Laboratorio de Fisiologa - Fisiologa Animal

Estudio de las determinaciones hematolgicas en sangre

Objetivos
1. Conocer y determinar algunos parmetros hemticos representativos. 2. Interpretar los resultados experimentales. 3. Estudiar diferentes tipos de anemia. 4. Comprobar si el hematocrito tiene relacin con el volumen ocupado por los eritrocitos.

El estudio de las determinaciones hematolgicas en sangre consta de dos bloques: 1. Parmetros e ndices hematimtricos: para determinar los valores ms representativos de la sangre. 2. El eritrocito como osmmetro: para detectar la susceptibilitat de los eritrocitos frente a pequeas variaciones de la concentracin osmtica del medio.

Introduccin
Principios fisiolgicos La sangre de vertebrados constituye una especializacin del medio interno; su volumen vara segn la especie, y en el hombre representa el 8 % del peso corporal. La sangre es un lquido complejo con un peso especfico de 1,055 g/ml. Las clulas sanguneas realizan dos funciones importantes: transporte de gases respiratorios (O2 y CO2) y proteccin inmunolgica frente a agentes extraos. La primera la llevan a termino los eritrocitos (tambin llamados hemates o glbulos rojos), clulas muy especializadas. Si bien en casi todos los grupos de vertebrados los eritrocitos son nucleados, biconvexos y generalmente elpticos, en los mamferos (aparte de los camlidos) son anucleados y discoidales. Los eritrocitos contienen un pigmento proteico en concentracin elevada, la hemoglobina, la cual se combina reversiblemente (en relacin con la presin parcial del gas) con el O2 y el CO2. Cada hemoglobina est formada por cuatro subunidades, cada

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una con un grupo hemo (responsable del color rojo y al cual se une una molcula de O2) y una globina (responsable de las interacciones alostricas que modifican la afinidad al O2 y a la cual se fija el CO2). La funcin de transporte de oxigeno por la sangre vendr condicionada, en primer lugar, por la cantidad de hemoglobina circulante, la cual depender del nmero de eritrocitos y de la concentracin eritroctica del pigmento.

Protocolo Experimental
Se har una determinacin de los ndices ms representativos de la sangre: contaje globular, hematocrito, y hemoglobina con mtodo manual y mtodo automtico. A partir de estos valores se calcularn los ndices hematimtricos: Volumen corpuscular medio (VCM), Hemoglobina corpuscular media (HbCM) y Concentracin de hemoglobina corpuscular media (CHbCM). Se valorarn los cambio provocados en el volumen celular por efecto de disoluciones de diferente concentracin osmtica.

Metodologa Pararmetros e ndices hematimtricos

Sacar sangre por puncin cardiaca en rata Guardar en tubo heparinizado en nevera a 4C Antes de analizar cada parmetro, resuspender la sangre con agitador de rodillo

Contaje Globular
Esta medida se realiza mediante una cmara de Thoma o de Neubauer que presenta una cuadrcula especial (ver figura 1). El contaje se expresa en millones de glbulos por mm3 de sangre. La disminucin del nmero indica una anemia y el aumento, una policitemia.

Hematocrito
Expresa el volumen de eritrocitos que hay en 100 ml de sangre. Normalmente los leucocitos y las plaquetas contribuyen al hematocrito en un grado nfimo, referido al tanto por ciento de volumen de sangre. El valor del hematocrito vara con la especie y en relacin con el nmero y el tamao de los eritrocitos as como con el volumen de

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plasma. Un hematocrito reducido puede ser un indicador de anemia y un valor elevado (65 %) se observa en casos de deshidratacin, como el clera (a causa de las considerables prdidas de lquido en la defecacin, con la consiguiente reduccin del volumen plasmtico). El valor del hematocrito constituye un ndice indirecto de la capacidad de transporte de oxgeno de la sangre y es un parmetro importante para detectar una anemia o una policitemia.

ndices hematimtricos
La relacin entre los valores hemticos de hematocrito o Htc (volumen celular ! 100/volumen de sangre), contaje o Rc (millones de eritrocitos/mm3) y concentracin de hemoglobina o Hb (g Hb/100 ml sangre) permiten calcular los ndices hematimtricos. Tienen inters porqu presentan variaciones entre los diferentes vertebrados y permiten interpretar alteraciones patolgicas, como por ejemplo las anemias.

Volumen corpuscular medio

El volumen corpuscular medio (VCM) es el volumen medio de los eritrocitos y viene dado por la expresin: VCM = (Htc ! 10) / Rc donde Rc representa el nmero de eritrocitos en millones por mm3 de sangre.

Hemoglobina corpuscular media

Hemoglobina corpuscular media (HbCM) es la cantidad media de Hb por eritrocito. Se expresa en picogramos y se puede calcular siguiendo la expresin: HbCM = (Hb ! 10) / Rc donde Hb es la concentracin de hemoglobina en g/100 ml sangre y Rc los millones de eritrocitos por mm3 de sangre.

Concentracin de hemoglobina corpuscular media

Concentracin de hemoglobina corpuscular media (CHbCM) es la concentracin media de hemoglobina de los eritrocitos, es decir, la cantidad (en g) que hay en 100 ml de glbulos; viene dada por la expresin: CHbCM = Hb / (Htc / 100) = Hb ! (100 / Htc)

El eritrocito como osmmetro

A causa de la marcada susceptibilidad de los eritrocitos frente a las pequeas variaciones de la concentracin de partculas osmticamente activas en el medio que las rodea, el eritrocito pierde o gana lquido con relativa facilidad. Los cambios provocados en el volumen celular por efecto de disoluciones de diferente concentracin osmtica pueden comprobarse fcilmente mediante la determinacin del hematocrito. Esta prueba pone de manifiesto la necesidad de controlar cuidadosamente los factores o elementos que puedan modificar la composicin del medio con el cual se ponen en contacte los eritrocitos, para evitar errores o variaciones importantes a la hora de determinar el hematocrito de una muestra de sangre.

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Material
Centrfuga microhematocrito Espectrofotmetro Contador hematolgico Microscopio Pipetas automticas Pipeta cuentaglbulos Cmara de Thoma

Contaje globular A. Mtodo manual

Dilucin de la sangre: Se introduce la punta de la pipeta cuentaglbulos, colocndola en posicin casi horizontal, y se aspira para hacer subir la sangre hasta al seal 0,5 de la pipeta. Si la sangre pasa de la seal, puede hacerse retroceder tocando el extremo de la pipeta con un papel de filtro, para eliminar el volumen excedente. Es importante no pasarsede la marca 0,5. Es importante limpiar de sangre la superficie de la pipeta con papel de filtro y vigilar de no perder muestra del interior. Con la punta de la lengua se ha de tapar el tubo de goma, sumergir la punta de la pipeta en el lquido de dilucin (suero fisiolgico al 0,9 %) y aspirar hasta que este lquido llegue a la seal 101. Al sumergir la punta, hay que aspirar al principio con rapidez para evitar que parte de la sangre de la pipeta pase al lquido. Es importante no pasarse. Se ha de tapar con el dedo la punta de la pipeta, quitar el tubo de goma y tapar el otro extremo con el ndice (o a la inversa, como sea ms cmodo). Se ha de girar la pipeta, as sostenida, diversas veces para mezclar el contenido el. As, la sangre se ha diludo en 0,5/100 o 1/200.

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Aplicacin sobre la cmara de Thoma o de Neubauer (ver la fig. 1) Se ha de desengrasar la cmara y un cubreobjetos, el cual se colocar sobre la zona de contaje. Se hace tocar la punta de la pipeta diversas veces con un papel de filtro para eliminar el lquido contenido en el capilar, ja que contiene slo diluyente. Es importante que antes de este paso se vuelva a mezclar el contenido girando la pipeta diversas veces, ja que durante la preparacin de la cmara los glbulos pueden haberse sedimentado parcialmente. A continuacin se hace tocar la punta de la pipeta con el lado del cubreobjetos (sobre la elevacin longitudinal central, entre los dos zcalos de la cmara). La suspensin de eritrocitos no habra de sobrepasar el zcalo transversal central (si hay). Alternativamente, se puede depositar una pequea gota y despus colocar encima el cubreobjetos (aunque este sistema es menos fiable). Despus de unos minutos, para que sedimenten las clulas, se observa al microscopio con un objetivo de aumento mediano.

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Contaje (ver la fig. 1): La cmara de Thoma o de Neubauer consta de una cuadrcula central (1 mm2) con 16 cuadros grandes (4 ! 4), separados por lneas divisorias. Cada uno de estos cuadrados est dividido en 16 cuadraditos pequeos de 1/400 mm2 de superficie. Si los eritrocitos se han repartido homogneamente por toda la cuadrcula, se procede al contaje (en caso contrario tendra que repetirse la aplicacin a la cmara). Para sto se cuentan los eritrocitos en cinco cuadritos de cada uno de los cuadros grandes. En cada cuadradito se consideran dentro 10 de las clulas que estn sobre las

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lneas inferior y derecha, pero no se tienen en cuenta las que estn sobre las otras lneas. En total se habrn contado 5 ! 16 = 80 cuadraditos.

Clculo El volumen de lquido de la parte de la cmara donde se realiza el contaje es: 1/400 mm2 (rea de un cuadradito) ! 80 (nmero de cuadraditos) ! 0,1 mm (hondura cmara) = 0,02 mm3. El nmero de clulas por mm3 de suspensin diluida ser: nmero contado / 0,02 = nmero contado ! 50. La dilucin en la pipeta es de 1/200; por tanto, el nmero de eritrocitos por mm3 de sangre ser: nmero contado ! 50 (factor dependiente de volumen) ! 200 (factor de dilucin). Para expresarlo en millones de eritrocitos por mm3, lo nico que tendr que hacerse es dividir el nmero contado por 100.

B. Utilizando un contador de partculas

Los contadores de partculas utilizan el sistema Coulter, que es un sistema no ptico en qu una suspensin de clulas sanguneas circula a travs de una abertura al mismo tiempo que pasa un corriente elctrica. El paso de cada clula produce un cambio de impedancia (resistencia) en la abertura segn el tamao de la clula. El contador relaciona el tamao con el tipo de clula. El nmero de clulas contadas es unas 100 veces superior a las contadas en los recuentos microscpicos (manuales), con lo que se reduce el error. El nmero de pulsos elctricos indica el nmero de partculas que pasan por la abertura, y la medida de los pulsos es proporcional al volumen de las partculas. Los contadores Coulter hacen el recuento de eritrocitos, leucocitos y plaquetas por triplicado. Los contadores de partculas disponen de dos baos, uno de eritrocitos con una abertura de 50 "m y otro de leucocitos con una abertura de 100 "m.

Contaje de eritrocitos
En el bao de eritrocitos, estos son identificados como partculas de medida igual o superior a 36 fl.
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En este bao tambin se llevan a cabo el recuento de plaquetas (volumen entre 2 y 20 fl).

Contaje leucocitos
A continuacin las clulas son diluidas con diluente isotnico y pasan al bao de leucocitos, donde se aplica un agente que lisa los eritrocitos y leucocitos, de manera que quedan los ncleos de los leucocitos intactos (los eritrocitos no tienen ncleo) y las partculas con un volumen de 35 fl o ms son contadas como leucocitos.

Valoracin de Hb
Para la valoracin de la Hb, el agente lisante reacciona con la hemoglobina libre y el color resultante se lee a 525 nm. A partir de estos valores el contador tiene capacidad para calcular: Hc, VCM, HCM, CHCM

Hematocrito (Hc)
1. Resuspender clulas por inversin 2. Sumergir el capilar en la sangre por uno de sus extremos. Para favorecer la entrada de sangre conviene mantener el capilar casi horizontal. 3. Cuando falte medio centmetro para el llenado del capilar. Obturar el extremo con plastilina y limpiar sangre exterior. 4. Colocar los capilares en la centrfuga de microhematocrito de forma que el extremo 5. con la plastilina est en contacto con la goma de la rendija. 6. Ajustar bien la primera cubierta de la centrfuga. 7. Cerrar la centrfuga. Centrifugar durante 5-6 minutos.

Hemoglobina (Hb)
Se utilizar el mtodo de *Drabkin, que se basa en la conversin de la hemoglobina de una muestra de sangre en cianmetahemoglobina y la determinacin fotomtrica de sta. Previamente se habr de tener confeccionada una **recta patrn con cianmetahemoglobina comercial.

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*Drabkin: El reactivo de Drabkin que produce la conversin tiene la siguiente composicin : Ferrocianuro potsico 200 mg Cianuro potsico 50 mg Bicarbonato potsico 1 g Agua destiada qsp 1 l. Estable durante un mes a 4 C y en oscuridad. **Recta patrn Construccin de la recta patrn de la hemoglobina: [Hb] (g/dl) Solucin patrn (ml) H2O (ml) 5 0,25 0,75 10 0,50 0,50 15 0,75 0,25 20 1,00 0,00 De cada un de los viales coger los 20 "l correspondientes y medir la absorbancia. Ejemplo recta patrn: g Hb/dl sangre = (A540 0,0036) / 0,0301

El eritrocito como osmmetro

En diferentes tubos de ensayo es colocar 1 ml de cada cuna de las disoluciones siguientes de NaCl: 50 mM 150 mM 400 mM A continuacin, se aade 1 ml de sangre, mantenida incoagulada, a cada uno de los tres tubos y se deja en repos durante 1 minuto. Hay que agitar los tubos invirtindolos suavemente. Por capilaridad, se transfiere una muestra de cada sangre a los tubos capilares de microhematocrito y se valora el hematocrito en cada caso, relacionando el valor obtenido con la concentracin osmtica del medio en el cual se ha puesto en contacto la muestra inicial de sangre.

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Resultados

Tipos principales de anemias

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