RECUENTO DE SALMONELLA EN HUEVO

El huevo es un alimento con un excelente valor nutricional. As como es rico en nutrientes para el ser humano, lo es tambin para los microorganismos, ya que stos eligen medios apropiados para desarrollarse y el huevo puede ser uno de ellos. La salmonella es una bacteria que puede estar presente en numerosos alimentos y por el aire, en las manos y en la materia fecal. Pero si vamos al estudio de dicha bacteria siempre nos vamos a referir al huevo porque es uno de los ms ricos en nutrientes y cuenta con las condiciones ptimas de desarrollo de la salmonella. La presencia de Salmonella en el huevo de la gallina permite inferir contaminacin en el tracto intestinal del animal que pasa de ste a los huevos por medio de la llamada contaminacin transovrica (contaminacin generada en las glndulas productoras de huevo por su cercana con otros rganos contaminados). Cuando los resultados son negativos, como en nuestro caso, se puede presumir ausencia de este tipo de contaminantes en el alimento del animal que hubiera podido comenzar la reproduccin y una cadena de contaminacin con un final indeseado.

RESULTADOS Anlisis: identificacin de Salmonella en muestras de huevo de gallina crudo. Pre-enriquecimiento no selectivo: Se sumergi el huevo (con cscara) en 225 ml de agua peptonada, con una cuchara se mezcl all adentro y se llev a la incubadora 24 horas a 37C.

Enriquecimiento selectivo: Se inocul 1ml de la mezcla de agua peptonada y huevo y se llev a un tubo que contena 10 ml del medio de enriquecimiento selectivo (Caldo Rappaport), el cual posteriormente fue llevado a la incubadora 24 horas a 37C

Aislamiento: Se tom con un asa previamente esterilizada un poco del medio de enriquecimiento selectivo y se sembr por agotamiento en caja con agar S-S, finalizando con una estra para aislar de una mejor manera el microorganismo, posteriormente fue llevado a la incubadora 24 horas a 37C.

Identificacin: Las colonias visualizadas no cumplan con la descripcin dada, para afirmar que era salmonella positiva, las cuales son (Negras con borde transparente). Observe las colonias lactosa negativa y sulfuro + tpicas de Salmonella, en cambio crecieron colonias blancas, cremosas, un poco opacas caractersticas de otra clase de aerobio mesofilo o enterobacteria, indicadores de contaminacin microbiolgica en el alimento. Por lo cual podemos decir que el huevo analizado es salmonella negativo, y que no posee este microorganismo como indicador de calidad del producto. (Ausencia de salmonella)

ANALISIS DE RESULTADOS Como se podemos deducir, los resultados obtenidos estn por fuera del rango permitido o aceptado para su utilizacin en la formulacin de un resultado. El rango permitido para este tipo de microorganismos fija lmites en 30 y 300 UFC, lo que nos impidi continuar con el procedimiento fijado inicialmente por el protocolo del laboratorio. Las pocas colonias que crecieron en la placa con agar no presentaron las caractersticas descritas por la literatura en cuanto a su color negro y borde brillante o grisceo. Esto indica que el procedimiento realizado no fue idneo para permitir el crecimiento de las colonias de Salmonella. Este resultado nos permite inferir que la muestra estudiada no presenta contaminacin significativa por parte de Salmonella. Recordemos que este tipo de microorganismos, a pesar de ser patgeno, en pequeas concentraciones es inofensivo y es necesario que exista cierta cantidad de ellos en un organismo humano. En el caso especfico de la Salmonella, es necesaria una inoculacin relativamente grande, entre 10 y 100 millones de microorganismos, para provocar sntomas de su infeccin en personas saludables. Si llevamos los resultados a trminos de dilucin, podemos identificar que no es posible utilizar un exponente de 10 que sea mayor a 2 para el resultado presentado en las placas. Es decir, el resultado obtenido tampoco alcanza a determinar la presencia de una cantidad de microorganismos potencialmente peligrosa para la salud humana. Este resultado indica que las condiciones del animal productor del huevo y consecuentemente de los que con l conviven y del criadero donde se encuentran, son adecuadas para la produccin de huevo de gallina, teniendo en cuenta que el tipo de microorganismo ms comn en este tipo de animales y plantas productoras es la Salmonella. La presencia de Salmonella en el huevo de la gallina permite inferir contaminacin en el tracto intestinal del animal que pasa de ste a los huevos por medio de la llamada contaminacin transovrica (contaminacin generada en las glndulas productoras de huevo por su cercana con otros rganos contaminados). Cuando los resultados son negativos, como en nuestro caso, se puede presumir ausencia de este tipo de contaminantes en el alimento del animal que hubiera podido comenzar la reproduccin y una cadena de contaminacin con un final indeseado. La presencia de una pequea cantidad de microorganismos en la muestra no permite generar tranquilidad y total aceptacin. Por el contrario, presume una potencial contaminacin como efecto de un descuido que se pueda producir en la manutencin, procesamiento, transporte y almacenamiento del huevo y de su madre. Es una voz de alarma que llama a estar pendiente de cada una de las condiciones de inocuidad que se manejen durante el proceso productivo para evitar cualquier falla que permita la reproduccin en masa del microorganismo latente presente en el producto. No cabe, en este tipo de resultados, descartar la posible contaminacin de los manipuladores en el laboratorio o en el manejo del producto de trabajo previo a la realizacin del mismo. Es por eso que se reitera el llamado a conservar las buenas condiciones del laboratorio y del procedimiento como tal, as como de las condiciones de limpieza del manipulador y de su aseo personal.

CONCLUSIONES

La muestra de huevo evaluada no present contaminacin significativa de Salmonella que pueda generar complicaciones de salud en las personas que la consuman. La prueba realizada en el laboratorio es slo una de una serie de pruebas que se realizan a este producto. Normalmente, para el huevo de gallina se realiza una prueba rpida (comnmente conocida como prueba de campo), por personal competente en el mismo gallinero antes de ser embalado el producto. En el anexo se presentan los pasos de la prueba en mencin, que es la ms utilizada para este tipo de producto especfico como ya se mencion. Los huevos de gallina recin puestos no suelen estar contaminados, s bien algunos microorganismos pueden ganar acceso a stos a travs del oviducto. Los microorganismos presentes en el interior del huevo proceden principalmente del tracto intestinal de las aves, el ponedero, el polvo, las cajas de embalaje y almacenamiento, y pueden penetrar a travs de los poros del cascarn si ste se encuentra caliente y se contamina con materia fecal fra, entonces los grmenes pasan al interior, conforme este territorio se va enfriando. Los principales puntos de control para la produccin de huevos y productos avcolas con buenas condiciones de salubridad se encuentran principalmente en el propio recinto de reproduccin. Las aves infectadas, el alimento, los roedores y otras aves son los principales agentes de traspaso del microorganismo a los corrales y los que propician la contaminacin de la Salmonella. stos son los puntos crticos que se recomienda controlar en la produccin de huevos y aves. Algunos factores que afectan el crecimiento, muerte y/o sobrevivencia de la salmonella pueden ser la actividad de agua afecta el crecimiento de Salmonella siendo el lmite inferior de 0.94 y puede sobrevivir por aos en alimentos con aw bajo (chocolate, pimienta, gelatina), adems el pH mnimo es de 3.8. Cuando el pH excede el ptimo, el crecimiento disminuye. La muerte ocurre cuando los lmites extremos son sobrepasados, incluyendo la naturaleza del cido orgnico. La nica va de penetracin de la Salmonella en el cuerpo humano es por va oral, por lo que es muy importante el anlisis a todos los dems alimentos, aparte del huevo, que presenten peligrosidad y sean conocidos como transportadores potenciales de ste microorganismo.

CUESTIONARIO

1. Justifique el uso del paso de Pre-enriquecimiento, en lugar de simplemente colocar su muestra en el caldo de enriquecimiento selectivo, sabiendo que el medio de pre-enriquecimiento es caldo nutritivo el cual permite que crezca una amplia cantidad de microorganismos. El pre-enriquecimiento tiene como objetivo el desarrollo general de microorganismos del tipo similar a aqul que estamos buscando que se desarrolle. Todos aquellos microorganismos que no son del mismo grupo (en el caso de Salmonella, aquellos diferentes al grupo Enterobacteriaceae) suelen ser inhibidos o tienen crecimiento marginal durante este paso. Los caldos ms usados suelen ser el Lactosado, el Agua Peptonada Bufferada y el Caldo Soya Tripticasena. El pre enriquecimiento o enriquecimiento no selectivo suele hacerse solamente cuando los m.o. buscados estn debilitados o daados y se usan siempre medios nutrientes lquidos, no selectivos. En el caso del agua peptonada (pH 7.2) sta asegura la mantencin del pH durante 24horas, lo que sumado al perodo de incubacin permite el incremento de clulas que son sensibles a la disminucin del pH. A stos medios se les puede adicionar sustancias que contrarresten las sustancias inhibidoras que estn presentes en algunos alimentos; as mismo se debe asegurar el pH que es un factor muy importante para el crecimiento de Salmonella.

2. Investigue todas las posibles pruebas bioqumicas que se pueden hacer a un cultivo presuntivo de Salmonella

INDOL La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs descrito ms adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano. ROJO DE METILO - VOGES-PROSKAUER (RM VP)

Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen dos tipos

generales: la fermentacin cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixto. UTILIZACIN DE CITRATO

La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

DESCARBOXILACIN DE LISINA Y ORNITINA

El caldo descarboxilasa de Moeller es el medio base ms comnmente usado para la determinacin de las descarboxilasas en enterobacterias. Se prepara un tubo con el medio conteniendo el aminocido a ensayar y un tubo control con medio base sin aminocido. Se cubren con una capa de aceite mineral (vaselina lquida) para hacer el medio anaerobio de manera que ocurra la fermentacin de la glucosa que contiene. Durante las primeras etapas de la incubacin en ambos tubos se observar viraje del indicador de pH del medio al cido, por la fermentacin de la glucosa. Luego, si el aminocido es descarboxilado, se forman aminas que provocan un retorno al color original del medio o un viraje al alcalino. FENILALANINA DESAMINASA

La prueba de la fenilalanina se basa en la deteccin del cido fenilpirvico luego del desarrollo del m.o. en un medio que contiene fenilalanina. Para eso se agrega cloruro frrico que forma un complejo de color verde con el cido fenilpirvico. El medio de cultivo no puede contener extractos de carne o peptonas por su contenido variable en fenilalanina.

TSI (TRIPLE SUGAR IRON)

Al crecer un m.o. en el TSI, el pico tiende a virar al pH alcalino (color rojo por el rojo fenol) por la produccin de aminas, debido a la utilizacin aerobia de las peptonas. En el fondo del tubo -donde no hay oxgeno- la degradacin de peptonas es menor y no se generan aminas, de manera que se pueden detectar la produccin de pequeas cantidades de cido (color amarillo por el rojo fenol). Si se inoculan m.o. no fermentadores no se formarn cidos, pero por la produccin de aminas en el pico, todo el medio quedar rojo. LIA (Lysine iron agar) Durante las primeras etapas de la incubacin el fondo virar el indicador de pH del medio al cido (amarillo) por la fermentacin de glucosa. Luego, si el aminocido es descarboxilado se formarn aminas que provocan un retorno al color original del medio o hacia un viraje al bsico (color violeta). En la desaminacin se produce un cido carboxlico y NH3 y se visualiza en la superficie la aparicin de un color rojo intenso. La produccin de H2S a partir de tiosulfato se visualiza por la precipitacin de sulfuro ferroso de color negro.

MIO (semi slido, picadura, una 3ra parte del tubo) MALONATO (liquido se inocula). UREA, (es liquido por lo que se toma la colonia para analizar y se inocula en el caldo)

3. Cual podra ser la ventaja de hacer aun ms pruebas bioqumicas que el nmero que se hizo en el laboratorio. Debemos tener en cuenta que al realizar mas pruebas bioqumicas a una siembra presuntiva de algn microorganismo en el laboratorio, se determinara con mayor grado de seguridad la presencia exacta de un microorganismo a estudiar. Tambin debemos pensar que debido a la gran variedad de pruebas bioqumicas para algunos microorganismos se puede determinar la actividad de una va metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo.

4. Discuta cmo este extenso proceso de identificacin de Salmonella podra impactar en las prcticas de distribucin en productos alimenticios en una planta.

Primero que todo se debe tener en cuenta que este extenso proceso de investigacin podra sobrepasar los costos de produccin, tambin el tiempo de produccin se incrementara, dando as una tardanza a la hora de la distribucin del producto a la poblacin consumidora. Y a parte de todos estos problemas ocasionados al interior de la planta se aadira los problemas entre los operarios y los laboratoristas, ya que acosaran mutuamente para saber si el producto puede salir al pblico o no, adems podra tomarse en cuenta el incumplimiento de trminos y el despido inmediato de las personas a cargo de la produccin.

5. Por qu es importante empezar el paso de las pruebas bioqumicas con una colonia bien aislada de la caja de agar selectivo?

Es importante empezar el paso de las pruebas bioqumicas con una colonia bien aislada de la caja de agar selectivo ya que esta colonia aislada se encuentra lo suficientemente pura para la determinacin de el microorganismo a estudiar, pues las colonias no aisladas estn compuestas de varios microorganismos que harn que las

pruebas bioqumicas nos queden mal realizadas, adems se debe tener en cuenta es que la salmonella es una bacteria mvil y se desplaza hacia los bordes exteriores de la caja de sembrado en el medio selectivo.

6. Tuvo usted dificultad para interpretar los resultados de las pruebas bioqumicas? Podra el nivel de experiencia del analista del laboratorio impactar la confiabilidad de las pruebas de control de calidad? Explique

No se tuvo dificultad, ya que se tuvo asesoria continua por la docente, y esto ayudo mucho a la identificacin de la salmonella en nuestro cultivo, y obviamente el nivel de experiencia del analista de laboratorio impactara en los resultados, ya que si no sabe las reglas generales de cultivo, de aislamiento y de lectura esto puede ocasionar una deficiente calidad de el anlisis haciendo que la calidad del producto no sea lo demasiado confiable a la hora del consumo.

7. Cules son las nuevas tecnologas que podran acortar o eliminar este largo proceso? En qu paso del proceso podran ser implementadas?

El avance en la biotecnologa ha permitido el desarrollo de diversos mtodos alternativos, los cuales proporcionan ventajas en cuanto a eficiencia, sensibilidad y disminucin del tiempo de deteccin. Estos mtodos rpidos, por estar basados en la determinacin de cidos nucleicos, tienen la potencialidad de ser muy especficos. Tal es el caso de la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y la tcnica PCR-TR (real time PCR), ambas tecnologas moleculares basadas en la amplificacin in vitro del ADN; esta ultima tiene la ventaja de que lleva a cabo simultneamente los procesos de amplificacin y deteccin en el mismo vial y que determina la cantidad de ADN sintetizado en cada momento de la reaccin. El avance mas reciente es el desarrollo de un biosensor para la deteccin de salmonella en alimentos

CIC micro GUNE trabaja junto con el centro tecnolgico Gaiker-IK4 en un proyecto para desarrollar un biosensor que permitir detectar de manera rpida

contaminaciones microbiolgicas en los alimentos, como la Salmonella. Este microdispositivo har posible identificar, en el momento y sin necesidad de la infraestructura de un laboratorio, agentes patgenos que puedan existir en toda la cadena alimentaria, una buena trazabilidad desde la granja a la mesa.

El objetivo inicial de PATSENS se basa en la deteccin de dos microorganismos patgenos, la Salmonella spp y la cronobacter, muy relevantes en los sistemas de control de calidad alimentaria, aunque luego se extender a otros microorganismos y toxinas de inters alimentario.

BIBLIOGRAFIA

RIBEIRO, Vinicius B., ANDRIGHETO, Cristiano, BERSOT, Luciano S. et al. Serological and genetic diversity amongst Salmonella strains isolated in a salami processing line. Braz. J. Microbiol. [online]. 2007, vol. 38, no. 1 [cited 2007-11-10], pp. 178-182. Available from: [3]. ISSN 1517-8382.