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Aspetti tecnico-metodologici e applicazioni cliniche della citometria a flusso in Anatomia Patologica

ELENA LEONARDI
U.O. ANATOMIA PATOLOGICA - OSPEDALE S.CHIARA - Trento

Brescia, 21 marzo 2005

CARATTERIZZAZIONE CLINICO-PATOLOGICA TUMORI SOLIDI

STADIO PATOLOGICO GRADO ISTOLOGICO METASTASI LINFONODALI

STUDIO MORFOLOGICO

CA. MAMMELLA ( Ematoss. / Eosina ) x 100

CA. MAMMELLA ( Ematoss. / Eosina ) x 400

STUDIO BIOLOGICO

Recettori ER+Pgr

Cerb-2 MIB-1

Sviluppo di una neoplasia


Iniziazione + Divisione cellulare

Promozione

PROGRESSIONE

CARATTERIZZAZIONE BIOLOGICA DEI TUMORI

VALUTAZIONE DELLAGGRESSIVITA BIOLOGICA

Contenuto di DNA

Espressione di Oncogeni

VALUTAZIONE DELLA CINETICA CELLULARE

Attivit mitotica

Frazione di crescita Eteroclonalit Eterogeneit del differenziamento cellulare ( Recettori )

VALUTAZIONE DELLINSTABILITA GENETICA

Strategie di studio dei tumori solidi

MORFOLOGICO

METABOLICO

MODELLO ANIMAL

Citochimica

Colture in vitro

Tumori spontanei Tumori indotti

Immuno-citochimica

Citometria

A flusso

CITOMETRIA A FLUSSO COSE?

LA CITOMETRIA A FLUSSO E UNA METODIC CHE PERMETTE DI VALUTARE PARAMET FISICI E CHIMICI DI PARTICELL BIOLOGICHE O CELLULE CONTENUTE UNA SOSPENSIONE .
Coulter Cytometry

Citometro a flusso
Detectors Lasers

Fluidics

Computers

Laser Power Supply or LAMP

Citometria a flusso: analisi simultanea di pi fluorescenze

FITC PE Perc-p

Propidio iod

PERMETTE DI ANALIZZARE INDIVIDUALMENTE FACENDOLE PASSARE IN UNA CAMERA DI RILEVAZIONE, ANALISI.


Coulter Cytometry

LE

CELLULE,

CON UNA ELEVATA VELOCITA DI

Flow Cell: camera di rilevazione


Injector Tip
Sheath fluid

uorescence signals Focused laser beam

Forward Angle Light Scatter ( FSC )

aser

FALS Senso

DIMENSIONE

90 Degree Light Scatter ( SSC )

ser

FALS Se

GRANULOSIT
90LS Sensor

Fluorescence Detectors

aser

FALS Se

Freq

Fluorescence

Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)

Example Channel Layout for Laserbased Flow Cytometry

PMT
4

cell

Dichroic Filters
PMT
2

PMT
3

Bandpass Filters
PMT
1

Laser

DNA PROBES
( MARCATORI FLUORESCENTI INTERCALANTI )

Propidium
NH2 NH2 NH2

Ethidium

NH2

N+ C2H2)3 N+

C2H5 CH3 C2H5

N+ C2H5

FLUOROCROMI INTERCALANTI Ioduro di Propidio

FLUORESCENTE SOLO SE SI INTERCALA NELLA DOPPI ELICA , NON FLUORESC. ALLO STATO LIBERO SI LEGA SIA A DNA CHE A RNA

COLORANTE DI ELEZIONE PER MISURE DI DNA IN CFM

Propidium Iodide
Excitation
300 nm
400 nm

Emisson
600 nm
600 nm

400 nm
500 nm

500 nm

700 nm
700 nm

Rel at v i e I nt ensi ty

DNA

Ioduro di Propidio
FLUORESCENZA: rossa

FLUOROCROMI BASE SPECIFIC Dapi

LEGA ALLE SEQUENZE A-T DEL DNA

ILIZZAZIONE: CITOMETRI A LAMPADA A VAPORI DI

ERCURIO

OMBINATO CON FLUOROCROMI SPECIFICI PER G-C E

ILIZZATO PER ANALIZZARE LE DIFFERENTI COMPOSIZ. I

SI DEGLI ACIDI NUCLEICI

Dapi
FLUORESCENZA: azzurra ( nuclei )

FLUORESCENZA: azzurra ( nuclei ); rossa: ( proteine

Dapi-Sulphorodamine

FLUOROCROMI PER LE PROTEINE (F.I.T.C. )


MARCATORE CLASSICO DEGLI AC. MONOCLONALI FLUORESCENTE SIA IN FORMA LIBERA CHE LEGATA VIENE USATO IN COMBINAZIONE CON PE

Fluorescein (FITC)
Excitation Emisson
300 nm 400 nm
400 nm

500 nm
Wavelength 500 nm

600 nm
600 nm

700 nm
700 nm

Rel at v i e I nt ensi ty

Protein

F.I.T.C. F.I.T.C. Fluorescenza: verde

INDICE DI DNA

PARAMETRO PROGNOSTICO PIU STUDIATO NEI TUMORI

COME INDICE INDIPENDENTE DI SOPRAVVIVENZA

CONTENUTO DI DNA ( PLOIDIA )

ALTERAZIONI QUANTITATIVE ( NUMERICHE ) DEI CROMOSOMI

mite: Difetti cromos. minori come Traslocazioni, Riarrangiament

Ciclo Cellulare

M G2 S G1
G0

Cellule quiesce

M
2

G2 G1 S

Cell age

G1

Triplette

G2M

DNA CONTENT

Definizioni
PLOIDIA DNA INDEX COEFFICIENTE DI VARIAZIONE ( CV )

PPloidia :numero di cromosomi in una cellula

AAploide: numero di cromosomi in un gamete (germ cell)

DDiploide: numero di cromosomi in una cellula somatica di una particolare specie

DNA INDEX (D.I.)

Contenuto di DNA della popolaz. G1 Aneuplo

Contenuto di DNA della popolaz. G1 Diploide

PLOIDIA
MULTICLONALE IPER-TETRAPLOIDE TETRAPLOIDE IPER-TRIPLOIDE TRIPLOIDE IPER-DIPLOIDE DIPLOIDE IPODIPLOIDE
ASSOCIAZIONE DI PIUCLONI ANEUPLOIDI

DI >2.10 1.90< DI <2.10 1.61< DI <1.89 1.40< DI <1.60 1.16 <DI <1.39 DI = 1.00 1.00 <DI

DIPLOIDE
DI= 1.00

IPER-DIPLOIDE

DI= 1.30

IPO-DIPLOIDE

DI= 0.90

TRIPLOIDE

DI= 1.40

IPER-TRIPLOIDE

DI= 1.75

TETRAPLOIDE
DI= 1.90

DI= 2.00

IPER-TETRAPLOIDE
DI=3.30

MULTI-CLONALITA

DI= 1.80+ 2.10

Utilizzo della Metodica DAPI / SULFORODAMINA NEI TUMORI SOLIDI

Utilizzo della Metodica DAPI / SULFORODAMINA NEI TUMORI SOLIDI

Utilizzo della Metodica DAPI / SULFORODAMINA

COEFFICIENTE DI VARIAZIONE ( C.V. ) Rapporto tra:


deviazione standard del picco G1 M

DS / M

= canale medio della distribuz

C.V.= 2.5

C.V.= 5

C.V.= 3.5

Campioni per analisi CFM


Asportati chirurgicamente Materiale Ago-aspirato (F.N.A.C)

UMORI SOLIDI

ABORTI

Biopsia

TESTICOLO

Biopsia

RACCOLTA CAMPIONE

Il campione va immerso in : soluzione fisiologica o in tampone salino ( PBS , Ph = 7, 2 - 7,4)

OTTENIMENTO SOSPENSIONE CELLULARE

MACROSCOPICA

FISSAZIONE DEL PELLET


ALCOOL

70% PRE-RAFFREDDATO A 20

( Ricerca di Antigeni citoplasmatici ) METANOLO/ ACETONE 3:1 ( Ricerca di Antigeni nucleari )

CONSERVAZIONE SOSPENSIONI CELLULAR

IN PROVETTE DI POLI-PROPILENE A 20C IN PROVETTE DI POLI-PROPILENE A 80C

ANALISI CFM NON ESEGUIBILE O NON CLASSIFICABILE ( Cause )

PROCESSI AUTOLITICI CELLULARI INADEGUATA O NON TEMPESTIVA CONSERVAZIONE MATERIALE TEMPERATURA DI CONGELAMENTO INADEGUATA

PRESENZA DI COAGULI DI SANGUE O ZONE DI NECROS

CONSERVAZIONE SOSPENSIONI CELLULAR

LIQUIDO PER LA CRIOPRESERVAZIONE A -80 C

80% RPMI + 10% FETAL CALF SERUM + 10% DIMETHYLSULFOXIDE

COLORAZIONE

CON IODURO DI PROPIDIO 50 GAMMA ( eccitaz. LASER )

CON DAPI SULFORODAMINA ( eccitaz. LAMPADA )

APPLICAZIONI CLINICHE
STUDI PROGNOSTICI NEI TUMORI SOLIDI STUDIO DIAGNOSTICO IN:

- patologia del trofoblasto

- spermatogenesi di Pz. Azoo-oligo-spermici

STUDI PROGNOSTICI
CA.

VESCICALE

CA. RENALE CA. PROSTATICO CA. ENDOMETRIALE CA. MAMMELLA CA. GASTRICO

La ploidia d informazioni aggiuntive rispetto al grado tumorale e allo stadio. Il contenuto in DNA di maggior utilit nei gradi 2 dei tumori vescicali in quanto la maggior parte dei grado 1 diploide mentre la maggior parte dei grado 3 aneuploide. Laneuploidia sembrerebbe correlata con la progressione della malattia verso linfiltrazione tumorale e le metastasi.
Cytometry 1993

DI=1

Ca. Transiz. Papillare G1

DI=1.75

Ca. Transiz. Papillare G3

I.= 2.00

TETRAPLOIDE

CA. TRANSIZ. PAPILLARE G

DNA INDEX e STADIO CA. VESCICALI


100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% pTa ( 209 ) D A

100% 85% 73%

27% 15% 0%
pTis ( 9 ) pT1(20)

DNA INDEX e GRADO CA. VESCICALI 96%


100%

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

66%
D 34% A

4% G1 G2

0%
G3

DIMENSIONI CA. RENALE E PLOIDIA <=2,5, 2,6-7, >7


60 50 40 30 20 10 0 <2,5

55

37 29 19 6
2,6-7

7
>7

Cellula neopla

Cellula infiammatoria

LE ANALISI MULTI-PARAMETRICHE NEI TUMORI SOLIDI

Studio del DNA

+ Antigeni citoplasmatici

STUDIO DI AG. CITOPLASMATICI

CITOCHERATINE

Moll R. ( Cell 1982 20 citocheratine

DNA

Tipo I (acide) CK9-CK20

Tipo II: ( basiche) CK1-CK

VANTAGGI DI UNA ANALISI MULTIPARAMETRICA

Non richiede un controllo di DNA esterno (DNA standard

analisi del DNA senza linterferenza delle cellule

nfiammatorie;

dentificazione di cellule tumorali con diversi fenotipi;

possibilit di successivo sorting

BIOL. MOLECO

DNA NEI TUMORI SOLIDI ANALISI MULTIPARAMETRICA

* CHERATINA

DNA

* VIMENTINA * MIB-1 * ONCOGENI

Metodo
MARCATURA DIRETTA CK-FITC
Fissazione sospensione cellulare in etanolo 70 %

MouseIgG FITC

CK-FITC

M.F.

STUDIO DELLE CITOCHERATINE NEI TUMORI SOLIDI Ioduro di Propidio

FITC

Esempio 1):

IPER O IPODIPLOIDIA ?

Esempio 2) : IPER O IPODIPLOIDIA?

La citometria nello studio della Mola idatiforme

a mola idatiforme una placenta anorm ratterizzata da villi idropici ed iperplasia ofoblasto. Essa pu persistere, rimanendo confin la cavit uterina, penetrare nel miome mbolizzare alla vagina o ai polmoni o trasformars riocarcinoma. caratterizzata da specifiche aberrazioni genetiche

Mola Idatiforme Parziale

69XXY 23Y

23Y 23X

23X

69XXY

Cellule 69XXY triploid

permia Dispermia

23X

Cromosomi Materni co Extra Set Paterno


69XXY

Diandria

Mola Idatiforme Completa


Complete mole
Blighted ovum Progression to choriocarcinoma in 2-3% of cases 23 X

23 X 46 X Paternal chromosomes only

rsistence and need or therapy in 1030% of cases

23 X

ABORTO IDROPICO D.I. = 1.00

MOLA IDATIFORME PARZIALE D.I. = 1.50

MOLA IDATIFORME COMPLETA D.I. = 2.00 ( o 1.00 )

La citometria a flusso nello studio della spermatogenesi


A>D>T

1 mal spermatogenesis. Seminiferous tubule with regular germ cell maturation from b matogonia to luminal spermatids and spermatozoa as well as Sertoli cells ( E/E staining x 250). 1a w Cytometry, Dapi/Sulphorodamine staining. Aploid>Diploid>Tetraploid. id compartment appears composed by two peaks with a different fluorescence intensity becaus er degree of chromatin condensation of mature spermatozoa ( green arrow ) in compariso matids ( red arrow ).

IPOSPERMATOGENESI
D>A>T

ermatogenesis. Cellularity in tubules is normal, but very few spermatids and spermatozoa are pre aining x 250).

ARRESTO MATURATIVO COMPLET

D>T>A

g. 3 omplete maturation arrest. Arrest of the maturation sequence; o spermatids or spermatozoa are present. g. 3a ow Cytometry, Dapi/Sulphorodamine staining. Complete maturation arrest: Diploid>Tetraploid>Ap

SERTOLI CELL ONLY SYNDROME


D

Fig. 4 Extreme atrophy of the testis showing thickened basement membranes with Sertoli cells. Fig. 4a Flow Cytometry, Dapi/Sulphorodamine staining. Diploid compartment only. Absence of haploid ce

Limportanza dello studio della proliferazione cellulare


La valutazione della % di cellule proliferanti importante in molti tipi di tumore; Esiste una correlazione fra proliferazione e grado istologico e sopravvivenza; La situazione proliferativa ha importanti implicazioni nella scelta terapeutica del Paziente.

STUDIO DELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE

INDICE MITOTICO ( Conta manuale ) METODI AUTO-RADIOGRAFICI FASE S DEL CICLO CELLULARE IMMUNOISTOCHIMICA ( MIB-1) CITOMETRIA A FLUSSO (MIB-1)

Tumore a bassa proliferazione


Buona prognosi MIB-1

Tumore ad alta proliferazione

Prognosi peggiore MIB-1

STUDIO DELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE ( FASE S )

M G2

G1

G0

Cellule quie

Ciclo Cellulare

ELABORAZIONE ISTOGRAMMA

%D= %A= D.I.= 1.4

29.4%

70.6 %

Fase S = 7.6%

CITOMETRIA A FLUSSO MIB-1


Ac. Mo. in grado di riconoscere gli epitopi di un Ag. Nucleare Espresso in tutte le cellule proliferanti ( G1-S-G2-M ) Assente nelle cellule quiescenti ( G0) Lespressione nucleare dellantigene MIB-1 caratterizza la frazione di crescita di una popolazione cellulare La valutazione di MIB-1 ha importanza clinica poich correla con il grado di malignit ed il tempo di sopravvivenza.

METODO
MARCATURA CON MIB-1
Fissazione sospensione cellulare in Metanolo/acetone 3:1

MouseIgG isotipico

MIB-1

+ Goat anti-mouse FAB FITC

M.F.

Ca.vescica DI=1
A1 A2 A3

FL3-H

Ca.Vescica DI=1.85
B1 B2 B3

FL3-H

Ca.vescica DI=1.90 C1 C2 C3

FL3-H

Expression of fMIB-1 values in diploid and aneuploid tumors


92% No.45

Diploid
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% fMIB-1=<=3%

Aneuploid

fMIB-1=4-7%

fMIB-1=>7%

CONCLUSIONI
Morfologia Ibridazione molecolare in situ

ometria a flusso

Immunoistochimica Citogenetica

U.O. ANATOMIA PATOLOGICA OSPEDALE S.CHIARA-TRENTO

LABORATORIO DI CITOMETRIA A FLUSSO