrados 20 aminocidos encontrados. Alguns exemplos:
Grupo R aliftico no polar
Glicina Gly-G
Alanina Ala A
Valina Val V

Grupo R aromtico:
Fenilalanina Phe F
Tirosina Tyr - Y
Triptofano Trp - W

4

Quimicamente, enzimas so protenas com estrutura especial contendo
um centro ativo denominado apoenzima e, s vezes, um grupo prosttico (cofator) que
pode ser orgnico (coenzima) ou um on metlico ativo.
A habilidade com que a enzima se liga ao substrato se denomina
atividade biolgica e depende:
a) estrutura da protena;
b) nmero de cadeias peptdicas;
c) arranjo dessas cadeias na molcula;
d) natureza do substrato;
e) natureza do grupo prosttico (se houver).
Cada organismo vivo produz uma grande variedade de enzimas, a
maioria delas em pequenas quantidades. Algumas so produzidas em grandes
quantidades por certos microrganismos, que as excretam para o meio externo. As
enzimas extracelulares so capazes de digerir materiais nutritivos insolveis, como
celulose, protenas e amido.
Algumas destas enzimas so usadas em alimentos, bebidas, laticnios, nas
industrias farmacuticas, txtil e de detergentes. Sua utilizao feita em processos
biotecnolgicos industriais, ajudando a reduzir a poluio, muitas vezes substituindo
processos qumicos nefastos ao meio ambiente.
So produzidas comercialmente em grande escala, por sntese microbiana,
atravs de fungos ou de bactrias. O processo de produo normalmente anaerbico e
o meio de cultura similar aos usados para a fermentao de sntese de antibiticos.
As enzimas so especialmente importantes porque agem em grupos funcionais
especficos, catalisando reaes de forma estereoespecfica, formando somente um ou
dois enantimeros possveis.
Algumas caractersticas importantes das enzimas podem ser citadas, tais como:
So produtos naturais biolgicos.
Apresentam um alto grau de especificidade.
Reaes baratas e seguras.
Possuem mecanismo de turnover, desempenhando a mesma funo
consecutivamente, sem serem consumidas no processo.

5
So altamente eficientes, acelerando a velocidade das reaes catalisadas.
So econmicas, reduzindo a energia de ativao necessria para a reao
catalisada.
So biodegradveis, sendo o lodo residual reciclado como biofertilizante.
No so txicas.
Altamente eficientes: aumentando a velocidade de reao de 10
8
a 10
11
vezes mais rpida.
Condies brandas.

Comparao das Enzimas com os Catalisadores Qumicos
Caracterstica Enzimas Catalisadores Qumicos
Especificidade ao substrato alta baixa
Natureza da estrutura complexa simples
Sensibilidade T e pH alta baixa
Condies de reao (T, P e
pH)
suaves drstica (geralmente)
Custo de obteno (isolamento
e purificao)
alto moderado
Natureza do processo batelada contnuo
Consumo de energia baixo alto
Formao de subprodutos baixa alta
Separao catalisador/
produtos
difcil/cara simples
Atividade Cataltica
(temperatura ambiente
alta baixa
Presena de cofatores sim no
Estabilidade do preparado baixa alta
Energia de Ativao baixa alta
Velocidade de reao alta baixa




6
Classificao e Nomenclatura das Enzimas

Esto disponveis comercialmente mais de 300 enzimas, de acordo com a
Comisso de Enzimas (EC) da Unio Internacional de Bioqumica (IUB)
responsvel pela nomenclatura e classificao
So divididas em seis classes: baseiam-se na reao que catalisam. O
primeiro nmero designa a qual das 6 classes a enzima pertence. O segundo
nmero indica o tipo de ligao que a enzima atua. O terceiro nmero uma
subclassificao do tipo de ligao e o quarto nmero apenas um nmero de
srie.

Principais Classes de Enzimas
Primeiro EC
nmero
Classe da enzima Tipo de reao catalisada
1. Oxirredutases Catalisam reaes de oxirreduo.
Transferncia de H, O ou eltrons.
2. Transferases Catalisam transferncias de grupos
entre molculas
3. Hidrolases Catalisam reaes de hidrlise
4.

5.

6.
Liases

Isomerases

Ligases
Catalisam a adio de grupos a
ligaes duplas e vice-versa
Catalisam reaes de isomerizao
Catalisam a unio de duas molculas,
associadas ruptura da ligao
tirofosfato do ATP








7
Mercado Global de Enzimas
Setor Enzimas Milhes de Dlares (US$)
Produo de amido -amilase, glucoamilase,
glucose isomerase
500
Detergentes Protease, lipase, amilase 450
Txteis Amilases 150
Tratamento de couro Enzimas diversas 25
Papel e celulose Celulases 25
Laticnios Lactase 150
Papana - 25
Pectinesterases - 30
Total 1.355 bilhes
Dados de 1998

2-GENERALIDADES

2.1- ENERGIA DE ATIVAO
Termodinamicamente falando, as enzimas so catalisadores biolgicos
que abaixam seletivamente as energias de ativao das reaes qumicas vitais. Energia
de ativao, a energia mnima necessria para que uma molcula de reagente ou de
substrato S alcance o estado de transio SP

e da se tornar uma molcula de

produto P.
A velocidade da reao SP depende do nmero de molculas de S que
alcanam o estado de transio por unidade de tempo. Na presena de uma enzima
apropriada, a temperatura ambiente fornece uma quantidade suficiente de molculas
reagentes com a necessria energia de ativao. Uma reao catalisada por enzima pode
processar a 25
o
C, 10
8
a 10
11
vezes mais rapidamente que a mesma reao no catalisada.
As enzimas no afetam o G (energia livre de Gibbs) ou a Keq
(constante de equilbrio) de uma reao. Elas simplesmente aceleram a velocidade com
a qual a reao alcana o equilbrio. No equilbrio, as reaes em ambos os sentidos so
iguais.


8
Portanto:
S P

v
f
=k
1
[S] =v
d
=k
1
[P]

Keq
P
S
k
k
= =

[ ]
[ ]
1
1
onde,
v
f
=velocidade de formao do produto P.
v
d
=velocidade de dissociao do produto P.
[S] =concentrao de substrato S.
[P] =concentrao de produto P.
Na presena de uma enzima apropriada, k
1
e o k
-1
crescem na mesma
ordem. Se k
1
aumenta de 10
6
vezes, o k
-1
deve tambm aumentar de 10
6
vezes. O G e
o Keq permanecem invariveis (figura 1).











FIGURA 1- G e Ea de (a) uma reao no enzimtica; (b) uma reao enzimtica.

2.2- O STIO ATIVO
Sua funo de ligao e cataltica.
A seqncia total de uma reao enzimtica pode ser descrita como:
S +E ES EP E +P

k
1
k-
1

P
P
S
S
E
a

E
a
(a)
(b)
Nvel de
energia
Nvel de
energia
(SP)

G
(SP)

G

9
Embora a enzima participe da seqncia da reao, ela no sofre
nenhuma transformao. Sendo assim, apenas poucas molculas de E so capazes de
catalisar a converso de milhares de molculas de S a P por exemplo.
A existncia de um complexo enzima-substrato, ES, foi deduzida:
a) do alto grau de especificidade apresentado pelas enzimas;
b) da forma da curva de velocidade contra concentrao de substrato;
c) do fato de que substratos freqentemente protegem as enzimas de
inativao.
O alto grau de especificidade das enzimas originou a hiptese do modelo
templete ou da analogia chave-fechadura (Emil Fischer,1894). Esse modelo
considera que a enzima possui uma regio chamada stio ativo, a qual complementar
em tamanho, forma e natureza qumica molcula de substrato (figura 2).
A hiptese de Koshland, mais moderna, da enzima flexvel ou do
encaixe induzido considera que o stio ativo no precisa preexistir sob uma forma
geomtrica rgida, devendo contudo existir um arranjo espacial preciso e especfico dos
grupamentos R (cadeia lateral) dos aminocidos, arranjo esse que induzido pelo
contato com o substrato (figura 3). O stio ativo de uma enzima ocupa apenas uma
pequena parte da molcula de enzima.




FIGURA 2- Hiptese da chave fechadura (templete) de especificidade das enzimas.








FIGURA 3- Hiptese do encaixe induzido de Koshland. (a) O substrato se aproxima do stio
ativo. (b) A ligao do substrato induz o alinhamento apropriado dos grupos catalticos A e B.
3- CINTICA ENZIMTICA
+
E
S
ES
A
C
B
A
C
B
E
S
E
S
(a) (b)

10

Entende-se por cintica enzimtica a anlise quantitativa do efeito de cada um dos
fatores que influencia a atividade enzimtica avaliada atravs do aumento ou reduo da
velocidade da reao catalisada.
A atividade da enzima, e, portanto a cintica enzimtica determinada pela
concentrao da enzima, concentrao de cofatores, concentrao e tipo de inibidores
(quando presentes) e ainda pH, T e fora inica.

3.1. CATLISE

Caracterstica do catalisador

Modificar a velocidade da reao, sem ser nela consumido ou aparecer entre os
produtos.
No apresenta efeito termodinmico global: energia livre liberada ou absorvida
na reao independente da presena ou ausncia do catalisador.
Atua pela reduo da Energia de Ativao.
Catalisador mais reagente: estados de transio mais estvelreduo da
energia de ativao.
Influncia da Concentrao de Enzima
Sob determinadas condies, a velocidade de transferncia do substrato em
produto proporcional quantidade de enzima. Desvios da linearidade podem ocorrer
devido a: presena de inibidores na prpria soluo de enzima; presena de substncias
txicas; presena de um ativador que dissocia a enzima; e limitaes impostas pelo
mtodo de anlise. A fim de se evitar o efeito causado por estes fatores recomenda-se
utilizar nos ensaios cinticos, sempre que possvel: enzimas com alto grau de pureza;
substratos puros; e mtodo de anlise confivel.
Influncia do pH
Geralmente as enzimas so ativas numa faixa restrita de pH e na maioria dos
casos h um pH timo definido.

11
O efeito do pH sobre a afinidade pode ser eliminado utilizando-se altas
concentraes de substrato de modo a se saturar a enzima em todos os valores de pH; e
o efeito do pH sobre a enzima deve-se s variaes no estado de ionizao dos
componentes do sistema medida que o pH varia. Como as enzimas so protenas
contm muitos grupos ionizveis, elas existem em diferentes estados de ionizao, por
isso, a atividade cataltica restrita a uma pequena faixa de pH (HARTMEIER).
A atividade da enzima deve ser ento medida no pH timo. A estabilidade de
uma enzima ao pH depende de muitos fatores como: temperatura, fora inica, natureza
qumica do tampo, concentrao de vrios preservativos (por exemplo, glicerol,
compostos sulfdricos), concentrao de ons metlicos contaminantes, concentrao de
substratos ou cofatores da enzima e concentrao da enzima.

Efeito da Temperatura
A atividade cataltica das enzimas altamente dependente da temperatura, como
no caso dos catalisadores convencionais, porm, medida que se eleva a temperatura
dois efeitos ocorrem simultaneamente: (a) a taxa de reao aumenta, como se observa
na maioria das reaes qumicas; e (b) a estabilidade da protena decresce devido a
desativao trmica.
A influncia da temperatura sobre a atividade da enzima geralmente,
representada em termos de atividade ou velocidade de reao em funo da temperatura,
ou seja, a maioria das reaes qumicas se processa a uma velocidade maior medida
que a temperatura aumenta..
O efeito da temperatura de uma enzima depende de um nmero de fatores
inculem o pH e a fora inica do meio e a presena ou ausncia de ligantes. Os
substratos freqentemente protegem a enzima da desnaturao pelo calor.
No processo de desnaturao trmica ocorre a perda da atividade biolgica da
enzima.
Toda enzima tem uma temperatura tima para que atinja sua atividade mxima,
ou seja, a temperatura mxima na qual a enzima possui uma atividade constante por
um perodo de tempo.


12
3.2- Sistema Unirreacional Simples Tratamento Em Equilbrio Rpido
(Henri, Michaelis e Menten)
A reao enzimtica mais simples envolve um nico substrato se transformando
em um nico produto. Admite-se que, inicialmente, a enzima e o substrato reagem
reversivelmente, formando um composto intermedirio denominado complexo enzima-
substrato que, por sua vez, ou se decompe ou reage com outra substncia,
regenerando a enzima e formando os produtos da reao. Considerando o caso mais
simples possvel, caracterizado pelos seguintes pontos:
a) a formao do complexo enzima-substrato se d na proporo de 1
mol de enzima para 1 mol de substrato;
b) o complexo formado se decompe, sem reagir com outras substncias
existentes no sistema.
A seqncia da reao :

E +S ES E +P

A equao de velocidade pode ser obtida considerando condies de
equilbrio rpido:
a) E, S e ES alcanam o equilbrio muito rapidamente em comparao
com a velocidade com a qual ES se transforma em E +P (etapa lenta);
b) a velocidade instantnea em qualquer tempo depende da concentrao
de ES:
v =k
p
[ES], onde k
p
= constante de velocidade cataltica.
A enzima total est distribuda entre E e ES [E]
t
=[E] +[ES].
Dividindo a equao de velocidade por [E]
t
, onde [E] +[ES] usado no
termo da direita, obtemos:

v
[E]
k
[E] [ES]
[ES]
t
p
=
+

No equilbrio a [ES] pode ser expresso em termos de [S], [E] e Ks, onde
Ks a constante de dissociao do complexo ES:


K s
E S
ES
k
k
ES
S E
K s
= = =
[ ][ ]
[ ]
[ ]
[ ][ ] 1
1

k
1

k
-
k
p


13

Substituindo-se para [ES]:

v
[E]
k [S][E]
Ks
[E]
[S][E]
Ks
t
p
=
+

Rearranjando-se, tem-se:

v
k [E]
[S]
Ks
1
[S]
Ks
p t
=
+

Se v =k
p
[ES], ento k
p
[E]
t
=V
mx
a velocidade mxima que ser
observada quando toda a enzima estiver presente sob a forma de ES, ento:

v
V
[S]
Ks
1
[S]
Ks
(1)
max
=
+


Ou

v
V
[S]
Ks [S]
(2)
max
=
+
Equao de Henri-Michaelis-Menten

A equao (2) nos d a velocidade instantnea ou inicial relativa a
V
mx
para uma dada concentrao de substrato.
A equao s vlida se v medida num tempo pequeno o suficiente
para que [S] permanea praticamente constante. Pra isto no mais do que 5% do
substrato devem ser utilizados durante o tempo de ensaio.

3.3. TRATAMENTO DO ESTADO ESTACIONRIO (BRIGGS E
HALDANE)
Se a enzima estiver presente em quantidades catalticas (isto , [S] >>
[E]
t
), ento a velocidade de aparecimento de ES ser praticamente igual velocidade de
desaparecimento de ES caracterizando-se um estado estacionrio no qual a
concentrao de ES permanece praticamente constante num certo perodo de tempo.

14
A equao de velocidade pode ser derivada de maneira muito similar
equao anteriormente descrita. Neste caso, ES ser obtido da equao do estado
estacionrio ao invs de expresses de equilbrio:

E +S ES E +P

v =k
p
[ES]
v
[E]
k
[E] [ES]
[ES]
t
p
=
+
(2a)

Analisando a seqncia de reao, verifica-se que:
Velocidade de formao de ES =k
1
[E][S]
Velocidade de decomposio de ES =k
-1
[ES] +k
p
[ES] =(k
-1
+k
p
)[ES]
No estado estacionrio, d[ES]/dt =0 (no h acmulo) ou,
k
1
[E][S] =(k
-1
+k
p
)[ES]

Resolvendo para [ES]:

[ES]
k [E][S]
(k k )
1
1 p
=
+

Onde,
k k
k
K =constante de Michaelis- Menten
1 p
1
m
+
=

Assim:

[ES]
[E][S]
Km
=
, que substituindo na equao da velocidade:

v
k [E] p t
=
+
[ ][ ]
[ ]
[ ][ ]
S E
K
E
S E
K
m
m


v
V
[S]
K
1
[S]
K

max
m
m
=
+
ou
v
V
[S]
K [S]
(3)
max m
=
+


K
m
diferente de Ks:

K
E S
ES
k k
k
m
p
= =
+ [ ][ ]
[ ]
1
1

k
1

k
-1

k
p


15

K s
E S
ES
k
k
= =
[ ][ ]
[ ]
1
1


A constante de Michaelis, K
m
, uma constante dinmica. ou de
pseudoequilbrio, que expressa a relao entre as concentraes reais no estado
estacionrio ao invs de concentraes no equilbrio.
Se k
p
muito pequeno quando comparado com k
-1
, K
m
se reduz a Ks.
A equao de Henri-Michaelis-Menten indica que K
m
equivalente
concentrao de substrato no qual uma enzima produz metade de sua velocidade
mxima.

v =
+
[S]
K [S]
V
m
max
quando[S] =K
m
,

v =
+
K
K
V =
V
2

m
m
max
max
Km

O valor de K
m
indica a afinidade de uma enzima pelo seu substrato. O
substrato com valor mais baixo de K
m
tem uma afinidade aparente maior para a enzima.
Observao: V
mx
no uma constante. V
mx
depende do k
p
, que uma
constante, e da concentrao da enzima na experincia. V
mx
proporcional
concentrao de enzima (figura 4).
Lembre-se que a etapa lenta da reao [ES] P +E e portanto a
velocidade de formao de produto praticamente a velocidade da reao:
v =k
p
[ES] e quando v =V
mx
, temos V
mx
=k
p
[E]
t
.








FIGURA 4 - Grfico de v vs. [S] com V
mx
variando de acordo com a [E].
3.4. CURVAS DE VELOCIDADE VS. CONCENTRAO DE
SUBSTRATO
A equao de Henri-Michaelis-Menten descreve a curva obtida quando a
velocidade inicial lanada em grfico contra [S] (figura 5).
V
mx
[2E]
V
mx
[E]
[S]
v

16
A curva de v vs. [S] uma hiprbole retangular perfeita cujos limites so
V
mx
e -K
m
. A curvatura fixa independentemente dos valores de K
m
e V
mx
. Em
conseqncia, a razo das concentraes do substrato para quaisquer duas fraes de
V
mx
constante para todas as enzimas que obedecem cintica de Henri-Michaelis-
Menten.










FIGURA 5 - Grfico de v vs. [S]

4- ORDEM DE REAO
A curva de v vs. [S] apresenta 3 regies distintas onde a velocidade
apresenta uma resposta caracterstica medida que [S] aumenta (figura 6a). Em
concentraes muito baixas de substrato (por exemplo, [S] <0.01K
m
), a curva de
v vs. [S] praticamente linear (figura 6b). Esta a regio de cintica de primeira ordem.
Em concentraes de substrato muito altas ([S] >100K
m
), a velocidade
praticamente independente da concentrao de substrato. Esta a regio de cintica de
ordem zero (figura 6c). Para as concentraes intermedirias de substrato, a relao
entre v e [S] no segue nem uma cintica de primeira ordem nem uma de ordem zero.







K
m

0.5V
mx

V
mx

Velocidade inicial v
Velocidade inicial v
Concentrao de substrato S
v
ordem zero

17















FIGURA 6- (a) Grfico de v vs. [S] numa grande faixa de [S]. (b) Grfico de v vs.[S]
onde [S]<<K
m
. (c) Grfico de v vs. [S] onde [S]>K
m
.

4.1- CINTICA DE PRIMEIRA ORDEM
A relao linear entre v e [S], quando [S] <<K
m
pode ser deduzida a
partir da equao de Henri-Michaelis-Menten.

v =
V [S]
K +[S]
max
m

Quando [S] <<K
m

v =
V [S]
K
max
m
ou v =k[S] (4)
k =constante de velocidade de primeira ordem para a equao total.
k =V
mx
/K
m
=moles x litro
-1
x min
-1
/ moles x litro
-1
=min
-1

A equao indica que quando [S] muito pequena, a velocidade absoluta
diminui a cada momento, medida que [S] decresce (figura 7a). Porm, em certo
momento, uma frao constante de substrato presente se transforma em produto:

=
d S
dt
[ ]
v =k[S] k =
-d[S] / [S]
dt

=
d S
dt
[ ]
v = quantidade de [S] utilizada por um pequeno periodo

Concentrao de substrato S Concentrao de substrato S
1
a
ordem
v
Concentrao de substrato S
(a)
(b)
(c)

18
k =frao constante de substrato presente em qualquer momento.
Como v diminui com o tempo na regio de primeira ordem, grficos de
[S] e [P] contra o tempo so curvos (figura 7b). Pode-se determinar a quantidade de
substrato utilizada ou de produto formado durante qualquer intervalo de tempo
utilizando a equao integrada de velocidade de primeira ordem.









FIGURA 7- Regio de primeira ordem da curva de velocidade. (a) v diminui
continuamente com o tempo. (b) O aparecimento de P e o desaparecimento de S no so
lineares com o tempo.

v =
-d[S]
dt
=k[S] ou
-d[S]
[S]
=kdt

=

d S
dt
k dt
S
S
to
t
[ ]
[ ]
[ ]
0

ln
[ ]
[ ]
( ) ( )
S
S
k t t k t t
0
0 0 = = ou 2.3log
[S]
[S]
0


Se [S]
0
= concentrao inicial de substrato e t
0
=tempo zero, a equao
fica assim:

kt =
[S]
[S]
log 2.3
0
(5)
Onde, t =tempo decorrido
[S] =concentrao de substrato no tempo t
Na forma exponencial:
[S] =[S]
0
e
-kt
(6)
A equao 5 pode ser transformada em:

log[ ]
.
log[ ] S
k
t S =

+
23
0

v
Tempo
(a)
Tempo
(b)
[S] ou [P]
[S]
0
/2
[P]
[S]
[S]
0
0
t
1/2

19
Ento, um grfico de [S] vs. t linear, com uma inclinao de -k/2.3 e
uma interseo de log[S]
0
no eixo de log[S] (figura 8).
Quando [S] = [S]
0
, t =meia-vida, t
1/2
.
t
1/2
=tempo necessrio para converter em produto metade do substrato
originalmente presente.
O t
1/2
constante para reaes de 1
a
ordem e est relacionado ao k:

23
1
05
1 2 . log
.
/ = kt

23 2
1 2
. log
/
k
t =


0693
1 2
.
/
k
t =
(8)











FIGURA 8- Grfico semilog da forma integrada da equao da velocidade de primeira
ordem.



4.2- CINTICA DE ORDEM ZERO
Quando [S] >> K
m
, o K
m
no denominador da equao de Henri-
Michaelis-Menten pode ser ignorado e a equao simplificada:

v =
V [S]
K +[S]
max
m
[ ]
[ ]
[ ]
S Km
max V S
S
>>


v =V
mx
(9)

Inclinao =-k/2.3
l og
[ ] S 0
2
log[S]
0

log[S]
t
1/2
Tempo

20
5- MTODOS PARA CONSTRUO DE GRFICOS DOS DADOS E
CINTICA ENZIMTICA
Para facilitar a determinao das constantes cinticas, os dados so
geralmente lanados em grficos lineares.

5.1- GRFICOS DOS RECPROCOS DE LINEWEAVER-BURK: 1/v
VS. 1/[S]
baseado no rearranjo da equao de Henri-Michaelis-Menten numa
forma linear (y =mx +b):

v
v V
o =
K +[S]
[S] max
m
=
+
[ ]
[ ]
S
K S m
Invertend :
Vmax


1
v
=
K +[S]
V [S]
m
max

Separando os termos:

1 1
v
=
K
V
+
[S]
V [S]

m
max max

[ ] S

ou
1 1
v
=
K
V
+
1
V

m
max max

[ ] S
(10)















1/V
mx


1/v

21




FIGURA 9- Grfico duplo recproco (1/v vs.1/[S]) de Lineweaver-Burk

Existem outros tipos de grficos:
Grfico De Hanes-Woolf: [S]/V Vs. [S]
Grfico De Woolf-Augustinsson-Hofstee: V VS. V/[S]
Grfico De Eadie-Scatchard: V/[S] Vs. V

5.2- FORMA INTEGRADA DA EQUAO DE HENRI-MICHAELIS-
MENTEN
Em determinadas condies pode ser difcil medir-se velocidades
iniciais, embora seja ainda possvel determinar-se a concentrao de substrato ou
produto durante o curso de uma reao.
Se Keq muito alto e o produto tem pouca afinidade pela enzima, ento a
velocidade decrescente com o tempo resulta somente da saturao decrescente da
enzima. K
m
e V
mx
podem ser determinados pelo uso da forma integrada da equao de
velocidade.

v = =
+
d S
dt
V S
K S
max
m
[ ] [ ]
[ ]



V dt
K S
S
d S max
m
=
+ [ ]
[ ]
[ ]

Integrando:

V dt
K S
S
d S max
m
t
t
S
S t
=
+

0 0
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]


V dt
K
S
d S d S max
m
t
t
S
S
S
S t t
=

0 0 0
[ ]
[ ] [ ]
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]


V t K
S
S
S S max m = ln
[ ]
[ ]
([ ] [ ] )
0
0

ou
-1/K
m

1/[S]

22

V t K
S
S
S S max m = + 23
0
0 . log
[ ]
[ ]
([ ] [ ])

onde [S] =concentrao de substrato em qualquer tempo t =[S]
0
- [P]
([S]
0
- [S]) = concentrao de substrato utilizado no tempo t = [P], a
concentrao de produto formado no tempo t.
A equao 14 pode ser dividida por t e sofrer um rearranjo, resultando
em:

23 1 0 0 .
log
[ ]
[ ]
([ ] [ ])
t
S
S K
S S
t
V
K m
max
m
=

+
(15)









FIGURA 10- Grfico de equao integrada de Henri-Michaelis-Menten.

6- INIBIO ENZIMTICA
Um inibidor qualquer substncia que reduza a velocidade de uma
reao enzimtica.
Os inibidores podem ser classificados em:
competitivos
Reversveis no competitivos
Inibidores
Irreversveis

6.1- INIBIO REVERSVEL
V
mx
/K
m

V
mx

23 0 0
0
.
log
[ ]
[ ]
log
[ ]
[ ] [ ] t
S
S
S
S P
ou
2.3
t

([S]
0
-[S])/t ou [P]/t
Inclinao =-1/K
m


23
Neste tipo de inibio, a atividade enzimtica recuperada com a
remoo do inibidor.
caracterizada por um equilbrio entre o inibidor e a enzima definido
por uma constante de equilbrio, k
i
.
6.1.1-INIBIO COMPETITIVA
Um inibidor competitivo uma substncia que se combina com uma
enzima livre de uma forma tal que impede a ligao do substrato. Isto , o
inibidor e o substrato so mutuamente exclusveis, em geral porque h uma
verdadeira competio pelo mesmo stio. Um inibidor competitivo poderia ser
um anlogo no metabolizvel ou um derivado de um substrato verdadeiro, ou
um substrato substituto da enzima, ou um produto da reao.
A combinao do inibidor com a enzima provoca uma mudana na
conformao (estrutura terciria ou quaternria) da enzima que deforma o stio
do substrato e, portanto, impede o substrato de se ligar.
As figuras abaixo ilustram os modelos de inibio competitiva:

24

O esquema de reao que descreve a inibio competitiva :

A velocidade inicial da reao proporcional concentrao no
estacionrio do complexo enzima-substrato, ES. Todas as reaes so
reversveis. Desse modo, podemos prever que em qualquer concentrao sub-
saturante fixa de inibidor: a) v, (a velocidade da reao em ausncia de inibidor)
pode ser igualada a v (a velocidade da reao em ausncia de inibidor), porm,
nesse caso, uma concentrao mais alta de substrato ser necessria (para obter a

25
mesma concentrao de ES), e b) na presena de uma concentrao de substrato
muito alta (saturante), toda enzima pode ser levada forma de complexo ES.
Como conseqncia, a velocidade inicial mxima, na presena de um inibidor
competitivo, igual a V
mx
(velocidade inicial mxima em ausncia de inibidor).
A K
m
aparente (medico como [S] para V
mx
) aumentar na presena de um
inibidor competitivo porque, qualquer que seja a concentrao deste ltimo,
existir uma frao de enzima sob forma de EI, a qual no possui afinidade pelo
S.
A equao de velocidade pode ser facilmente deduzida a partir de
condies de equilbrio rpido:

A figura abaixo ilustra o efeito de um inibidor competitivo no grfico de
v vs. [S].

A equao da velocidade para a inibio competitiva na forma recproca
:


26
O grfico recproco (V
-1
x [S]
-1
) dado pela figura
abaixo:
A inclinao do grfico recproco na presena do inibidor competitivo
dada por:

A Km
ap
dada como:

6.1.2- INIBIO NO COMPETITIVA

27
Um inibidor no competitivo clssico no tem efeito na ligao do
substrato, e vice-versa. S e I se ligam reversvel, aleatria e independentemente
em stios diferentes. Isto , I se liga a E e a ES: S se liga a E e a EI. Entretanto, o
complexo ESI resultante cataliticamente inativo. I pode impedir o
posicionamento adequado do centro cataltico. As reaes de equilbrio so:

Podemos observar pelas reaes de equilbrio que, em qualquer
concentrao de inibidor, uma concentrao infinitamente alta de substrato no
consegue levar toda enzima sob forma de ES que a forma produtiva. Em
qualquer [I] uma parte da enzima permanecer sob a forma de complexo no
produtivo ESI, donde podemos prever que V
mx
em presena de um inibidor no
competitivo (V
mx
) ser menor que a V
mx
observada na ausncia de inibidor. O
valor K
m
(medido a uma [S] quando av, igual a 0,5 V
mx
) permanece o mesmo
na presena do inibidor no competitivo porque, qualquer que seja a
concentrao de inibidor, as formas da enzima que podem combinar com S (E e
EI) apresentam a mesma afinidade para com o S. O efeito final de um inibidor
no competitivo fazer com que parea que haja menor quantidade de enzima
presente.
A equao da velocidade dada por:

Como previsto, observamos que o nico efeito de um inibidor no
competitivo diminuir a V
mx
. A figura abaixo ilustra o comportamento do
grfico V vs [S].

28

A equao do recproco :

A figura apresenta o grfico recproco V
-1
vs [S]
- 1
:


29

A inclinao da reta no grfico recproco em presena de um inibidor
puramente no competitivo um funo linear de [I], como j mostrado para a
inibio puramente competitiva.
6.2. INIBIO IRREVERSVEL
Um substrato que se combina irreversivelmente com uma enzima pode
assemelhar-se a um inibidor no competitivo porque V
mx
diminui, ao passo que
K
m
permanece a mesma. As reaes so:

A V
mx
diminui porque parte da enzima completamente removida do
sistema. Pela construo de um grfico de V
mx
vs. a quantidade total de enzima

30
adicionada ao meio de reao em presena de I, pode-se distinguir um inibidor
irreversvel de um inibidor, no competitivo clssico:

7. EFEITO DO pH NA ESTABILIDADE E ATIVIDADE DAS ENZIMAS
Os efeitos do pH na estabilidade de uma enzima devem ser levados em
conta em qualquer estudo do efeito do pH na ligao do substrato e na catlise.
Os stios ativos nas enzimas so freqentemente compostos por grupos
ionizveis que devem se encontrar numa forma inica adequada para que
mantenham a conformao do stio ativo, liguem-se aos substratos, ou catalisem
a reao. Alm disso, os prprios substratos podem conter grupos ionizveis e
somente uma forma inica deste substrato pode se ligar enzima ou sofrer
catlise.
A figura ilustra uma curva experimental de v vs. PH para uma enzima
(curva A). E o efeito do pH na estabilidade da enzima (curva B).

31

Observamos que a pr-incubao da enzima em pH 5 ou pH 8 no
produz nenhum efeito na atividade medida em pH 6,8. Ento, o declnio na
atividade entre pH 6,8 e 8 e entre pH 6,8 e 5 deve resultar da constituio de
uma forma inica no adequada da enzima e/ou do substrato. Quando a enzima
pr-incubada em pH >8 ou pH >5, a atividade total no obtida em pH 6,8.
Ento, parte do declnio na atividade acima de pH 8 e abaixo de pH 5 resulta de
uma inativao irreversvel da enzima. Um estudo do efeito do pH na
estabilidade de uma enzima, tal como ilustrado pela curva B, constitui parte
essencial na caracterizao de qualquer enzima.
A curva B de estabilidade pode ser obtida pela pr-incubao da enzima
nos pH indicados por um tempo que seja, pelo menos, to longo quanto o tempo
que se gasta para fazer as determinaes usuais. A atividade da enzima deve ser
ento medida no pH timo. A estabilidade de uma enzima ao pH depende de
muitos fatores como (a) temperatura, (b) fora inica, (c) natureza qumica do

32
tampo, (d) concentrao de vrios preservativos (por exemplo, glicerol,
compostos sulfidrlicos), (e) concentrao de ons metlicos contaminantes, (f)
concentrao de substratos ou cofatores da enzima, e (g) concentrao da
enzima.
8. EFEITO DA TEMPERATURA NA ESTABILIDADE E ATIVIDADE
DAS ENZIMAS
A maioria das reaes qumicas se processa a uma velocidade maior
medida que a temperatura aumenta. Um aumento na T (temperatura) imprime
maior energia cintica s molculas de reagente, ocasionando um maior nmero
de colises produtivas por unidade de tempo. As reaes catalisadas por enzimas
se comportam de modo at certo ponto semelhante. As enzimas so molculas
proticas complexas. Sua atividade cataltica provm de uma estrutura terciria
precisa, altamente ordenada que justape os grupamentos R especficos dos
aminocidos de tal modo a formar stios estereo-especficos de ligao com o
substrato e o centro cataltico. A estrutura terciria de uma enzima mantida
principalmente por um grande nmero de ligaes no covalentes fracas. Em
termos prticos, uma molcula de enzima uma estrutura muito delicada e
frgil. Se a molcula absorve energia demais, a estrutura terciria romper-se- e
a enzima ficar desnaturada, isto , perder a atividade cataltica. Logo, a
medida que a temperatura cresce, o esperado aumento em v, resultante do
aumento das colises entre E +S, compensado pelo aumento da velocidade de
desnaturao. Consequentemente, um grfico de v vs. T em geral apresenta um
pico algumas vezes chamado de temperatura tima. A temperatura tima
depende do tempo escolhido para a realizao das medidas. A verdadeira
temperatura tima para uma determinao a temperatura mxima na qual a
enzima possui uma atividade constante por um perodo de tempo pelo menos to
longo quanto o tempo da determinao.
O efeito da temperatura de uma enzima depende de um nmero de
fatores que incluem o pH e a fora inica do meio e a presena ou ausncia de
ligantes. Os substratos freqentemente protegem a enzima da desnaturao pelo
calor. Enzimas de baixo peso molecular compostas de uma nica cadeia

33
polipeptidica e possuindo pontos dissulfetos so geralmente mais estveis ao
calor do que enzimas oligomricas, de alto peso molecular. Em geral, uma
enzima ser mais estvel ao calor em preparaes brutas livres de clulas que
contenham uma concentrao alta e de outras protenas (desde que na ausncia
de proteases).
A EQUAO DE ARRHENIUS - ENERGIA DE ATIVAO
A relao entre a constante de velocidade de uma reao, K, e a energia
de ativao, E
a
, dada pela equao de Arrhenius.

A a constante para cada reao em particular. A forma integrada da
equao de Arrhenius :

onde K
2
e K
1
so as constantes de velocidade especficas em duas temperaturas
diferentes, T
2
e T
1
, respectivamente.
Num sistema de equilbrio rpido e simples, V
mx
[E]
t
= K
p
uma
constante de velocidade de primeira ordem. Assim, um grfico de log V
mx
[E]
t

vs. 1/T fornece E
a
para a etapa cataltica. Na prtica pode-se colocar no grfico
apenas log V
mx
, uma vez que V
mx
, de uma determinada preparao
proporcional a K
p
, desde que K
m
varia com T, no podemos admitir que uma
determinada concentrao de substrato seja saturante em todas as temperaturas.
O ideal seria determinar a V
mx
a partir de um grfico recproco a cada
temperatura. Para a maior parte das reaes enzimticas, o V
mx
depende de
vrias constantes de velocidade, cada qual podendo ser afetada de maneira
diferente pela variao de temperatura. Isto quer dizer que a E
a
calculada atravs

34
do grfico de Arrhenius ser um valor aparente ou uma mdia. O prprio
grfico de Arrhenius pode no ser linear se diferentes etapas se tornam
limitantes da velocidade em temperaturas diferentes. Em alguns casos, o grfico
pode apresentar uma variao brusca na inclinao da reta a determinadas
temperaturas (temperatura de transio) em que a dependncia de V
mx
varia
de uma etapa limitante para outra (curva B). Uma queda brusca no grfico de
Arrhenius em 1/T baixa (T alta) indica uma desnaturao da protena (curva C).

O efeito da temperatura na velocidade das reaes em geral expresso
em termos de coeficiente de temperatura (Q
10
) - fator pelo qual a velocidade
aumenta quando a temperatura aumenta de 10
o
C.


35

9. DETERMINAO DAS ENZIMAS
9.1. UNIDADES DE ENZIMAS E ATIVIDADES ESPECFICAS - QUANTIFICAO
DE [E]
t

Na maior parte das preparaes e concentrao real da enzima
desconhecida. Consequentemente, a quantidade de enzima presente s pode ser
expressa em termos de sua atividade. A determinao da atividade da enzima
envolve a medida da velocidade de reao, portanto, a Comisso de Enzima da
Unio Internacional de Bioqumica, recomenda a seguintes definio (DIXON e
WEBB, 1979):
Uma unidade (U) de atividade a quantidade de enzima que catalisa a
transformao de 1 micromol de substrato, ou a formao de 1 micromol de
produto por minuto, nas condies de ensaio (temperatura, pH, concentrao de
substrato, etc).
U=micromoles produto/minuto
A concentrao da enzima de uma preparao impura expressa em termos de
unidades/ml. A atividade especfica expressa em termos de atividade por
miligrama de protena (U/mg).


AE = Unidades/ml =Unid/mg protena
mg protena/ml

9.2. EXTRAO DE ENZIMAS
Extrao um processo em que a protena de interesse transferida a
partir da fase aquosa existente para outra fase, tanto aquosa ou orgnica. Neste
processo, a atividade biolgica preservada.
Sempre quando inicia-se a extrao, definem-se as condies, tais como:
concentrao, tipo de extrato, bem como o tempo e a temperatura em que
ocorrer o processo, alm do nvel de agitao.
Alguns reagentes mais utilizados na extrao: NaCl, soluo tampo, solventes
apropriados, entre outros.

36
9.3. PURIFICAO DE ENZIMAS
A purificao consiste numa srie de processos que removem
contaminantes at a obteno de um produto de elevado grau de pureza. Estes
processos devem ocorrer em condies que mantenham a estabilidade da
molcula a ser purificada ou seja, deve-se evitar a degradao da protena.
As enzimas so purificadas pelo emprego sucessivo de mtodos do
fracionamento qumicos ou fsicos. O objetivo de cada etapa reter o mximo
possvel da enzima que se quer purificar e eliminar, tambm o mximo possvel,
outras protenas, cidos nuclicos e outras substncias. A eficincia de cada
etapa dada por um rendimento ou recuperao (a porcentagem retida da
atividade total da enzima originalmente presente) e a purificao ou fator de
purificao (o fator pelo qual a atividade especfica da preparao aumentou).
O objetivo otimizar ambos os fatores. Algumas vezes, um bom rendimento
sacrificado em funo de uma etapa excelente de purificao; algumas vezes
uma boa etapa de purificao no utilizada porque o rendimento muito baixo.
A recuperao e a purificao so representadas por:
Recuperao =
unidades totais na frao purificada
unidades totais no extrato bruto
x 100%
Purificao =
atividade especfica na frao purificada
atividade especfica do extrato bruto
x 100%

No h regras gerais com relao ordem das etapas de purificao,
embora sejam normalmente utilizados em primeiro lugar nas etapas de
purificao o tratamento por calor (onde possvel) e as precipitaes por sulfato
de amnio. A filtrao em gel seguir-se precipitao por sulfato de amnio,
servindo para dessalificar a preparao assim como para fracionar as protenas
de acordo com o tamanho. Se a cromatografia de troca inica usada
posteriormente precipitao por sulfato de amnio, recomendvel dialisar a
preparao rpida em gel (por exemplo, Sephadex G-25). A eliminao do
sulfato de amnia facilitar a ligao das protenas resina de troca inica.
Outras etapas podem ser altamente eficientes para certas enzimas incluem

37
centrifugao diferencial, precipitao por sulfato de protamina ou sulfato de
estreptomicina, cromatografia de afinidade, e eletroforese preparativa em gel.

9.4. Precipitao de Protenas
Uma das etapas iniciais de purificao a precipitao de protenas de
uma soluo aquosa concentrada (extrato). Vrios agentes precipitantes so
disponveis, incluindo sais, calor, pH e solventes orgnicos.
A solubilidade da protena devido, em grande parte, distribuio de
resduos hidroflicos e hidrofbicos na superfcie da molcula e, desta maneira,
protenas diferentes componentes de uma mistura, ao responderem de modo
distinto a agentes precipitantes, podem ser separadas.
O fracionamento de acordo com a solubilidade em solues de sulfato de
amnio muito utilizado em protocolos de isolamento de protenas e, em geral,
fornece preparaes com menor grau de contaminao e mais enriquecidas da
protena de interesse. Adicionalmente, preparaes homogneas podem ser
obtidas pela precipitao dos contaminantes permanecendo a protena de
interesse solvel.

9.5. Quantificao de Protenas
A determinao quantitativa de protenas indispensvel durante o
procedimento de isolamento e caracterizao destas biomolculas. Entre os
vrios mtodos para quantificar protenas, o de Lowry e colaboradores e a
medida da absoro de luz ultravioleta (280 nm) so freqentemente utilizados.

9.6. Processos cromatogrficos
Cromatografia um procedimento fsico-qumico que se desenvolve em
um meio slido, de origem orgnica (Sephadex, Celulose) ou inorgnica
(poliacrilamida, slica). Neste processo ocorre a separao dos componentes
constituintes de uma mistura, devido a migrao destes em diferentes
velocidades, atravs de uma coluna.
Em cromatografia vrios so os fatores que determinam a qualidade da
separao (resoluo), sendo exemplos: temperatura e velocidade de fluxo,

38
volume e concentrao da amostra e propriedades da matriz, como: forma e
tamanho da partcula e nmero de stios de adsoro disponveis.
Cromatografias mais utilizadas: cromatografia de troca inica,
cromatografia de afinidade, cromatografia de fase reversa, cromatografia de
excluso (filtrao em gel).

10. UTILIZAO DE ENZIMAS
10.1. HISTRICO
1876 Willain Krihne, props o nome ENZIMA
EN =EM
ZIMA =LEVEDO
Enzimas de plantas e animais de importncia industrial
Nome Fonte Aplicao
Papana mamo Digestiva, mdica, bebidas, carne
Bromelina abacaxi Digestiva, mdica, bebidas, carne
Diastase malte Xarope, panificao, digestivo
Pepsina estmago Amaciamento de carne

10.2. Usos de Enzimas na Indstria
Industria de Cerveja
Indstria de Amido E Aucares
Indstria de lcool
Detergentes
Txtil
Papel E Celulose
Curtumes
Panificao






11. BIBLIOGRAFIA
BROCK, T. (1997), Biology of Microorganisms. Prentice-Hall Inc. Chapter 12.
Industrial Microbiology.

39

GLAZER, A. N. & NIKAIDO, H. (1994) Microbial Biotecnology, fundamentals of
applied Biotecnology. University of California, Berkeley. W. H. Freeman &
Company, N.Y.

NOVONORDISK. (1995) Apostila sobre uso de enzimas.

SHREVER, R. N. & BRINK J R, J . A. (1980) Indstrias de Processos Qumicos.
Ed. Guanabara Dois S.A. R.J .
SEGEL, I.H. (1979) Bioqumica. Teoria e Problemas. Ed. Livros tcnicos e
cientficos. RJ .

BAILEY, J . E. e OLLIS,.D. F. Biochemical Engineering Fundamentals 2 nd
edition.

LEHNINGER, A . L. - Bioqumica - volume 1 - Componentes Moleculares das
Clulas