03 Actividad Enzimática

Prcticas de Bioqumica I
Prctica: Actividad de la Catalasa Sangunea
ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA CATALASA SANGUNEA

Objetivos Al finalizar el trabajo prctico los alumnos estarn en capacidad de: Conocer la forma y condiciones para obtener un preparado de catalasa sangunea. Verificar el efecto de la concentracin de la enzima sobre la actividad de la catalasa sangunea. Reconocer el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica. Demostrar la influencia del pH sobre la actividad enzimtica. Probar el efecto de la concentracin de substrato sobre la actividad de la catalasa sangunea. Verificar la influencia de un inhibidor sobre la actividad enzimtica.
Introduccin El metabolismo celular de los tejidos animales y vegetales genera perxido de hidrgeno (H2O2) molcula que resulta txica para la clula. A travs de la evolucin estos organismos han desarrollado sistemas enzimticos que descomponen este perxido y evitan daos a la clula. Uno de estos sistemas enzimticos lo representa la catalasa. La catalasa es una cromoprotena porfirnica cuya masa molecular es de 225.000 kDa, contiene cuatro grupos hemo por molcula y su contenido de hierro es 0.9%. Esta protena presenta actividad enzimtica del tipo oxido-reductasa sobre el perxido de hidrgeno (H2O2) el cul constituye el sustrato para esta enzima y lo descompone en oxgeno y dos molculas de agua Su nombre sistemtico de acuerdo a la Unin Internacional de Bioqumica es H2O2 oxidoreductasa y cataliza la siguiente reaccin:
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Catalasa 2H2O2
Peroxido de hidrgeno
O2 + 2H2O
En los mamferos esta enzima se encuentra en todo tipo de clulas, siendo su actividad mayor en el hgado, rin y eritrocitos. Un mol de catalasa puede descomponer 5.000.000 de molculas de H2O2 por minuto a 37C, esto se conoce como nmero de recambio y representa uno de los ms altos de toda la enzimologa. La actividad de la catalasa de los eritrocitos puede determinarse mediante algunos principios bioqumicos de los cuales los ms sencillos estn basados en la desaparicin del H2O2 al incubarlos con preparaciones crudas o purificadas de la enzima. A su vez la desaparicin del H2O2 puede estimarse por varios mtodos, uno de ellos es el mtodo titrimtrico por permanganimetra. En este mtodo una preparacin de catalasa se incuba con una concentracin conocida de perxido de hidrgeno durante cierto tiempo y en
condiciones adecuadas. Al cabo de este tiempo, la reaccin se detiene por adicin de H2SO4 2N y luego se titula con una solucin de permanganato de potasio (KMnO4). La reaccin de perxido de hidrgeno con el permanganato de potasio en medio cido es la siguiente:
2 KMnO4 + 3 H2SO4 + 5 H2O2 K2SO4 + 2 MnSO4 + 8 H2O + 5 O2
Esta reaccin constituye una tpica titulacin de oxidacin-reduccin, la cual se hace en proporciones estequiomtricas entre el permanganato y el perxido de hidrgeno. Los experimentos que se realizarn en este trabajo prctico, se basarn en el mtodo titrimtrico por permanganimetra y en cada uno de ellos se realizar la titulacin de un tubo control, el cul constituye una medida de perxido presente al comienzo del experimento. La titulacin de los tubos experimentales representa la medida del perxido remanente despus que la enzima ha actuado sobre el sustrato. La diferencia entre las dos titulaciones (control experimental) representa la cantidad de perxido descompuesto en una unidad de tiempo, es decir, la velocidad de la reaccin.
MATERIALES Y REACTIVOS Matraces erlenmeyer Tubos de ensayo Embudo Bureta y soporte universal Gradilla Baos de calentamiento Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL. H2SO4 2 N Buffer fosfato 0,01 M, pH 3, 7 y 8. Debe contener H2O2 para gastar aproximadamente 15 mL de KMnO4 0,012 N. KMnO4 0,012 N Soluciones de KCN 10-2 M., 10-3 M., 10-4 M a pH 7 las cuales deben ser preparadas el da de su uso.
Obtencin de un preparado de catalasa sangunea: (ser preparada con anticipacin por el docente). Para obtener una preparacin cruda y altamente activa de la enzima se sigue el siguiente procedimiento: 1.- Pipetear 25 mL de agua destilada en un tubo de ensayo grande y enfriarla sobre hielo picado. 2.- Con ayuda de una lanceta estril, extraer sangre capilar (del dedo pulgar), descartar la primera gota de sangre y luego pipetear 0,02 mL de sangre con una pipeta de Shalli. 3.- Agregar los 0.02 mL de sangre en los 25 mL de agua destilada fra. Lavar varias veces la pipeta en el agua. 4.- Mantener la preparacin de enzima en bao de agua helada con suficiente hielo para prevenir el deterioro de la enzima.
Experimentos. Se estudiarn los siguientes factores que modifican la actividad enzimtica: a. Concentracin de enzima. b. Concentracin de substrato. c. Temperatura. d. pH. e. Efectos de inhibidor: concentracin progresiva de inhibidor y concentracin progresiva de substrato con concentracin fija del inhibidor. PRIMERA PARTE (Semana 1) Experimento 1 Efecto de la concentracin de enzima La velocidad de reaccin es afectada por la concentracin de enzima presente en el medio de incubacin. A medida que se incrementa la concentracin de enzima, la velocidad de la reaccin es mayor. En este experimento se variar la concentracin de enzima y se mantienen constantes todos los dems factores. a. Tomar 5 frascos erlenmeyer de 125 mL c/u; rotularlos del 1 al 5 y proceder a agregar las cantidades que indica la siguiente tabla: Frasco N 1 2 3 4 5* *Tubo control. H2O2 pH 7 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL Enzima 0,1 mL 0,2 mL 0,4 mL 0,8 mL ----Tiempo en min 5' 5' 5' 5' 5' H2SO4 2N 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL mL gastados KmnO4
b. Una vez agregada la enzima debern transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco para luego detener la reaccin con cido sulfrico (en todos los frascos). c. Titule los frascos con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado plido permanente. Anote el volumen de permanganato gastado para cada frasco. d. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reaccin para los tubos experimentales Volumen de enzima 0,1 mL 0,2 mL 0,4 mL 0,8 mL Concentracin de Enzima (UI) 2 x 10-3 4 x 10-3 8 x 10-3 1,6 x 10-2 Velocidad de reaccin (Calculada)
e. Construya un grfico que muestre la relacin entre la velocidad de reaccin y la concentracin de la enzima. Nota: usar papel milimetrado. Experimento 2 Efecto de la temperatura. Toda reaccin enzimtica presenta una temperatura ptima la cul es definida como la temperatura a la cual la velocidad de la reaccin es mayor, manteniendo constante los otros factores. En este experimento se utilizaran tres temperaturas diferentes para observar el efecto de la misma sobre la actividad de la catalasa. a. Preparar tres series de tubos de ensayo (cada serie consta de dos tubos). b. Proceder a rotular los tubos de la siguiente manera: 1era serie: tubos 1A y 1B. 2da serie: tubos 2A y 2B. 3era serie: tubos 3A y 3B.
Los tubos "A" sern controles y los "B" experimentales. c. Agregar a cada uno de los tubos los reactivos y volmenes indicados en la siguiente tabla:
Tubo N 1A 1B 2A 2B 3A 3B
H2 O2 pH 7 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
Temperatura 10C 10C 37C 37C 60C 60C
Enzima -0,5 mL -0,5 mL -0,5 mL
Tiempo 5' 5' 5' 5' 5' 5'
H2SO4 2N 5 mL 5 mL 5 mlL 5 mL 5 mL 5 mL
mL gastados KmnO4
d. Una vez agregada la enzima debern transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco para luego detener la reaccin con cido sulfrico. e. Transfiera el contenido de los tubos a frascos erlenmeyer y titule con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado plido permanente. Anote el volumen de permanganato gastado para cada frasco. f. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reaccin para los tubos experimentales
Temperatura C 10 37 60
Velocidad de reaccin (calculada)
g. Construya un grfico que muestre la relacin entre la velocidad de reaccin y la temperatura. Nota: usar papel milimetrado. Experimento 3 Efecto del pH La mayora de las enzimas muestran su mximo de actividad en un rango limitado de pH. Es conocido que la conformacin del sitio activo y su relacin con el sustrato son
afectadas por este factor. Esto es el resultado de la suma de una serie de factores tales como: ionizacin de la enzima, ionizacin del substrato, difusin de productos, etc.
En este experimento se determinar la actividad de la catalasa a diferentes valores de pH, para observar el efecto de este importante factor sobre la velocidad de la reaccin. a. Rotular tres series de erlenmeyer al igual que en el experimento anterior. b. Adicione los reactivos y sus cantidades segn la siguiente tabla: Frasco N 1A 1B 2A 2B 3A 3B H2 O2 pH 3 5 mL 5 mL ----H2O2 pH 7 --5 mL 5 mL --H2 O2 pH 8 -------5 mL 5 mL Enzima -0,5 mL -0,5 mL -0,5 mL Tiempo 5' 5' 5' 5 5 5 H2SO4 2N 5 mL 5 mL 5 mlL 5 mL 5 mL 5 mL mL gastados KmnO4
c. Una vez agregada la enzima debern transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco para luego detener la reaccin con cido sulfrico. d. Titule con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado plido permanente. Anote el volumen de permanganato gastado para cada frasco. e. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reaccin para los tubos experimentales
pH 3 7 8
f. Construya un grfico que muestre la relacin entre la velocidad de reaccin y el pH. Nota: usar papel milimetrado.
SEGUNDA PARTE (Semana 2) Experimento 4 Efecto de la concentracin del substrato A medida que aumenta la concentracin del sustrato, la velocidad de reaccin aumenta. El aumento en la concentracin de sustrato puede llegar a sobrepasar la capacidad de la enzima de convertirlo en producto, llegando esta a la velocidad conocida como mxima. (Vmax) En este experimento se aumentar progresivamente la concentracin de perxido de hidrgeno con el objetivo de determinar la velocidad mxima (Vmax) Procedimiento: a. Rotular tres series de erlenmeyer al igual que en el experimento anterior. b. Adicione los reactivos y sus cantidades segn la siguiente tabla: Frasco No. 1A 1B 2A 2B 3A 3B H2 O2 pH 7 1,25 mL 1,25 mL 2,50 mL 2,50 mL 5 mL 5 mL H2O destilada 3,75 mL 3,75 mL 2,50 mL 2,50 mL ----Enzima -0,5 mL -0,5 mL -0,5 mL Tiempo 5' 5' 5' 5' 5' 5' H2SO4 2N 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL mL gastados KmnO4
c. Una vez agregada la enzima debern transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco para luego detener la reaccin con cido sulfrico. d. Titular con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado plido permanente. Anote el volumen de permanganato gastado para cada frasco. e. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reaccin para los tubos experimentales
Volumen de sustrato 1,25 mL 2,5 mL 5 mL
Concentracin de Sustrato 1,25 x 10-2 M 2,5 x 10-2 M 5 x 10-2 M
f. Construya un grfico que muestre la relacin entre la velocidad de reaccin y la concentracin de sustrato. Nota: usar papel milimetrado. Efectos del inhibidor. La actividad de la catalasa es fuertemente inhibida por agentes capaces de combinarse con el hierro de su grupo prosttico porfirnico, tales como el KCN. Indudablemente la mayor parte de los efectos letales del cianuro se deben a la inhibicin de enzimas ferroporfirnicas como la catalasa, citrocromo-oxidasa, etc. En este experimento se demostrar el efecto inhibitorio de concentraciones progresivas de cianuro sobre la velocidad de reaccin enzimtica. Se har tambin la reaccin con una sola concentracin de cianuro y dosis progresivas de substrato, para determinar el tipo de inhibicin producida por el cianuro sobre la enzima.
Experimento 5 Efecto de la concentracin progresiva del substrato sobre una sola concentracin del inhibidor a. Rotular tres series de erlenmeyer al igual que en el experimento anterior. b. Proceder de igual forma al experimento N 4. La nica diferencia entre ambos experimentos es la presencia en todos los tubos de KCN. Contrastando los datos con los del experimento 4, podremos determinar que tipo de inhibicin lleva a cabo el cianuro de potasio sobre la catalasa sangunea. c. Coloque en los frascos lo que se indica en la tabla siguiente:
Frasco N 1A 1B 2A 2B 3A 3B
H2O2 pH 7 1,25 mL 1,25 mL 2,50 mL 2,50 mL 5 mL 5 mL
H2 O 3,75 mL 3,75 mL 2,50 mL 2,50 mL ---
KNC -3 10 M 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
Enzima -0,5 mL -0,5 mL -0,5 mL
Tiempo 5 5 5 5 5 5
H2SO4 2N 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
mL gastados KmnO4
d. Una vez agregada la enzima debern transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco para luego detener la reaccin con cido sulfrico. e. Titule con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado plido permanente. Anote el volumen de permanganato gastado para cada frasco. f. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reaccin para los tubos experimentales, as como los inversos de las velocidades 1/[V] y de las concentraciones de sustrato 1/[S] de los experimentos N 4 y 6 (grfico de los inversos recprocos) Volumen de sustrato 1,25 mL 2,5 mL 5 mL Concentracin de sustrato Velocidad de reaccin 1 / [S] Exp 4 1 / [S] Exp 5 1 / [V] Exp 4 1 / [V] Exp 5
g. Construya un grfico que muestre la relacin entre el inverso de la velocidad de reaccin y el inverso de la concentracin de sustrato en presencia o no del inhibidor. Nota: usar papel milimetrado. Experimento 6 Efecto de la concentracin progresiva de cianuro a. Tomar 5 erlenmeyer de 125 mL y roturarlos del 1 al 5. b. Agregar a cada uno de los erlenmeyer lo que se indica en la siguiente tabla:
10
Frasco N 1 2 3 4 5
H2 O2 pH 7 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
KNC 10-4 M 0,5 mL -----
KNC 10-3 M -0,5 mL ----
KNC 10-2 M --0,5 mL ---
Enzima 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL ---
Tiempo 5 5 5 5 5
H2SO4 2N 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
mL gastados KmnO4
c. Una vez agregada la enzima debern transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco para luego detener la reaccin con cido sulfrico. d. Titular con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado plido permanente. Anote el volumen de permanganato gastado para cada frasco. e. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reaccin para los tubos experimentales Concentracin de Inhibidor (M) 0 10-4 10-3 10-2 Velocidad de reaccin (calculada)
f. Construya un grfico que muestre la relacin entre la velocidad de reaccin y la concentracin de la enzima. Nota: usar papel milimetrado. Clculos de la velocidad de reaccin La velocidad de reaccin para cualquier tubo experimental se expresa en la siguiente unidad: = mmoles de H2O2 destruidos / minuto Para obtener el resultado de velocidad expresado en esa unidad deben realizarse los siguientes clculos siguiendo esta secuencia: a. mEq de KmnO4 = N KMnO4 x Volumen gastado (mL) b. mEq de H2O2 = mEq de KmnO4 c. mmoles de H2O2 = mEq de H2O2 / N de hidrgenos (2) d. mmoles destruidos de H2O2 = mmoles totales (control) mmoles remanentes (experimental)
11
e. (velocidad de reaccin) = mmoles destruidos de H2O2 / tiempo de reaccin (5 minutos) Los clculos debern realizarse para cada tubo experimental en todos los experimentos. Construya las siguientes grficas: a. Concentracin enzimtica contra velocidad de reaccin (Experimento 1) b. Temperatura contra velocidad de reaccin (Experimento 2) c. pH contra velocidad de reaccin (Experimento 3) d. Concentracin de sustrato contra velocidad de reaccin (Experimento 4) e. Inverso de la concentracin de sustrato contra inverso de la velocidad de reaccin con y sin inhibidor (Experimentos 4 y 5) f. Concentracin progresiva de inhibidor contra velocidad de reaccin (Experimento 6)
Auto evaluacin 1. Como cree usted que ser el efecto de las temperaturas 15C, 37C y 60C sobre la actividad enzimtica de la catalasa sangunea? 2. Explique que diferencia existe entre los tubos controles y experimentales de esta prctica. 3. En que se basa el mtodo titrimtrico por permanganimetra? 4. Que funcin cumple el H2SO4 N en los experimentos de esta prctica. Bibliografa Plummer, David. Bioqumica prctica. Mc Graw Hill. 1981. Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press. 1987. Universidad Simn Bolvar. Prcticas de Bioqumica I: BC-3181. Departamento de Biologa Celular. 1999.
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Temperatura 10C 10C 37C 37C 60C 60C

Enzima -0,5 mL -0,5 mL -0,5 mL

Tiempo 5' 5' 5' 5' 5' 5'

Velocidad de reaccin (calculada)

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Velocidad de reaccin (calculada)

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Volumen de sustrato 1,25 mL 2,5 mL 5 mL

Concentracin de Sustrato 1,25 x 10-2 M 2,5 x 10-2 M 5 x 10-2 M

Velocidad de reaccin (calculada)

Prctica: Actividad de la Catalasa Sangunea

H2O2 pH 7 1,25 mL 1,25 mL 2,50 mL 2,50 mL 5 mL 5 mL

H2 O 3,75 mL 3,75 mL 2,50 mL 2,50 mL ---

KNC -3 10 M 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL

Enzima -0,5 mL -0,5 mL -0,5 mL

Prctica: Actividad de la Catalasa Sangunea

KNC 10-4 M 0,5 mL -----

KNC 10-3 M -0,5 mL ----

KNC 10-2 M --0,5 mL ---

Enzima 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL ---

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