INFORME # 3.

DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR EL MTODO NUMERO MAS PROBABLE NPM

INFORME # 3. DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR EL MTODO NUMERO MAS PROBABLE NPM

RESULTADOS DE LA PRCTICA

IDENTIFICACIN DEL ALIMENTO Nombre: Arepa casera. Empaque: No aplica. N lote: No aplica Fecha de vencimiento: No aplica

INDICADOR MICROBIOLGICO O PATGENO EVALUADO Coliformes Totales y Fecales. E coli Rango microbiolgico: No aplica para el NMP. Limite de NMP inferior 3.5 y superior a 120.

REPORTE MICROBIOLGICO Medios de cultivo y reactivos Caldo Fluorcult LMX (Peptona 10 g/l; Lactosa 10 g/l; Bilis de buey desecada 20 g/l; Verde brillante 0,0133 g/l; L-triptofano 1 g/l; 4metilumbeliferil-b-D-glucurnido 0,1 g/l.) Agua peptonada

Reactivo de Kovacs (p-dimetilaminobenzaldehdo 5%(p/v) en alcohol amlico o isoamlico con 2,5%(v/v) de HCl(c).

Temperatura de Incubacin: 35C Tiempo de Incubacin: 24 horas

COLIFORMES TOTALES DILUCIN/TUBO 1 10-1 10-2 10-3 + 2 + 3 + CODIGO 3 0 0

Los tubos positivos presentaron un color azul/verdoso y los tubos que dieron negativo conservaron el color del agar (transparente). REPORTE Segn el cdigo formado por la combinacin de tubos positivos y negativos se busco en la tabla estadstica del nmero ms probable (NMP), obteniendo el siguiente resultado: 23 NMP / gr de arepa. COLIFORMES FECALES Los tubos positivos fueron expuestos a luz ultravioleta y se adicionaron 2 gotas del reactivo de Kovacs, el cual permite que en los tubos que dan positivo para E.coli se forma un aro de color rojizo en la parte superior. DILUCIN/TUBO 1 10-1 10-2 10-3 + 2 + 3 + CODIGO 3 0 0

E. COLI= La prueba es positivo (+)

REPORTE Segn el cdigo formado por la combinacin de tubos positivos y negativos se busco en la tabla estadstica del nmero ms probable (NMP), obteniendo el siguiente resultado 23 NMP / gr de arepa.

ANALISIS DE RESULTADOS

La arepa es un alimento el cual posee una serie de caractersticas especiales, por su proceso de elaboracin. Primero que todo en el proceso de anlisis de la muestra se tom una porcin de arepa y se homogeniz en una solucin diluyente y se sembraron diluciones 10-1, 10-2 y 10-3, por triplicado respectivamente para evaluar el cambio de coloracin a azul verdoso, el cual result positivo en 3 de las nueve muestras, ya que el alimento a analizar presenta caractersticas que lo hacen ajeno a esta clase de microorganismos. (Coliformes totales, fecales) y en la revisin que se le efectu a los otros 6 tubos, todos conservaban una misma coloracin, que indicada la ausencia de Microorganismos indicadores (CT y CF). La presencia de E. COLI se pudo haber generado por las deficientes prcticas sanitarias del manipulador, teniendo presente que no usa implementos necesarios para la manipulacin de un alimento; la mesa de trabajo puede ser de madera lo cual es un foco de contaminacin y el sitio de trabajo es expuesto al ambiente donde frecuentemente pasan carros y personas. Este alimento (arepa) no es apto para consumo, ya que evidencia la presencia de E. COLI, lo cual puede generar una enfermedad gastrointestinal a los consumidores. La presencia de coliformes totales nos permite evaluar la calidad microbiolgica del producto aunque no siempre indican una contaminacin fecal. Los recuentos de coliformes fecales evidenciaron la contaminacin del producto ya sea por la materia prima utilizada o por fallas en el proceso de elaboracin antes de la venta al consumidor.

CONCLUSIONES

Se hizo un buen manejo de la parte instrumental de laboratorio para que los resultados obtenidos fueran de una excelente margen de confianza, pero la muestra que utilizamos mostr una contaminacin mnima por parte de los coliformes (T y F); y adems el medio estaba completamente asptico, facilitando mucho mas una buena elaboracin de un plan de trabajo organizado, pues se mantuvieron todas las superficies con buena limpieza y desinfeccin y todos los utensilios utilizados en la practica de la misma forma. Las arepas que se venden en la calle, poseen fuerte potencialidad para la transmisin de enfermedades gastrointestinales debido a que son alimentos extensamente manipulados. Podemos aplicar los coliformes como indicadores en deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricacin de los alimentos, adems, en la evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto y la evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e higinicas en el equipo.

Las bacterias coliformes, comprenden la E. coli y Enterobacter aerogenes. Ambos organismos son bacilos cortos, gram negativos que fermentan la lactosa con produccin gas. E. coli tiene su localizacin primaria en el tracto intestinal del hombre y de los animales, y de all su nombre coli, que deriva del colon. E. coli se encuentra normalmente en el tracto gastrointestinal de los animales, donde no suele causar enfermedad.

Los organismos coliformes son buenos indicadores de la calidad higinica de los alimentos, se basa en la experiencia positiva adquirida en el agua. El hallazgo de gran nmero de organismos el los alimentos y en el agua indica la polucin o contaminacin fecal. Ya que las enfermedades transmitidas por el agua generalmente son de carcter intestinal la presencia de polucin indica la posibilidad de que existan agentes etiolgicos productores de estas enfermedades.

CUESTIONARIO 1. Describa los diferentes mtodos para el recuente de CT y CF. METODO DEL NMP La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a zando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir 24 a 48 h. La bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioqumicas bsicas (IMViC) a las colonias tpicas. METODO DE FILTRACIN A TRAVS DE UNA MEMBRANA (MF) La muestra a analizar se pasa a travs de un filtro de membrana estril, que tiene las bacterias y luego el filtro se encuba en un medio de cultivo. Se deben tomar dos muestras de agua, las cuales deben ser tomadas en dos membranas y se incuban en agar Chapman TTC a 36 C y 44C, respectivamente. Despus de 21 horas de incubacin: - E. coli y Citrobacter spp presente colonias de color amarillo con el centro de color naranja. - Enterobacter spp forma colonias de color rojo y amarillo oscuro con el centro de color naranja. El medio es amarillo.

- Formulario de Klebsiella spp de color rojo o amarillo, pero sin centro. El medio es amarillo. El agar lactosa TTC con Tergitol 7 es un medio selectivo y diferencial, se utiliza para el control presuntivo de E. coli y coliformes en las aguas para el consumo humano por la tcnica de membrana de filtracin.

DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES POR CUENTA EN PLACA El medio selectivo a emplear es agar-lactosa-bilis-rojo violeta (ABRV). Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se desarrollan en ABRV, el cido producido por la fermentacin de la lactosa, ocasiona el vire del indicador rojo neutro y la precipitacin de las sales biliares por lo que las colonias son color rojo oscuro y generalmente estn rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas, de color rojo claro o rosa. Debe ponerse una sobre capa de medio una vez que las placas vertidas han solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, ms adecuadas para los coliformes. Para utilizar este mtodo se debe considerar: Si el alimento contiene mono o disacridos en altas concentraciones, stos pueden ser fermentados por otro grupo de microorganismos, generando colonias semejantes a las de coliformes. El medio no debe esterilizarse ni sobrecalentarse por lo que se debe utilizar antes de 3 h. a partir de su preparacin; en cuanto se disuelva el agar se debe colocar en bao de agua a 45 C para mantenerlo fundido, hasta el momento de utilizarlo. Debe ponerse una sobre capa de medio una vez que las placas vertidas han solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, ms adecuadas para los coliformes. El sobrecalentamiento del medio y las variaciones en las condiciones de incubacin, especialmente la incubacin prolongada, pueden ocasionar la formacin de colonias rojas de cocos Gram positivos. El rango estadstico para tener confiabilidad en el aspecto cuantitativo (de sensibilidad del mtodo) es de 15 a 150 UFC por placa. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se vierten los medios de cultivo en las cajas con las muestras de diluciones, no debe exceder de 20 minutos.

2. Mencione mnimo 4 ejemplos en los que es reglamentario hacer el recuento de CT y CF. Algunos de los alimentos reglamentarios para hacer el recuento de CT y CF en las pruebas microbiolgicas son: Plantas de agua Alimentos envasados para nios Agua potable Huevo pasteurizado Alimentos deshidratados para nios lactantes Mayonesa Mermelada 3. Qu otras aplicaciones tiene el mtodo de NMP? ENUMERACION BACTERIANA: EL NMERO MS PROBABLE EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia eficiente de estimacin de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluacin cuantitativa de clulas individuales no es factible. La tcnica se basa en la determinacin de presencia o ausencia (pos o neg) en rplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este mtodo es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la poblacin(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrn de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabilstica. Algunas de las ventajas del NMP son: (i) la capacidad de estimar tamaos poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede determinar la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en una muestra de suelo usando el mtodo de infeccin de plantas, (ii) provee una recuperacin uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados, (iii) determina slo organismos vivos y activos metablicamente, y (iv) suele ser ms rpido e igual de confiable que los mtodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros. En este ejercicio, se utilizar una variante de esta metodologa para estimar la densidad total de bacterias presentes en una muestra. El atributo particular a utilizarse ser la capacidad de microorganismos a formar colonias en medios slidos de crecimiento.

4. Enumere y describa la composicin de los medios de cultivo que se pueden utilizar para el recuento de CT y CF SIM Sulfato, indol y movilidad. Medio plano de color amarillo. Estado semislido. pH 7.3 + 0.2 Es un medio que se usa para determinar la formacin de sulfuro de hidrgeno, la produccin de indol y la movilidad en el diagnstico de Enterobacterias. (g/litro) Peptona de casena 20 g Peptona de carne 6.1g Sulfato de hierro y amonio 0.2g Tiosulfato de sodio 0.2g Agar 3.5g MIO Movilidad, indol, ortinina. Medio plano de color prpura. Estado semislido. pH 6.5 + 0.2 El Medio MIO es utilizado para la diferenciacin de Enterobacterias en base a su movilidad, capacidad para descarboxilar la lisina y la produccin de indol. Este medio tambin es conocido como Medio para Movilidad Indol y Ornitina. Edered y Clark as como Oberhofer y Hajkowsky desarrollaron el Medio MIO para poder observar las reacciones de movilidad, produccin de indol y descarboxilacin de la lisina simultneamente. Estas reacciones son determinantes para la identificacin de Enterobacterias. En este medio las peptonas proporcionan la fuente de carbono y nitrgeno. El extracto de levadura provee las vitaminas y cofactores requeridos para el desarrollo. La dextrosa proporciona la fuente de energa. El agar es adicionado para demostrar la movilidad. El prpura de bromocresol acta como indicador de cambios de pH facilitando la deteccin de la descarboxilacin de la lisina. (g/litro) Extracto de levadura 3.0 g Peptona de gelatina 10.0 g Peptona de caseina 10.0 g

L-Ortinina 5.0 g Dextrosa 1 g Agar 2 g Prpura de bromocresol 0.02g AGAR MCCONKEY Medio diferencial para la deteccin, aislamiento y enumeracin de bacterias coniformes y patgenas intestinales en aguas, productos lcteos y muestras biolgicas. Su accin diferencial esta basada en que los microorganismos capaces de fermentar lactosa producen una cada de pH, junto con una absorcin del colorante, apareciendo en la colonia el color rojo, las colonias de microorganismos que no fermentan la lactosa permanece incolora. Pancretico digestivo de gelatina- 17g Pancretico digestivo de casena- 1.5g Peptona de tejido animal- 1.5g Lactosa- 10g Sales Biliares- 1.5g Cloruro Sdico- 5g Rojo Neutro- 0.03g Cristal Violeta- 0.001g Agar- 13.5g pH 7.1+- 0.2 a 25 grados AGAR LEVINE Medio para el aislamiento y la diferenciacin de los Escherichia coli y Enterobacterias, fermentadores de lactosa y no fermentadores de lactosa y para la identificacin rpida de los albicans. (g/litro) Peptona pancretica- 10g Lactosa - 10g Fosfato Dipotsico- 2g Agar- 15g Eosina- 15g Azul de metileno- 0.065g pH 7.1+- 0.2 a 25 grados EMB Este medio (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

(g/litro) Peptona 10g Lactosa 5g Sacarosa 5g Fosfato dipotsico 2g Agar 13.5g Eosina 0.4g Azul de metileno 0.065g Para escherichia coli se observan colonias con brillo metlico y centro negro azulado

AGAR VERDE BRILLANTE. Medio para crecimiento selectivo y numeracin de grmenes mediante determinacin del titulo de E. Coli en agua, leche, alimento y otros materiales, la bilis inhibe notablemente el crecimiento de la flora contaminante incluso clostridios degradadores de lactosa con formacin de gas, es un indicativo de la presencia de E. Coli. En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de nitrgeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo fenol es el indicador de pH, que vira al amarillo cuando hay produccin de cido a partir de la fermentacin de azcares, el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el verde brillante acta como agente selectivo. (g/litro) Pluripeptona 10g Extracto de levadura 3g Cloruro de sodio 5g Lactosa 10g Sacarosa 10g Rojo fenol 0.08 Verde brillante 0.0125 Agar 20g pH final: 6.9 0.2 Escherichia coli ATCC 25922: las colonias se presentan Amarillo-verdosas sobre fondo amarillento AGAR ENDO O EMB VERDE BRILLANTE

COLONIAS CON METALICO: Escherichia coli Otras coliformes COLONIAS BLANCAS: Salmonella Shigella Proteus Pseudomonas

BRILLO

COLONIAS VERDES: Escherichia coli Otras coliformes COLONIAS ROJAS Salmonella Shigella Proteus Pseudomonas

AGAR CHROMOCULT Agar selectivo para la identificacin simultanea de coliformes totales y E.coli. Gracias a la accin conjunta de peptonas selectivas, piruvato y tampn de fosfatos se garantiza un rpido crecimiento tambin de coliformes con daos subletales. El contenido de lauril sulfato inhibe ampliamente el crecimiento de bacterias grampositivas, sin tener influencia sobre el crecimiento de coliformes. (g/litro) Peptona 3g Cloruro sdico 5g Dihidrogenofosfato potsico 1.7g Dihidrogenofosfato dipotsico 3g Piruvato sdico 1g Triptfano Agar-agar 21g Lauril sulfato sodico0.1 Mezcla cromgenos 0.2g CALDO BRILLA Caldo-verde-brillante-bilis- lactosa Para el enriquecimiento y numeracin de escherichia coli. La bilis y el verde brillante inhiben notablemente el crecimiento de la flora indeseable acompaante. la fermentacin de lactosa con formacin de gas, que es indicativo de la presencia de e. coli, se demuestra mediante campanas de DURHAM. Los restantes coliformes tambin crecen en este medio pero casi siempre sin formacin de gas. (g/litro) Peptona 10g Lactosa 10g Bilis de buey desecada 20g Verde brillante 0.0133

CALDO LACTOSA Medio de cultivo exento de sustancias inhibidoras para el ensayo previo orientado a bacterias coliformes especialmente E.coli. La utilizacin de lactosa se demuestra por la formacin de gas, que se recoge en campanas de DURHAM. (g/litro) Peptona de gelatina 5g Extracto de carne 3g Lactosa 5g CALDO LAURIL SULFATO Medio recomendado para deteccin y recuento de coliformes en aguas, aguas residuales y alimentos. Medio rico en nutrientes, que permite un rpido desarrollo de los microorganismos fermentadores de la lactosa, an de los fermentadores lentos. La Triptosa es la fuente de nitrgeno, vitaminas, minerales y aminocidos, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico Es un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la flora acompaante. Por la fermentacin de la lactosa, se produce cido y gas, ste ltimo se evidencia al utilizar las campanas Durham. (g/litro) Triptosa 20g Lactosa 5g Cloruro de sodio 5g Lauril sulfato de sodio 0.1g Fosfato dipotsico 2.75 Fosfato monopotsico 2.75 pH final: 6.8 0.2 Para recuento de coliformes totales, tcnica del Nmero Mas Probable 5. Describa el procedimiento para la identificacin de Escherichia coli a partir de los tubos mltiples usados en el recuento de CT y CF. E. Coli y Coliformes Principios. Las investigaciones ecolgicas han puesto de manifiesto que E. Coli, procede del intestino de hombre y de los intestinos de los animales de sangre caliente, si bien puede sobrevivir y aun multiplicarse en determinados substratos. Del origen fecal de E. Coli, se concluye que si esta bacteria se encuentra en algn

alimento ello indica que han tenido lugar una contaminacin de origen fecal y que, consiguientemente, existe el riesgo de que hayan llegado al alimento en cuestin microorganismos patgenos de procedencia enterica.

En los alimentos que han sido sometidos a un tratamiento de higienizacin eficaz, que asegura su inocuidad para el Consumidor, por lo general, la determinacin de coliformes o grmenes del grupo coliaergenes: grmenes que, incubados a 37 C, fermentan la lactosa con produccin de gas en un medio, con verde brillante y 2 % de bilis. Ya hemos sealado antes que esta determinacin no tiene necesariamente relacin con una contaminacin de origen fecal y consiguientemente, con la posible presencia en los alimentos de microorganismos patgenos de procedencia entrica, sino que es slo una indicacin de deficiencias o fallos en el tratamiento industrial de los alimentos. Se utiliza a veces tambin la denominacin "coliformes fecales" refirindose a los microorganismos que crecen y producen gas a partir de la lactosa en un medio que contiene sales biliares u otros agentes selectivos, equivalentes y que se incuba a 44-45.5 C. Metodologa.-E.coli. La determinacin de este microorganismo en los alimentos no presenta problemas analticos especiales. Cuando su nmero supera claramente la cifra de I/ml de I0/gr, en el Caso de un alimento slido, puede ensayarse una tcnica de recuento directo. Se ha demostrado sin lugar a dudas que la utilizacin del agar de MacConkey a 44 0,1C, en anaerobiosis es el mtodo de eleccin de las colonias obtenidas en este medio, una proporcin adecuada, entre 3 y 10 por placa o bolsa, se someten a la prueba de Mackenzie-Taylor-Gilbert (MTG): formacin de gas a partir de la lactosa en caldo verde brillante bilis lactosa Y produccin de endol a partir de pptidos conteniendo triptfano, en ambos Casos a 44C. Cuando el nmero de clulas de E. coli en los alimentos sea muy inferior al sealado ms arriba, procede realizar las pruebas de presencia o ausencia o una determinacin por el mtodo del NMP. Tambin en estos casos se cuenta con una tcnica fiable. Primero se lleva a cabo el enriquecimiento en el clsico caldo lactosado bilis verde brillante y despus agar de MacConkey que se incuba a 44C. Coliformes-Metodologa. Como ya hemos sealado repetidamente, el grupo coli-aerogenes no est definido de una manera precisa. Por lo tanto los resultados dependen en gran medida del mtodo utilizado. La razn de la conveniencia de esta determinacin, de sus partidarios, reside en una mayor facilidad de ejecucin. Existen dos tcnicas perfectamente estandarizadas tanto para el recuento directo de Ufc del grupo coli-aerogenes como para la prueba de presencia o ausencia (PA). Las primeras emplean un agar tipo bilis lactosa de MCConkey y sus modificaciones. La segunda hace uso de un caldo bilis verde brillante lauril

sulfato lactosa. La temperatura de incubacin varia de 30 a 37 "C. Los niveles de identificacin aplicados (presuncin, confirmacin Y terminacin o pruebas finales). BIBLIOGRAFIA

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