UNIVERSIDAD EARTH

ESTUDIO TCNICO PARA LA PLANIFICACIN Y EL DISEO DE UN

LABORATORIO ARTESANAL PARA LA PRODUCCIN DE ORQUDEAS IN
VITRO
Mara Mercedes Mendieta Teller
Trabajo de Graduacin presentado como requisito parcial para optar al ttulo
de Ingeniera Agrnoma con el grado de Licenciatura
Gucimo, Costa Rica
Diciembre, 2002
Trabajo de Graduacin presentado como requisito parcial para optar al ttulo de
Ingeniera Agrnoma con el grado de Licenciatura
Profesor Asesor Humberto Leblanc, M. Sc.
Profesor Coasesor Hctor Medrano, Ph. D.
Decano Daniel Sherrard, Ph. D.
Candidata Mara Mercedes Mendieta Teller
Diciembre, 2002
ii
DEDICATORIA
A mi abuelo Jorge por haber formado una familia tan unida y ensearnos
con el ejemplo que el que persevera alcanza.
A la familia Teller por ser ejemplo de esfuerzo, perseverancia y amor.
A la familia Mendieta por ser ejemplo de sencillez, cario e inculcarme el
amor por la naturaleza.
A mi patria Nicaragua por quin quiero trabajar hasta verla libre.




iii
AGRADECIMIENTO
Agradezco a los profesores Humberto Leblanc y Hctor Medrano por su
colaboracin invaluable en este trabajo.
A NORAD por ser los impulsores de mis estudios en EARTH.
A las personas entrevistadas durante el proceso de obtencin de datos para
la elaboracin de este trabajo.
A mis amigos.
iv
RESUMEN
Las orqudeas, son una de las especies ms admiradas y apreciadas por la
majestuosa belleza de sus flores. Actualmente la produccin y venta de las
orqudeas es una de las actividades ms lucrativas dentro del mercado de plantas
ornamentales tanto en el mbito nacional como internacional. Esta situacin las ha
colocado en peligro de extincin debido a que son extradas de su hbitat natural
de una manera descontrolada.
Una de las formas ms eficaces para la reproduccin de orqudeas y evitar
la extraccin indiscriminada de esta especie es la micropropagacin.
Lamentablemente, esta tcnica no est al alcance del pequeo y mediano
empresario. Es por esta razn que surge la idea de realizar un estudio tcnico
para la planificacin y diseo de un laboratorio artesanal de orqudeas in vitro que
este al alcance del pequeo y mediano empresario.
Este estudio tiene por objetivo determinar el equipo y materiales
alternativos mnimos, necesarios para un laboratorio artesanal de
micropropagacin de orqudeas; adaptando la tecnologa convencional a las
condiciones artesanales de un pequeo o mediano empresario.
El estudio demostr que existen costos de un laboratorio convencional que
no podrn ser sustituidos en un laboratorio artesanal. Sin embargo, la mayor
reduccin de gastos se obtuvo al momento de sustituir un auto clave por una olla
de presin, la cmara de flujo laminar por una construida artesanalmente bajo los
principios de aislamiento y por sustituir el sistema de destilacin de agua por agua
hervida.
Palabras claves: laboratorio artesanal, cultivo in vitro, reduccin de costos.
MENDIETA, M. 2002. Estudio tcnico para la planificacin y diseo de un
laboratorio artesanal para la produccin de orqudeas in vitro. Universidad
EARTH. Gucimo, Costa Rica. 42 p
v
ABSTRACT
Orchids are one of the most admired species because of their beauty.
Presently, the orchid industry is one of the most lucrative among the ornamentals
market, both nationally and internationally. However, these species are becoming
endangered because of irresponsible extraction form their habitats.
There are several techniques for mass reproduction of orchids without
endangering their existence. One of the most effective ways is through tissue
culture propagation. However, this technique is very expensive, making it less
attractive and for small and medium scale entrepreneurs. The main goal of this
project was to design a small-scale laboratory for orchid tissue culture.
The study primarily focused on identifying the most essential equipment
needed to operate a small-scale laboratory to reproduce orchids, adapting
conventional technology to the conditions of a small or medium scale entrepreneur.
The study showed that there are some costs from a conventional laboratory
that cannot be replaced in a small-scale laboratory. Nevertheless, substituting a
pressure cooker for the autoclave, a small-scale chamber for the laminar flow
chamber, and substituting boiling water for the water distillation system could result
in a significant cost reduction.
Key words: Artesian laboratory, tissue culture propagation, cost reduction.
MENDIETA, M. 2002. Estudio tcnico para la planificacin y diseo de un
laboratorio artesanal para la produccin de orqudeas in vitro. Universidad
EARTH. Gucimo, Costa Rica. 42 p

vi
TABLA DE CONTENIDO
Pgina
DEDICATORIA ................................................................................................. III
AGRADECIMIENTO........................................................................................ IV
RESUMEN........................................................................................................ V
ABSTRACT...................................................................................................... VI
TABLA DE CONTENIDO................................................................................ VII
LISTA DE CUADROS...................................................................................... IX
LISTA DE FIGURAS......................................................................................... X
LISTA DE ANEXOS......................................................................................... XI
1. INTRODUCCIN............................................................................................... 1
2. OBJETIVOS...................................................................................................... 3
2.1. GENERAL ................................................................................................. 3
2.2. ESPECFICOS .......................................................................................... 3
3. REVISIN DE LITERATURA............................................................................ 4
3.1. BIOLOGA DE LA GERMINACIN DE SEMILLAS DE ORQUDEAS....... 4
3.2. FUNDAMENTOS DE LA GERMINACIN DE ORQUDEAS IN VITRO.... 4
3.3. INFRAESTRUCTURA DE UN LABORATORIO CONVENCIONAL DE
CULTIVO DE TEJIDOS............................................................................. 5
3.4. MEDIDAS DE ASEPSIA EN UN LABORATORIO..................................... 6
3.5. MEDIOS DE CULTIVO PARA ORQUDEAS............................................. 9
3.6. MICROPROPAGACIN DE ORQUDEAS.............................................. 10
3.6.1. Cultivo de meristemos............................................................... 10
3.6.2. Cultivo de semillas..................................................................... 11
4. MATERIALES Y METODOS........................................................................... 13
5. RESULTADOS................................................................................................ 16
5.1. DESCRIPCIN DEL PRODUCTO.......................................................... 16
5.2. LOCALIZACIN, TAMAO Y DESCRIPCIN DEL LABORATORIO
ARTESANAL ........................................................................................... 16
5.3. PRINCIPIOS TCNICOS DE TRABAJO IN VITRO DENTRO DEL
PROCESO PRODUCTIVO...................................................................... 18
5.4. TIEMPO Y MOVIMIENTO DEL PRODUCTO.......................................... 20
5.5. PERSONAL............................................................................................. 22
vii
5.6. TECNOLOGIA ARTESANAL................................................................... 22
5.6.1. Tecnologa artesanal para la cmara de flujo laminar ............... 25
5.6.2. Tecnologa artesanal para la esterilizacin ............................... 25
5.6.3. Tecnologa artesanal para los recipientes................................. 26
5.6.4. Tecnologa artesanal para la incubacin................................... 26
6. CONCLUSIONES............................................................................................ 27
7. RECOMENDACIONES ................................................................................... 29
8. LITERATURA CITADA................................................................................... 30
9. ANEXOS ......................................................................................................... 32

viii
LISTA DE CUADROS
Pgina
CUADRO 1. COMPOSICIN DE UN MEDIO PARA EL CULTIVO IN VITRO DE ORQUDEAS ............... 9
CUADRO 2. COSTOS DEL EQUIPO PARA UN LABORATORIO ARTESANAL.................................. 23
CUADRO 3. COSTOS DEL EQUIPO PARA UN LABORATORIO CONVENCIONAL ........................... 24

ix
LISTA DE FIGURAS
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FIGURA 1. FLUJOGRAMA DE LOS PROCESOS DENTRO DEL LABORATORIO............................... 21

x
LISTA DE ANEXOS
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ANEXO 1. MEDIO DE CULTIVO DE MURASHIGE Y SKOOG. MEDIO DE
CULTIVO DE KNUDSON. ............................................................................. 33
ANEXO 2. SUPLEMENTOS NO DEFINIDOS QUE SE PUEDEN AGREGAR
A LOS MEDIOS PARA EL CULTIVO DE ORQUDEAS ............................ 34
ANEXO 3. CAMARA DE FLUJO LAMINAR ARTESANAL.......................................... 35


xi

1. INTRODUCCIN
Las orqudeas han sido una de las plantas ms admiradas y apreciadas
desde hace muchos siglos por diferentes civilizaciones, debido a la belleza y
vistosidad de sus flores. Actualmente se conocen ms de 20, 000 especies,
repartidas en el mundo. La flora Latinoamericana cuenta con una gran variedad de
orqudeas, distribuidas en las costas, las sierras y las selvas, encontrndose en
mayor densidad en las zonas selvticas (Quinez, 2000).
En la actualidad, la deforestacin de nuestra selva y la extraccin
indiscriminada de estas plantas de tan majestuosas flores, debido al buen precio
que se obtiene de la venta de estas en los mercados nacionales como en el
extranjero, vienen ocasionando que una gran cantidad de orqudeas nativas se
encuentren hoy en peligro de extincin (Mckendrick, 2002).
Conservar no quiere decir no hacer uso de los recursos, sino saber como
usarlos y en que proporciones hacerlo para conservar y mantener la productividad.
Por tanto si queremos comercializar estas especies debemos primero asegurarnos
que no se agoten por causa de una extraccin irracional (Quinez, 2000). La
biotecnologa nos permite reproducir plantas y por ende salvar aquellas que estn
en peligro de extincin. Una de las formas ms eficaces para la conservacin de
cualquier especie es la propagacin in vitro (Mckendrick, 2002).
Se puede definir como cultivo in vitro el cultivo de plantas, semillas,
embriones, rganos, tejidos, clulas y protoplastos de plantas superiores sobre un
medio nutritivo en condiciones estriles (Pierik, 1989).
De manera general, se puede decir que la micropropagacin presenta
grandes ventajas sobre otros mtodos de propagacin vegetativa. Como por
ejemplo que permite el incremento acelerado del nmero de plantas por genotipo y
la reduccin del perodo de multiplicacin. Aumenta la capacidad de multiplicar
grandes cantidades de material en un espacio reducido, lo que permite un ahorro
1

considerable en espacio y energa (Pierik, 1989). De igual manera se pueden
enunciar ventajas ms especficas que se le pueden en el caso de las orqudeas
adjudicar a la micropropagacin, como el establecimiento de hbridos y el
mejoramiento de la industria y del comercio de orqudeas (Quinez, 2000).
Adems, no es necesario esperar a que la semilla presente su estado de madurez
para poder sembrarla si se hace en condiciones controladas como se hace en el
cultivo in vitro, ya que cuando la semilla ha alcanzado las tres cuartas partes de su
madurez se pueden sembrar y se evita as la contaminacin de la misma (Aguilar,
1998).
Lamentablemente la mayora de la tecnologa para la propagacin in vitro
de orqudeas se realiza con ayuda de laboratorios sofisticados, los cuales no son
factibles de ser instalados por el pequeo o mediano empresario. Por este motivo
la elaboracin de un estudio tcnico para montar un laboratorio artesanal de
propagacin de orqudeas constituye una gran oportunidad para el incremento de
la exportacin de productos no tradicionales para Latinoamrica, ms acordes con
los recursos disponibles de un pequeo y mediano empresario que comienza.
Es aqu donde surge la idea de realizar un estudio tcnico que ayude a la
planificacin y diseo de un laboratorio artesanal, para la reproduccin de
orqudeas in vitro, el cual permita propagar eficientemente estas especies y as
poder ayudar a la conservacin de las mismas.
2

2. OBJETIVOS
2.1. GENERAL
Disear un estudio tcnico que permita planificar y organizar un
laboratorio artesanal para la produccin de orqudeas in vitro.
2.2. ESPECFICOS
Determinar la infraestructura, equipo y materiales alternativos
mnimos, necesarios para un laboratorio artesanal de
micropropagacin de orqudeas.
Adaptar la tecnologa convencional existente para micropropagar
orqudeas, a las condiciones artesanales de un pequeo y mediano
productor o empresario.
3

3. REVISIN DE LITERATURA
3.1. BIOLOGA DE LA GERMINACIN DE SEMILLAS DE ORQUDEAS
Segn Mckendrick (2000), cuando las semillas de orqudeas germinan
producen una masa indiferenciada de clulas llamadas protocormo, las cuales
continan su crecimiento por varias semanas, meses o incluso aos hasta que
alcancen la edad apropiada para producir hojas y races. En el caso de orqudeas
terrestres, se requiere de la presencia de un hongo (micorriza) el cual sirve de
extensin de las races y por consiguiente para absorber nutrientes durante los
estados tempranos del ciclo de vida de la planta. Caso contrario en los
protocormos de orqudeas epfitas que forman esta asociacin.
Las semillas de orqudeas por su tamao tan pequeo, contienen pocas o
ninguna reserva para llevar a cabo su germinacin, prcticamente no presentan
endospermo por lo que al trabajar in vitro, deben suministrrsele los nutrientes
necesarios en los medios estriles (Pierik, 1990).
3.2. FUNDAMENTOS DE LA GERMINACIN DE ORQUDEAS IN VITRO
Mediante la germinacin in vitro, se reproducen semillas en frascos de
vidrio o plsticos sobre un medio nutritivo que contiene una fuente de carbono
(azcar) y nutrientes necesarios para que las semillas germinen y crezcan.
Existen dos tipos de germinacin in vitro: simbitica y no simbitica. En la
simbitica, las semillas se siembran con una pequea porcin del hongo micorriza
apropiado. El hongo crece en el medio, coloniza las semillas en el proceso de
germinacin y se origina una relacin simbitica que se espera alimente al
protocormo hasta que ste produzca hojas y se vuelva auttrofo. Esta es la
tcnica que da mejores resultados en propagacin de orqudeas terrestres en las
zonas templadas. Este mtodo tiene la ventaja de usar un medio simple, como
avena en polvo con una pequea cantidad de extracto de levadura. Este medio
4

produce plantas micorrizales ms fuertes y resistentes a infecciones que las
cultivadas asimbiticamente. Sin embargo, la desventaja de este sistema es que
se necesita obligatoriamente seleccionar el tipo de hongo adecuado para que se
origine la simbiosis y prevenir el parasitismo y consecuentemente la muerte de las
semillas (Mckendrick, 2000).
La germinacin no simbitica se realiza ms comnmente en orqudeas
tropicales. El medio que se utiliza para este tipo de germinacin es ms complejo,
ya que todos los nutrientes orgnicos e inorgnicos y los azcares deben estar
disponibles para las orqudeas en una forma apropiada puesto que no existe la
simbiosis con el hongo como en el caso de las orqudeas terrestres de zona
templada (Mckendrick, 2000).
3.3. INFRAESTRUCTURA DE UN LABORATORIO CONVENCIONAL DE
CULTIVO DE TEJIDOS
Todo laboratorio de cultivo de tejidos debe de contemplar en su planeacin
la norma elemental de asepsia. Para esto se requiere que el diseo de un
laboratorio se haga pensando en el aislamiento de las reas segn el uso que se
les asignar.
Segn Alvarenga (2002) un laboratorio de cultivo de tejido debe de tener las
siguientes reas de trabajo como requisito bsico para considerarse un buen
laboratorio:
Sala de preparacin de medios.
Dentro de esta sala se deben de preparar las soluciones madres y medios
de cultivo. En esta sala encontraremos reactivos, balanzas de precisin,
medidores de pH, agitadores magnticos, cristalera, sistemas de destilacin de
agua, refrigeradora, etc.
Sala de lavado y esterilizacin.
5

Esta sala debe de contar con autoclave, fregadero o pila, estantes,
detergentes, cepillos para botellas, esponjas para lavar cristalera, etc.
Sala de siembra.
Es necesario contar dentro de esta sala con una cmara de flujo laminar,
sistemas de extraccin de aire, mecheros, desinfectantes, bisturs, pinzas, etc.
Sala de incubacin.
En esta rea se requiere de estantes, sistemas de aire acondicionado para
le control de temperatura, termmetro, y un sistema de iluminacin (tubos
fluorescentes). El cultivo de orqudeas in vitro requiere de un ciclo de 16 horas luz
con una temperatura no mayor a los 26
0
C.
3.4. MEDIDAS DE ASEPSIA EN UN LABORATORIO
Dentro de un laboratorio de cultivo de tejidos es necesario manejar tcnicas
de esterilizacin y realizar todo tipo de manipulacin de la manera ms asptica
posible. Todo buen laboratorio toma en cuenta la asepsia desde el momento de su
diseo y construccin.
La razn principal por la cual todo laboratorio de cultivo de tejidos debe de
mantener las condiciones de asepsia es sin duda alguna que todos los medios
empleados contienen nutrientes, los cuales facilitan el crecimiento de muchas
bacterias y hongos. El crecimiento de dichos microorganismos provocara la
contaminacin del material vegetativo que deseamos reproducir (Leblanc, 2002)
1
.
La manera de combatir dichos microorganismos no deseados dentro de un
sistema de micropropagacin es mediante la eliminacin de sus clulas
vegetativas, esporas y otras estructuras reproductivas. Esto se logra gracias a la

1
LEBLANC, H. 2002. Comunicacin personal.
6

esterilizacin de medios, instrumentos y recipientes de cultivo, as como la
limpieza personal (Merino, 1988).
El mtodo ms comn de esterilizacin de medios de cultivo y cristalera es
la utilizacin del autoclave. Esto consiste en la destruccin del patgeno por altas
temperaturas, 120
0
C y 15 lb/in
2
. Es necesario que siempre se tome en cuenta ese
tiempo para evitar la sobre esterilizacin que produce la prdida de valor nutritivo
del medio y la caramelizacin de los azcares. El tiempo para los medios es de 20
minutos, para la cristalera es de 30 minutos a 120
0
C. Los instrumentos como
esptulas, pinzas, tijeras bisturs, etc se envuelven en papel aluminio para
someterlos a la esterilizacin, y luego se mantienen sumergidos en alcohol hasta
el momento de su uso (Merino, 1988).
El material vegetativo u rgano empleado tambin exige una desinfeccin
antes de comenzar a trabajarlo. El agente ms adecuado debe estar en
dependencia del material vegetativo u rgano con que se cuenta. Generalmente
se usan soluciones de hipoclorito de calcio o de sodio a concentraciones de 0.1 a
2 y 2 a 10 % respectivamente. Tambin puede utilizarse perxido de hidrgeno
(agua oxigenada), agua de bromo, nitrato de plata y cloruro mercrico. Estos
agentes desinfectantes posteriormente son enjuagados con agua destilada
(Merino, 1988).
El trabajo que se realiza en la sala de siembra debe de llevarse a cabo
dentro de un rea estril proporcionada por una cmara de flujo laminar. La
limpieza personal de cada uno de los operadores en la siembra y de los
empleados en general dentro de un laboratorio tambin es requisito fundamental
para que se logren niveles altos de asepsia. As que es necesario que el personal
utilice bata solo dentro del laboratorio para evitar contaminar la bata lo ms que se
pueda. El cabello en caso de mujeres que lo acostumbran largo debe de estar
recogido y para todo el personal en general es necesario que utilice una maya o
7

redecilla. Se requiere de mascarillas y botas de tela en caso que sea el rea de
siembra.
Puesto que la cmara de flujo laminar es el rea de mayor importancia al
momento de la siembra, es necesario al utilizarla seguir los siguientes pasos
descritos por McKendrick (2002):
Lvese las manos, fregndose bien las uas usando un jabn
antibacterial, squese y desinfctese las manos con alcohol.
Asegrese de estar utilizando la bata al momento de estar dentro del
rea de cultivo.
Desinfecte la cmara por completo usando alcohol al 70%. Usando
un atomizador y algodn limpie todas las superficies de la cmara,
incluyendo las paredes y el techo.
Todo lo que ingresar en la cmara debe de estar esterilizado. Los
frascos que se utilizarn para la siembra al igual que todos los
instrumentos a utilizar deben de haberse autoclavado y envueltos en
papel de aluminio hasta el momento de la siembra.
Recuerde que cualquier espora de bacteria u hongo dentro de la
cmara flotar hacia el exterior y en direccin a su persona. No
ponga las manos, las mangas u otro objeto sobre o en direccin de
algo desinfectado (como el medio). Mantenga movimientos leves y
evite crear turbulencia de aire que pueda ocasionar contaminacin.
No hable, tosa o estornude dentro de la cmara. Trabaje en lo
posible hacia el fondo de la cmara y minimice el tiempo de
exposicin de los medios cuanto sea posible.
Mantenga las condiciones de esterilizacin mediante la limpieza
regular de la cmara con alcohol, desinfecte nuevamente los
8

instrumentos luego de su uso y una vez en la cmara desinfctese
con alcohol despus de haber tenido contacto con cualquier objeto
fuera de la cmara. De manera especial, no se toque el cabello o la
cara.
3.5. MEDIOS DE CULTIVO PARA ORQUDEAS
Un medio para el cultivo in vitro de orqudeas, esta compuesto bsicamente
por: agua, sales minerales, azcar, vitaminas, y en algunos casos reguladores de
crecimiento (Cuadro 1). Adems hace falta un elemento que de consistencia la
medio que suele ser el agar o gelatina simple. En los laboratorios convencionales
existen se utilizan medios de cultivos ya preparados previamente por industrias en
cargadas de la rama (anexo 1) (Grupo Orquidefilo Canarias, 2002).
La adicin de extracto de levadura es muy beneficiosa, pues proporciona
vitaminas inusuales, algo de nitrgeno en forma de aminocidos y ologopptidos
(fragmentos muy cortos de protenas de entre 2 y 10 aminocidos), oligoelementos
y cofactores (Grupo Orquidefilo Canarias, 2002).
Cuadro 1. Composicin de un medio para el cultivo in vitro de orqudeas
Elementos Cantidad
Abono mineral 20-20-20 (sin urea) 1 g
Agar 8 g
Agua 1 L
Azcar comercial 10 g
Extracto de levadura 1 g
Complejo de vitamina B 1 ampolla
Otros aditivos (agua de coco, banano, etc) depende del aditivo
Fuente: Chavarri, Y. 2002
En los medios de cultivo para orqudeas tambin se usan suplementos no
definidos como el agua de coco que se filtra por medio de un filtro normal de caf
(20 ml por cada litro de medio), papilla de banano (muy fina) a razn de media
banana por litro 25 ml de zumo de pia natural filtrado, aunque pare este es
necesario controlar el pH, pues es muy cido y hay que corregirlo despus
9

necesitando por consiguiente de un pH-metro (Grupo Orquidefilo Canarias,
2002).
Para el Grupo Orquidefilo Canarias (2002) es necesario tomar en cuenta:
El agua de coco es mejor utilizada para la germinacin y el banano
para el desarrollo de plntulas. No usar los dos a la vez.
El banano como aditivo funciona muy bien (no debe de estar sobre
maduro, los que estn entre verdes y amarillos son ideales).
El agua a utilizar debe de ser destilada, aunque se podra usar agua
de lluvia que este bien limpia.
Si se usa vermiculita como soporte no se aade agar.
3.6. MICROPROPAGACIN DE ORQUDEAS
3.6.1. Cultivo de meristemos
El cultivo de meristemos de orqudeas permite producir plantas libres de
virus y patgenos, al igual que reproducir las caractersticas de la planta madre.
Para esto s asla el meristemo de la planta y se hace crecer en un medio nutritivo
estril (Muoz, 1998). Esta tcnica se utiliza cuando el material vegetativo
presenta ms de un meristemo y su utilizacin como explante, no involucra el
dao o prdida de la planta madre de la cual se tom (Muoz, 1998).
Segn Morel (1965) cada meristemo cultivado in vitro desarrolla brotes y
races o se dividen en dos o ms masas de tejidos, que al ser colocados en
diferentes secciones pueden proliferar para desarrollar ms plntulas.
El cultivo de meristemos es un mtodo efectivo para la eliminacin de
infecciones virales debido a que carece de tejidos vasculares que es por donde se
propagan los virus, adems que el meristemo apical tiene mayor velocidad de
10

crecimiento y en consecuencia el virus no alcanza los meristemos, otros factores
que interviene en la eficiencia de este tipo de cultivo es que en una clula
meristemtica el virus tiene mayor dificultad de acoplamiento con los ribosomas,
debido a que estas clulas tienen un cdigo de trabajo muy definido y que existe
una competencia por uso de algunos metabolitos entre clulas y virus (Grupo
Orqudeofilo Canarias,2002).
Por lo general los meristemos se cultivan sobre medios slidos a pH entre
5,4- 6,0. El contenido de sacarosa es de un 2-4 %. Se utilizan las vitaminas B1,
piridoxina, cido nicotnico y cido pantotnico, los reguladores que se utilizan en
bajas concentraciones (0,1-0,5 mg) son auxinas, citoquininas para promover la
divisin celular (Grupo Orqudeofilo Canarias, 2002).
Con respecto a la intensidad lumnica que deben de recibir los meristemas,
Morel (1965), recomienda desde 100 hasta 200 lux con un fotoperodo de 12 a 16
horas y un rango de temperatura de 22 a los 25
0
C.
3.6.2. Cultivo de semillas
Los hongos juegan un rol muy importante en la germinacin de las semillas
de orqudeas en condiciones naturales. Los hongos del gnero Rhizoctonia forman
una simbiosis con las races de orqudeas a la cual se denomina micorriza. La
micropropagacin de orqudeas por semillas permiti que se puedan reproducir
estas plantas sin necesidad de dicha simbiosis (Cuya, 2002)
Gracias a la utilizacin de la tcnica in vitro para la siembra de semillas la
coleccin de orqudeas va aumentando cada ao. Las razones de esta prctica in
vitro son, segn Pierik (1988):
Las semillas de las orqudeas son muy pequeas y contienen poca o
nada reserva alimenticia. Por lo tanto la germinacin tiene ms
probabilidades de xito in vitro.
11


En la naturaleza depende de una relacin simbitica con un hongo;
Sin embargo, in vitro es posible sustituir la accin del hongo por un
medio nutritivo.
Como resultado de un cruce se obtiene un limitado nmero de
semillas, eligiendo un medio nutritivo apropiado, se puede conseguir
que todos germinen in vitro.
La generacin y desarrollo tiene lugar de una manera ms rpida si
se realiza in vitro ya que se realiza en un ambiente acondicionado, y
sin competencia con hongos y bacterias.
Dependiendo de las especies las semillas crecen en cultivos diferentes sin
embargo deben contener al menos carbohidrato como fuente de carbono y
energa, minerales y agar como medio de soporte para algunos medios y
vitaminas, amino cidos, reguladores de crecimientos en otros. Los medios son
esterilizados en un autoclave. El cuarto de cultivo debe de estar condicionado con
las respectivas horas luz y temperatura.
12

4. MATERIALES Y METODOS
En este estudio tcnico, se realiz la planificacin y diseo de un laboratorio
de cultivo de tejidos artesanal. Para alcanzar los objetivos de este estudio,
primeramente se hizo la descripcin del producto que se deseaba obtener, luego
la localizacin y tamao del laboratorio, seguido de los principios tcnicos del
trabajo in vitro dentro del proceso productivo. Terminada esta primera etapa se
procedi a establecer el flujograma del producto, se estipul el tiempo y
movimiento del producto al igual que el del personal y se realiz la descripcin de
lo que sera el laboratorio artesanal y sus componentes. Finalmente se realiz una
comparacin de costos entre un laboratorio convencional y el artesanal
presentado en este estudio.
Para determinar la ubicacin del laboratorio artesanal se analizaron los
recursos con los que se contaban (terreno y construccin) para as minimizar
costos. Luego de determinar la ubicacin del terreno se procedi a buscar la
informacin adecuada mediante entrevistas personales, visitas a laboratorios, y
revisin de literatura que pudieran ser tiles para la planificacin y diseo del
laboratorio artesanal.
La recoleccin de datos e informacin a travs de investigaciones se realiz
en la biblioteca de la universidad EARTH, as como en los laboratorios de ciencias
naturales de la misma entidad. De igual manera se realizaron visitas a otros
laboratorios e invernaderos donde cuentan con los equipos necesarios para la
micropropagacin de orqudeas. Se cont con el apoyo de personas capacitadas
en la rama que aportaron con sus conocimientos en lo que respecta al cultivo de
tejidos, botnica y cultivo de orqudeas.
Para determinar los costos de los instrumentos necesarios para un
laboratorio convencional se hicieron cotizaciones a travs de visitas y llamadas a
empresas encargadas de la distribucin de instrumentos para laboratorios en
13

Costa Rica; tambin se investig el costo de los instrumentos y materiales que
podan sustituir a los tradicionales y que podran adaptarse a un laboratorio
artesanal y disminuir los costos.
Los laboratorios visitados fueron:
Taisuco de Costa Rica, S.A.
Cuenta con alta tecnologa para la micropropagacin. El laboratorio
se encuentra ubicado dentro de la zona franca Best, Costa Rica.
Invernadero Costa Brava
Es un laboratorio artesanal dedicado a la produccin in vitro,
aclimatacin y comercializacin de orqudeas. Se encuentra ubicado
en Orotina de Alajuela, Costa Rica.
Jardn botnico LANKASTER
Es un jardn botnico donde se muestra una gran variedad de
orqudeas. Esta ubicado en Cartago, Costa Rica.
Invernadero Lomas de San Isidro
Invernadero de orqudea. Est ubicado en San Isidro de Heredia,
Costa Rica.
Las personas entrevistadas fueron:
Ingeniera Agrnoma Yolanda Chavarri
Conferencista y asesora en la produccin y mantenimiento de
plantas ornamentales con gran nfasis en orqudeas.
Rodolfo Galvn
14

Encargado del laboratorio de cultivo de tejidos de la Universidad
EARTH
Celina Merino
Encargada de la parte de cultivo de tejidos dentro de la clase de
biotecnologa impartido en la Universidad EARTH.
Las cotizaciones se realizaron en:
AUDRN Y JIMNEZ, S.A.
Almacn El Gallo ms Gallo.
Importadora Monje.
Almacn el Verdugo.
15

5. RESULTADOS
5.1. DESCRIPCIN DEL PRODUCTO
El producto final que se desea obtener son plntulas de orqudeas para
exportacin que han sido producidas en un laboratorio de cultivo in vitro. Para la
obtencin de las plntulas se recolectan las semillas que pueden comprarse o bien
se puede tener un banco de semilla de donde obtenerlas, otra manera de obtener
las plntulas es por la siembra de meristemos. Una vez obtenido el material a
sembrar se prepara el medio de cultivo y se realiza la siembra. Las plntulas
finales habrn pasado todas sus etapas de desarrollo dentro del laboratorio.
5.2. LOCALIZACIN, TAMAO Y DESCRIPCIN DEL LABORATORIO
ARTESANAL
El laboratorio que se pretende construir fue planeado para estar al alcance
de un pequeo o mediano empresario. Por esto surge la idea de llamarlo
laboratorio artesanal.
El laboratorio estar ubicado en Managua, Nicaragua. En una zona
comercial, con vas pblicas y de fcil acceso al aeropuerto (25 minutos del
aeropuerto).
El laboratorio se dise basndose en una casa que actualmente no est
en uso. Se analiz para realizar las modificaciones necesarias y habilitarla como
un laboratorio.
El rea total del terreno es de 250 m
2
de los cuales 120 m
2
son de
construccin y sern los que se adaptarn a las reas y cuartos que tendr el
laboratorio.
16

El laboratorio artesanal que se diseo contar con las siguientes reas o
salas de trabajo. rea de recepcin, rea de lavado y desinfeccin de materiales,
bodega, cuarto de siembra, cuarto de incubacin, invernadero y rea de empaque.
El rea de recepcin con capacidad de trabajo para una persona estar
equipada con: un escritorio, 3 sillas, computadora, telfono y un archivador. La
funcin principal de esta oficina es la atencin de pedidos, y el control de compra
de materiales que bodega reporte como agotados, as como el control en general
de todos los movimientos internos de materiales y personal. En esta sala se
encontrara en la pared una especie de armario donde se colocarn las batas de
laboratorio, mascarillas (para rea de siembra), mayas para la cabeza y botas de
tela que el personal deber ponerse antes de ingresar a cualquier rea del
laboratorio. Esta es la nica rea que estar abierta al pblico, en el piso de la
entrada se encontrar una bandeja plstica con una sustancia desinfectante por la
cual toda persona que desee entrar debe pasar y desinfectar as los zapatos.
La sala de lavado con capacidad para dos personas estar equipada con
un lavadero, llave de agua potable, mueble de repisas (4 repisas) cada repisa de
maya o cedazo (para secar materiales), aqu se encontrar la hoya de presin que
suplir las funciones de un autoclave. Esta rea de lavado se ocupar igualmente
para la preparacin de los medios de cultivos, por tal razn se encontrar una
mesa de trabajo de madera forrada en su parte superior con una lmina de
aluminio, una refrigeradora donde se guardarn los medios y soluciones que
necesiten refrigeracin. Para guardar los materiales (vasos qumicos, probetas,
plato petri, etc.) se ocupar un armario con puertas.
La bodega ser un cuarto pequeo donde se encontrar un mueble estilo
armario para colocar todos los productos necesarios para la elaboracin de los
medios, algodn, alcohol, etc.
El rea de siembra ser un cuarto pequeo de paredes altas (al techo) pero
de vidrio que permitan saber cuando alguien est dentro de la sala ya que aqu se
17

maneja fuego y alcohol altamente inflamable. Esta sala con capacidad para dos
personas contar con una cmara de flujo laminar (artesanal), dos sillas, y aire
acondicionado, y sistema de luz fluorescente. En esta sala se realizarn todos los
trabajos de siembra, multiplicacin y establecimiento.
La sala de incubacin ser un cuarto cerrado, pequeo con estantes de
cuatro repisas donde se colocarn los frascos con las semillas o plntulas que se
desean desarrollar, cada repisa tiene por la parte de abajo luz fluorescente ya que
el cultivo necesita fotoperodos de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. La
habitacin contar con sistema de aire condicionado y un termmetro para control
de la temperatura la cual debe de ser de 26
0
C 1.
El piso de cada una de las salas anteriormente mencionadas ser de
cemento para evitar acumulaciones de agua u otra materia que pueda ser
hospedera de patgenos. Cada esquina de los cuartos se rellenar con cemento
con el fin de que no haya acumulaciones de basura, agua o cualquier sustancia
que produzca un hbitat ideal para la reproduccin de bacterias y hongos. Se
evitarn ventiladores que puedan esparcir esporas por todo el laboratorio, por tal
razn se instalaran aires acondicionados. La pintura de las paredes ser de color
blanca para facilitar visibilidad a la hora de que estn sucias y dar mayor claridad a
los cuartos.
5.3. PRINCIPIOS TCNICOS DE TRABAJO IN VITRO DENTRO DEL
PROCESO PRODUCTIVO
La tcnica de produccin in vitro puede ser dividida en cuatro partes. La
primera podra calificarse como la preparacin de la solucin del medio nutritivo en
donde se sembraran las semillas o meristemos. Para esto es necesario preparar el
medio de cultivo. Una vez preparado el medio de cultivo se distribuyen en los
frascos donde se sembraran las orqudeas y se tapan, luego se introducen en la
hoya de presin para esterilizarlos por 20 minutos. Los frascos ya esterilizados se
dejan enfriar antes de hacer la siembra por lo general el tiempo de enfriado es de
18

un da para otro por lo que se deja el material dentro de la hoya hasta el da
siguiente que se utilice.
Para la segunda parte que corresponde a la siembra se requiere que se
cumpla estrictamente con las normas de asepsia. Antes de comenzar la siembra
es necesario asegurarse que se cuenta con todos los materiales necesarios dentro
de la sala, una vez comenzada la siembra no se permite salir a buscar nada. El
piso de la habitacin debe estar limpio y desinfectado, para ello puede utilizarse
cloro. La cmara de flujo laminar debe desinfectarse (por completo) con alcohol
70% antes de comenzar la siembra, las pinzas y bisturs se colocan en dentro de
la cmara en un recipiente con alcohol, los mecheros de alcohol, encendedores y
los frascos de igual manera se introducen a la cmara. A diferencia de las dems
reas en esta se requiere que se utilice mascarilla. Las semillas o meristemos que
se sembrarn estn dentro de la cmara, tienen que ser desinfectadas
previamente. Aunque todo el trabajo se realizar dentro de la cmara que
remplazar la de flujo laminar se debe colocar una lmina de vidrio para trabajar
especficamente sobre ella. Las manos nunca deben ser apoyadas a la cmara.
Una vez listos y dispuestos a comenzar el trabajo se enciende el mechero de
alcohol. Los frascos a sembrar no deben de abrirse todos a la vez; si no nada ms
el que se utilizar. Al frasco donde se sembrara se le flamea la tapa de una
manera muy rpida y luego una vez abierto el frasco se flamea la boca. Las
pinzas, bistur a utilizar se flamea, con las pinzas se colocan las semillas o
meristemo dentro del frasco, otra vez se flamea el borde y se tapa. El bistur se
utilizar en caso que se desee remover algo de lo que se va a sembrar.
El cuarto paso dentro del trabajo de micropropagacin luego de la siembra
es la incubacin del material. Se llevan a un cuarto con condiciones controladas
de temperatura (261
0
C) y luz (16 horas luz y 8 horas oscuridad). Es necesario
estar en constante revisin de que el material no se haya contaminado, en caso
contrario es necesario sacar las muestras, autoclavarlas antes de abrir los frascos
y repetir todos los pasos desde la preparacin de medios para recuperar el
19

material perdido. Otra labor cultural que se realiza dentro de esta etapa es la de
subcultivar o dar mantenimiento y sirve para multiplicar. Esta tcnica de
mantenimiento se hace cuando las semillas o meristemos han germinado y
crecido hasta alcanzar medio centmetro de altura. Esta prctica consiste en
transplantar de 3 4 plntulas por frascos a un nuevo medio nutritivo. La rapidez
de germinacin y crecimiento depende de la especia aunque por lo general esto
toma de 1 1 mes para realizar el subcultivo (Merino, 2002).
Una vez cumplido el tiempo de desarrollo de las plntulas, estas
comenzarn su proceso de aclimatacin. Para esto se pasan a bandejas con
sustratos y se llevan al invernadero. Segn el tamao que vallan desarrollando se
van pasando a macetas ms grandes. El sustrato que se utiliza en las primeras
etapas de aclimatacin es aserrn y luego se cambia a fibra de coco. En esta
etapa es necesario estarle proporcionando a la plntula los elementos que
requiere para su desarrollo.
5.4. TIEMPO Y MOVIMIENTO DEL PRODUCTO
Lo primero que se debe de hacer es la recoleccin de las semillas o
meristemos que se desean sembrar (Figura 1). En caso de las semillas pueden
ser colectadas a partir de cpsulas verdes que estn madurando o ya maduras.
Las semillas colectadas deben de ponerse a secar, la manera ms prctica de
hacer esto es a temperatura ambiente en una habitacin seca. Una vez secas las
semillas pueden almacenarse por muchos meses en frascos cerrados dentro del
refrigerador a una temperatura de 4-5
0
C. El tiempo de maduracin de las semillas
varan segn la especie; Por ejemplo, especies como Epidendrum requieren
aproximadamente 3.5 meses para madurar, mientras que las semillas
Odontoglossum requieren alrededor de 18 meses (McKendrick, 2002).
El tiempo que se requiere para la preparacin del medio es de
aproximadamente 30 minutos, luego se coloca por 20 minutos en el autoclave y
se espera 1 hora para poder abrirlo.
20

El tiempo de la siembra est en dependencia de la rapidez y prctica del
operador y de la cantidad de semillas o meristemos que se deseen sembrar. Se
puede hacer un clculo a sabiendas que de un litro de solucin nutritiva salen 32
frascos de 30 ml cada uno. Para la siembra de meristemos se utiliza
aproximadamente 4 horas tomando en cuenta el tiempo que se toma la
desinfeccin entre cada siembra. etc. Para la siembra de semillas se hace en
menor tiempo.
El tiempo que el producto este en la sala de incubacin esta en
dependencia de la especie y si la planta est recibiendo las condiciones ptimas
para su desarrollo.













Escogencia del
material Desinfectarlo Almacenamiento
Preparacin de medio nutritivo
Desinfeccin de
materiales a utilizar
Siembra
Incubacin
Figura 1. Flujograma de los procesos dentro del laboratorio
21

5.5. PERSONAL
Para este laboratorio es necesario contar con una secretaria y dos
personas encargadas de preparar los medios de cultivo, siembra y lavado de
cristalera, etc. Estas personas sern capacitadas para ejercer sus funciones en
un rea especfica, por que dentro del laboratorio no existe la posibilidad de rotar
el personal. Las funciones de estas dos personas se definieron mediante la
experiencia personal adquirida dentro del laboratorio de Ciencias de la
Universidad EARTH.
5.6. TECNOLOGIA ARTESANAL
Los costos del laboratorio artesanal son menores a los de uno convencional
al sustituir algunos de los equipos que tienen mayores costos. El quemador
Bunsen se puede sustituir por uno estilo casero utilizando frascos con tapaderas
estilo Gerber, retazos de tela y alcohol. En el caso de una botella con gotero de
30 ml, se buscan botellas ya utilizadas que posean goteros sin importar la medida
ya que nicamente se requieren para la solucin cida o alcalina que ayuden a
regular el pH del medio. El papel parafina puede sustituirse por rollos de plstico
adhesivo de cocina, el mismo que se puede partir con tijera y sacar hasta tres
rollitos de uno solo. El agua destilada puede sustituirse por agua hervida o agua
pura certificada. El autoclave se cambia por una olla de presin de las que se
utilizan en las casas. La cmara de flujo laminar se puede construir como se
explic anteriormente (cuadros 2 y 3).
22

Cuadro 2. Costos del equipo para un laboratorio artesanal
$1 = 370 colones
Cant. Descripcin
Precio unit. en
colones Impuestos
Precio en
dlares
1 Balanza de precisin 1,011,840.00 0 2734.70
1 olla 20,000.00 0 54.05
1 pHmetro 349,103.00 0 943.52
1 Agitador magntico 40,488.00 0 109.43
1 Pinzas 12.7 cm largo, curvas 3,329.00 0 9.00
1 Pinzas 114 mm recta 2,879.00 0 7.78
1 Termmetro de mercurio 1,112.00 0 3.01
1 Beaker 50 ml 926.00 0 2.50
1 Beaker 100 ml 1,105.00 0 2.99
1 Beaker 150 ml 1,105.00 0 2.99
1 Beaker 250 ml 1,135.00 0 3.07
1 Beaker 600 ml 1,614.00 0 4.36
1 Beaker 1000 ml 2,582.00 0 6.98
1 Beaker 2000 ml 4,512.00 0 12.19
1 Pipeta volumtrica 10 ml 1,507.00 0 4.07
1 Pipeta volumtrica 50 ml 3,899.00 0 10.54
1 Plato Petri de vidrio 100*15 mm 1,678.00 0 4.54
1 Pizeta 500 ml 882.00 0 2.38
1 Pizeta 1000 ml 967.00 0 2.61
Total 1,450,663.00 3920.71
Fuente: Audrn y Jimnez S.A.
23

Cuadro 3. Costos del equipo para un laboratorio convencional
$1 = 370 colones
Cant. Descripcin
Precio unidad en
colones impuesto
Precio unidad
en dlares
1 Balanza de presicin 1,011,840.00 0 2734.70
1 pHmetro 349,103.00 943.52
1 Agitador magntico 40,488.00 109.43
1 Quemador Bunsen 15,531.00 41.98
1
Pinzas 12.7 cm largo
con punta curva 3,329.00 9.00
1 Pinza 114 mm recta 2,879.00 7.78
1
Termmetro de
mercurio 1,112.00 3.01
1 Beaker 50 ml 926.00 2.50
1 Beaker 100 ml 1,105.00 2.99
1 Beaker 150 ml 1,105.00 2.99
1 Beaker 250 ml 1,135.00 3.07
1 Beaker 600 ml 1,614.00 4.36
1 Beaker 1000 ml 2,582.00 6.98
1 Beaker 2000 ml 4,512.00 12.19
1
Pipeta volumtrica 10
ml 1,507.00 4.07
1
Pipeta volumtrica 50
ml 3,899.00 10.54
1
Plato petri de vidrio 100
* 15 mm 1,678.00 4.54
1
Botella con gotero 30
ml 551.00 1.49
1 Pizeta 500 ml 882.00 2.38
1 Pizeta 1000 ml 967.00 2.61
1
Papel parafilm 10
cm*76 mtrs 14,210.00 38.41
1 Destilador de agua 945,000.00 2554.05
1 Auto clave 2,046,000.00 5529.73
1 Cmara de flujo laminar 3,600,000.00 9729.73
Total 8,051,955.00 21762.04
Fuente. Audrn y Jimnez S.A.

24

5.6.1. Tecnologa artesanal para la cmara de flujo laminar
Para la siembra de semillas y meristemos se requiere de una cmara de
flujo laminar, debido a que esta es de alto costo (uno de los ms altos dentro de
los materiales del laboratorio) se requiere de una que al menos cumpla con la
funcin de aislar el cultivo y medio del entorno a la hora de la siembra. Para esto
se hace una caja de madera y vidrio puede estar por dentro forrada de lmina de
aluminio en la parte donde se encuentra la madera, de unos 40 cm de altura por
60 de ancho y 40 de profundidad (Anexo 3). En la parte frontal la cual es de vidrio
para mejor visibilidad (al igual que la parte superior), se hacen unos orificios
adecuados para introducir las manos a los que se les acoplan mangas largas que
dejen libre las manos para poder operar con mayor facilidad. El ancho de los
agujeros debe ser lo suficiente para brazos anchos o delgados. La manera ms
conveniente para la instalacin de los guantes es colocar bolsas largas pegadas
con cinta adhesiva al agujero por la parte exterior dejando una abertura al final
para las manos que en todo momento deben de estar desinfectadas con alcohol.
5.6.2. Tecnologa artesanal para la esterilizacin
Para la esterilizacin de los materiales se requiere de un autoclave que
igual que la cmara de flujo laminar representa un gran gasto. Para esto se
recomienda que se utilice ollas de presin, las mismas que se usan en nuestras
casas y bajo los mismos principios de seguridad.
Para evitar riegos de incendio las mesas de trabajo en un laboratorio
convencional estn recubiertas de un material especial antiinflamable; sin
embargo resulta costoso querer comprar este estilo de mesa para un laboratorio
artesanal, por lo que se recomienda se forren las mesas de trabajo con una lmina
de aluminio.
25

5.6.3. Tecnologa artesanal para los recipientes
Los frascos en los que se realizan la siembra y algunas prctica culturales
como el subcultivo si se compran resultan caros, por lo cual se recomienda
recolectar los que usualmente hay en las casas que son las de estilo Gerber, en
donde se venden alimentos para bebs. Es necesario que los frascos sean
tapados pero estas tapas tambin representan un costo por lo que lo ms comn y
de mejores resultados han sido taparlas con bolsas plsticas y sujetarlas con
hules.
5.6.4. Tecnologa artesanal para la incubacin
Los muebles para la colocacin de los frascos ya con el cultivo dentro,
pueden ser elaborados en una pequea fabrica de herrera ya que no necesitan de
ningn equipo en especial y pueden ser hechos localmente. A este mueble se le
deben hacer las conexiones necesarias para la instalacin del sistema de luces.
La luz que se debe de usar en el laboratorio es la fluorescente, esto debido
a que es la ms fra y no interfiere en el proceso de mantener la temperatura
adecuada para el cultivo.
El instrumento para la medicin de la temperatura dentro de la sala de
incubacin es un termmetro de mercurio.
La energa que se utilizar para este laboratorio es la que actualmente se
utiliza en la casa donde se instalar, esta es energa elctrica. Sin ninguna
objecin se puede catalogar el uso de la energa elctrica como una de las
materias primas de mayor importancia debido a que todos los procesos desde la
preparacin de medios, siembra e incubacin requieren exclusivamente de este
tipo de energa.
26

6. CONCLUSIONES
- El estudio tcnico demostr que es factible implementar un laboratorio
artesanal para el cultivo de orqudeas in vitro.
- El aspecto medular para la implementacin de este laboratorio artesanal,
result ser las condiciones de asepsia, sin las cuales el laboratorio no podra
funcionar.
- Dentro de las condiciones de asepsia se encontr que para reducir costos
y mantener la funcionalidad del laboratorio, era fundamental reemplazar la cmara
de flujo laminar por una artesanal y el autoclave para esterilizar por una olla de
presin.
- Muchos de los materiales utilizados en un laboratorio convencional,
pueden ser sustituidos por materiales de ms bajo costo, como por ejemplo se
puede sustituir el uso del destilador de agua por agua hervida y los recipientes de
cultivo por frascos de alimentos para infantes resistentes al calor (frascos
Gerber).
- Los costos ms altos de los equipos del laboratorio convencional los
dieron, la cmara de flujo laminar con 9,729 dlares, esta puede sustituirse por
una caja de madera y vidrio manteniendo el principio de aislamiento y resulta de
menor costo. En segundo lugar estuvo el autoclave con un costo de 5,529 dlares
pero puede sustituirse por una olla de presin con un costo de 54 dlares. En
tercer lugar est el sistema de destilacin de agua con un costo de 2,554 dlares,
el cual puede ser sustituido por agua hervida.
- El equipo de laboratorio mnimo necesario para un laboratorio
convencional dio un costo de 21,762 dlares, en cambio el equipo mnimo
necesario para el laboratorio artesanal dio un costo de 3,920 dlares.
27

- El laboratorio artesanal propuesto en este estudio, est al alcance del
pequeo y mediano empresario que desee incursiona en el mercado de orqudeas
in vitro.
- Aunque el objetivo de este laboratorio es la produccin in vitro de
orqudeas, el mismo puede ser utilizado para la micropropagacin de otras
especies.

28

7. RECOMENDACIONES
Para determinar la rentabilidad del laboratorio artesanal propuesto, es
necesario que se realice un estudio de factibilidad completo donde se tomen en
cuenta los estudios de mercado, financiero, de impacto social y el de impacto
ambiental.
29

8. LITERATURA CITADA
AGUILAR, M. 1988. Micropropagacin de cattleya dowiana y c. Skinneri Batem,
dos orqudeas de Costa Rica en vas de extincin. Congreso de la PCCMA,
XXIV Reunin, Costa Rica. 267p.
ALVARENGA, S. 2002. Laboratorio de Cultivo de tejidos. Instituto Tecnolgico de
Costa Rica. Escuela de Biologa. 64p.
AUDRN Y JIMNEZ S.A. Distribuidora Cientfica. Contacto personal. Tel. (00505)
277-2547. Telefax. (00505) 227-9270.
CHAVERRI, Y. 2002. Entrevista personal. San Jos, Costa Rica
CUYA, M. 2002. Micropropagacin de orqudeas in vitro. LA MOLINA. Per. En
Lnea.http://www.lamolina.edu.pe/FACULTAD/Agronomia/horticultura/propa
gacion/biotecnologia/cuya_resumen.htm
GALVN, R. 2002. Entrevista personal. EARTH. Costa Rica.
GRUPO ORQUIDEOFILO CANARIAS. Orqudeas su cultivo in vitro en el mbito
domstico. (en lnea). Espaa. Consultado el 11 de febrero del 2002
Disponible en: http://www.lanzarote.net/ogro/gocarticuloinvitrojmsv.htm
McKENDRICK, S. 2000. Manual para la germinacin in vitro de orqudeas. Ceiba
Foundation. USFQ. Quito, Ecuador. 76 p.
MERINO, C. 2002. Cultivo de tejidos. Material de curso. Biotecnologa, 2002
Universidad EARTH.
MERINO, M. 1988. Tcnicas de esterilizacin y manipulaciones aspticas. Material
de curso. Biotecnologa, 2002. Universidad EARTH.
MOREL, G. 1965. Tissue culture: a new means of clonal propagation of orchids.
Sin fecha. Mxico, D.F. Mxico.
MUOZ, A. 1998. Cultivo de mersitemas de tres especies de orqudeas y
evaluacin de un producto para su conservacin. Universidad de Costa
Rica. San Jos, Costa Rica. 77p.
PIERIK, R. 1989. Cultivo in vitro de plantas superiores. (en lnea) Consultado el 20
de marzo del 2002. Disponible en:
http://www.iztacala.unam.mx/temas/foropaea/02TB13la.htm
30

QUINEZ, M. 2000. Micropropagacin de orqudeas Peruanas a escala piloto.
Universidad Ricardo Palma. CONCYTEC. Lima, Per. 98 p.
RIVERA, G. 1998. Orqudeas. Generalidades y su cultivo. EFUNA. Heredia, Costa
Rica. 266p

31

9. ANEXOS

ANEXO 1. MEDIO DE CULTIVO DE MURASHIGE Y SKOOG. MEDIO DE
CULTIVO DE KNUDSON.
Medio de Murashige y skoog.
Nutrientes Gramos / litro
Nitrato de potasio - KNO
3
1.9
Nitrato de amonio - NH
4
NO
3
1.65
Cloruro de calcio - CaCl
2
0.44
Sulfato de magnesio - MgSO
4
.7H
2
O 0.37
Fosfato monobsico de potasio KH
2
PO
4
0.17
Sodio EDTA - Na EDTA 0.0373
Sulfato de hierro - FeSo
4
.5H
2
O 0.0278
Sulfato de manganeso - MnSO
4
.4H
2
O 0.0223
Sulfato de Zinc ZnSO
4
.4H
2
O 0.0086
Acido Brico - H
3
BO
3
0.0062
Yoduro de potasio KI 0.00083
Molibdato de sodio - Na
2
MoO
4
.2HO 0.00025
Sulfato de cobre Cu
3
O
4
.5H
2
O 0.000025
Cloruro de cobalto - CaCl
2
.2H
2
O 0.000025
Azcar 30
Fuente: Chavarria, 2002.
Medio de Knudson.
Nutrientes Gramos / litro
Nitrato de calcio - CaNO
3
1
Sulfato de amonio - SO
4
NO
3
0.5
Sulfato de magnesio - MgSO
4
.7H
2
O 0.25
Fosfato monobsico de potasio KH
2
PO
4
0.25
Sulfato de hierro - FeSO
4
.5H
2
0 0.025
Sulfato de manganeso MnSO
4
.4H
2
O 0.0075
Azcar 30
Fuente: Chavarria, 2002.


33

ANEXO 2. SUPLEMENTOS NO DEFINIDOS QUE SE PUEDEN AGREGAR A
LOS MEDIOS PARA EL CULTIVO DE ORQUDEAS

Nutrientes
Agua de coco 150 ml / l
Banano 50 g / l
Manzana 20 g / l
Agua de pipa 100 ml / l
Papa 100 g / l















34



ANEXO 3. CAMARA DE FLUJO LAMINAR ARTESANAL

Fuente: Grupo orquideofilo. 2002
Nota: Dimensiones en centmetros
35