Tesis Maestria Mjalbo 2009xxxxxx

SELECCIN SEXUAL Y CITOGENTICA EN ESPECIES DE ARAAS DONADORAS DE REGALOS NUPCIALES (TRECHALEIDAE Y PISAURIDAE)
Mara Jos Albo
Orientadora: Dra. Alicia Postiglioni
Co-Orientador: Prof. Fernando Costa
Tesis de Maestra Ciencias Biolgicas rea Biologa Sub-rea Zoologa PEDECIBA Facultad de Ciencias Universidad de la Repblica Montevideo, Uruguay. 2009
A puro sol escribo, a plena calle, a pleno mar, en donde puedo canto, slo la noche errante me detiene pero en su interrupcin recojo espacio, recojo sombra para mucho tiempo. El trigo negro de la noche crece mientras mis ojos miden la pradera y as de sol a sol hago la llaves: busco en la oscuridad las cerraduras y voy abriendo al mar las puertas rotas hasta llenar armarios con espuma. Y no me canso de ir y de volver, no me para la muerte con su piedra, no me canso de ser y de no ser. A veces me pregunto si de dnde, si de padre o de madre o cordillera hered los deberes minerales, los hilos de un ocano encendido y s que sigo y sigo porque sigo y canto porque canto y porque canto. No tiene explicacin lo que acontece cuando cierro los ojos y circulo como entre dos canales submarinos, uno a morir me lleva en su ramaje y el otro canta para que yo cante. As pues de no ser estoy compuesto y como el mar asalta el arrecife con cpsulas saladas de blancura y retrata la piedra con la ola, as lo que en la muerte me rodea abre en m la ventana de la vida y en pleno paroxismo estoy durmiendo. A plena luz camino por la sombra. PLENOS PODERES - Pablo Neruda
NDICE
Resumen CAPTULO 1 - Introduccin General Las familias Trechaleidae y Pisauridae Seleccin sexual y regalos nupciales Citogentica
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Un enfoque interdisciplinario 11 Objetivos. Materiales Anlisis estadsticos Literatura CAPITULO 2 - Estrategias Reproductoras 2.1- Regalo nupcial, cortejo, cpula y tcticas sexuales: implicancias evolutivas en cuatro especies de araas (Trechaleidae y Pisauridae) 24 12 15 17 17
2.2- La feromona sexual femenina y su efecto sobre la construccin del regalo nupcial en Paratrechalea ornata (Trechaleidae) 43 2.3- El regalo nupcial como esfuerzo de apareamiento del macho Paratrechalea ornata (Trechaleidae) 58 2.4- Machos de calidad? Evaluacin de los posibles costos de la construccin del regalo nupcial en los machos de Pisaura mirabilis (Pisauridae) 73 CAPITULO 3 - Estudios Citogenticos 3.1- Comportamiento cromosmico meitico y estudio de la heterocromatina en Trechaleidae . 101 CAPTULO 4 - Discusin General y Conclusiones/Eplogo 116
CAPTULO 5 - Agradecimientos 122 CAPTULO 6 Apndice I 125 CAPTULO 7 Apndice II 133
RESUMEN Trechaleidae y Pisauridae integran con otras familias la superfamilia Lycosoidea, que incluye araas vagabundas distribuidas por todo el mundo. En estas dos familias existen especies con machos que donan regalos nupciales a las hembras durante el cortejo y la cpula. Los regalos nupciales son bien conocidos en insectos pero poco estudiados en araas, siendo Pisaura mirabilis (Pisauridae) la nica especie bien analizada en aspectos de comportamiento y de seleccin sexual. La construccin del regalo nupcial en araas consiste en la envoltura con seda de una presa capturada, que luego el macho transporta en sus quelceros y ofrece a la hembra. Se ha considerado el regalo nupcial como esfuerzo de cpula del macho en P. mirabilis, pero no se ha puesto a prueba esta hiptesis en Trechaleidae. Asimismo, el regalo es una caracterstica heredable, asociada a preferencias alimenticias de las hembras, que cumple un papel en la especiacin, por lo que podra relacionarse con la impronta gentica. Es por ello que se plantea estudiar la meiosis de los machos, ya que no existen reportes citogenticos que permitan conocer la dinmica de la cromatina en ninguna de las dos familias mencionadas. En el Orden Araneae en general, a pesar de tener una alta diversidad de especies, stas presentan sistemas cromosmicos sexuales estables y estabilidad cariotpica. El objetivo de esta tesis fue estudiar las estrategias reproductivas y el comportamiento cromosmico meitico de tres especies de Trechaleidae presentes en Uruguay, y realizar estudios comportamentales comparativos con la especie europea P. mirabilis. Especficamente fue de inters estudiar que estmulos pueden desencadenar la construccin del regalo nupcial (envoltura en seda), as como cual es la funcin y los costos asociados a ste comportamiento. Adems analizar el comportamiento de los cromosomas sexuales y la distribucin de heterocromatina. La informacin encontrada permiti tener una primera aproximacin sobre las estrategias reproductivas de las especies estudiadas, enmarcndolas dentro de las hiptesis actualmente planteadas. As como incorporar el regalo nupcial como carcter filogentico en Trechaleidae y Pisauridae. Los datos generados permitirn aproximarse a posibles efectos epigenticos pudindose asociar comportamientos heredables de alta influencia ambiental con variabilidad de cromatina. Los estudios comportamentales sumados a los estudios citogenticos nos permitirn realizar comparaciones ms slidas entre las especies estudiadas.
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Captulo 1 Introduccin General
CAPITULO 1 - Introduccin General

Las familias Trechaleidae y Pisauridae
Las familias Trechaleidae y Pisauridae fueron descriptas por Simn en 1890. Junto con otras 10 familias integran la superfamilia Lycosoidea (Griswold 1993, Silva 2003, Coddington 2005), que contiene araas vagabundas distribuidas por todo el mundo. Trechaleidae es una familia pequea que contiene 18 gneros y 76 especies con amplia distribucin en las Amricas, desde Argentina a Estados Unidos, existiendo una nica especie extracontinental en Japn (Platnick 2009). Dentro de esta familia se agrupan especies que generalmente viven asociadas a cursos de agua dulce y que llevan la ooteca colgada en el abdomen, carcter que comparten con Lycosidae (Carico 2005). Pisauridae contiene 53 gneros y 339 especies, y se encuentra distribuida por todo el mundo (Platnick 2009). Pisauridae incluye especies terrestres y tambin semiacuticas, y a diferencia de las Trechaleidae las hembras sostienen la ooteca con los quelceros hasta la emergencia de las cras. En ambas familias existen especies en las que los machos donan regalos nupciales a las hembras durante el cortejo y la cpula. Pisaura lama Bsenberg & Strand, 1906, Perenethis fascigera (Bsenberg & Strand 1906) y Pisaura mirabilis (Clerck 1757), son especies palerticas, que han sido descritas como donadoras de regalos nupciales en la familia Pisauridae (Bristowe 1968, Itakura 1993, 1998), agregndose recientemente una especie neotropical del gnero Thaumasia descripta por Bastos-Pereira (2009). Mientras tanto en Trechaleidae, Paratrechalea ornata (Mello-Leito 1943),
Paratrechalea azul Carico, 2005 y Paratrechalea galianoae Carico, 2005, han sido recientemente indicadas como constructoras de regalos nupciales en Brasil por Costa-Schmidt et al. (2008). Segn estos ltimos autores la cpula no ocurre sin el regalo, y la presencia de regalo nupcial podra ser un carcter plesiomrfico para la familia. En Uruguay Capocasale & Pereira (2003) han indicado la presencia de dos especies pertenecientes a esta familia, Trechaleoides keyserlingi y Paratrechalea ornata. Trabajos de campo recientes (M.J. Albo, F. Costa y F.G. Costa-Schmidt, observaciones personales) sugieren la presencia de ms especies en cursos de
agua dulce, habindose encontrado coexistiendo con P. ornata, a Trechaleoides biocellata y Trechalea bucculenta. Hemos encontrado que en las poblaciones uruguayas de P. ornata existe tambin regalo nupcial (M.J. Albo y F.G. Costa, observaciones personales). Se desconoce la existencia de regalo nupcial en las otras especies del Uruguay.
Seleccin sexual y regalos nupciales
El trmino seleccin sexual refiere a las presiones que actan sobre los individuos promoviendo el desarrollo de caracteres o rasgos que permitirn un mayor xito reproductivo, an en desmedro de su xito de supervivencia (Darwin 1871). Existen 2 niveles donde acta la seleccin sexual: la seleccin intersexual o epigmica, que promueve el desarrollo de caracteres en un sexo para atraer a los individuos del otro sexo, y la seleccin intrasexual, que impulsa el desarrollo de caracteres en los individuos del mismo sexo (generalmente los machos) mediante los que competirn por el acceso al otro sexo. La seleccin sexual puede ocurrir antes, durante o despus de la cpula, conocindose estas ltimas instancias como eleccin crptica femenina y competencia espermtica (Parker 1984, Eberhard 1996). Cualquiera de estos niveles requiere que un sexo elija y el otro compita por el primero; usualmente y debido a la diferencia de inversin en los gametos y en el cuidado parental, las hembras son el sexo que elige mientras que los machos compiten por el acceso a stas (Trivers 1972).
Las araas son un excelente modelo para trabajos de seleccin sexual (Eberhard 2004). En general y siguiendo la regla, los machos de araas buscan y compiten activamente por las hembras, mientras que las hembras son el sexo que elige (Foelix 1996, Eberhard 2004, Huber 2005). Durante el cortejo, los canales de comunicacin ms utilizados son el qumico, acstico, vibratorio, tctil y el visual (Foelix 1996, Costa & Quirici 2007). Algunas de las principales funciones del cortejo son el reconocimiento intraespecfico, as como la evaluacin de la pareja y la minimizacin de comportamientos no sexuales (Krebs & Davies 1993). A pesar de los conspicuos cortejos realizados por los machos de araas, es bien conocido que muchas veces
las hembras pueden llegar a atacar y canibalizar a los machos durante el mismo (Elgar 1992). En consecuencia, los machos debern elaborar importantes exhibiciones que les permitan ser reconocidos y elegidos como pareja, evitando ser rechazados o atacados.
Una de las caractersticas ms notables, descrita y discutida en el marco de la seleccin sexual, es la presencia de regalos nupciales. stos son generalmente nutrientes donados por el macho a la hembra durante el cortejo y la cpula. Pueden ser presas capturadas, regurgitaciones, fluidos glandulares, partes corporales del macho, entre otros (Boggs 1995, Sakaluk 2000, Vahed 2007). Existen 4 hiptesis principales sobre la funcin de los regalos nupciales. Una postula que los regalos pueden funcionar como una estrategia del macho de transferir nutrientes a la hembra, que sta utilizar para aumentar su descendencia comn (hiptesis de inversin parental; Trivers 1972, Thornhill 1976a, Gwynne 1984). Otra hiptesis es conocida como esfuerzo de cpula, donde los machos invierten en el regalo para obtener mayor cantidad y calidad de cpulas (Boldyrev 1915, Thornhill 1976b, Sakaluk 1984). La tercera sugiere que los regalos nupciales son utilizados por los machos para evitar ser canibalizados por las hembras durante la cpula (hiptesis antipredadora, Kessel 1955). Finalmente la cuarta hiptesis predice que los machos manipulan a las hembras explotando una preferencia preexistente en la hembra, que promueve que los elijan en base a las caractersticas del regalo (hiptesis de explotacin sensorial; Sakaluk 2000, Stlhandske 2002). Los regalos nupciales han sido descritos para una amplia variedad de insectos pero muy poco estudiados en araas (Kessel 1955, Austad & Thornhill 1986, Vahed 1998, 2007, Wedell 2005, Gwynne 2008). De un total de 40.998 especies de araas descritas en el mundo (Platnick 2009), slo se conoce este carcter en pocas especies pertenecientes a las familias Pisauridae y Trechaleidae. De hecho, la nica especie estudiada en detalle de las que presentan regalo nupcial es Pisaura mirabilis (Bristowe 1968, Austad & Thornhill 1986, Lang 1996, Drengsgaard & Toft 1999, Stlhandske 2001, 2002, Bruun et al. 2003, Prokop 2006, Bilde et al. 2006, 2007,
Andersen et al. 2008, Hansen et al. 2008, Prokop & Maxwell 2009). Slo recientemente aparecieron reportes de regalo nupcial en tres especies neotropicales pertenecientes a la familia Trechaleidae (Costa-Schmidt et al. 2008). En ambas familias la construccin del regalo nupcial es semejante y consiste bsicamente en la envoltura con seda de una presa capturada (usualmente un insecto), resultando un paquete blanquecino y redondo que el macho transporta en sus quelceros mientras busca una posible pareja (Bristowe 1968, Costa-Schmidt et al. 2008). El macho inicia el cortejo y ofrece el regalo a la hembra con mltiples y variados comportamientos ritualizados. Cuando la hembra toma el regalo con sus quelceros (seal de aceptacin) la pareja adopta la posicin de cpula y el macho realiza inserciones alternadas siguiendo patrones especie-especficos con los palpos (Bristowe & Locket 1926, Costa-Schmidt et al. 2008).
El hecho de disponer de nuevos modelos animales con regalo nupcial es sumamente promisorio, ya que permite anlisis comparativos y tambin poner a prueba en nuevos animales la capacidad predictiva de cada una de las hiptesis propuestas para la primera especie analizada, P. mirabilis. Por lo tanto, poder obtener informacin acerca de las estrategias reproductivas de las tres especies mencionadas de Trechaleidae en Uruguay es mucho ms que disponer de nuevas descripciones, ya que habilita realizar estudios comparativos con la especie P. mirabilis de manera de aportar nueva informacin para enriquecer la discusin a la luz de estas hiptesis.
Citogentica El trmino heterocromatina, tal y como lo describi en 1928 Emil Heitz, estaba basado exclusivamente en observaciones histolgicas. Heitz defini la heterocromatina (HC) como regiones compuestas por segmentos cromosmicos que aparecan condensados y oscuros en el ncleo interfsico (heteropicnosis positiva). El resto del ncleo estara ocupado por eucromatina,
o verdadera cromatina, que apareca difusa y ms clara (isopicntica). La eucromatina forma una madeja de fibras de un dimetro que vara durante el ciclo celular, el estadio y la regin cromosmica observada. La eucromatina, en su forma activa, est formada por una fibra cuyo dimetro no supera los 10-11 nm. Este dimetro corresponde al del nucleosoma, que contiene un segmento de ADN bicatenario de 146 pares de bases enrollado alrededor de 4 homodmeros de las histonas H2A, H2B, H3, y H4. Actualmente es conocido que genes que requieren expresarse continuamente (house keeping) se encuentran en la eucromatina (bandas R), mientras que aquellos tejido-especfico que regulan comportamientos u otras actividades similares se hallan en la heterocromatina (bandas G) (Holmquist & Ashley 2006). Dentro de estos genes se encuentran aquellos cuya plasticidad en la expresin y el silenciamiento est asociada a efectos ambientales, incluyndose genes que intervienen en el comportamiento, en el desarrollo, caractersticas heredables que se encuentran ntimamente asociadas al concepto de impronta gentica. Este concepto se basa en la teora de conflicto sexual, sugerida por el bilogo evolutivo y genetista David Haig en 1993 quien propone la existencia de genes improntados como resultado de un conflicto de intereses entre padre y madre, s sta ltima aporta una mayor fuente energtica para el mantenimiento de su progenie (Vrana 2007, Hunter 2007). Esta regulacin que ocurre con la impronta genmica, involucra un complejo reordenamiento en la estructura de la cromatina debido principalmente a metilaciones de citocinas del ADN, importante para la regulacin, control de la replicacin y expresin gnica de clulas eucariotas (Field et al. 2004, Vasco et al. 2008). La espermatognesis corresponde a la diferenciacin de las clulas germinales del
macho desde las espermatogonias hasta espermatozoides maduros, siendo un proceso continuo caracterizado por una etapa premeitica, una etapa meitica y una postmeitica o
espermiognesis (De Robertis et al. 2000). Durante este proceso es que ocurren fenmenos epigenticos (impronta gentica) en algunos alelos de genes segregados por va paterna. En mamferos, durante la
espermatognesis se produce la metilacin monoallica de novo, a diferencia de la hembra en la que que ocurre durante el crecimiento del oocito, es decir, en ausencia de replicacin del ADN (Vasco et al. 2008). En el macho es un proceso continuo que ocurre en las clulas madre espermatognicas en divisin mittica y en los espermatocitos derivados de estas divisiones. Luego de la fecundacin el genoma sufre una reprogramacin postcigtica que ocurre antes de la expresin de genes tejido-especficos. La regulacin de la impronta ocurre entre las clulas germinales y la embriognesis de la descendencia, es decir que el proceso meitico se encuentra involucrado, y es ah donde se puede observar la plasticidad y remodelacin de la cromatina durante la sucesin de estadios que llevan al espermatozoide maduro (Vasco et al. 2008). Las variaciones genticas no slo son tiles para la caracterizacin de especies sino que han demostrado ser eficaces en el estudio de relaciones filogenticas (Giroti et al. 2007, Ramalho et al. 2007, Krl et al. 2006). El estudio de la citogentica en arcnidos, con identificacin cromosmica, se inicia a principios del siglo XX con un trabajo de Wallace (1909). En la actualidad se conoce el nmero cromosmico de 1000 especies de arcnidos aproximadamente, observndose en araas un nmero diploide (2n) entre 7 y 98, y un sistema cromosmico de determinacin del sexo de X 1X20 (macho) y X1X1X2X2 (hembra) (Mola 2005). Algunos estudios realizados revelan que, a pesar de tener una alta diversidad de especies, el orden Araneae presenta sistemas cromosmicos estables y estabilidad cariotpica,
fundamentalmente en lo que se refiere a los cromosomas sexuales (Brum-Zorrilla & Postiglioni 1980). Segn estos autores, esta estabilidad puede estar mediada por una escasa proporcin de heterocromatina respecto a la eucromatina, que prevendra la recombinacin cromosmica y en consecuencia mantendra cierta estabilidad a travs de la evolucin. Los recientes estudios citogenticos en la familia Trechaleidae sugieren que existe alta variacin a nivel de los cromosomas sexuales. Esto ha sido justificado por una serie de hiptesis como la posibilidad de que las especies estudiadas
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representen un complejo de especies cada una con un SDCS diferente, la existencia de cromosomas B, o un polimorfismo intrapoblacional (Giroti et al. 2007).
La informacin cromosmica que actualmente est disponible (Giroti et al. 2007) cuestiona la estabilidad cromosmica en esta familia e impulsa la realizacin de estudios que puedan revelar diferente informacin citogentica. No existen reportes citogenticos de esta familia en Uruguay, por lo tanto resulta importante poder caracterizarlas, de manera de obtener informacin que sirva de base para el estudio de distribucin de la cromatina. Como se mencion antes, en Uruguay existen al menos tres gneros de Trechaleidae, cada uno compuesto hasta ahora por una sola especie. Comparado con otras familias de Lycosoidea, como Lycosidae, con una media de ms de 20 especies por gnero, esta baja cantidad de especies podra estar indicando un nivel de diferenciacin elevado, siendo probable encontrar diferencias cromosmicas, morfolgicas y comportamentales importantes. La informacin encontrada permitir aproximarse a posibles efectos epigenticos que asociaran
comportamientos heredables de alta influencia ambiental con variabilidad en la distribucin de la heterocromatina.
Un enfoque interdisciplinario De acuerdo a lo expuesto resulta de inters poder obtener informacin acerca de las estrategias reproductivas y del comportamiento cromosmico meitico de las tres especies uruguayas pertenecientes a la familia Trechaleidae y de la especie P. mirabilis perteneciente a Pisauridae. Los estudios comportamentales, y en especial la caracterstica heredable regalo nupcial, cuando ste es un contenido alimenticio para la hembra, vislumbra un aspecto fenotpico novedoso que despierta inters para realizar estudios de la cromatina y en especial durante la espermatognesis (meiosis). Este enfoque multidisciplinario permitir enriquecer las discusiones generadas por las diferentes hiptesis planteadas a nivel de la funcin del regalo nupcial en el proceso evolutivo.
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Captulo 1 Introduccin General OBJETIVOS Hiptesis generales Bajo la hiptesis de que el regalo nupcial es un carcter ancestral para Trechaleidae y Pisauridae, ste se mantendr presente en algunas especies pero se habr perdido en otras. Las similitudes comportamentales en el cortejo y cpula evidenciarn este proceso evolutivo. Las especies que no utilicen regalo nupcial durante el cortejo podrn evidenciar tambin modificaciones a nivel citogentico en el comportamiento de los cromosomas sexuales durante la meiosis y/o en la distribucin de heterocromatina condicional.
Objetivo general Conocer el comportamiento sexual (cortejo, cpula y especialmente la presencia y funcin del regalo nupcial) de 3 especies de la familia Trechaleidae en Uruguay, con nfasis en P. ornata. Realizar estudios comportamentales similares en P. mirabilis (Pisauridae) que permitan establecer comparaciones entre ambas familias. Utilizar los datos citogenticos como herramienta para enriquecer y robustecer las comparaciones entre las tres especies de Trechaleidae.
Objetivos especficos A) Estrategias reproductoras Conocer y analizar las estrategias reproductivas de las tres especies de Trechaleidae y de la especie de Pisauridae, registrando la presencia de regalos nupciales y comportamientos asociados mediante un estudio comparativo que permita estimar la evolucin del regalo en la filogenia de la familia y familias vecinas. Enfatizar en el posible origen, funcin y mecanismos de seleccin sexual sobre los regalos nupciales usando como modelos a Paratrechalea ornata y Pisaura mirabilis.
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Hiptesis 1: La presencia o ausencia de regalo nupcial est relacionada con el repertorio del cortejo y cpula de cada especie. Objetivo: Poner a prueba la presencia de regalos nupciales y su relacin con el cortejo y la cpula en las 3 especies pertenecientes a Trechaleidae. Analizar detalladamente todos los comportamientos e interacciones entre machos y hembras adultos, permitiendo comparar stos con los de P. mirabilis (Pisauridae).
Hiptesis 2: La presencia de feromona sexual femenina en la seda estimula la construccin del regalo nupcial por los machos. Objetivo: Analizar la posible relacin entre la construccin del regalo nupcial y la existencia de feromonas de contacto femenina en P. ornata, lo que permitira una adecuacin de los costos de construccin a la presencia cercana de una hembra.
Hiptesis 3: Las cpulas pueden ocurrir sin regalo nupcial, pero la presencia del regalo mejorar la calidad de la cpula y consecuentemente aumentar el xito reproductivo del macho. Objetivo: Investigar frecuencia, caractersticas de las cpulas (duracin, nmero de inserciones palpares), porcentaje de la descendencia en presencia y ausencia de regalo nupcial en P. ornata en el laboratorio.
Hiptesis 4: La envoltura de la presa puede implicar un costo importante para el macho, que podra ser balanceado con la previa ingesta de parte de la presa a donar. Objetivos: Analizar si la envoltura de la presa vara acorde con el estado corporal (alimenticio) del macho e investigar si existen diferencias en las frecuencias de construccin del regalo nupcial cuando los machos de P. mirabilis (estimulados por seda de hembra) se ven expuestos a diferentes tamaos de presa.
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Captulo 1 Introduccin General B) Estudios citogenticos Estudiar la meiosis de machos de Trechaleidae a efectos de identificar: cromosomas sexuales, nmero de cromosomas autosmicos y desarrollo de la meiosis (divisin I y II).
Hiptesis 1: Existen diferencias en el nmero y comportamiento de los cromosomas autosmicos y de los cromosomas sexuales en la meiosis de las tres especies. Objetivo: Identificar los bivalentes autosmicos y los cromosomas sexuales; analizar su comportamiento durante la meiosis.
Hiptesis 2.
La distribucin de la heterocromatina durante la meiosis es diferente entre las
tres especies. Objetivo: Someter el material cromosmico a tcnicas de bandeo cromosmico (bandeo G) a los efectos de conocer la localizacin y distribucin de heterocromatinas ricas en secuencias AT y genes tejido-especfico, y en heterocromatina pericentromrica en las tres especies.
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Captulo 1 Introduccin General Materiales Se colectaron individuos juveniles y subadultos de Trechalea bucculenta, Trechaleoides biocellata y Paratrechalea ornata (Trechaleidae) durante los meses de febrero y mayo 2007, y durante abril, agosto y setiembre 2008, en las reas correspondientes al Arroyo Yerbal Chico (Quebrada de los Cuervos, Departamento de Treinta y Tres, 325530.50S 542733.10W) y al Ro Santa Luca (Paso del Molino, Arequita, Departamento de Lavalleja, 341640.10S 551400.80W), en Uruguay. Adems, se colectaron juveniles y subadultos de Pisaura mirabilis (Pisauridae) durante el mes de abril 2009, en pastizales de la pennsula de Mols, al este de Jutland, Dinamarca. Los individuos pertenecientes a Trechaleidae fueron sexados y mantenidos de forma individual en el laboratorio en frascos de vidrio de 8 cm de dimetro interno y 11 cm de alto, con pequeas piedras que recreaban el ambiente natural. Los individuos subadultos fueron criados en un cuarto caliente (24.4 1.8 C) de forma de acelerar su desarrollo, una vez alcanzada la madurez sexual fueron mantenidos en cuartos con temperatura promedio de 20.4 C ( 2.3 SD), donde se realizaron las experiencias. Se control diariamente la ocurrencia de mudas y se los aliment semanalmente con una dieta variada de termitas (Nasutitermes sp., Isoptera), de moscas de la fruta (Drosophila melanogaster), moscas (Musca domestica, Diptera) y larvas (Tenebrio molitor, Coleoptera), en nmero acorde al tamao corporal de la especie. Se les suministr agua diariamente con un algodn. Los juveniles y subadultos de Pisauridae fueron criados en el laboratorio en tubos de plstico (30 ml) conteniendo musgo ( Sphagnum sp.) que simulaba las condiciones naturales y aportaba humedad a los animales. Los machos y las hembras fueron colocados en cuartos alejados para evitar posibles efectos de feromonas voltiles. Los individuos fueron mantenidos bajo temperatura controlada (20C de promedio) y fotoperodo natural. Se los aliment con 3 moscas domsticas ( Musca domestica) por semana (excepto en los individuos sometidos experimentalmente a una alimentacin diferencial), se les suministr agua diariamente y se control la existencia de mudas Para todas las experiencias se utilizaron hembras y machos vrgenes, excepto en aquellas que se experiment con T. biocellata y T. buccullenta que debido a la baja densidad
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encontrada a campo, se obtuvieron escasos ejemplares y se utilizaron hembras y machos adultos de campo, cuyo pasado reproductivo no era conocido. Las observaciones fueron llevadas a cabo bajo condiciones de laboratorio, durante los aos 2007, 2008 y 2009. Se utilizaron dos tipos de recipientes experimentales con la familia Trechaleidae. Botellas de plstico transparentes (captulo 2.2) colocadas de forma horizontal de 9 cm dimetro y 35 cm de largo (Fig. 1a) y recipientes de vidrio (captulo 2.1 y 2.3) de 30 x 14 cm de base y 20 cm de alto (Fig. 1b), ambos conteniendo piedras y agua en su base simulando las condiciones ribereas. Para P. mirabilis se utilizaron recipientes de plstico de 22 x 17 cm de base y 6 cm de altura, estando la base cubierta con papel absorbente (Fig. 1c).
Figura 1. a) Botella de plstico experimental adecuada con piedras en su base utilizada para experiencias de P. ornata (Foto: M.J. Albo). b) Caja de vidrio experimental con pequeas piedras utilizada para las experiencias de P. ornata, T. bucculenta y T. biocellata (Foto: A. Klein). c) Caja de plstico experimental con papel de filtro en su base utilizada para las experiencias de P. mirabilis (Foto: M.J. Albo).
Algunos individuos representativos (machos, hembras y ninfas) sern depositados en la coleccin aracnolgica de la Facultad de Ciencias, Montevideo, Uruguay.
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Captulo 1 Introduccin General Analisis estadsticos Los resultados se analizaron utilizando los paquetes estadsticos Past (Hammer et al. 2003) y JMP7 (SAS Institute, Inc. Cary, NC). La normalidad y homogeneidad de varianzas fueron puestas a prueba con los tests de Shapiro-Wilk y Levene, respectivamente. Para las comparaciones de promedios se utiliz el test de la U de Mann-Whitney para datos no paramtricos y el test de t de Student para 2 muestras independientes en caso de datos paramtricos. Las frecuencias de muestras independientes fueron comparadas con el test de Chi cuadrado (con correccin de Yates) y el Test de probabilidad exacta de Fisher. Para comparar los resultados de los mismos machos antes y despus, se utiliz el test global de Kruskal Wallis (si datos no paramtricos) ANOVA (si datos paramtricos). Cuando correspondi, se realizaron comparaciones pareadas usando Wilcoxon o Test de t de Student para muestras pareadas; as como ANCOVA, regresiones lineales y anlisis de correlacin. Los datos fueron transformados siempre que fue necesario.
Literatura Andersen, T., Bollerup, K., Toft, S. & Bilde, T. 2008. Why do males of the spider Pisaura mirabilis wrap their nuptial gifts in silk: female preference or male control? Ethology 114, 775-781. Austad, S.N. & Thornhill, R. 1986. Female reproductive variation in a nuptial-feeding spider, Pisaura mirabilis. Bulletin of the British Arachnology Society 7, 48-52. Bastos-Pereira, R. 2009. Comportamento sexual e a importancia do presente nupcial na reproducao de Thaumasia sp. nov. (Araneae: Pisauridae). Tesis de Maestra, Universidad de Brasilia. Bilde, T., Tuni, C., Elsayed, R., Pekar, S. & Toft, S. 2006. Death feigning in the face of sexual cannibalism. Biological Letters 2, 23-35.
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Captulo 2 Estrategias Reproductoras
CAPITULO 2 - ESTRATEGIAS REPRODUCTORAS
2.1- REGALO NUPCIAL, CORTEJO, CPULA Y TCTICAS SEXUALES: IMPLICANCIAS EVOLUTIVAS EN CUATRO ESPECIES DE ARAAS (TRECHALEIDAE Y PISAURIDAE) Introduccin Las araas son uno de los grupos megadiversos mejor estudiados y conocidos en lo que respecta a sus relaciones filogenticas (Coddington y Levi 1991). Los caracteres taxonmicos tradicionalmente estudiados son los morfolgicos, aunque ms recientemente los trabajos con caracteres moleculares se han incrementado, aportando nuevas perspectivas a las filogenias ya existentes (Vink et al. 2002, Giribet et al. 2001, Chang et al. 2007, Murphy et al. 2006). No obstante, aunque infrecuente en arcnidos e insectos, se han usado caracteres
comportamentales para realizar aproximaciones filogenticas (Eberhard 1981, Riede 1987, Stratton et al. 1996). Ms an, los caracteres comportamentales pueden conducir a la diferenciacin de grupos (Morrone 2000) y se puede utilizar la combinacin de caracteres morfolgicos y etolgicos para determinar si la aparicin de uno facilit la evolucin del otro (Maddison 1996). Se ha encontrado que comportamientos sexuales tales como posiciones de cpula, patrones de insercin, duracin de la cpula, entre otros, son caracteres tiles para establecer relaciones filogenticas (Stratton et al. 1996). Los regalos nupciales en forma de presa (comnmente envuelta en seda) donados por los machos a las hembras son un carcter comportamental nico y poco estudiado en las araas. Tanto en Trechaleidae como en Pisauridae los machos realizan conspicuos y variados comportamientos ritualizados para donar los regalos nupciales durante el cortejo y la cpula. Segn Bristowe & Locket (1926), y Lang (1996) el cortejo del macho en P. mirabilis consiste en rpidas vibraciones de las primeras y segundas patas sobre el sustrato, acompaado de intensas vibraciones del abdomen. Una vez que la hembra acepta el cortejo y muerde el regalo, el macho inicia la posicin de cpula e inserta uno de los palpos. Costa-Schmidt et al. (2008) destac algunas similaridades del cortejo de P. mirabilis compartidas con las especies del gnero Paratrechalea, aunque tambin destac la existencia de diferencias, como la tanatosis
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del macho, slo observada en P. mirabilis (Bristowe 1958, Stlhandske 2001, Bilde et al. 2006) . Por otro lado, en lo que refiere a la cpula y los tiempos de cpulas, en general se ha observado que algunas especies de Pisauridae comparten la misma posicin y similares tiempos de cpula que especies pertenecientes a Lycosidae (Stratton et al. 1996), mientras que otras como Pisaura mirabilis y Thaumasia sp. muestran una postura de cpula diferente y ms prolongada (Bristowe & Locket 1926, Bastos-Pereira 2009). La clasificacin y filogenia de las especies pertenecientes a Pisauridae y Trechaleidae ha sido ampliamente discutida (Dondale 1986, Sierwald 1990, Griswold 1993, Carico 2005). Algunos de los gneros que actualmente pertenecen a la familia Trechaleidae ( Trechalea, Hesydrus, Syntrechalea, Dossenus, Paradossenus, Dyrines y Enna), fueron originalmente clasificados dentro de la familia Pisauridae (Simn 1890). Estudios morfolgicos en el gnero Trechalea, un anlisis cladstico de la superfamilia Lycosoidea y una lista de las sinapomorfas compartidas por Trechalea con la familia Lycosidae sugieren que este grupo representa un taxn diferente a Pisauridae (Dondale 1986, Sierwald 1990, Griswold 1993). Adems se sugiere que Trechaleidae sera grupo hermano de Lycosidae (Griswold 1993), compartiendo el carcter etolgico: transporte de la ooteca por las hembras en el abdomen. Trechaleidae fue revalidada por Carico en 1986, agrupndose dentro de este clado especies que mayoritariamente viven asociadas a cursos de agua dulce (Carico 2005). Pisauridae tambin contiene especies semiacuticas (gneros Dolomedes, Thalassius, Thaumasia) y se caracteriza por la construccin de una telaraa o nido de cra (nursery web) que realizan las hembras cuando emergen las araitas de la ooteca. En Uruguay se han indicado slo dos especies pertenecientes a Trechaleidae, Trechaleoides keyserlingi y Paratrechalea ornata (Capocasale & Pereira 2003). Trabajos de campo recientes realizados por M.J. Albo y F.G. Costa sugieren la presencia de ms especies, habindose encontrado coexistiendo con P. ornata en cursos de agua dulce, dos especies de gneros diferentes: Trechaleoides biocellata y Trechalea bucculenta. Se ha encontrado que en
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las poblaciones uruguayas de P. ornata existe tambin regalo nupcial (M.J. Albo & F.G. Costa, observaciones personales) y Costa-Schmidt et al. (2008) reporta observaciones en T. bucculenta, y ha sugerido que el regalo sera ancestral para la familia Trechaleidae. Se desconoce la existencia de regalo nupcial en T. biocellata y adems nada se sabe acerca de detalles comportamentales del cortejo y cpula en estas tres especies de Uruguay. Sumado a esto Costa-Schmidt & Araujo (2008) ha sugerido que la poblacin presente en Uruguay es verdaderamente P. ornata y que la descrita por Costa-Schmidt et al. (2008) en Brasil es una nueva especie, por lo que se hace imprescindible una descripcin de la poblacin uruguaya. Costa-Schmidt et al. (2008) ha sugerido que el regalo sera ancestral, una sinapomorfa para la familia Trechaleidae. Por otro lado, desde la perspectiva de los estudios nombrados con anterioridad, donde Trechaleidae y Lycosidae (sta sin presencia de regalos) se consideran familias hermanas (Dondale 1986, Sierwald 1990, Griswold 1993), el regalo nupcial sera una convergencia para Pisauridae y Trechaleidae. Sin embargo, debido a la discusin acerca de la cercana filogentica de Trechaleidae y Pisauridae, fue de inters realizar un estudio comparativo detallando el comportamiento sexual en ambas familias, tomando como modelos las tres especies pertenecientes a Trechaleidae (P. ornata, T. bucculenta y T. biocellata) y una Pisauridae (P. mirabilis). De esta forma en el presente estudio se describen nuevos caracteres comportamentales que permitirn realizar nuevas hiptesis acerca del origen evolutivo del regalo nupcial dentro de Trechaleidae y sobre las relaciones filogenticas entre estas dos familias pertenecientes a Lycosoidea. Mtodos Para investigar la existencia e implicancias del regalo nupcial durante el cortejo y la cpula de las cuatro especies, se expusieron 21 machos de Paratrechalea ornata, 20 machos de Pisaura mirabilis, 8 machos de Trechaleoides biocellata y 3 machos de Trechalea bucculenta con una presa capturada (mosca o polilla) frente a una hembra co-especfica (21 hembras de P. ornata, 20 hembras de P. mirabilis, 8 hembras de T. biocellata y 3 hembras de T. bucculenta). Un da
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previo a la experiencia, la hembra fue colocada en el recipiente experimental (captulo 1Materiales) permitiendo la habituacin y la deposicin de seda (la cual, al contener feromonas, estimula el comportamiento sexual del macho). Simultneamente, el macho fue alimentado con una mosca (Drosophila melanogaster o Musca domestica, dependiendo de la especie) de forma de evitar condiciones altas de hambre. Para la propia observacin experimental cada macho recibi una mosca viva (Drosophila melanogaster o Musca domestica, dependiendo de la especie) y fue transferido al recipiente experimental inmediatamente despus de capturar la presa. El macho fue inicialmente expuesto slo a la seda de la hembra, aislado de la hembra por una pared opaca de vidrio (para evitar el contacto inmediato entre sexos y permitir al macho empaquetar la presa antes de encontrar a la hembra). Luego de 15 minutos se extrajo la barrera, permitiendo el encuentro macho-hembra con el regalo ya construido. En el caso que no empaquetara la presa, se permiti que el macho encontrara a la hembra transportando la presa sin empaquetar. De esta manera, los machos encontraron a las hembras en dos condiciones: con la presa empaquetada en seda o sin empaquetar. Los individuos no fueron re-utilizados. Cada experimento fue finalizado cuando la cpula termin o luego de una hora de ausencia de interacciones. Se registraron en planillas mediante observacin directa todos los comportamientos y las interacciones entre los individuos. Se previ el registro de los comportamientos ya descritos (ver Costa-Schmidt et al. 2008), especialmente la ocurrencia de envoltura en seda de la presa, las caractersticas y frecuencia de cortejo del macho, la presencia y postura del ofrecimiento de la presa/regalo durante el cortejo, la frecuencia de ataques de la hembra hacia el macho, la ocurrencia y postura de receptividad femenina, los movimientos de quelceros de la hembra, la ocurrencia y caractersticas de la cpula, y el uso del tercer par de patas del macho durante la cpula.
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Captulo 2 Estrategias Reproductoras Resultados Durante el cortejo el macho ofreci el regalo (presa envuelta o sin empaquetar) a la hembra. En P. ornata y T. bucculenta el macho ofreci el regalo replegando el primer y segundo par de patas hacia atrs de forma que los fmures quedaron paralelos al cuerpo (hiperflexin; Fig. 2a y 2b). Un macho de T. biocellata realiz tambin hiperflexin a pesar de no tener presa (Tabla 1; Fig. 2c). En P. mirabilis el macho se posicion en frente a la hembra con palpos, primer y segundo par de patas elevadas, apoyando el abdomen en el sustrato (sentado) y permaneciendo con su cuerpo de forma casi vertical (Fig. 2d). En ambas posiciones el regalo qued expuesto hacia la hembra, que al tomarlo tambin realiz hiperflexin y la pareja qued cara a cara tomada del regalo (Fig. 3). A partir de ese momento, macho y hembra intercambiaron vibraciones y toqueteos con el primer y segundo par de patas.
Figura 2. Machos de Trechaleidae y Pisauridae (indicados con flecha blanca) durante el cortejo adoptando la posicin de ofrecimiento del regalo nupcial, a) Paraterchalea ornata, b) Trechalea bucculenta, c) Trechaleoides biocellata y d) Pisaura mirabilis. Fotos: M.J. Albo.
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Figura 3. Macho (derecha) y hembra (izquierda) de a) P. ornata y b) P. mirabilis tomados del regalo nupcial durante el cortejo. Fotos: M.J. Albo.
Figura 4. Machos de a) P. ornata y b) T. bucculenta y c) P. mirabilis una vez finalizada la construccin del regalo nupcial. Fotos: M.J. Albo.
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La Tabla 1 muestra la frecuencia de ocurrencia de 7 unidades comportamentales de cortejo y cpula en las cuatro especies estudiadas, destacndose la ausencia de
empaquetamiento y ofrecimiento de la presa en T. biocellata. Considerando conjuntamente las cuatro especies, se encontraron diferencias significativas en la frecuencia de construccin del regalo nupcial (empaquetado en seda de la presa, Fig. 4) (2yates = 26.9, p < 0.001, gl = 3). En las comparaciones de a pares y utilizando el test de Fisher, se encontr que T. biocellata envolvi con menos frecuencia que P. ornata y que P. mirabilis (p = 0.005 y p < 0.001, respectivamente), mientras que no difiri de T. bucculenta (p = 0.27). P. mirabilis envolvi con ms frecuencia que P. ornata (p = 0.0008) y que T. bucculenta (p = 0.01). P. ornata y T. bucculenta no difirieron entre s (p = 0.43). Tres machos de P. ornata y uno de T. bucculenta ofrecieron a la hembra la presa sin empaquetar en seda, mientras que no se observ este ofrecimiento en T. biocellata ni en P. mirabilis, encontrndose diferencias significativas de frecuencias (2yates = 28.7, p < 0.001, gl = 3). Cuando se analizaron las frecuencias de a pares (Test de Fisher) T. biocellata difiri de P. ornata y de P. mirabilis (p = 0.0007 y p < 0.0001, respectivamente), pero no de T. bucculenta (p = 0.27). P. mirabilis ofreci con menor frecuencia que P. ornata y que T. bucculenta (p = 0.01, en ambos casos), mientras que no hubieron diferencias entre P. ornata y T. bucculenta (p = 0.24). En presencia de la hembra cinco de los ocho machos de T. biocellata abandonaron la presa y continuaron el cortejo, mientras que esto no fue observado nunca para las otras especies.
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Tabla 1. Ocurrencia de envoltura de la presa, ofrecimiento del regalo, cortejo y vibraciones del primer y segundo par de patas (patas I y II), hiperflexin del macho, ataques de la hembra, cpula y uso del tercer par de patas por parte del macho, durante cortejo y cpula de Paratrechalea ornata, Trechalea bucculenta, Trechaleoides biocellata y Pisaura mirabilis. *Tres machos ofrecieron presas sin empaquetar en P. ornata y uno en T. bucculenta. Paratrechalea ornata (n = 21) Macho empaqueta presa en seda Macho ofrece regalo a hembra Cortejo de machoVibraciones patas I y II Macho hiperflexin Ataques de hembras a machos Cpulas Macho engancha regalo con pata III durante la cpula 15 8 15 15 1 1 1 1 1 4 3 0 20 8 20 20 12 15* 21 Trechalea bucculenta (n = 3) 1 1* 3 Trechaleoides biocellata (n = 8) 0 0 6 Pisaura mirabilis (n = 20) 20 20 20
Aunque la mayora de los machos de las cuatro especies cortejaron a las hembras vibrando el primer y segundo par de patas, se encontraron diferencias en sus frecuencias de ocurrencia (2yates = 11.44, p = 0.01, gl = 3). En la comparacin de a pares (test de Fisher) T. biocellata no difiri (aunque cerca del lmite de significacin) de P. ornata (p = 0.07) ni de P. mirabilis (p = 0.07), mientras que claramente no difiri de T. bucculenta (p = 0.50) (Tabla 1). Tampoco se encontraron diferencias en las frecuencias de ocurrencia de vibraciones entre P. mirabilis respecto a P. ornata y a T. bucculenta, ni entre P. ornata y T. bucculenta (p = 1 para todos los casos). Sin embargo se observ que durante el cortejo los machos de P. ornata, T. buccullenta y P. mirabilis realizaron vibraciones similares, rpidas e intensas sobre el sustrato, mientras que los machos de T. biocellata vibraron las patas anteriores de forma lenta, elevndolas y oscilndolas en el plano sagital. En las cuatro especies se observaron hembras
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Captulo 2 Estrategias Reproductoras realizando ataques hacia el macho, sin presentar frecuencias de ocurrencia diferentes (2yates = 0.42, p = 0.94, gl = 3) (Tabla 1). Estos ataques consistieron en saltos rpidos y repentinos sobre el macho, que ste evit. En los ataques las hembras contactaron con sus patas la zona anterior del cefalotrax de los machos. Luego de cada ataque, macho y hembra quedaron enfrentados y frecuentemente el macho qued inmvil y pocos segundos despus inici el cortejo, vibrando el primer y segundo par de patas sobre la hembra y ofreciendo el regalo. Una hembra de P. mirabilis logr morder el regalo durante el ataque y el macho inicio entonces la cpula. Con excepcin de T. biocellata, los machos ofrecieron el regalo en sus posturas caractersticas, mientras la hembra permaneci inmvil. En P. ornata, T. bucculenta y P. mirabilis se observ al menos una vez que las hembras enfrentadas a machos movieron conspicuamente los quelceros (abriendo y cerrando stos). Este comportamiento no fue registrado para T. biocellata. Las posiciones copulatorias fueron similares entre las Trechaleidae ( P. ornata, T. bucculenta y T. biocellata), mientras que la posicin de la Pisauridae (P. mirabilis) fue diferente (Fig. 5). Los machos y hembras de P. ornata y T. bucculenta tironearon del regalo hasta que el macho enganch las uas de su tercer par de patas en el regalo y mont a la hembra, una vez ubicado sobre la hembra el macho insert uno de sus rganos copuladores en el orificio correspondiente al mismo lado de la genitalia femenina (palpo derecho en el orificio genital derecho de la hembra, palpo izquierdo en orificio genital izquierdo). En P. mirabilis una vez que macho y hembra estuvieron tomados del regalo, el macho comienza a vibrar fuerte su cuerpo empujando el regalo, empujando a la hembra y elevndola hasta una posicin casi vertical. De la misma forma que en las otras especies el macho enganch el tercer par de patas en el regalo, aunque en vez de montar a la hembra se posicion por debajo de ella e insert el palpo en el orificio genital femenino (derecho con derecho, izquierdo con izquierdo). En T. biocellata la monta y la posicin copulatoria fueron similares a las otras dos especies de Trechaleidae. No se pudo registrar el uso del tercer par de patas en esta especie.
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Se obtuvo una nica cpula en T. bucculenta y tres cpulas en T. biocellata, y todas presentaron una nica insercin durante 1.0 min y 0.4 min ( 0.3 SD), respectivamente (medida desde la insercin del palpo hasta el desacople del mismo). Por el contrario, las cpulas de P. ornata y de P. mirabilis consistieron de varias inserciones alternadas (2.5 1.5, N = 14 y 3.4 1.3, N = 16, respectivamente), sin presentar diferencias significativas (pero cercanas al lmite de significacin) al test de Mann-Whitney (U = 68, p = 0.06). En P. mirabilis se registraron 4 casos de inserciones muy numerosas (40.0 61.3 SD, rango 15 - 146). La duracin promedio de cada insercin fue 1.1 min. ( 0.8 SD; N = 14) en P. ornata y 73.6 min. ( 30.6 SD; N = 16) en P. mirabilis, siendo significativamente ms prolongadas en P. mirabilis (U = 0, p < 0.0001). En ambas especies, al finalizar cada insercin, el macho retom la posicin frente a frente con la hembra y volvi a tomar el regalo con sus quelceros, pudiendo permanecer en esta posicin varios minutos. Usualmente, insert luego el otro palpo. La duracin de la cpula, que incluy todo el perodo desde la primera insercin hasta el final de la ltima insercin, fue menor en P. ornata (5.9 min 6.6 SD) que en P. mirabilis (76.3 min 31.5 SD) (N = 14, N = 20, U = 1, p < 0.0001).
Figura 5. Posiciones copulatorias de a) Trechaleidae y b) Pisauridae. Fotos: M.J. Albo.
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Captulo 2 Estrategias Reproductoras Discusin La envoltura en seda de una presa como forma de regalo nupcial en Trechaleidae se confirma para Paratrechalea ornata y Trechalea bucculenta, aunque los machos de estas especies pueden eventualmente ofrecer la presa sin empaquetar y ser aceptados por las hembras. La ausencia de ofrecimiento de presa (con o sin empaquetar) en Trechaleoides biocellata, sumado a las observaciones en las que el macho abandon la presa y continu el cortejo hacia la hembra (nunca observado para especies donadoras de regalos) y a la ausencia de observaciones de transporte de regalo nupcial por machos en la naturaleza (G. Machado, L.E. Costa-Schmidt, M.J. Albo y F.G. Costa, observaciones personales), sugieren la ausencia de regalo nupcial en el cortejo de esta especie. Ms an, el hecho de que los machos activamente descarten la presa durante el cortejo, ha sido observado en el licsido Aglaoctenus lagotis, donde no se ha registrado ofrecimiento de regalos nupciales (A. Aisenberg, observaciones personales). Por otro lado, los resultados muestran que el tipo de vibraciones del primer y segundo par de patas durante el cortejo, la ocurrencia de movimientos de quelceros de las hembras frente al macho y el uso particular del tercer par de patas durante la cpula, fueron comportamientos comunes en P. ornata y T. bucculenta, pero no para T. biocellata. Esta ltima mostr tener un patrn similar de vibraciones al observado en el Pisauridae no donador de regalos Dolomedes triton (Roland & Rovner 1983) y que adems son tambin comunes en Lycosidae (Costa 1975, 1998). Hasta donde alcanza nuestro conocimiento, los movimientos de quelceros por la hembra durante el cortejo no han sido reportados para otras especies de araas, aunque no puede descartarse su presencia debido al alto grado de detalle requerido para este tipo de observaciones. Sin embargo el mismo observador (M.J. Albo) no registr estos movimientos en T. biocellata pero s en las otras especies, por lo que se sugiere podran estar relacionados con la obtencin del regalo nupcial por parte de la hembra, recordando los llamados movimientos de intencin (Tinbergen 1951). Finalmente aunque el macho puede copular sin regalo en P. ornata, ste necesita del regalo para poder realizar cpulas ms exitosas (Albo & Costa en
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prensa). Los resultados sugieren que el uso del tercer par de patas sobre el regalo es fundamental. Se ha observado el uso del tercer par de patas durante la construccin del regalo nupcial, as como durante la cpula en P. ornata (Costa-Schmidt et al. 2008, Albo & Costa en prensa) y ahora en T. bucculenta. Las presentes observaciones indican el uso del tercer par de patas actuando como soporte o punto de apoyo, y permitiendo a los machos mantenerse en la posicin de cpula. Ms an, en P. ornata se observ el uso del tercer par de patas en cpulas sin regalo, donde el macho apoya el tercer par de patas en las partes bucales de la hembra durante las inserciones (Albo & Costa en prensa), tal como si el regalo estuviera presente. Se desconoce este comportamiento en otras especies de araas. Los ataques de las hembras fueron observados en las tres especies de Trechaleidae, y se ha sugerido que stos podran indicar a la hembra la presencia de regalo (Albo & Costa en prensa). En estos ataques las hembras parecen contactar siempre la zona frontal del macho, donde transporta el regalo. Los ataques son seguidos de una quietud del macho y muchas veces una posicin de hiperflexin, pudiendo estar relacionada con una postura derivada de un comportamiento de defensa que se modific para ofrecer la presa a las hembras que solicitan el regalo. Por otro lado, durante la hiperflexin (descrita y definida por Costa-Schmidt et al. 2008) el macho de P. ornata presenta la presa de manera evidente y exagerada frente a la hembra, exponiendo el regalo en primer plano y apenas distinguindose su cuerpo desde una vista frontal. Estas similitudes observadas para las dos especies donadoras de regalos en Trechaleidae (comportamientos de ataques e hiperflexin) y que fueron tambin observados en T. biocellata podran sugerir que el regalo nupcial es un carcter ancestral para la familia Trechaleidae (concordando con Costa-Schmidt et al. 2008) y una prdida secundaria en esta especie. Bajo esta hiptesis, tanto los ataques como la hiperflexin seran comportamientos ritualizados que habran evolucionado de forma de incrementar la claridad de la seal de bsqueda y ofrecimiento del regalo, y se mantendran en T. biocellata a pesar de la prdida de la seal, el regalo. Dado que existen 76 especies en la familia Trechaleidae (Platnick 2009) y slo se han descrito hasta ahora cuatro especies con regalos nupciales ( Paratrechalea ornata,
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Paratrechalea azul, Paratrechalea galianoae y Trechalea bucculenta; Costa-Schmidt et al. 2008), son necesarios estudios en nuevas especies para poder fortalecer esta hiptesis. Por otro lado, los resultados nos permiten una comparacin comportamental primaria de Trechaleidae con Pisauridae, en base a los datos obtenidos de la especie Pisaura mirabilis, donde se registr un 100% de xito en la construccin del regalo nupcial. Las diferencias en ocurrencia de envoltura en seda entre P. ornata y P. mirabilis pudieron deberse a las condiciones de alimentacin diferencial de ambas especies (ver captulo 1- Materiales). En P. mirabilis los machos estaban en mejores condiciones fsicas de empaquetar la presa en seda y construir el regalo, mientras que los machos de P. ornata parecieron invertir ms tiempo manipulando la presa (probablemente comiendo). Estudios en P. mirabilis confirman que la ausencia de envoltura tambin sucede en sta especie (Bilde et al. 2007). El tipo de vibraciones del primer y segundo par de patas, fue similar entre Trechaleidae ( P. ornata y T. bucculenta) y Pisauridae (P. mirabilis) y adems han sido descritas recientemente por Bastos-Pereira (2009) en la especie Thaumasia sp. (Pisauridae), tambin donadora de regalos. Los ataques de las hembras y la ocurrencia de movimientos de quelceros de stas, tambin fueron comunes para las especies donadoras de regalos nupciales incluyendo a P. mirabilis. Como fue planteado con anterioridad los ataques podran estar vinculados a una bsqueda del regalo por parte de la hembra. Ms an, en un caso en P. mirabilis la hembra logr morder el regalo durante el ataque, sucediendo la cpula inmediatamente despus y esto ha sido observado tambin en P. ornata (M. Trillo y M.J. Albo, observaciones personales). Se ha observado el uso del tercer par de patas durante la cpula tambin en P. mirabilis, confirmando lo observado por Bristowe & Locket (1926). De las observaciones en este trabajo se desprende que el tercer par de patas funcionara como un punto de apoyo para el macho, pero que adems servira a modo de enganche en el regalo asegurando al macho la permanencia en cpula. Esta interpretacin coincide con la hiptesis de control de la cpula por parte del macho sugerido por Andersen et al. (2008) en donde el empaquetado en seda del regalo de los machos de P. mirabilis evitara
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que la hembra escape con ste antes de completar la transferencia espermtica. Trechaleidae y Pisauridae comparten caracteres que los distinguen de Lycosidae, como la presencia de apfisis retrolateral y presencia de tarso flexible en las frecuentes especies semiacuticas, sugerido como una adaptacin para caminar por la superficie del agua (Griswold 1993, Carico 1993). Sumado a esto sabemos que las hembras de P. ornata, T. biocellata y P. mirabilis cuelgan la ooteca una vez que las primeras ninfas comienzan a emerger (Stlhandske 2001, Albo y Costa, observaciones personales). Nuestro trabajo agrega a lo ya reportado por Dondale (1986), Sierwald (1990) y Griswold (1993), cuatro comportamientos compartidos por las familias, sumando en total 7 caracteres comunes. Por otro lado, se conoce que ambas familias difieren en: 1) la forma de transportar la ooteca: mientras las hembras de Trechaleidae y Lycosidae la cuelgan de las hileras (Carico 1993), las hembras de Pisauridae mantienen la ooteca en los quelceros hasta la emergencia de las ninfas (Austad y Thornhill 1986, Stlhandske 2001). 2) La construccin de u n nido de cra o nursery web, las hembras hilan una tela en donde permanecern las ninfas al emerger, y 3) el comportamiento de tanatosis de machos, donde estos parecen estar muertos y son arrastrados por las hembras durante la cpula. Estos dos ltimos caracteres presentes slo en Pisauridae (Bristowe & Locket 1926, Bilde et al. 2006). Nuestros resultados suman tres diferencias comportamentales entre ambas familias: 1) La posicin de ofrecimiento de la presa, 2) la posicin de cpula y 3) la duracin de la cpula, generndose en total al menos 6 diferencias entre ambas familias. Las mismas posturas de ofrecimiento de presa y cpula observadas aqu fueron encontradas en el Pisauridae Thaumasia sp. (Bastos-Pereira 2009). Sin embargo en otros gneros de Pisauridae como Thalassius, Dolomedes y Pisaurina, que no presentan regalo nupcial, la posicin y duracin de cpula fueron similares a las reportadas para Lycosidae y Trechaleidae (Stratton et al. 1996). Estas diferencias en el ofrecimiento del regalo nupcial y la postura copulatoria de P. mirabilis y Thaumasia sp. respecto a los otros Pisauridae podran explicarse por alguna adaptacin ecolgica particular de estas dos especies. P. mirabilis vive en pastos altos y usualmente
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durante la cpula ambos sexos cuelgan de forma vertical al suelo (M.J. Albo, observaciones personales), lo que podra explicar la postura del macho a la hora de realizar la insercin. Stratton et al. (1996) observaron que la duracin de la cpula es diferente en especies que habitan cuevas que en especies que no lo hacen. P. mirabilis podra haber desarrollado cpulas ms prolongadas dado que en la naturaleza stas suceden usualmente dentro de la vegetacin, en donde los individuos estaran ms protegidos de depredadores. Nada se sabe de las cpulas de Thaumasia sp. en la naturaleza, pero podran tambin estar relacionadas a este factor. Finalmente, se ha reportado que Trechaleidae comparte con Lycosidae tres caracteres morfolgicos, que excluyen a Pisauridae, justificando la cercana de las dos primeras (Griswold 1993). En este estudio los nuevos datos comportamentales evidencian nuevas semejanzas entre Pisauridae con Trechaleidae, que podran afectar las relaciones filogenticas propuestas (Dondale 1986, Sierwald no son 1990 y Griswold con 1993). En tal sentido, los resultados en datos
comportamentales
congruentes
clasificaciones
previas
basadas
morfolgicos y algunos comportamentales. Considerando que los caracteres comportamentales sumados a los aspectos ecolgicos propios de cada especie pueden conducir a la diferenciacin de grupos (Morrone 2000), nuevos estudios multidisciplinarios que incluyan datos
comportamentales, morfolgicos y moleculares permitirn mejorar estas estimaciones de parentesco.
Agradecimientos Se agradece a Anita Aisenberg, Soledad Ghione, Alicia Postiglioni, Rodrigo Postiglioni y Carlos Toscano-Gadea por su colaboracin en la colecta de araas. Se agradece a Maria. J. Ferreiro, Santiago Ruiz y Rafael Cantera del Departamento de Biologa del Neurodesarrollo del IIBCE por gentilmente brindarnos las moscas Drosophila spp.
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Captulo 2 Estrategias Reproductoras Literatura Albo, M.J. & Costa, F.G. (en prensa). Nuptial gift giving behaviour and male mating effort in the Neotropical spider Paratrechalea ornata (Trechaleidae). Animal Behaviour. Andersen, T., Bollerup, K., Toft, S. & Bilde, T. 2008. Why do males of the spider Pisaura mirabilis wrap their nuptial gifts in silk: female preference or male control? Ethology 114, 775- 781. Austad, S.N. & Thornhill, R. 1986. Female reproductive variation in a nuptial-feeding spider, Pisaura mirabilis. Bulletin of the British Arachnology Society 7, 48-52. Bastos-Pereira, R. 2009. Comportamento sexual e a importancia do presente nupcial na reproducao de Thaumasia sp. nov. (Araneae: Pisauridae). Tesis de Maestra, Universidad de Brasilia. Bilde, T., Tuni, C., Elsayed, R., Pekar, S. & Toft, S. 2006. Death feigning in the face of sexual cannibalism. Biological Letters 2, 23-35. Bilde, T., Tuni, C., Elsayed, R., Pekar, S. & Toft, S. 2007. Nuptial gifts of male spiders: sensory exploitation of females maternal care instinct or foraging motivation?. Animal Behaviour 73, 267-273. Bristowe, W.S. 1958. The world of spiders. London: Collins. Bristowe, W.S. & Locket, G.H. 1926. The courtship of British Lycosid spiders, and its probable significance. Proceedings of the Zoology Society 22, 317-347. Capocasale, R.M. & Pereira, A. 2003. Diversidad de la biota uruguaya. Araneae. Anales del Museo Nacional de Historia Natural y Antropologa, Montevideo 10, 1-32. Carico J.E. 1993. Revision of the genus Trechalea Thorel (Araneae, Trechaleidae) with a review of the taxonomy on the Trechaleidae and Pisauridae of the western hemisphere. Journal of Arachnology 21, 226-257.
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Captulo 2 Estrategias Reproductoras 2.2- LA FEROMONA SEXUAL FEMENINA Y SU EFECTO SOBRE LA CONSTRUCCIN DEL REGALO NUPCIAL EN Paratrechalea ornata (TRECHALEIDAE)
Introduccin Es bien conocido en los artrpodos que la presencia de seales qumicas emitidas por las hembras promueve la atraccin y el cortejo de los machos (Lfstedt 1993, Foelix 1996, Huber 2005, Gaskett 2007). En araas es comn la existencia de semioqumicos como feromonas sexuales de contacto en los hilos de seda liberados por las hembras (Schulz 2004, Huber 2005, Gaskett 2007). Las feromonas sexuales tienen un rol importante promoviendo la bsqueda y el cortejo del macho, previniendo ataques por parte de las hembras e incrementando las chances de encuentro y cpula entre sexos (Platnick 1971). Las feromonas tambin informan a los machos acerca de las caractersticas de las hembras, como el estatus reproductivo o la edad (Roberts & Uetz 2005, Stoltz et al. 2007, Baruffaldi & Costa, en prensa). La informacin en estos semioqumicos puede ser particularmente importante en especies de araas en las que los machos invierten en cortejos exuberantes, incluyendo especies que ofrecen regalos nupciales (Lang 1996). Evidencia indirecta de previos trabajos en la araa terrestre P. mirabilis indican que la construccin del regalo nupcial por parte del macho es promovida por la presencia de rastros sexuales, probablemente feromonas sexuales asociadas a la seda de la hembra (Bristowe 1958, Lang 1996, Stlhandske 2001, 2002, Prokop, 2006). Sin embargo esa evidencia no existe para las especies semiacuticas del gnero Paratrechalea. En general, las feromonas sexuales de araas son consideradas solubles en agua y otros solventes polares (Schulz, 2004; Gaskett, 2007), pero algunas hembras de pisuridos semiacuticos, as como de algunos Lycosidos, tienen en la seda feromonas sexuales resistentes al agua (Roland & Rovner 1983, Lizotte & Rovner 1989, Arnqvist 1992). De esta forma bajo el modelo estimulatorio descrito para P. mirabilis, la hiptesis es que estos semioqumicos promueven la construccin del regalo nupcial en las especies de gnero Paratrechalea, anticipando el encuentro sexual.
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Paratrechalea ornata es una araa semiacutica encontrada en el sur de Brasil, norte de Argentina y Uruguay. Los individuos son encontrados en bordes de ros y arroyos, donde adultos y subadultos son vistos en las piedras que emergen del agua. Estas araas son capaces de caminar y capturar presas en la superficie del agua. La presencia de regalos nupciales ha sido observada en las poblaciones de P. ornata tanto brasileas (Costa-Schmidt et al. 2008) como uruguayas (M.J. Albo & F.G Costa, observaciones personales). El objetivo principal de este estudio es determinar si la presencia de hilos de seda de la hembra estimula la construccin del regalo nupcial en P. ornata. Tambin se describen en detalle algunos comportamientos fundamentales asociados con la construccin del regalo nupcial en las poblaciones uruguayas. Estos datos aportarn informacin adicional a trabajos previos (Costa-Schmidt et al. 2008) que sugieren que las poblaciones brasileas y uruguayas de P. ornata podran representar diferentes especies. Los resultados obtenidos nos permitirn estimar las implicancias de la envoltura en seda en acuerdo con las hiptesis actuales acerca del origen y la evolucin del regalo nupcial en artrpodos.
Mtodos Para poner a prueba la influencia de diferentes estmulos sobre la construccin del regalo nupcial, se realizaron 3 tratamientos: (S) presencia de seda de la hembra, (SH) presencia de seda y de la hembra y (C) ausencia de seda y de hembra. Un da antes de la experiencia, cada macho adulto fue colocado en una caja de Petri y alimentado con una termita (Nasutitermes sp.) para prevenir condiciones de hambre. Antes de la experiencia se le dio al macho una mosca de los baos viva (Telmatoscopus albipunctatus). Inmediatamente luego de que el macho capturaba la mosca se lo coloc en la caja experimental. Tanto en S como en SH, las hembras fueron colocadas en la caja experimental 24 horas antes de la experiencia, permitiendo la deposicin de seda. En el tratamiento S, la hembra fue extrada luego de las 24 horas y el macho fue expuesto al sustrato con seda. En el tratamiento SH la hembra fue extrada y colocada en el extremo de la caja experimental (cuello y tapa de la botella), que permiti el
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contacto directo hembra-macho, pero evit la cpula por la presencia de una reja. Para el grupo C el macho fue colocado en el sustrato sin ningn rastro de la hembra. Quince machos y 15 hembras fueron usados para cada grupo, al menos un da despus de la ltima muda. Todas las hembras fueron usadas al azar una vez en S y otro en SH. Cada macho fue usado una vez en cada grupo, S, SH y C en un orden azaroso. Las araas fueron usadas en un segundo experimento 3 das despus. La duracin de cada experimento fue de 30 min., pero si se observaban movimientos del macho predecibles como el inicio de la construccin del regalo nupcial, el registro continu hasta que la construccin finalizara. Los machos y las hembras de todas las edades fueron pareados al azar para cada tratamiento. Para analizar el posible efecto de la edad de los individuos, se compararon los resultados de los machos y hembras clasificados en tres categoras de acuerdo a la edad como adultos el da de la experiencia: (1) entre 1 y 20 das, (2) entre 21 y 40 das y (3) ms de 40 das. El comportamiento y las interacciones entre individuos fueron registrados, especialmente la presencia y duracin de la construccin del regalo nupcial. Se establecieron dos categoras para los comportamientos del macho: locomocin lineal y locomocin no-lineal. La locomocin lineal consisti en una actividad locomotora rpida a travs de la caja experimental sin mostrar unidades de cortejo. La locomocin no-lineal (o comportamiento de bsqueda, llamado movimientos estroboscpicos por Costa-Schmidt et al. 2008) consisti en una locomocin lenta alternando movimientos laterarles, usualmente con vibraciones de los palpos y del primer y segundo par de patas, sugiriendo la percepcin de algn estmulo sexual.
Resultados Construccin del regalo nupcial Seis machos en el tratamiento S y ocho en el tratamiento SH construyeron regalo nupcial, mientras que todos los machos en el tratamiento C comieron la presa y no construyeron regalos nupciales. No se observ que los machos de los grupos S y SH comieran la presa.
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La frecuencia de construccin de regalo nupcial fue significativamente diferente entre los 3 grupos (2yates = 10.78, P = 0.0045, gl = 2). En las comparaciones pareadas, se encontraron diferencias estadsticas en la construccin del regalo entre S y C ( 2yates = 5.21, P = 0.02), y entre SH y C (2yates = 8.35, P = 0.004), mientras que no hubo diferencias entre S y SH (2yates = 0.13, P = 0.71). Todos los regalos en S y SH fueron construdos durante la primera mitad del perodo de experiencias. Para poner a prueba si el contacto con la hembra afecta la construccin del regalo nupcial, los datos del grupo SH fueron divididos en 2 perodos: antes y despus de contactar a la hembra. Cuatro machos de SH no encontraron ni contactaron la hembra que estaba confinada en el extremo de la caja experimental, y dos de ellos construyeron regalo. Once machos encontraron a las hembras luego de un promedio de 10.77 min ( 8.14 SD, rango 0.921.6). Cinco de estos machos construyeron regalo antes de contactar a la hembra, tres lo hicieron luego del contacto y tres machos no construyeron regalo luego de contactar a la hembra. La construccin del regalo nupcial en los ocho machos del grupo SH comenz a los 8.59 min ( 3.38 SD, rango 4.9-12.9 min); esta demora fue de 7.18 ( 3.27 SD, rango 4.912.9) en los machos que construyeron antes de contactar a la hembra y de 10.90 min ( 2.34 SD, rango 8.3-12-7) en aquellos que lo hicieron luego de contactar a la hembra. En los seis machos del grupo S la demora en la construccin de fue de 9.92 min ( 3.41 SD, rango 3.412.3 min). No se encontraron diferencias significativas en la demora de la construccin entre S y SH (U = 21, N = 6, N = 8, P = 0.75). Se observ un nmero similar de secuencias de empaquetado de la presa (construccin de un plato basal de seda con cobertura con seda) en ambos tratamientos (Tabla 1). La construccin del regalo nupcial involucr secuencias de empaquetado de la presa y perodos donde el macho se desplaz transportando el regalo, como fue descrito por Costa-Schmidt et al. (2008). En nuestras observaciones el macho primero deposita hilos de seda en el sustrato, tejiendo una capa o base de seda fina (plato basal de seda). Seguido a esto, el macho deposita la presa en el plato basal y la cubre con seda (cobertura con seda). Finalmente, el macho
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muerde el paquete arrancndolo del sustrato donde estaba adherido. Usando los quelceros, los palpos y el tercer par de patas, el macho manipula y redondea el paquete, y luego lo transporta cortas distancias o permanece en el mismo sitio. Luego de esto el macho puede reiniciar la construccin del regalo agregando ms seda y reforzando el paquete. Ni la duracin de la primera secuencia de empaquetado de la presa, ni la duracin de la construccin del regalo nupcial mostraron diferencias estadsticas entre los grupos S y SH. Finalmente, se puso a prueba si el contacto con la hembra afect la construccin del regalo nupcial comparando, en el grupo SH, la duracin de la primera secuencia de empaquetado antes (5 casos) y despus (3 casos) del contacto con la hembra. Las duraciones medias fueron 1.83 1.02 y 1.7 0.35 minutos, respectivamente, no encontrndose diferencias entre los grupos (t = 0.019, P = 0.98).
Tabla 1. Nmero de secuencias de empaquetados de la presa, duracin del primer empaquetado de la presa (en minutos) y duracin total de la construccin del regalo (en minutos) en los tratamientos S (machos expuestos a seda de la hembra) y SH (machos expuestos a la seda y a la hembras). Los valores son dados como promedios desvo estndar, con el nmero de datos entre parntesis. Las comparaciones entre los dos tratamientos fueron realizados utilizando el test de la U de Mann-Whitney o el test de Student.
S (6)
SH (8)
Estadstica
Nmero de empaquetados de la presa
3.0 1.09
3.1 0.99
U = 22.5
0.89
Duracin 1 empaquetado de la presa
er
2.3 1.21
1.75 0.61
t = 1.19
0.26
Duracin total construccin del regalo
7.9 2.98
13.9 12.3
U = 19.5
0.61
Teniendo en cuenta que la construccin del regalo fue similar en S y SH, se agruparon estos datos para una descripcin ms detallada de las secuencias consecutivas de empaquetado de la presa. Se analizaron los datos de 11 machos (6 que construyeron en S y 5 que lo hicieron
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en SH), considerando por separado la construccin del plato basal de seda y la cobertura de la presa con seda. Los datos temporales de las secuencias de empaquetado de la presa se muestran en la Tabla 2. No se encontraron diferencias en la construccin del plato basal de seda (ANOVA: F3 = 2.18, P = 0.11), pero s se encontraron diferencias en los datos de la cobertura con seda (Kruskal Wallis: H3 = 9.91, P = 0.019). En las comparaciones de a pares (Test de Wilcoxon), se encontraron diferencias significativas slo entre las duraciones de la primera y segunda cobertura con seda (t = 1.0, P = 0.007), mostrando los valores ms cortos y ms largos, respectivamente.
Tabla 2. Duraciones (en minutos) de los consecutivos comportamientos de empaquetado de la presa, analizando de forma separada la construccin del plato basal de seda y la cobertura con seda de la presa. Slo un macho realiz un 5 to empaquetado (no incluido en la Tabla) de 0.4 min tejiendo el plato basal y 2.4 min de cobertura con seda. Los datos son dados en promedios desvo estndar, con el nmero de datos entre parntesis.
Primer empaquetado (n=11)
Segundo empaquetado (n=11)
Tercer empaquetado (n=7)
Cuarto empaquetado (n=4)
Construccin del plato basal Cobertura con seda
0.95 0.93
0.45 0.21
0.50 0.45
0.30 0.18
0.74 0.25
1.87 0.90
1.31 0.92
1.43 0.62
Otros comportamientos del macho
Los comportamientos del macho difirieron entre los grupos S, SH y C (Tabla 3). Los machos en el grupo C no exhibieron locomocin no-lineal o vibraciones del primer y segundo par de patas, permaneciendo en posicin de descanso mientras coman la presa y realizando, en algunos intervalos, locomocin lineal. Doce machos en el tratamiento S y 14 machos en el tratamiento SH realizaron locomocin no-lineal. Se encontraron diferencias estadsticas entre los tres grupos, en las frecuencias de locomociones no lineales del macho (2yates = 31.5, P = 0.001, gl = 2). Cuando se compararon de a pares no se encontraron diferencias en la ocurrencia de estas
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Captulo 2 Estrategias Reproductoras entre S y SH (2yates = 0.29, P = 0.59), pero si entre S y C (2yates = 16.81, P = 0.001) y entre SH y C (2yates = 22.63, P = 0.001). Se compar la frecuencia de construccin de regalo nupcial por machos buscadores en los grupos S y SH, pero no se encontraron diferencias entre ambos grupos (2yates = 0.001, P = 0.97). Las vibraciones del primer y segundo par de patas fueron observadas antes y despus de la construccin del regalo nupcial. La ocurrencia de estas vibraciones no difiri entre S y SH (2yates = 1.53, P = 0.22). Tampoco se encontraron diferencias en las vibraciones del primer y segundo par de patas cuando de analizaron slo los machos buscadores (2yates = 0.51, P = 0.48). La mayora de los machos que vibraron construyeron regalos nupciales (Tabla 3), pero no hubieron diferencias en la ocurrencia de regalo entre los machos que vibraron en S y SH (2yates = 0.04, P = 0.84).
Tabla 3. Frecuencias de comportamientos del macho en los 3 tratamientos, discriminando entre casos con y sin construccin de regalo nupcial. Locomocin lineal consisti en rpidos movimientos a lo largo de la caja experimental sin cortejo; locomocin no-lineal consisti en movimientos lentos mientras el macho buscaba; vibraciones del primer y segundo par de patas fueron seales de cortejo realizadas durante la locomocin no-lineal. El nmero de datos es dado entre parntesis. Tratamiento S Tratamiento SF Tratamiento C
Regalo (6)
No regalo (9)
Regalo (8) No Regalo (7)
No Regalo (15)
0 Locomocin Lineal 6 Locomocin No-lineal Vibracin de patas I y II 6
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Comportamientos de la hembra Las hembras en el grupo SH, que estaban expuestas al macho en el extremo de la caja experimental, se comportaron de forma diferencial de acuerdo a si fueron o no encontradas por el macho. Las hembras que no fueron encontradas (cuatro de quince casos) permanecieron inmviles dentro del lugar donde estaban confinadas, intercalando locomocin lineal que inclua
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intentos de escape,
pero sin mostrar comportamiento sexual alguno. Se observaron
interacciones macho-hembra donde ambos sexos intercambiaron toqueteos del primer y segundo par de patas a travs de las rejas; algunos machos realizaron hiperflexin (sensu Costa-Schmidt et al. 2008) ofreciendo el regalo (cinco casos) o la presa no envuelta (un caso) a la hembra. Tres hembras tomaron el regalo a travs de la reja mientras los machos realizaban hiperflexin y ambos sexos tironearon del regalo. Dos de estas hembras obtuvieron el regalo; una empez a comerlo inmediatamente y la otra lo expuso hacia el macho, el macho no lo pudo tomar y luego sta lo comi. En la otra pareja el macho retuvo el regalo y lo ofreci nuevamente, pero la hembra no lo volvi a tomar.
Edades de machos y hembras
Se analiz si la edad de los individuos afect o no la construccin del regalo nupcial, comparando el comportamiento del macho y de la hembra en 3 categoras de edades (ver seccin Mtodos). Se encontraron diferencias cuando se compar la frecuencia de presencia de la construccin de los machos (2yates= 6.6, P = 0.05). En las comparaciones de a pares (test de Fisher), los machos jvenes fueron diferentes de los machos viejos (P = 0.016). No se encontraron diferencias entre los machos jvenes y los medios (P = 0.076), o entre los machos medios y los viejos (P = 0.56) (Fig. 2a). Se encontraron diferencias entre las categoras de edades de las hembras (2yates = 6.39, P = 0.05), sugiriendo que las hembras jvenes promovieron ms la construccin del regalo que los otros grupos de edades (Fig. 2b). Sin embargo, no hubieron diferencias estadsticas cuando se realizaron las comparaciones de a pares: la nica comparacin que se encontr cerca del lmite de significacin fue entre las hembras ms viejas y las ms jvenes (2yates = 3.20, P = 0.07).
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Figura 2. Frecuencia de ocurrencia de la construccin del regalo nupcial segn las categoras de edades de adultos (en das) en los tratamientos S y SH: (a) machos; (b) hembras.
Discusin Los resultados muestran que los rastros de hembras adultas co-especficas promueven la construccin del regalo nupcial por parte de los machos de P. ornata. Debido a que la construccin del regalo fue solamente observada en los tratamientos donde la seda de la
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hembra estaba presente (S y SH), se puede interpretar que las feromonas sexuales de contacto existen en la seda de la hembra y podran ser las responsables de desencadenar este comportamiento. En araas es bien conocido que las feromonas en los hilos de seda de la hembra promueven la bsqueda y el cortejo de los machos, incluyendo las familias relacionadas (Lycosidae y Pisauridae) (Foelix 1996, Huber 2005, Gaskett 2007). Los rastros de las hembras podran ser especie-especficos, ya que los machos de P. ornata no construyen regalos al estar expuestos a la seda de hembras de otras especies relacionadas y que adems co-habitan con sta, como Trechalea bucculenta y Trechaleoides biocellata (M.J. Albo y A. Klein, observaciones personales). En la naturaleza las hembras de P. ornata depositan los hilos de seda en las piedras y rocas que emergen del agua (M.J. Albo, observaciones personales), sugiriendo que las seales qumicas involucradas son resistentes a la humedad o a la accin directa del agua, como ha sido reportado para otras especies de la superfamilia Lycosoidea (Roland & Rovner 1983, Lizotte & Rovner 1989, Arnqvist 1992). La deteccin de la hembra por parte del macho concuerda con el comportamiento sexual descripto para estas especies (Costa-Schmidt et al. 2008) y con evidencia experimental en P. mirabilis (Bristowe & Locket 1926, Lang 1996). Los resultados del grupo control excluyen la posibilidad de que los machos construyan regalos nupciales de forma espontnea cuando capturan una presa durante la estacin reproductiva. La posibilidad de que la experiencia previa del macho afecte la construccin del regalo puede tambin descartarse debido a que muchos machos que construyeron en S y SH no lo hicieron cuando estuvieron expuestos al sustrato sin rastros en el grupo C. La construccin del regalo parece ser un comportamiento adaptativo, permitiendo a los machos comer o empaquetar en seda la presa en respuesta a las oportunidades de cpula, estando listos para cortejar exitosamente y copular al encontrar a la hembra adulta (ver Lang 1996). Si el macho est listo cuando encuentra a una hembra evita demoras en la captura de una presa para empaquetar, y esto minimiza los riesgos de depredacin, la desercin de la hembra o la competencia macho-macho por una hembra receptiva.
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La construccin de un plato basal de seda observada en este estudio y tambin observada en las poblaciones de esta especie en Brasil (L. E. Costa-Schmidt, observaciones personales), puede prevenir la prdida de partes de la presa y evitar que la presa quede pegada al sustrato debido a los propios fluidos corporales emanados por sta. Coincidentemente, la construccin del primer plato basal de seda pareci ser el ms largo. Los machos de las poblaciones brasileras obtienen regalos nupciales blancos luego de una nica secuencia de empaquetado de la presa (Costa-Schmidt et. al., 2008), mientras que en este trabajo se observ la necesidad de al menos dos secuencias consecutivas para generar un regalo blanco, como fue descrito para P. mirabilis (Nitzsche 1988, Lang 1996). El segundo empaquetado de la presa en seda puede ser un paso importante para los machos obtener seales sexuales fuertes, transportando un regalo aparentemente grande, que visualmente contrasta con los quelceros rojizos del macho, como fue sugerido por Costa-Schmidt et al. (2008) y Costa-Schmidt & Araujo (2008) para estas especies. De acuerdo con Costa-Schmidt et al. (2008), la construccin del regalo nupcial es un paso obligatorio para el xito de cpula en estas especies. Por ello, presiones sexuales selectivas como la eleccin de la hembra y la competencia macho-macho operararan fuertemente sobre los machos en la construccin temprana del regalo nupcial. Sin embargo, la mitad de los machos no construyeron regalos y comieron sobre la presa, a pesar de recibir el estmulo sexual femenino. Factores como las condiciones de hambre del macho y la edad de ambos sexos podran afectar la construccin. Todos los machos fueron alimentados un da antes de la observacin experimental, por lo que se descarta esta primera posibilidad. Por otro lado, debido a que los machos viejos construyeron regalos ms frecuentemente que los jvenes, los machos viejos pueden ser ms constructores de regalos, porque estn fisiolgicamente maduros y poseen mayores presiones para aparearse comparados con los machos ms jvenes, debido a su corta vida. Los machos recin mudados de P. mirabilis usualmente comen sobre la presa (R.O.M. Nitzsche, observaciones personales, citado por Lang, 1996). La edad de las
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hembras pareci afectar tambin la construccin del regalo por los machos, siendo que el regalo fue observado ms frecuentemente en las experiencias con hembras ms viejas. Las hembras maduras viejas podran depositar ms hilos de seda (ms rastro sexual) para promover la construccin de regalo y atraer machos, evitando el riesgo de permanecer sin copular. Asimismo, se ha observado que las hembras maduras vrgenes de otras araas pertenecientes a Lycosoidea son qumicamente ms atractivas que las recin mudadas (Rypstra et al. 2003, Roberts & Uetz 2005, Baruffaldi & Costa en prensa). A diferencia de las poblaciones brasileas de P. ornata, los machos de las poblaciones uruguayas pueden copular sin regalo bajo condiciones de laboratorio (M.J. Albo & F.G. Costa, observaciones personales). Machos de P. mirabilis (Stlhandske, 2001) sin regalo tambin tuvieron xito de cpulas; aunque este comportamiento no fue confirmado por Prokop (2006) en la misma especie. Tomando en consideracin estas diferencias comportamentales
observadas tanto en P. mirabilis como en P. ornata, debern ser analizadas las variaciones geogrficas en relacin a la condicin obligatoria o no del regalo nupcial. El anlisis de las variaciones en el uso del regalo nupcial puede tambin ayudar a dilucidar la funcin del regalo como inhibidor de la agresin de la hembra y/o como donacin con beneficios nutritivos. Trechaleidae est cercanamente emparentada con las familias Lycosidae y Pisauridae. Muchas especies que hoy estn incluidas en Trechaleidae antes estaban incluidas en Pisauridae, pero recientes revisiones consideran que Lycosidae y Trechaleidae son grupos hermanos, y Pisauridae hermana de ambas (Sierwald 1990, Coddington & Levi 1991, Griswold 1993). De acuerdo con estas ltimas relaciones establecidas, el comportamiento de ofrecer un regalo nupcial en las especies del gnero Paratrechalea y en P. mirabilis podra haber evolucionado de forma independiente en ambas familias, pero las grandes similaridades podran evidenciar un origen comn. Nuevos datos sobre la biologa de las especies pertenecientes a ambas familias permitirn comparaciones ms completas para dilucidar el origen y la evolucin de estos grupos, as como revelar aspectos no conocidos de este comportamiento reproductivo.
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Captulo 2 Estrategias Reproductoras Agradecimientos Se agradece a Anita Aisenberg, Soledad Ghione, Alicia Postiglioni, Rodrigo Postiglioni y Carlos Toscano-Gadea por su colaboracin en la colecta de araas. Un agradecimiento especial a Anita Aisenberg, Carlos Toscano-Gadea y Luiz E. Costa-Schmidt por la lectura crtica del primer borrador del manuscrito.
Literatura Arnqvist, G. 1992. Courtship behavior and sexual cannibalism in the semi-aquatic fishing spider, Dolomedes fimbriatus (Clerk) (Araneae: Pisauridae). Journal of Arachnology 20, 222226. Baruffaldi, L. & Costa, F.G. en prensa. Changes in male sexual responses from silk cues of females at different reproductive states in the wolf spider Schizocosa malitiosa Journal of Ethology. DOI 10.1007/s10164-009-0158-8. Bristowe, W.S. 1958. The world of spiders. London: Collins. Bristowe, W.S. & Locket, G.H. 1926. The courtship of British Lycosid spiders, and its probable significance. Proceedings of the Zoology Society 22, 317-347. Coddington, J.A. & Levi, H.W. 1991. Systematics and evolution of spiders (Araneae). Annual Review of Ecology and Systematics 22, 565-592. Costa-Schmidt, L.E. & Arajo, A.M. 2008. Sexual dimorphism in chelicerae size in three species of nuptial-gift spiders: a discussion of possible functions and driving selective forces. Journal of Zoology 275, 307-313. Costa-Schmidt, L.E., Carico, J.E. & Arajo, A.M. 2008. Nuptial gifts and sexual behaviour in two species of spider (Araneae, Trechaleidae, Paratrechalea). Naturwissenshaften 95, 731739. Foelix, R.F. 1996. Biology of spiders, 2nd Edition. Oxford University Press: New York.
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Roland, C. & Rovner, J.S. 1983. Chemical and vibratory communication in the aquatic pisaurid spider Dolomedes triton. Journal of Arachnology 11, 77-85. Rypstra, A.L., Wieg, C., Walker, S.E. & Persons, M.H. 2003. Mutual mate assessment in wolf spiders: differences in the cues used by males and females. Ethology 109, 315-325. Schulz, S. 2004. Semiochemistry of spiders. In: Advances in insect chemical ecology: 110-150 Card, R.T. & Millar, J.G. (Eds.). Cambridge University Press: Cambridge. Sierwald, P. 1990. Morphology and homologous features in the male palp organ in Pisauridae and other spider families, with notes on the taxonomy of Pisauridae (Arachnida: Araneae). Nemouria 35, 1-59. Stlhandske, P. 2001. Nuptial gift in the spider Pisaura mirabilis mantained by sexual selection. Behavioral Ecology 6, 691-697. Stlhandske, P. 2002. Nuptial gifts of male spiders function as sensory traps. Proceedings of the Royal Society 269, 905-908. Stoltz, J.A., McNeil, J.N. & Andrade, M.C. 2007. Males assess chemical signals to discriminate just-mated females from virgins in redback spiders. Animal Behaviour 74, 669-1674.
ADDENDA Este captulo ha sido publicado en la revista internacional Journal of ZoologyApendice I
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Captulo 2 Estrategias Reproductoras 2.3- EL REGALO NUPCIAL COMO ESFUERZO DE APAREAMIENTO DEL MACHO EN Paratrechalea ornata (TRECHALEIDAE)
Introduccin Histricamente, los regalos nupciales fueron definidos como sustancias potencialmente nutritivas donadas por los machos a las hembras durante la cpula (Boggs 1995). Es conocido que el regalo puede suministrar nutrientes a la hembra, funcionando entonces como inversin parental del macho (Thornhill 1976a, Gwynne 1984, Simmons & Parker 1989). En algunos insectos los regalos nupciales tienen efecto positivo sobre la fecundidad de la hembra, as como tambin pueden incrementar la longevidad de la hembra (Wiklund et al. 1993, Karlsson 1998, Lewis & Cratsley 2008). Sin embargo, debido a que el conocimiento acerca del valor nutritivo del regalo es limitado, y que hay evidencia de que en algunas especies donadoras de regalos nupciales en realidad stos no proveen de beneficios directos (valor nutritivo) a la hembra y representan slo donaciones simblicas, se ha sugerido que podra estar operando conflicto sexual entre los sexos (Vahed 1998, 2007; pero ver Gwynne 2008). En este sentido, los machos pueden manipular el tiempo de cpula promoviendo eyaculados ms prolongados, induciendo un perodo refractario en la hembra y acelerando la oviposicin, maximizando de esta manera su esfuerzo de cpula (Thornhill 1976b, Simmons & Gwynne 1991, Eberhard 1996, Wolfner 1997, Heifetz et al. 2001, Arnqvist & Rowe 2005, Sakaluk et al. 2006). Ms all de las hiptesis de inversin paternal y esfuerzo de cpula, existen dos hiptesis ms que pueden explicar el significado adaptativo de los regalos nupciales: una implica que el regalo protege a los machos del canibalismo sexual (Bristowe 1958, Kessel 1955), aunque carece de evidencia emprica que la soporte; mientras que la otra asume que los machos con el regalo podran explotar preferencias pre-existentes en las hembras (Vahed 1998, 2007). Aunque la hiptesis de explotacin sensorial ha sido poco estudiada, un buen ejemplo es reportado en grillos, donde la donacin de espermatforos provee de un estmulo gustatorio que la hembras prefieren (Sakaluk 2000, Vahed 2007).
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En la araa Pisaura mirabilis, Stlhandske (2001) observ que a pesar de que los machos pueden copular sin donar un regalo, ste permite que el macho adopte la posicin de cpula correcta, manteniendo a la hembra ocupada manipulando el regalo. Los regalos grandes resultan tambin en cpulas ms prolongadas y ms huevos fertilizados (Austad & Tornhill 1986, Sthldhanske 2001). En P. mirabilis el regalo funciona como un esfuerzo de cpula del macho para facilitar las cpulas, y la envoltura en seda provee beneficios directos a los machos debido a que incrementa el control sobre la cpula y prolonga las cpulas (Lang 1996, Stlhandske 2001, Bilde et al. 2007, Andersen et al. 2008). Como fue encontrado en P. mirabilis, los machos de P. ornata pueden empaquetar o no la presa en seda (Albo et al. 2009). La decisin de empaquetar la presa es tomada por el macho una vez ste detecta los rastros de seda de la hembra, y se incrementa de acuerdo a la madurez del macho (Albo et al. 2009). El objetivo de este estudio fue investigar si el regalo nupcial funciona evitando el canibalismo sexual y/o si funciona como esfuerzo de cpula del macho, comparando machos con y sin regalo en P. ornata. Se compararn tambin los resultados con aquellos encontrados en P. mirabilis a la luz de la funcin y la evolucin de este comportamiento.
Mtodos Con motivo de investigar la importancia del regalo nupcial durante el cortejo y la cpula, se expusieron 23 hembras a machos sin presa (NP) y 25 hembras a machos que transportaban una presa (CP). Un da previo a la experiencia, la hembra fue colocada en el recipiente experimental permitiendo la habituacin y la deposicin de seda, mientras que el macho fue colocado en una caja de Petri y alimentado con una mosca de la fruta ( Drosophila sp.) de forma de evitar condiciones de hambre. Para las experiencias cada macho del grupo CP recibi una mosca grande viva (Drosophila funebris) y fue transferido al recipiente experimental inmediatamente despus de capturar la presa. En ambos tratamientos las experiencias consistieron en 2 pasos. Primero, el macho fue expuesto a la seda de la hembra, aislado de la
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hembra por la presencia de una pared opaca de vidrio. En segunda instancia luego de 15 minutos se extrajo la barrera de vidrio permitiendo el encuentro macho-hembra. Este tiempo es suficiente para que los machos empaqueten en seda la presa (Albo et al. 2009). Si el macho en CP no envolvi se permiti que el macho fuera al encuentro con la hembra transportando la presa sin empaquetar. De esta manera, los machos de CP podan encontrar a la hembra con la presa envuelta en seda o con sta sin empaquetar. En los casos en los que el macho cortej a la hembra con una presa envuelta pero copul sin donar la presa a la hembra (manteniendo la presa entre los quelceros) consideramos los datos en CP para los anlisis de cortejo, pero como un grupo separado (no donantes, ND) para los anlisis de cpula. La mayora de los individuos fueron utilizados luego de 20 das despus de la ltima muda. stos no fueron re-utilizados, con excepcin de 3 hembras que fueron utilizadas primero en NP pero no copularon, y fueron re-expuestas ms tarde en CP. Para evitar posibles efectos de la experiencia previa de la hembra, estos datos fueron excluidos de los anlisis de frecuencias, pero se incluyeron en los anlisis de cpula debido a su condicin de virginidad. Cada experimento fue finalizado cuando la cpula termin o luego de 30 minutos de ausencia de interacciones. Se registraron todos los comportamientos y las interacciones entre los individuos. Registramos especialmente la ocurrencia de envoltura en seda de la presa, el cortejo del macho, la receptividad femenina, la ocurrencia de aceptacin de la hembra y de la cpula (ver Costa-Schmidt et al. 2008). El cortejo del macho consisti en una locomocin no-lineal (comportamiento de bsqueda) y vibraciones del primer y segundo par de patas hacia la hembra; la receptividad femenina consisti en hiperflexin del primer y segundo par de patas y un comportamiento activo hacia el macho; la aceptacin de la hembra fue definida cuando la hembra tom el regalo entre sus quelceros y acept la monta (CP) o directamente acept la monta (NP). La cpula consisti en inserciones alternadas de los palpos, con el macho sobre la hembra y con intervalos entre inserciones, en los que los sexos permanecieron cara a cara. La
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duracin de la cpula incluy todo el perodo desde la primera insercin hasta el final de la ltima insercin; la duracin de la insercin fue medida desde la insercin del palpo hasta el desacople del mismo. El intervalo entre dos inserciones incluy la postura cara a cara. Cada hembra copulada fue individualmente criada controlndose el perodo hasta la construccin de la primera ooteca (latencia de oviposicin), as como el nmero de ninfas emergidas. Resultados
Cortejo y xito de cpula del macho
Todos los machos y hembras se encontraron en ambos tratamientos. El primer encuentro macho-hembra ocurri a los 12.1 min ( 7.7 SD) en NP y a los 8.7 min ( 7.3 SD) en CP, mostrando diferencias significativas (U = 184, N = 23, N = 25, P = 0.03). En el grupo NP, cuatro machos no cortejaron a las hembras y 19 lo hicieron, mientras que en CP los 25 machos cortejaron (Test de Fisher: P = 0.06). La duracin del cortejo fue ms corta en NP (8.4 7.7 min) comparado con CP (14.4 15.6 min), pero sin diferencias significativas (U = 195.5, N = 19, N = 25, P = 0.33). Nueve de 23 parejas copularon en NP. En CP, 15 machos copularon luego de donar la presa, seis no copularon, y cuatro copularon sin donar la presa (mantenindola en sus quelceros) durante toda la cpula. Estos ltimos casos fueron considerados separadamente en el resto de los anlisis (ver seccin Mtodos). Los machos con donaciones (presas envueltas en seda o no) copularon ms frecuentemente que aquellos sin presa (Test de Fisher: P = 0.03). En CP, seis machos cortejaron a las hembras transportando una presa empaquetada en seda y cinco copularon; nueve machos cortejaron a la hembra con la presa sin empaquetar y tres copularon. No se encontraron diferencias estadsticas (Test de Fisher: P = 0.08). Los machos que fallaron en obtener la cpula transportando la presa no empaquetada (seis casos) o la presa empaquetada (un caso) inmediatamente envolvieron o re-envolvieron la misma copulando exitosamente luego de sto. Luego de las experiencias y una vez que los machos fueron devueltos a sus cajas de cra, cinco machos que no obtuvieron cpula y dos que
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copularon en NP,
construyeron inmediatamente un regalo nupcial, empaquetando en seda
restos secos de presa (larvas de Tenebrio molitor).

Duracin de la cpula y primera oviposicin
En la Tabla 1 se muestran los valores de duracin de cpula, y nmero y duracin de inserciones palpares en los grupos NP, CP y ND. El tratamiento CP mostr cpulas ms prolongadas, mayor nmero de inserciones e inserciones ms prolongadas, que el tratamiento NP. Comparado NP y CP con el grupo ND (el grupo de cuatro machos que copularon sin donar la presa a la hembra), no se encontraron diferencias estadsticas en ninguna de stas comparaciones.
Tabla 1. Duracin total de la cpula, nmero y duracin de las inserciones palpares e intervalo entre inserciones (ambos en minutos) durante la cpula en grupos de machos sin presa (NP) y con presa (CP).
NP (n = 9) Duracin de cpula Duracin de inserciones Intervalo de inserciones Nmero de inserciones 2.0 3.3
CP (n = 17) 6.5 6.7
Estadstica
ND (n = 4) 3.4 3.1
Estadstica ND-NP U = 32.0, P =0.11 ND-CP U = 22.5, P =0.32 ND-NP U = 9.5, P =0.21 ND-CP U = 22.5, P =0.32 ND-NP U = 7.0, P =0.09 ND-CP U = 23.0, P =0.35 ND-NP U = 14, P =0.55 ND-CP U = 20.0, P =0.21
NP-CP U = 32.0, P = 0.018 NP-CP U = 39.0, P = 0.046 NP-CP U = 35.5, P = 0.028 NP-CP U = 38.0, P = .034
0.6 0.2
1.2 0.8
0.8 0.3
1.4 3.1
5.3 6.3
2.6 3.3
1.6 0.7
2.7 1.4
1.8 0.5
Todas las comparaciones estadsticas fueron realizadas utilizando el test de la U de Mann-Whitney. Tres hembras que no copularon en NP fueron reusadas y copularon en CP, estos datos fueron incorporados al grupo CP. En una cpula del grupo CP los datos no fueron correctamente registrados, por lo que estos no fueron incluidos.
La ocurrencia de la primera oviposicin fue similar para ambos tratamientos: ocho de nueve hembras en NP y 12 de 18 hembras en CP (datos de tres hembras no copuladas en NP fueron incluidos en CP; ver Mtodos). No se encontraron diferencias entre estas frecuencias
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(Test de Fisher, P = 0.22). Ninguna de las 14 hembras no copuladas construy ooteca. La latencia de la oviposicin (periodo entre la cpula y la construccin de la primera ooteca) fue ms prolongada en NP (24.6 9.9 das) que en CP (14.5 10.1 das) (Test de Mann-Whitney: U = 18.5, N = 8, N = 12, P = 0.03). Se encontr una relacin significativa entre la duracin de la cpula y la latencia en la oviposicin (ANCOVA: F = 13.35, P = 0.002); CP mostr una relacin lineal (inversa) significativa (r11 = -0.76, P = 0.006), mientras que NP no mostr esto (r8 = 0.09, P = 0.82) (Fig. 2a). Relaciones similares fueron encontradas entre la duracin de la insercin y la latencia en la oviposicin: ANCOVA (F = 9.79, P = 0.006), en CP (r 11 = -0.63, P = 0.04), en NP (r8 = -0.017, P = 0.96) (Fig. 2b). Se analiz adems si la edad de la hembra y la temperatura afectaron las latencias de oviposicin, no encontrndose relacin significativa (ANCOVA: F = 0.031, P = 0.99). La eclosin de las ninfas fue observada en slo tres ootecas de NP y en cinco ootecas de CP, mostrando promedios de 44.3 ( 34.5 SD) y 34.8 ( 25.8 SD) ninfas, respectivamente, sin diferencias estadsticas (Student test: t = 0.45, P = 0.66).
(a) 1,6 1,5 Latencia 1,4 oviposici n 1,3 n 1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 -0,5 0 0,5 1 1,5 Duracin cpula Latencia (b) 1,6 1,5 1,4 oviposicin 1,3 n 1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 Duracin inserciones
Figura 2. Relacin linear entre: (a) latencia de oviposicin de la hembra y duracin total de la cpula, y (b) entre latencia de oviposicin y duracin de la insercin. La latencia es expresada en das (luego de transformacin logartmica) y la duracin de la cpula y de las inserciones en minutos (luego de transformacin logartmica). Las lneas y cuadrados grises indican los datos del grupo NP, y las lneas y cuadrados negros los datos del grupo CP.
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Receptividad de la hembra
Diecisis hembras de NP fueron receptivas frente a los cortejos del macho, adoptando postura de hiperflexin; sin embargo siete de ellas no copularon. En este grupo, tres hembras fueron reluctantes, evitando el contacto con el macho, y cuatro no fueron cortejadas. Diecisiete hembras de CP fueron receptivas, pero dos de stas no copularon. Todas las hembras de CP fueron cortejadas pero cuatro fueron reluctantes. Se encontraron diferencias estadsticas al comparar la ocurrencia de cpulas entre hembras receptivas de NP y CP (Test de Fisher: P = 0.046). Ocho hembras de NP y ocho hembras de CP inicialmente atacaron a los machos, realizando un salto rpido y sorpresivo, que fue rpidamente evitado por el macho. En NP, slo las hembras receptivas realizaron ataques, mientras que en CP cinco hembras receptivas y tres no receptivas atacaron a los machos, sin diferencias estadsticas (Test de Fisher: P = 0.10). Luego del ataque ambos sexos permanecieron enfrentados (cara a cara recuerda la mordida de regalo) hasta que el macho inici o continu el cortejo, mientras la hembra permaneci inmvil. Se observ un nico caso de canibalismo sexual luego de la cpula (en CP): luego de una nica insercin el macho se retir manteniendo el regalo enganchado a una de su tercer par de patas, y la hembra atac inmediatamente al macho tratando de morder el regalo y capturando al macho al mismo tiempo. En el grupo de machos no donantes (ND) las cuatro hembras fueron receptivas, dos de ellas atacaron a los machos y las cuatro copularon.
Descripcin de la cpula
Considerando que las poblaciones estudiadas aqu difieren de las poblaciones brasileas estudiadas por Costa-Schmidt et al. (2008), donde las cpulas slo ocurren en presencia de regalo nupcial, se describen algunas peculiaridades de la cpula con particular nfasis en los casos en que el regalo no est presente. Similar a las poblaciones brasileas, la cpula consiste en perodos de insercin palpar alternados por posiciones cara a cara, en donde tanto el macho como la hembra muerden el regalo (Fig. 3). Antes de cada insercin, el macho engancha el regalo con las uas del tercer par de patas y monta a la hembra intentando insertar el
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rgano palpar. Una vez se da la insercin el macho mantiene el tercer par de patas en esta posicin y slo lo quita cuando la insercin finaliza, mordiendo el regalo con los quelceros al retornar a la posicin cara a cara.
Figura 3. Hembra (izquierda) y macho (derecha) de P. ornata tomados del regalo nupcial durante la cpula. Foto: M.J. Albo.
Cuando la donacin no estuvo presente (grupo NP), se observ que el comportamiento del macho fue similar, y el tarso del tercer par de patas del macho enganch las partes bucales de la hembra durante las inserciones, aunque una vez la insercin finalizaba no se observ contacto directo entre las partes bucales de macho y hembra en la posicin cara a cara. Cuando los machos mantuvieron el regalo en sus quelceros (grupo ND), el patrn de cpula fue similar al observado en NP. Estos machos retuvieron la presa incluso en la posicin cara a cara y no se observaron dificultades para realizar las inserciones. Discusin La presencia de regalos nupciales en P. ornata mejora el xito de cpula del macho e incrementa la duracin de la cpula, lo que concuerda por lo reportado para algunos insectos donadores de regalos nupciales. (Sakaluk 1984; Thornhill 1976b; Simmons & Gwynne 1991;
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Vahed 2007). Efectos similares fueron indicados en la araa Pisaura mirabilis por Stlhandske (2001), quien sugiri que el regalo puede optimizar la posicin de cpula y facilitar la insercin palpar. A pesar de que los machos pueden copular donando tanto presas empaquetadas como no empaquetadas, los resultados muestran que el empaquetado de la presa en seda y la construccin de un regalo verdadero en P. ornata mejora las chances de cpula del macho. La envoltura en seda de la presa podra tambin incrementar el control del macho sobre la cpula, como fue sugerido por Andersen et al. (2008) para P. mirabilis. La ausencia de regalo no increment la existencia de canibalismo sexual, y el nico caso donde se observ canibalismo fue en presencia de regalo, por lo que se descarta que el regalo pueda ser usado por el macho para evitar ser devorado por la hembra en esta especie. Los resultados muestran que los machos transportando una presa (empaquetada en seda o no) activamente buscan hembras y las encuentran antes que los machos sin donacin. Esto sugiere que los primeros tuvieron mayor motivacin de bsqueda y fueron ms exitosos en obtener cpulas. En acuerdo con sto, los machos sin presa activamente exploraron el sustrato al detectar los rastros de las hembras como si buscaran una presa para empaquetar, a veces tambin evitando la monta. Las hembras receptivas fueron tambin activas y realizaron muchos ataques ritualizados, sugiriendo que estos ataques son una seal de receptividad o alternativamente la hembra est buscando un regalo. Construir y transportar un regalo antes del encuentro con la hembra implica para los machos el beneficio de facilitar la cpula rpidamente y asegurar cpulas prolongadas. Esto ltimo parece beneficiar a los machos en un escenario de competencia espermtica (Drengsgaard & Toft 1999) y compensar los costos de capturar una presa sin comerla, las cantidades de seda invertidas en el empaquetado, la prdida de tiempo y energa sin haber encontrado la hembra y los riesgos de depredacin mientras empaqueta y transporta el regalo (ver Albo et al. 2009). Contrario a lo observado en P. mirabilis, donde los machos con presa empaquetada y sin empaquetar obtuvieron xito de cpula similares (Bilde et al. 2007), en P. ornata el empaquetado en seda mejora el xito de
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obtener una cpula. En Paratrechalea ornata los machos transportando presas empaquetadas tendieron a obtener mayor xito de cpula en el primer encuentro con la hembra, que aquellos que presentaban presas sin empaquetar. Ms an, la mayora de los machos con presas sin empaquetar iniciaron el empaquetado en seda luego de contactar a la hembra y todos copularon luego de ofrecer la presa empaquetada en seda. El grupo NP aporta evidencia adicional de fuerzas selectivas sobre los machos para el empaquetado en seda, donde la mitad de los machos no copularon a pesar de que las hembras aparentemente fueron receptivas. Estos machos empaquetaron restos de presa luego en sus cajas de cra. Estas donaciones simblicas o no nutritivas fueron tambin observadas en la naturaleza en las poblaciones de P. ornata, conteniendo presas secas o incluso hasta semillas (M.J. Albo & F.G. Costa, observaciones personales), y han sido reportadas en P. mirabilis en condiciones de laboratorio (G. Winther & M.J. Albo, observaciones personales) y en la naturaleza (Bristowe 1958, Nitzche 1988, Stlhandske 2002). La cobertura en seda por s misma podra tener algn valor nutritivo, y el probable consumo de seda ha sido reportado para algunas especies de araas (Miyashita et al. 2004), incluyendo a hembras de P. mirabilis durante la cpula (Nietzsche 1988). Sin embargo, la digestibilidad de la seda por las araas pertenecientes a Trechaleidae es incierta (W. Eberhard, comunicacin personal), dejando importantes dudas acerca del valor nutritivo suministrado por un regalo simblico. A pesar de sto y debido a los requerimientos alimenticios de las hembras (Bilde et al. 2007, Prokop & Maxwell 2009), el regalo nupcial podra haberse originado como un importante aporte nutricional para las hembras de araa. Los resultados presentados aqu no concuerdan con la hiptesis de inversin paternal en P. ornata, como ha sido reportado para insectos (Thornhill 1976a, Gwynne 1984, Simmons & Parker 1989, Boggs 1995), a pesar del pequeo tamao de la muestra de ninfas eclosionadas. Consecuentemente, los resultados sugieren que el regalo nupcial ha evolucionado como esfuerzo de cpula que incrementa las chances del macho de
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obtener cpulas ms prolongadas, asegurando la paternidad en un contexto de poliandria con altos niveles de competencia espermtica (Stlhandske 2001, Drengsgaard & Toft 1999). Por otro lado, el incremento en la duracin de la cpula pareci acelerar la primera oviposicin de la hembra. El regalo nupcial por s mismo no determin la oviposicin temprana, pero el regalo fue asociado a cpulas prolongadas. El efecto de la duracin de la cpula podra surgir de forma de incrementar la transferencia de esperma e incluso posiblemente tambin para adicionar sustancias asociadas al eyaculado, afectando la tasa de oviposicin y fecundidad de la hembra (Heifetz et al. 2001, Vahed 2006, Gwynne 2008). Promoviendo cpulas ms prolongadas los machos podran asegurar el uso rpido de su esperma, maximizando el suministro del mismo y la fertilizacin de los huevos, y de sta manera obteniendo la paternidad de la mayora de la descendencia (Gwynne 2008). Las hembras de P. ornata son poliandricas (M.J. Albo, datos no publicados) y los machos podran beneficiarse acelerando la oviposicin, minimizando as la competencia espermtica. Sin embargo, este efecto podra afectar negativamente los intereses de la hembra, como fue reportado para algunas especies de insectos (Simmons & Gwynne 1991, Sakaluk et al. 2006), y entonces la manipulacin de la hembra por el macho y el conflicto de intereses, podran estar involucrados. Por otro lado, la temprana oviposicin de la hembra en P. ornata podra tambin ser una ventaja para las hembras porque rpidamente pueden obtener descendencia antes de ser ms viejas, as como tambin maximizar el nmero de ootecas durante la estacin reproductiva (hasta 4 ootecas; Albo, observaciones personales). Desde la perspectiva de la hembra, la existencia de inserciones numerosas y prolongadas podran ser explicadas en un escenario de eleccin crptica femenina, donde el esperma del macho con cortejo copulatorio ms conspicuo y/o costoso podra ser el elegido por la hembra (Eberhard 1996). En resumen, los resultados apoyan la hiptesis de que el regalo nupcial y la envoltura en seda de la presa son mantenidos en Paratrechalea ornata por esfuerzo de cpula del macho, mejorando las chances de cpula de ste y probablemente brindando ventajas en un contexto
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de fuerte competencia espermtica. Explicaciones similares fueron sugeridas en Pisaura mirabilis (Stlhandske 2001, Drengsgaard & Toft 1999, Bilde et al 2007). Nuevos estudios son particularmente necesarios respecto al valor nutritivo del regalo nupcial y la eleccin de la hembra en P. ornata y otras especies de araas donadoras de regalos nupciales. Agradecimientos Se agradece a Anita Aisenberg, Soledad Ghione, Alicia Postiglioni, Rodrigo Postiglioni y Carlos Toscano-Gadea por su colaboracin en la colecta de araas. Se agradece a Maria. J. Ferreiro, Santiago Ruiz y Rafael Cantera del Departamento de Biologa del Neurodesarrollo del IIBCE por gentilmente brindarnos las moscas Drosophila spp. Un agradecimiento especial a Ernesto CostaSchmidt, Trine Bilde, Sren Toft y William Eberhard por las constructivas discusiones.
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Captulo 2 Estrategias Reproductoras 2.4- MACHOS DE CALIDAD? EVALUACIN DE LOS POSIBLES COSTOS DE LA CONSTRUCCIN DEL REGALO NUPCIAL EN LOS MACHOS DE Pisaura mirabilis (PISAURIDAE)
Introduccin La teora de seleccin sexual predice un importante desarrollo de los caracteres secundarios (armas y ornamentos) que permitir a los individuos obtener un alto xito reproductivo, an en desmedro de su propio xito de supervivencia (Darwin 1871). Bajo este escenario, debido a que en general en el reino animal los machos compiten por las hembras y son las hembras las que eligen, los machos invertirn en rasgos y comportamientos que los harn elegibles (Andersson 1994). Existen dos hiptesis principales que explican la evolucin de la eleccin de la hembra. Una es la corrida Fisheriana (runaway), donde se establece en la poblacin que machos con determinadas caractersticas que los hacen ms atractivos son elegidos por las hembras, y tanto la atractividad de los machos como la preferencia de las hembras se transmitirn a la descendencia, aumentando su xito reproductivo (Fisher 1930, Kirkpatrick 1982). La otra, la hiptesis de los buenos genes o hndicap (Zahavi 1975) plantea que la honestidad y costo de las seales (como ornamentaciones e intensidad del cortejo) permitir a las hembras distinguir entre machos de buena o mala calidad y decidir la eleccin o no de la cpula. Bajo este planteo, los machos en pobres condiciones energticas y fsicas no podrn eventualmente mantener estos rasgos y sern rechazados por las hembras, mientras que aquellos en buenas condiciones tendrn el mayor xito reproductivo y sus caractersticas podrn ser heredadas por sus hijos (Andersson 1994, 1996). Varios factores pueden afectar las condiciones fsicas de los machos (enfermedades, parsitos, etc). Ha sido demostrado en vertebrados e invertebrados que la carencia alimentaria e incluso tambin el balance nutricional del individuo pueden afectar negativamente su xito reproductivo, en algunos casos como resultado de la eleccin realizada por la hembra (Rowe & Houle 1996, Ahtiainen et al. 2000, Andrade & Mason 2000, Kotiaho 2002, Engqvist & Sauer 2003, Cotton et al 2004, Hunt et al. 2004, Lomborg & Toft in press).
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Captulo 2 Estrategias Reproductoras Tpicamente el cortejo precopulatorio es uno de los comportamientos imprescindibles tanto para el reconocimiento especfico, como para la evaluacin y eleccin de la futura pareja (Andersson 1994, Alcock 1998). Los regalos nupciales refuerzan la atractividad de los machos durante el cortejo y la cpula, y son caracteres que han sido ampliamente estudiados principalmente en diferentes familias de insectos, tanto su origen y funcin, como su evolucin (Boggs 1995, Vahed 2007, Gwynne 2008). Se han descrito regalos en forma de presas capturadas, regurgitaciones, fluidos glandulares, partes corporales especializadas del macho, que son donados por el macho a la hembra durante el cortejo y la cpula (Thornhill 1976, Boggs 1995, Sakaluk 2000, Vahed 2007). La presa ofrecida por el macho de Pisaura mirabilis puede estar envuelta o no en seda, y esta envoltura parece no tener efectos sobre la aceptacin y duracin de la cpula (Bilde et al. 2007). Mientras existen varias hiptesis acerca de la funcin del empaquetado en seda, tales como evitar la disgregacin de la presa, permitir empaquetar varias presas juntas, o bien aumentar el tamao aparente del regalo (Austad y Thornhill 1986, Lang 1996), slo dos trabajos han estudiado y discutido en profundidad el tema. Stlhandske (2001), sugiri que existe explotacin sensorial por el macho del instinto maternal de la hembra, siendo en este caso la seda blanca que recubre el regalo una imitacin de la capa de seda que recubre los huevos (ooteca), que resulta muy atractiva la hembra. Recientemente adems se ha sugerido que la envoltura en seda favorecera a los machos a controlar la cpula, permitiendo la sujecin del regalo y evitando que la hembra escape antes que se complete la transferencia espermtica (Andersen et al. 2008). Ms all de las posibles funciones de la seda en el regalo, se ha sugerido que la inversin que el macho de P. mirabilis realiza en la seda es baja y no implicara altos costos para ste (Lang 1996). Este autor observ que el tamao de la presa no es un factor que determine la cantidad de seda y que sta es una parte mnima del regalo. Adems, ni la inversin de seda en regalos anteriores, ni la condicin de hambre del macho afectaran la
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cantidad de seda, dado que machos hambrientos compensaran una baja eficacia de produccin de seda con mayor tiempo de envoltura. Sin embargo, el costo de la envoltura de seda de los regalos nupciales no ha sido estudiado en suficiente detalle an. Debido a que la seda est constituda entre otras sustancias de abundantes protenas (Foelix, 1996), la prdida de stas podra implicar costos altos bajo ciertas circunstancias naturales, en este caso asociados al empaquetamiento del regalo. Por otro lado, bajo cualquiera de las hiptesis acerca de la funcin de la seda en el regalo y dado que el regalo es un posible carcter de eleccin femenina, el empaquetamiento en seda podra estar bajo intensas presiones de seleccin sexual epigmica. Siguiendo el modelo de handicap de Zahavi (1975), si la inversin en seda es importante y costosa, slo los machos de P. mirabilis en buenas condiciones nutricionales podrn envolver eficazmente y mantener la calidad de la seal. El objetivo general de este trabajo fue investigar la tasa de construccin de regalos nupciales en machos bajo distintos estmulos sexuales femeninos, y distintas condiciones de alimentacin. Adems, teniendo como hiptesis que el tamao de la presa puede influir en la decisin del macho en comer o envolver la presa, y que los machos con presas pequeas se veran bajo fuertes presiones de optimizar el tamao del regalo y envolver sin comer, nos interes saber si estos machos pueden adaptar su comportamiento de envoltura de acuerdo al tamao de la presa. Mtodos Con el fin de poner a prueba si las diferencias en el tamao de la presa usada para la construccin del regalo nupcial se traducan en diferencias comportamentales del macho, 17 machos de P. mirabilis fueron expuestos a diferentes tratamientos (ver ms adelante) con dos tamaos de presas diferentes. Las hiptesis subyacentes fueron que machos con presas grandes podran consumir la presa y alimentarse por mayor tiempo antes de empaquetarla, mientras que machos con una presa pequea se veran obligados a envolver sin comer la presa, para optimizar el tamao del regalo. Nueve machos recibieron como presa una mosca entera
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(Musca domestica) (grupo UM) y ocho machos recibieron la mitad de una mosca domstica (grupo MM). Las moscas de MM se sacrificaron al fro y se les hizo un corte sagital algunos minutos antes de la experiencia de forma de entregar una similar composicin de presa a todos los machos. Otras muestras de moscas (20 enteras y 20 mitades) fueron tratadas para constatar que el peso seco variara como el tamao. Para ello, las moscas fueron colocadas en un horno de vaco Struers Heraeus durante un mnimo de 3 das a una temperatura constante de 60C. Luego se pesaron en una balanza Mettler A30 de 0.0001 g de precisin. Las moscas enteras (UM) pesaron en promedio 0.0035 g ( 0.0005 SD) y fueron prcticamente el doble ms pesadas que las moscas cortadas (MM), que pesaron 0.0020 g ( 0.0006 SD) (Test de Student: N= 20, N= 20, t = 7.9, p < 0.0001). Estudios indirectos (Lang 1996) indicaron que la seda de la hembra es capaz de desencadenar la construccin del regalo nupcial en P. mirabilis, pero no existe informacin detallada y comparativa de la construccin del regalo por machos estimulados por las hembras o por machos sin estmulos femeninos. Se quisieron comparar los comportamientos ms representativos de la construccin del regalo nupcial frente a diferentes estmulos por machos con mosca entera y con media mosca. Para esto 17 machos con una presa recin entregada (9 UM y 8 MM) fueron expuestos sucesivamente y en orden aleatorio a tres tratamientos: (S) presencia de seda de la hembra; (SH) presencia de seda y de la hembra y (C) ausencia de seda y de hembra. En una primera etapa se realizaron las 34 pruebas o ensayos con los machos bien alimentados y en una segunda etapa otras 34 pruebas con esos mismos machos mal alimentados (ver prrafo siguiente). En la primera etapa los machos fueron alimentados con 3 moscas domsticas (Musca domestica) semanales. Cada prueba estuvo separada por al menos cinco das de la anterior. Se utilizaron hembras distintas para cada ensayo. Para los tratamientos S y SH, las hembras fueron colocadas en la caja experimental un mnimo de una hora antes de la experiencia, permitiendo la deposicin de seda. En el tratamiento S, la hembra fue extrada luego de este perodo y el macho fue expuesto al sustrato. En el tratamiento SH la
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hembra fue extrada y colocada en la caja experimental dentro de un tubo muy corto encerrada con una red, lo que permiti el contacto directo hembra-macho, pero evit la cpula. Para el tratamiento C el macho fue colocado sobre el sustrato limpio, sin rastros de la hembra. Todos los machos y hembras fueron usados al menos 20 das despus de la ltima muda. Considerando que en esta especie las condiciones alimentarias del macho pueden afectar la eficacia en la produccin de seda (Lang 1996), repetimos los experimentos anteriores con los mismos machos mal alimentados, de manera de poder determinar si el mismo individuo era capaz de variar su comportamiento dependiendo de su estado alimentario, del estmulo al que estaba siendo sometido y el tamao de la presa que tena para empaquetar en seda. Terminada la primera etapa, los 17 machos fueron alimentados durante 10 das con una nica mosca de la fruta (Drosophila melanogaster), a partir de ese momento stos fueron expuestos
sucesivamente a los tres tratamientos (S, SH y C). En sta segunda etapa el intervalo entre los dos primeros tratamientos fue de 10 das, mientras que de 5 das entre el segundo y el tercero, al constatarse el mal estado corporal de los machos y la mortalidad observada (Fig. 2).
Bien alimentados 10 das E1 5 das E2 5 das E3 10 das
Mal alimentados 10 das E1 E2 5 das E3
Figura 2. Esquema de las etapas (bien alimentados y mal alimentados) y del momento de realizacin del ensayo (E). En la etapa bien alimentados (3 moscas domesticas semanales), los machos fueron expuestos a cada ensayo (E1, E2 y E3) con un intervalo de al menos 5 das. En la etapa mal alimentados, se redujo la alimentacin durante 10 das y luego se los expuso a E1. Se esperaron 10 das ms reduciendo la alimentacin y se realiz E2, y luego se contino sin alimentacin durante 5 das y se realiz E3.
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Finalmente y para descartar que el comportamiento de los machos se viera afectado ms por la edad que por la alimentacin, se criaron bajo buenas condiciones de alimentacin otros 10 machos de edad similar a los machos de la segunda etapa, los cuales se sometieron a los tratamientos S, SH y C, cinco con una mosca (UM) y cinco con media mosca (MM). Se pesaron los machos experimentales durante la segunda etapa (antes del segundo tratamiento) y se compararon con estos 10 machos bien alimentados y de misma edad, obtenindose una media 0.0722 g (0.010 SD) en los primeros y de 0.0843 g (0.019 SD) en los segundos, lo que signific una prdida del 14% del peso corporal. La duracin de cada ensayo fue de 30 min. Sin embargo, si se observaban movimientos del macho iniciando la construccin del regalo nupcial la observacin continu hasta que la construccin finalizara. Los machos y las hembras fueron pareados al azar para cada tratamiento. Se registraron los comportamientos y las interacciones entre individuos, especialmente la ocurrencia y demora del macho en construir regalo nupcial, la duracin de la construccin del regalo, nmero y tiempo de empaquetados en seda y el color del regalo. La demora en construccin fue definida como el tiempo transcurrido entre la exposicin del macho al tratamiento y el inicio del primer empaquetado en seda de la presa. La duracin de la construccin del regalo fue el tiempo entre el inicio del primer empaquetado y el fin del ltimo empaquetado (incluye varias secuencias de empaquetado y perodos intermedios donde el macho transporta el regalo). La duracin del empaquetado de la presa consisti en el tiempo total en que el macho estuvo empaquetando la presa en seda. Una vez finalizada la observacin, se clasificaron los regalos en 3 colores: blancos, grises o negros, como una forma de estimar la cantidad total de seda liberada por el macho y visible por el observador.
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Captulo 2 Estrategias Reproductoras Resultados
Breve descripcin de la construccin del regalo nupcial La construccin del regalo nupcial por el macho consisti en el telado de una capa basal de seda sobre el sustrato mientras mantuvo la presa en la boca; el macho apoy la presa en el medio de este plato y lo cubri con seda; lo arranc del sustrato y lo redonde con palpos y quelceros. Este proceso de empaquetado de la presa se repiti hasta 7 veces en machos bien alimentados (primera etapa), intercalando perodos de transporte de la presa y actividad de bsqueda de la hembra, similar a lo descripto para Paratrechalea ornata (Trechaleidae) por Costa-Schmidt et al. (2008) y Albo et al. (2009). Frecuencias y duraciones en machos bien alimentados La frecuencia de construccin del regalo nupcial difiri en los 3 tratamientos (S, SH y C) (2yates = 31.4, p < 0.0001, gl = 2) (Tabla 1). En la comparacin de a pares (Test de Fisher) se observ una menor ocurrencia de construccin de regalos en C difiriendo significativamente de S y SH (S-C, p = 0.000008; SH-C, p = 0.000001), mientras que stos no difirieron entre s (p = 0.50). En S, ocho de nueve machos que transportaban una mosca (UM) y siete de ocho machos que transportaban media mosca (MM) construyeron regalo, no mostrando diferencias estadsticas entre s (2yates = 0.14, p = 0.71). Mientras que en SH, ocho de nueve en UM y los ocho machos de MM construyeron regalo, tampoco mostraron diferencias entre s ( 2yates = 0.00, p = 0.95).
Tabla 1. Frecuencias de construccin de regalo nupcial en los diferentes tratamientos de los machos bien alimentados, mal alimentados y grupo control de machos adicionales. Tratamientos: S, con slo seda; SH, con seda y hembra; C, control, sin rastros de hembra.
Machos bien alimentados S Construy No construy 15 2 SH 16 1 C 2 15
Machos mal alimentados S 6 5 SH 6 5 C 1 9
Machos control adicionales S 10 0 SH 8 2 C 1 8
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En la Tabla 2 se muestran los promedios de demora de construccin del regalo, duracin de la construccin, duracin del empaquetado en seda y nmero de empaquetados. No se encontraron diferencias entre los machos que transportaban una mosca (UM) y aquellos que transportaban media mosca (MM), tanto en el tratamiento S como en el SH. Tampoco se encontraron diferencias estadsticas entre UM y MM cuando se agruparon los datos de S y SH. Cuando, a la inversa, se agruparon los datos de UM y MM, no se encontraron diferencias entre S y SH en la demora de construccin del regalo, ni en la duracin de la construccin, ni en la duracin del empaquetado en seda (Tabla 2). Sin embargo, se encontraron diferencias en el nmero de empaquetados en seda: los machos de SH realizaron mayor nmero de empaquetados en seda que los machos de S. Tres machos construyeron regalo en C, demorando un promedio de 19.7 min ( 7.2 SD) en construir y realizando una media de 2.3 ( 1.2 SD) empaquetados. Estos mismos machos demoraron menos en construir en S y en SH (t = 4.1, p = 0.05; t = 4.1, p = 0.08, respectivamente).
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Tabla 2. Valores medios (en minutos) y desvo estndar de la demora en la construccin del regalo, la duracin de la construccin, la duracin del empaquetado de la presa en seda, as como valores medios del nmero de empaquetados en el grupo de machos bien alimentados (BA). Se compararon estas caractersticas entre UM y en MM tanto separadamente para cada tratamiento (S y SH, parte superior de la tabla) como agrupando los valores de S y SH (parte media de la tabla); tambin se compararon S y SH agrupando los valores de UM y MM (parte final de la tabla). Para los anlisis estadsticos se usaron los tests de Mann Whitney (U), de Student (t) y de Wilcoxon (Z).
Tratamiento S UM (N = 8) Demora en la construccin Duracin de la construccin Duracin del empaquetado Nmero de empaquetados 4.6 3.1 11.9 8.8 5.3 2.8 3.0 0.7 MM (N = 7) 7.8 7.3 12.7 10.4 3.8 1.5 2.2 0.7 Estadstica UM (N = 8) 5.7 5.4 14.4 7.3 7.3 4.0 3.9 1.6
Tratamiento SH MM (N = 7) 3.8 1.7 13.9 7.8 4.8 2.3 3.3 1.0 Estadstica
U = 22, p = 0.52 t = 0.15, p = 0.88 U = 19, p = 0.32 U = 15, p = 0.11 MM (N = 14)
U = 28, p = 0.71 t = 0.11, p = 0.91 U = 17.5, p = 0.14 U = 25, p = 0.48
UM (N = 16)
Estadstica
Demora en la construccin Duracin de la construccin Duracin del empaquetado Nmero de empaquetados
5.1 4.4 7.1 13.1 6.3 3.6 3.4 1.3 Tratamiento S (N = 14)
5.7 5.3 13.4 8.8 4.3 1.9 2.8 1.0 Tratamiento SH
U = 114, p = 0.80 t = 0.06, p = 0.95 U = 72, p = 0.06 U = 86.5, p = 0.17
Estadstica (N = 14) 4.5 4.3 13.8 7.4 5.7 2.4 3.7 1.3 Z = 0.91 p = 0.36 t = 0.44, p = 0.67 Z = 1.1, p = 0.25 Z = 2.6, p = 0.007
6.4 5.6 12.4 9.6 4.7 2.4 2.7 0.8
Frecuencias y duraciones en machos mal alimentados No se encontraron diferencias en las frecuencias de ocurrencia de construccin del regalo nupcial entre los tratamientos S, SH y C (Tabla 1), aunque estuvieron cercanas al lmite de significacin (2yates = 5.66, p = 0.06, gl = 2). Sospechando que hubiera diferencias significativas se realiz la comparacin de a pares mediante el Test de Fisher. Los machos de S
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y SH tuvieron mayor frecuencia de construccin que los machos de C (S-C, p = 0.04; SH-C, p = 0.04); mientras que S y SH no difirieron entre s (p = 0.33). En S, cinco de seis machos en UM y uno de cinco en MM construyeron regalo. En SH cuatro de seis en UM y dos de cinco machos en MM construyeron regalo nupcial.
Tabla 3. Valores medios (en minutos) y desvo estndar de la demora en la construccin del regalo, la duracin de la construccin, la duracin del empaquetado de la presa en seda, as como valores medios del nmero de empaquetados en el grupo de machos mal alimentados (MA). Se compararon estas caractersticas entre UM y en MM tanto separadamente para cada tratamiento (S y SH, parte superior de la tabla) como agrupando los valores de S y SH (parte media de la tabla); tambin se compararon S y SH agrupando los valores de UM y MM (parte final de la tabla). Para los anlisis estadsticos se us el test de Student.
Tratamiento S UM (N = 5) Demora en la construccin Duracin de la construccin Duracin del empaquetado Nmero de empaquetados 4.0 2.5 5.7 3.2 4.7 2.2 2.2 0.8 MM (N = 1) 3.9 4.7 2.5 2.0 UM (N = 9) Demora en la construccin Duracin de la construccin Duracin del empaquetado Nmero de empaquetados 3.6 2.4 5.9 2.5 5.2 1.9 2.4 0.8 Tratamiento S (N = 3) Demora en la construccin Duracin de la construccin Duracin del empaquetado Nmero de empaquetados 4.1 3.0 7.6 2.4 6.0 1.6 2.7 0.5 Estadstica UM (n = 4) 3.3 2.6 6.2 1.6 5.8 1.5 2.8 0.9 MM (N = 3) 2.3 1.4 3.7 1.3 3.0 1.1 2.3 0.5
Tratamiento SH MM (N = 2) 1.5 3.3 3.3 2.5 Estadstica
Estadstica
t = 0.94, p = 0.36 t = 1.39, p = 0.19 t = 1.84, p = 0.09 t = 0.20, p =0.85 Estadstica
Tratamiento SH (N = 3) 2.9 3.0 5.9 1.8 5.9 1.8 3.0 1.0
t = 0.43, p = 0.71 t = 0.73, p =0.54 t = 0.09, p = 0.93 t = 0.34, p = 0.74
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Agrupando los datos de S y SH, no se encontraron diferencias entre los machos UM y MM en la demora de construccin del regalo, en la duracin de la construccin, ni en la duracin del empaquetado en seda y tampoco en el nmero de empaquetados. Tampoco se observaron diferencias entre los comportamientos de los machos S y SH cuando se agruparon los valores de UM y de MM (Tabla 3). El nico macho que construy regalo en el tratamiento C demor 3.7 min en iniciar la construccin, tuvo una duracin total de construccin de 4.6 min y de empaquetado de 4.6 min, realizando 3 envolturas. Frecuencias y duraciones de machos adicionales de control. Este grupo (n = 10) ofici como control del factor edad de los machos mal alimentados (misma edad y bien alimentados). Se encontraron diferencias en la ocurrencia de construccin del regalo (2yates = 17.9, p < 0.0001, gl = 2) entre los tratamientos S, SH y C. En la comparacin de a pares usando el Test de Fisher (Tabla 4), los machos de S y de SH construyeron con mayor frecuencia regalos que los de C (S-C, p = 0.00012; SH-C, p = 0.004), pero no mostraron diferencias entre s (S-SH, p = 0.23) (Tabla 1). Al comparar los tiempos de demora de construccin del regalo, de duracin de la construccin, y el nmero de empaquetados, no se observaron diferencias entre UM y MM tanto en el tratamiento S como en los tratamientos SH y C. En cambio, los machos de UM envolvieron por ms tiempo la presa que los machos de MM en el tratamiento S (Tabla 4). Cuando se agruparon los datos de S y SH y se compararon los valores de UM y MM, nuevamente se observ que los machos de UM tuvieron mayores duraciones de empaquetado en seda que los machos de MM. No se encontraron diferencias entre los tratamientos S y SH cuando se agruparon los valores de UM y de MM (Tabla 4). Un nico macho construy regalo en el tratamiento C, demorando 2.6 min en iniciar la construccin, con un tiempo de construccin y empaquetado de 2.6 min y una nica envoltura.
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Tabla 4. Valores medios (en minutos) y desvo estndar de la demora en la construccin del regalo, la duracin de la construccin, la duracin del empaquetado de la presa en seda, as como valores medios del nmero de empaquetados en el grupo de machos de control adicional (CA). Se compararon estas caractersticas entre UM y en MM tanto separadamente para cada tratamiento (S y SH, parte superior de la tabla) como agrupando los valores de S y SH (parte media de la tabla); tambin se compararon S y SH agrupando los valores de UM y MM (parte final de la tabla). Para los anlisis estadsticos se usaron los tests de Mann Whitney (U) y de Student (t).
Tratamiento S UM (N = 5) Demora en la construccin Duracin de la construccin Duracin del empaquetado Nmero de empaquetados 3.0 1.1 11.0 5.6 6.2 1.8 2.8 1.3 MM (N = 5) 3.8 1.7 6.9 5.5 3.3 0.9 2.0 1.7 UM (N = 10) Demora en la construccin Duracin de la construccin Duracin del empaquetado Nmero de empaquetados 6.8 9.2 13.0 6.8 5.8 1.7 3.0 1.2 Tratamiento S (N = 7) Demora en la construccin Duracin de la construccin Duracin del empaquetado Nmero de empaquetados 3.0 0.9 9.2 32.1 4.9 2.4 2.7 1.1 Estadstica UM (N = 5) 10.5 12.4 14.9 8.0 5.5 1.7 3.2 1.3
Tratamiento SH MM (N = 3) 2.8 0.8 2.8 0.8 3.3 0.5 2.7 0.5 Estadstica
t = 0.89, p = 0.39 t = 1.1, p = 0.29 t = 3.06, p = 0.02 t = 1.2, p = 0.26
U = 6.5, p = 0.83 U = 1, p = 0.07 t = 2.08, p = 0.08 t = 0.65, p = 0.54 Estadstica
MM (N = 8) 3.4 1.4 9.3 6.1 3.3 0.7 2.3 0.7 Tratamiento SH (N = 7) 6.4 10.4 14.8 7.3 4.5 1.8 2.8 1.0
U = 37, p = 0.82 t = 1.17, p = 0.25 t = 3.8, p = 0.001 t = 1.5, p = 0.15 Estadstica
t = 0.95, p = 0.38 t = 1.4, p = 0.19 t = 0.35, p = 0.74 t = 0.28, p = 0.78
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Comparacin entre los grupos de machos bien alimentados, mal alimentados y del control adicional. Dado que no hubo diferencias significativas en las frecuencias de construccin del regalo entre los tratamientos S y SH, estos tratamientos se agruparon para comparar la construccin entre los grupos de machos bien alimentados, mal alimentados y controles. Al test de Fisher, los machos controles construyeron con frecuencias similares a los bien alimentados (p = 0.74), pero con mayor frecuencia que los mal alimentados (p = 0.01). Los machos bien alimentados construyeron ms frecuentemente que los mal alimentados (p = 0.002). Los machos de S y SH bien alimentados construyeron con frecuencias similares en los tres ensayos sucesivos ( 2yates = 1.17, p = 0.56, gl = 2), mientras que la frecuencia de construccin en los machos mal alimentados tendi a disminuir en los sucesivos ensayos ( 2yates = 4.91, p = 0.09, gl = 2) (Fig. 3). La construccin del regalo en este grupo fue mnima en el tercer ensayo, encontrndose diferencias significativas al test de Fisher entre el primero y el tercero (p = 0.04), pero no entre primero y segundo (p = 0.33) ni entre segundo y tercero (p = 0.27).
Figura 3. Frecuencias de construccin del regalo nupcial (porcentajes, en ordenadas) en los sucesivos ensayos de los mismos machos (1, 2 y 3), agrupando los valores de los tratamientos S y SH. BA indica los valores de machos bien alimentados y MA aquellos de los mal alimentados.
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Tabla 5. Tiempos promedio (en minutos) de la demora en la construccin del regalo, de la duracin de la construccin y de la duracin del empaquetado de la presa en seda, as como el promedio del nmero de empaquetados. Se comparan entre s los machos bien alimentados y los mal alimentados en el tratamiento S (BAS y MAS, respectivamente) y en el tratamiento SH (BASH y MASH, respectivamente), y ambos con el grupo control adicional en ambos tratamientos (CAS y CASH). Para los anlisis estadsticos se usaron los tests de Mann Whitney (U) y de Student (t).
BAS (N = 6) Demora en la construccin Duracin de la construccin Duracin del empaquetado Nmero de empaquetados 6.0 5.9
MAS (N = 6) 3.9 2.2
Estadstica U = 18, p = 1 U = 8, p = 0.13 U = 17.5, p = 0.97 U = 13.5, p = 0.68
BASH (N = 5) 6.2 9.9 16.7 9.4 6.6 2.9 4.0 1.2 BASH (N = 16) 4.8 4.0 14.2 7.3 6.0 3.4 3.5 1.3 MASH (N = 6) 2.6 2.3 5.2 2.0 4.9 1.9 2.7 0.8
MASH (N = 5) 3.3 1.6 4.6 2.1 4.2 2.3 2.0 0.7 CASH (N = 8) 7.7 10.2 14.2 6.9 4.6 1.7 3.0 1.0 CASH ( N = 8) 7.7 10.2 14.2 6.9 4.6 1.7 3.0 1.0
Estadstica U = 10, p = 0.69 t = 2.7, p = 0.02 t = 1.5, p = 0.19 t = 3.1, p = 0.01
12.1 9.9 5.5 2.9 4.8 3.3 2.5 0.5 BAS (N = 15) 4.3 2.1 2.2 0.7 CAS ( N = 10) 3.4 1.4 8.9 5.7 4.7 2.1 2.4 1.1 CAS ( N = 10) 3.4 1.4 8.9 5.7 4.7 2.1 2.4 1.1
Estadstica U = 56, p = 0.30 U = 63, p = 0.53 U = 68, p = 0.71 U = 62, p = 0.46
Estadstica U = 55.5, p = 0.62 t = 0.03, p = 0.97 U = 46, p = 0.27 U = 48.5, p = 0.38
6.1 5.5 12.2 9.2 4.6 2.3 2.7 0.8 MAS (N = 6)
Estadstica t = 0.62, p = 0.55 U = 20.5, p = 0.33 t = 0.37, p = 0.71 U = 27, p = 0.78
Estadstica U = 14, p = 0.21 U = 8, p = 0.04 t = 0.33, p = 0.74 U = 20, p = 0.63
3.9 2.2 5.5 2.9 4.3 2.1 2.2 0.7
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En la Tabla 5 se compararon los tiempos de demora en la construccin del regalo, tiempo de construccin, tiempo de empaquetado en seda y el nmero de empaquetados, entre los tratamientos S y SH de los machos bien alimentados, mal alimentados y controles adicionales. No se encontraron diferencias en la duracin de la construccin entre los bien alimentados y los controles; los mal alimentados presentaron duraciones bajas y diferentes respecto a los bien alimentados y a los controles (todos en el tratamiento SH). Adems se observ que el nmero de empaquetados de los machos bien alimentados fue mayor que el realizado por los machos mal alimentados (en SH). Agrupando los datos de S y SH de los tres grupos de machos, se encontraron diferencias en el tiempo de construccin del regalo nupcial, siendo significativamente mayor en los machos bien alimentados y controles respecto a los mal alimentados (U = 72, p = 0.01; U = 54, p = 0.03, respectivamente). Los machos bien alimentados y los controles mostraron valores similares (U = 245, p = 0.49) (Tabla 6).
Tabla 6. Tiempos promedio (en minutos) de la demora en la construccin del regalo, la duracin de la construccin, la duracin del empaquetado de la presa en seda, as como el promedio del nmero de empaquetados en los tres grupos de machos (test de Kruskal-Wallis). BA = Machos bien alimentados, MA = machos mal alimentados, controles adicionales. CA = machos
BA (N = 31) Demora en la construccin Duracin de la construccin Duracin del empaquetado Nmero de empaquetados 5.4 4.8 13.2 8.2 5.3 3.0 3.1 1.2
MA (N = 12) 3.3 2.2 5.4 2.4 5.4 4.8 2.4 0.7
CA (N = 18) 5.3 6.9 11.3 6.6 4.6 1.9 2.7 1.1
Estadstica H = 2.7, p = 0.25 H = 9.8, p = 0.008 H = 0.27, p = 0.87 H = 3.6 , p = 0.16
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Color de los regalos El comportamiento de construccin del regalo nupcial difiri cualitativamente entre los machos bien alimentados (BA y CA) y los mal alimentados (MA). Se observ que los machos MA realizaron movimientos ms lentos que los saciados, al caminar y sensar los hilos de seda femeninos, as como al realizar las sucesivas deposiciones de seda, ya sea del plato basal como la cobertura de la presa. Los machos en peor condicin corporal (las dos ltimas pruebas de MA) tuvieron serias dificultades en la manipulacin de la presa y en la deposicin de seda durante la construccin del regalo, observndose una mnima cantidad de seda a pesar de que el macho invirti en ello tiempos similares a los otros machos (N = 3). El color del regalo vari entre blanco, gris y negro (Fig. 4) tanto en BA como en MA. No se encontraron diferencias significativas entre las frecuencias de los tres colores entre BA y MA (2yates= 2.63, p = 0.27, gl = 2), aunque en trminos absolutos se observ mayor cantidad de regalos negros en MA (Fig. 4c). Analizando las frecuencias de colores dentro de cada grupo experimental, no se observaron diferencias estadsticas entre los tres ensayos sucesivos de BA (2yates= 5.19, p = 0.27, gl =2) (Fig. 4a), ni tampoco dentro de MA (2yates= 5.47, p = 0.24, gl = 2) (Fig. 4b). Sin embargo, los regalos negros (con muy escasa seda) aumentaron proporcionalmente en los dos ltimos ensayos de MA, siendo todos negros en el ltimo (Fig. 4c). En BA, en cambio, el color gris permaneci predominante y los regalos negros fueron disminuyendo en frecuencia (Fig. 4a).
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Figura 4. Frecuencias de los colores de los regalos nupciales- Blanco, Gris y Negro- (porcentajes, en ordenadas) en los tres sucesivos ensayos en el grupo de machos bien alimentados (a) y en el de machos mal alimentados (b), as como una comparacin del total de frecuencias de colores entre los dos grupos (c).
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Pesos de los regalos En la Tabla 7 se presenta la comparacin de los pesos (secos) de los regalos en los tratamientos S y SH, y de las presas sin envolver en C, tanto en la primera serie (bien alimentados) como en la segunda (mal alimentados), as como los pesos en el grupo control adicional. Los regalos con moscas enteras (UM) de los tratamientos S y SH, tanto en machos bien alimentados, mal alimentados como controles adicionales, no presentaron diferencias significativas de peso entre s (F = 2.0, p = 0.10). Sin embargo, estos regalos pesaron menos que la muestra de moscas pesadas al azar previamente a las experiencias (0.0035 0.0005 g) (F = 3.8, p = 0.01). En la comparacin de a pares se encontr un menor peso en los regalos de BA (0.0029 0.0007 g) respecto a la muestra (t = 2.4, p = 0.02), y mayor peso (en el lmite de significancin) en los regalos del control adicional (0.0040 0.0008 g) respecto a la muestra (t = 2.0, p = 0.05). No se encontraron diferencias entre los pesos de la muestra y los del grupo MA (0.0033 0.001 g) (t = 0.63, p = 0.53). Se encontraron diferencias significativas de pesos entre el control C (machos expuestos a una arena sin rastros de hembra) tanto respecto a S como a SH en la primera serie de machos bien alimentados (t = 3.1, p = 0.007 comparando S y C; t = 3.8, p = 0.002 comparando SH y C). Tambin se encontraron diferencias cuando los machos estaban mal alimentados (t = 1.9, p = 0.07 entre S y C; t = 2.6, p = 0.03 entre SH y C). Las presas del tratamiento C fueron ms livianas para todos los casos, tanto en machos BA como machos MA. No se encontraron estas diferencias en el grupo control adicional. Al analizar los resultados de los machos que transportaban media mosca (MM), slo se encontraron diferencias en el grupo BA (Tabla 7), observndose nuevamente que las presas (no envueltas en seda) del tratamiento C fueron ms livianas que los regalos de S (t = 2.3, p = 0.03) y que los de SH (t = 2.9, p = 0.01). Los pesos de los regalos en los tratamientos S y SH de los grupos de machos BA, MA y controles adicionales fueron similares (F = 0.29, p = 0.21), pero difirieron respecto a los valores de la muestra previa (F = 3.5, p = 0.007). En la comparacin de a pares se registr mayor peso en la muestra previa (0.0020 0.0006 g)
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respecto a los pesos de BA (0.0013 0.0004 g, t = 3.7, p = 0.01), de MA (0.0013 0.0006 g, t = 2.8, p = 0.008) y del control adicional (0.0015 0.0005 g, t = 2.2, p = 0.04).
Tabla 7. Valores de pesos secos (promedios desvo estndar, en gramos) de regalos con una mosca (UM) y regalos con media mosca (MM) en los tratamientos S y SH, y de las presas sin envolver en el tratamiento C, para los grupos de machos bien alimentados (BA), mal alimentados (MA) y controles adicionales (CA). Las comparaciones estadsticas se hicieron con ANOVA.
UM
SH
Estadstica
Grupo BA
0.0030 0.0006 (N = 9) 0.0036 0.001 (N = 6) 0.0039 0.0009 (N = 5) S
0.0030 0.0008 (N = 9) 0.0029 0.0008 (N = 6) 0.0040 0.0007 (N = 4) SH
0.0018 0.0005 (N = 7) 0.0022 0.0003 (N = 5) 0.0037 0.001 (N = 4) C
F = 7.1, p = 0.004
Grupo MA
F = 3.7, p = 0.04
Grupo CA MM
F = 0.12, p = 0.88 Estadstica
Grupo BA
0.0012 0.0004 (N = 8) 0.0014 0.0008 (N = 5) 0.0020 0.0005 (N = 5)
0.0015 0.0004 (N = 8) 0.0012 0.0003 (N = 4) 0.0015 0.0006 (N = 3)
0.0007 0.0005 (N = 6) 0.0007 0.0003 (N = 3) 0.0013 0.0005 (N = 4)
F = 4.5, p = 0.02
Grupo MA
F = 1.3, p = 0.31
Grupo CA
F = 1.12, p = 0.89
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Captulo 2 Estrategias Reproductoras Discusin Es bien conocido que, tanto en vertebrados como en invertebrados, las condiciones alimentarias e incluso el balance nutricional de los individuos tienen efectos importantes sobre el cortejo y consecuentemente sobre el xito reproductivo de los individuos (Rowe & Houle 1996, Ahtiainen et al. 2000, Andrade & Mason 2000, Kotiaho 2002, Engqvist & Sauer 2003, Cotton et al 2004, Hunt et al. 2004). Los resultados muestran que las condiciones de alimentacin en los machos de Pisaura mirabilis afectan considerablemente el cortejo precopulatorio. El aumento progresivo de bajas condiciones de alimentacin en los machos result en una disminucin de las frecuencias de construccin del regalo nupcial, sumado a una baja eficiencia en el comportamiento de construccin y bsqueda de la hembra. Los machos hambreados (grupo MA) invirtieron tiempos menores en la construccin del regalo y envolvieron ms lentamente que los machos saciados, tanto jvenes (BA) como viejos (control adicional, CA). Esto no implic sin embargo menor tiempo de deposicin de seda, pero si implic menor tiempo de transporte del regalo y bsqueda de la hembra. Segn lo sugerido por Lang (1996) para esta especie, los machos hambreados invertiran un mayor tiempo en el empaquetado como una forma de equilibrar la baja produccin de seda. Segn este autor la seda depositada por el macho sera una parte mnima del regalo e implicara bajos costos para este. En el presente trabajo no se encontr que los machos hambreados aumentaran el tiempo de empaquetado respecto a los machos bien alimentados, aunque s una tendencia a que los machos bien alimentados produjeran regalos mayoritariamente grises y los machos hambreados un mayor nmero de regalos negros, con poca seda. Este desacuerdo con los resultados de Lang (1996) podra responder a diferencias en las condiciones de alimentacin entre ambos trabajos. Una mayor cantidad de seda podra tener implicancias sobre el color del regalo, as como tambin sobre la cantidad de posibles sustancias asociadas (ej: feromonas) a la seda, pudiendo ser estos factores relevantes para la eleccin femenina. Un trabajo preliminar en P. ornata indicara la existencia de sustancias asociadas a la seda del regalo como importantes atractivos de la hembra (Brum et al. 2008). Por otro lado, Stlhandske (2001) observ en P. mirabilis que
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el brillo del regalo afectaba el tiempo de aceptacin de la hembra, y que los regalos ms claros eran aceptados ms rpidamente. Existen algunas evidencias de que esto tambin podra estar sucediendo en el trecaleido Paratrechalea ornata, otra especie donadora de regalos nupciales (Klein et al. 2009). Si ste fuera el caso, los regalos con ms seda seran ms blancos o al menos ms claros y los machos que inviertan ms en los empaquetados se veran favorecidos al hacer el regalo ms atractivo para las hembras (sin embargo, ver Bilde et al. 2007). Es bien conocido en araas, que diferencias en el rgimen alimenticio entre individuos no slo afectan la tasa de supervivencia, los tiempos de maduracin y el tamao de los adultos, sino que tambin afecta el desarrollo y las caractersticas de los caracteres sexuales secundarios (Anderson 1974; Riechert & Harp 1987; Uetz et al. 1992; Toft & Wise 1999; Walker et. al. 2000). De hecho se ha sugerido que los penachos (tufts) de las patas dela nteras de Schizocosa ocreata y los golpeteos de patas de Hygrolycosa rubrofasciata, rasgos importantes para la eleccin femenina, varan con la condicin alimentaria del macho, lo que indica su condicin de seales honestas de la calidad del macho (Parri et al. 1997, Uetz et al. 2002). Segn la hiptesis de Zahavi (1975) sobre los buenos genes, slo los machos de buena calidad sern capaces de mantener la calidad de la seal (seales honestas) pese a su costo o handicap, y las hembras elegiran a esos machos cuyos buenos genes se transmitirn a sus hijos. Una mayor cantidad de seda en el regalo podra ser un indicador de buena calidad del macho en P. mirabilis. El regalo nupcial puede entonces, bajo condiciones naturales, ser un reflejo de la calidad del macho. Machos capaces de invertir en mayores o notorias cantidades de seda, ofreciendo regalos bien empaquetados, indicaran a las hembras que no slo son buenos cazadores de presas sino que tambin estn en buenas condiciones fsicas para asumir ese costo, y seran favorecidos por una fuerte eleccin femenina. Nuevos estudios evaluando la interaccin macho-hembra son necesarios para validar esta hiptesis. Por otro lado, se ha indicado que el tamao de la presa usada por los machos de P. mirabilis como regalo nupcial, es determinante de la duracin de la cpula y consecuentemente del nmero de huevos fertilizados (Stlhanske 2001). En este sentido las presas grandes
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promueven cpulas ms prolongadas, por lo que podra esperarse que los machos pudieran estimar el tamao de la presa y tomar distintas decisiones acerca de comer o empaquetarla. Por ejemplo, con presas pequeas los machos podran ofrecerlas completas, mientras que con presas grandes podran aprovechar los nutrientes y empaquetarlas. Bajo esta hiptesis se esperaba: 1) que la demora de construccin del paquete fuera menor frente a una presa
pequea (en el grupo MM) y 2) que los regalos con presa grande (UM) pesaran menos que la muestra de moscas pesada al azar previamente, indicando el consumo previo de la presa. Contrariamente a lo esperado, no se encontraron diferencias en la demora de construccin al variar el tamao de la presa. Adems, y segn los pesos secos, los machos con presas pequeas parecieron comer mayor porcentaje de la presa que los machos con presas grandes. Esto podra estar sugiriendo que las presas chicas no son buenos atractivos sexuales y que si bien son tambin empaquetadas en seda, stas son poco valiosas como futuros regalos. No se descarta la posibilidad de que los machos de P. mirabilis no sean capaces de diferenciar entre una presa grande y una chica. Por otro lado, en general hubo un mayor nmero de empaquetados cuando el macho tena la presa grande (una mosca entera), sugiriendo la necesidad del macho de cubrir totalmente la presa con seda. Sin embargo Lang (1996) encontr que los machos de esta misma especie no ajustan la cantidad de seda segn el tamao de la presa. Pero estas diferencias pueden nuevamente ser resultado de la diferente alimentacin de los individuos en ambos trabajos. Cualquiera sea el tamao de la presa o la condicin alimentaria del macho, la presencia de seda de la hembra mostr ser suficiente para que los machos de P. mirabilis inicien la construccin del regalo nupcial, no encontrndose mejores respuestas de los machos con la presencia de la hembra (tratamiento SH). Esto concuerda con lo planteado por Lang (1996) para esta especie y por Albo et al. (2009) para P. ornata. Los datos disponibles sostienen la hiptesis de que el empaquetamiento temprano de la presa es ventajoso para el macho, ya que estara pronto para una cpula inmediata cuando encuentra una hembra. La presencia de la
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hembra pareci no afectar las decisiones de construccin, aunque machos jvenes y en muy buenas condiciones de alimentacin realizaron un mayor nmero de empaquetados cuando estuvieron expuestos a la presencia de la hembra. De esta manera y teniendo en cuenta que la seda sera costosa para los machos, ellos haran una mayor inversin en seda cuando la hembra est presente, asegurando la inversin en la futura cpula. Esto concuerda con observaciones en P. mirabilis y P. ornata, donde machos transportando presas sin envolver usualmente empaquetan la presa cuando encuentran a la hembra (Bilde et al. 2007, Albo & Costa en prensa). Contrario a lo encontrado en P. ornata (Albo et al. 2009), la construccin del regalo nupcial de los machos de P. mirabilis existi tambin en algunos tratamientos control sin seda (tratamiento C). Tambin se observ ocasionalmente el empaquetado de la presa en los machos que estaban ubicados en sus tubos de cra (M.J. Albo, observaciones personales). Debido a que machos y hembras vrgenes fueron criados en laboratorios separados y no tuvieron contacto alguno entre s, se descarta que la existencia de feromonas aerotransportables o que la experiencia previa hayan estimulado la construccin de regalo. En los machos bien alimentados, la demora en la construccin en el tratamiento control (ausencia de rastros de la hembra) fue mayor que en los machos expuestos a la seda (S) y a seda y hembra (SH), lo que sugiere que a pesar de construir regalo an en ausencia de estimulo femenino, los machos consumen parte de la presa y luego envuelven. Esto indicara que la construccin del regalo podra ser espontnea y depender de un biorritmo que se iniciara con la estacin reproductiva y la madurez sexual y que se gatillara por estmulos externos (rastros de seda con semioqumicos) que ajustaran adaptativamente el ritmo a las circunstancias ecolgicas. Finalmente, este trabajo muestra que existen altas presiones de seleccin sexual sobre los machos para la deposicin de seda y empaquetamiento de la presa. Los resultaron mostraron que, an bajo altas condiciones de hambre, algunos machos son capaces de invertir
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en la construccin del regalo y empaquetar la presa en vez de comerla, disminuyendo su propio xito de supervivencia. Los machos jvenes, a pesar de estar bien alimentados, consumieron la presa ms que los machos viejos bien alimentados. Esto concuerda con lo ya observado para esta especie, donde los machos jvenes comienzan a construir regalos (empaquetar presas en seda) al menos 10 das luego de la ltima muda, una vez estn bien alimentados (Nietzche 1988, Drengsgaard & Toft, datos no publicados). Los machos viejos se encontraran bajo fuertes presiones selectivas, ya que estaran al final de la estacin reproductiva, y optimizaran el regalo de forma de aumentar las chances de cpulas ms prolongadas y exitosas. Asimismo, el mayor peso de los regalos del grupo de machos viejos respecto a la muestra de moscas pesada previamente, indicara que los machos viejos no slo no comen la presa, sino que el peso de la seda estara aumentando el peso del regalo, lo que podra ser un factor de evaluacin por parte de la hembra. Son necesarios nuevos estudios que pongan a prueba la existencia y la accin de estos factores afectando la eleccin de la hembra. Agradecimientos Se agradece a Trine Bilde, Jesper Bechsgaard y a Gudrun Winther por su colaboracin en la colecta de araas. Se agradece a Gudrun Winther y a Marie Rosenstand Hansen por su colaboracin en la cra de araas. Un agradecimiento especial a Trine Bilde y Sren Toft por las constructivas discusiones.
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Captulo 3 Estudios citogenticos
CAPITULO 3- ESTUDIOS CITOGENTICOS
3.1-COMPORTAMIENTO CROMOSMICO HETEROCROMATINA EN TRECHALEIDAE
MEITICO
ESTUDIO
DE
LA
Introduccin Las observaciones realizadas por Heitz (1928) resaltaron el hecho de que, en el ncleo interfsico, la cromatina no tiene una apariencia homognea. La naturaleza heterognea de la cromatina fue ms tarde confirmada por observaciones en microscopa ptica, electrnica y difraccin de rayos X. Holmquist & Ashley (2006) en su revisin referida a la heterocromatina diferencian varios tipos de heterocromatina de acuerdo a su plasticidad dentro del ciclo celular, establecindose una heterocromatina constitutiva y , y una heterocromatina facultativa. La HC incluye la heterocromatina carente de genes, con funciones en la segregacin cromosmica (regiones centromrica, telomrica). Se caracteriza por ser de replicacin tarda, bandeo C positivo, sus citocinas altamente metiladas. La HC y la facultativa corresponden a
heterocromatinas difusas, que bandean entre la HC y la eucromatina (bandeo R), y presentan genes tejido-especficos que requieren del estadio heterocromtico para controlar su actividad, propiedad que justifica su existencia. La relacin entre el tamao y el nmero de bloques de heterocromatina y eucromatina durante la profase I de la meiosis sugiere la existencia de una coalescencia de estas regiones. En vertebrados, se ha observado que en las bandas R (eucromatina) residen genes que requieren expresarse continuamente, conocidos como house keeping, necesarios para diferentes mecanismos del funcionamiento celular. Mientras que en las bandas G
(heterocromatina) se encuentran muchos de los genes tejido-especficos que se expresan de forma intermitente, regulando comportamientos u otras actividades similares, siendo estos ltimos regulados por una heterocromatina plstica de tipo facultativa. Mecanismos
epigenticos como la metilacin del ADN, la remodelacin de la cromatina, la replicacin tarda
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asociada a represin, entre otros, son conocidos en vertebrados e invertebrados (Holmquist & Ashley 2006). Se ha observado que estos poseen importantes roles en la regulacin y expresin de genes, como por ejemplo el fenmeno de impronta genmica, genomic imprinting, donde alelos homlogos se expresan en forma monoallica, dependiendo del sexo parental que ha heredado (Crouse 1960, Moore & Haig 1991). Los cambios epigenticos son entonces, cambios reversibles de ADN que hace que unos genes se expresen o no dependiendo de condiciones ambientales y del propio inters de la lnea parental de los que provienen. Estos fenmenos se observan especialmente en aquellos genes que intervienen en caractersticas comportamentales, reproductivas, asociadas al crecimiento, a la
diferenciacin celular, siendo de baja heredabilidad, es decir con alta influencia ambiental (Vrana 2007). El objetivo principal de la meiosis es segregar un juego haploide completo de cromosomas. La recombinacin entre homlogos, que requiere complejas interacciones entre stos y la posterior reorganizacin de alelos, resulta en la generacin de diversidad. Se ha observado en organismos como plantas, saltamontes y mamferos que los entrecruzamientos, visualizados en los cromosomas como quiasmas, estn presentes slo en determinados tipos de heterocromatina (Jones et al., 1987). El mecanismo para esta exclusin es desconocido pero se hipotetiza que es resultado del alto grado de compactacin de la misma (Taruscio & Manuelidis, 1991). Esta hiptesis se soporta ya que en mamferos las bandas R, regiones de eucromatina ricas en genes house keeping, son claramente preferidas como sitios de recombinacin meitica (Holmquist, 1992; Eisenbarth et al., 2000; Eisenbarth et al., 2001). La amplia diversidad del Orden Araneae no slo se refleja en las 40.998 especies descritas hasta el momento (Platnick 2009) sino tambin en el nmero diploide cromosmico que tiene un rango entre 7 y 94 cromosomas (Suzuki 1954). En contraste con esta alta variacin, en general se han descrito cromosomas acrocntricos (Rowell 1990) y un sistema
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cromosmico de determinacin sexual (SDCS) X1X20 en machos y X1X1X2X2 en hembras (Wallace 1909, Patau 1948, Araujo et al. 2005); aunque existen reportes de sistemas con mltiples cromosomas sexuales, siendo X1X2 ancestral para el Orden (Madisson 1982, Rowell 1985, Krl et al. 2006). Segn Brum-Zorrilla & Postiglioni (1980) la estabilidad en el SDCS puede estar mediada por una escasa proporcin de heterocromatina respecto a la eucromatina, que prevendra la recombinacin cromosmica y en consecuencia mantendra cierta estabilidad a travs de la evolucin. Actualmente existen alrededor de 600 especies de araas cuyos cariotipos han sido identificados (ver Krl et al. 2006). Dentro de la familia Trechaleidae la informacin citogentica es escasa, y el nico reporte sugiere que existe alta variacin a nivel de los cromosomas sexuales. Esto ha sido justificado por una serie de hiptesis como la posibilidad de que las especies estudiadas representen un complejo de especies cada una con un SDCS diferente, la existencia de cromosomas B, o un polimorfismo intrapoblacional (Giroti et al. 2007). En particular, los cromosomas B se diferencian de los clsicos autosomas (A) por ser inestables durante el ciclo celular, poseer heteropicnosis positiva y carecer de recombinacin, considerndose un reservorio de transposones que intervienen en el silenciamiento o expresin gnica (Lacadena 1996, Camacho 2004). Por lo tanto, sabiendo que existen diferencias entre las especies uruguayas
pertenecientes a Trechaleidae en los datos comportamentales fundamentalmente referidos al cortejo y uso del regalo nupcial, y que adems podra existir una relacin de esta caracterstica fenotpica con la diferenciacin entre especies y la impronta gentica (sealada en el captulo 1), fue de inters realizar estudios citogenticos de forma de enriquecer y robustecer la informacin etolgica. El objetivo de este trabajo fue estudiar la meiosis de machos de Paratrechalea ornata, Trechalea bucculenta y Trechaleoides biocellata de forma de conocer el sistema cromosmico de determinacin sexual (SCDS), el comportamiento y dinmica de la cromatina durante la meiosis espermatogonial, y analizar si existen diferencias en la distribucin de la (eucromatina y heterocromatina) entre las tres especies. cromatina
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Captulo 3 Estudios citogenticos Mtodos Una vez adultos los machos fueron sacrificados, y se procedi a extraer sus gnadas. Catorce gnadas de Paratrechaea ornata, seis de Trechaleoides biocellata y tres de Trechalea bucculenta fueron disecadas en solucin fisiolgica para insectos, aplicndose la tcnica estndar de extendidos celulares segn protocolo de Arajo et al. (2005) y como se describe a continuacin. Una vez extrados los testculos se los coloc en colchicina (0,16% en solucin fisiolgica para insectos), durante 2 horas, a los efectos de encontrar metafases goniales. Pasado este perodo se realiz una hipotona agregando el mismo volumen de agua destilada, durante 15 minutos. Este paso permite la ruptura de la membrana nuclear y la separacin de los cromosomas en metafases goniales mitticas y bivalentes durante la profase I meitica. Este proceso se cort sustituyendo la solucin hipotnica por solucin de fijador Carnoy 3:1 (metanol: cido actico) durante al menos 3 das a 4C. Luego se procedi a la realizacin de las preparaciones, colocando la suspensin sobre un portaobjetos rotulado con lpiz y con una gota de cido actico al 60%, realizndose la dispersin de las gnadas, macerando, hasta formar una suspensin de clulas que se sec y fij sometiendo la preparacin a una platina caliente (3540C).
Identificacin del nmero cromosmico y comportamiento meitico Para la identificacin del nmero de autosomas, del sistema cromosmico de determinacin sexual (SCDS) y el estudio del comportamiento cromosmico durante la meiosis de todas las especies se tieron las preparaciones con Giemsa 3% (47ml agua destilada, 1,5 ml de Giemsa y 1,5 ml de buffer fosfato, pH 6,8), durante 10-15 minutos.
Bandeo G Para esta tcnica se sigui el protocolo de Verma & Babu (1995) con modificaciones. Los cromosomas fueron sometidos a digestin con la enzima tripsina (250mg/100ml de PBS) de manera controlada. A 10ml de la solucin stock de tripsina se le agreg buffer (pH 7,2) preparado de la siguiente manera: 6ml de Na2HPO4 + 3ml de KH2PO4 y se complet con PBS
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hasta 100ml (controlar pH 7,2 con NaOH 1N). Las preparaciones fueron sumergidas en sta solucin a 26C (bao mara Memmert). Los tiempos de accin de la tripsina sobre la cromatina de las tres especies se estableci entre 60 y 20 seg; ajustndose para P. ornata entre 43 y 45 seg., T. biocellata en 20 seg. y T. bucculenta en 30 seg. Luego del tratamiento se colocaron los preparados durante 1 min. en una solucin fra de PBS diluida 1:1 en agua destilada (pH a 6.9), de forma de detener el efecto de la enzima. Finalmente, se lavaron los preparados con agua destilada y se tieron con Giemsa al 3%. Los estadios meiticos se observaron, identificaron y fotografiaron bajo microscopio Olympus BX60 (100X), con software para captura de imgenes Image Pro -Express 6.0, perteneciente al Laboratorio de Gentica de la Facultad de Veterinaria.
Resultados Identificacin del nmero cromosmico En Paratrechalea ornata (Fig. 1A) se encontr un nmero haploide n = 11 + X1X2 0 (Fig. 2D); que en Trechalea bucculenta (Fig. 1B) fue n = 13 + X1X20 (Fig. 2I); mientras en Trechaleoides biocellata (Fig. 1C) fue de n = 13 + X1X2 0 (Fig. 2N).
Figura 1. Machos de A) Paratrechalea ornata, B) Trechalea bucculenta y C) Trechaloides biocellata.
En las tres especies se observ un bandeo natural (tincin slo con Giemsa) de la cromatina a lo largo de los brazos autosmicos, principalmente en el estadio de paquinema. Los cromosomas sexuales se diferenciaron de los cromosomas autosmicos por presentar una
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heteropicnosis positiva (Fig. 2). Todos los paquinemas en P. ornata (N = 18) aparecieron con una serie de crommeros, distinguindose regiones telomricas muy teidas con la coloracin de Giemsa. A su vez, se captur un total de 10 diplonemas, 8 diacinesis y 3 anafases I para esta especie (Fig. 2. A-E). En T. bucculenta se identificaron 46 paquinemas, destacndose un bandeamiento a nivel de brazos, bajo tincin con Giemsa en 20 de ellos. Se capturaron 7 diplonemas, 9 diacinesis, una anafase y dos metafases espermatogoniales (Fig. 2. F-J). En T. biocellata de 84 paquinemas 50 fueron observados con bandeamiento a nivel de brazos. Se capturaron 10 cigonemas, 6 diplonemas, 6 diacinesis, 6 metafases goniales y dos metafases espermatogoniales (Fig. 2. K-O).
Figura 2. Tincin con Giemsa de estadios meiticos en Trechaleidae. P. ornata (A-E): A) Profase I, B) Paquinema, C) Diplonema, D) Diacinesis, E) Anafase I. T. bucculenta (F-J): F) Metafase espermatogonial, G) Paquinema, H-I) Diacinesis, J) Anafase II. T. biocellata (K-O): K) Metafase espermatogonial, L) Paquinema, M) Diplonema, N) Diacinesis, O) Anafase I.
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Se encontr un sistema cromosmico de determinacin sexual X1X20 en los machos de las tres especies. Durante la meiosis I, tanto en P. ornata como en T. bucculenta los cromosomas sexuales X1X20 de tamao diferencial, se alinearon en paralelo hasta su segregacin en anafase. En T. biocellata se observ un comportamiento diferencial entre ambos cromosomas. Cada cromosoma ocup un lugar especfico en la periferia nuclear, distantes entre s y en ocasiones disponindose en forma perpendicular (Fig. 3.F). En diacinesis aparecieron alineados en paralelo (Fig. 3.G). Estas observaciones se realizaron sobre estadios de cigonemas (n = 10) (Fig. 3.A-B), paquinemas (n = 65) (Fig. 3.C-F) y diacinesis (n = 5) (Fig. 3.G).
Figura 3. Comportamiento de los cromosomas sexuales en Profase I de Trechaleoides biocellata. A, B) Cigonema; C, D, E, F) Paquinema; G) Diacinesis.
Bandeo G Este bandeo fue efectivo en la profase I de las tres especies. El tratamiento con tripsina evidenci bandas en las regiones intersticiales de los brazos de cromosomas autosmicos, y en regiones telomricas y centromricas. Los cromosomas sexuales mantuvieron su heteropicnosis positiva (Fig. 4). El bandeo G en P. ornata se ajust entre 43 y 45 seg. Se observ una ntida marcacin a nivel de las regiones terminales (telmeros) y una secuencia de crommeros a lo largo de algunos de los brazos de los bivalentes autosmicos en los estadios de cigonema y paquinema (Fig. 4.A-C). En diplonema se observ una marcada tincin de la banda G a nivel de los centrmeros y telmeros autosmicos en forma diferencial (Fig. 4.D). En anafase II se insina una marcacin a nivel centromrico de algunos autosomas (Fig. 4.E).
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En T. bucculenta este bandeo se ajust en 30 seg. Se observ un bandeo cromomrico a lo largo de los brazos autosmicos (Fig. 4.F-H-I), insinundose marcacin a nivel de algunos telmeros (Fig. 4.G). En anafase II se observ un bandeo diferencial a nivel de brazos autosmicos presentndose los cromosomas sexuales con bandeo positivo en la regin terminal (Fig. 4.J). El bandeo G en T. biocellata se optimiz en 20 seg., se observaron netos bloques densos de bandas G positivas a nivel de los bivalentes autosmicos y de los cromosomas X 1X20, as como marcacin a nivel de telmero en algunos bivalentes (Fig. 4.K-L-M). Mientras que en metafase y anafase I no se observ bandeo G positivo (Fig. 4.N-O).
Figura 4. Bandeo G de estadios meiticos en P. ornata (A-E): A) Cigonema, B-C) Paquinema, D) Diplonema, E) Anafase II. T. bucculenta (F-J): F-G-H-I) Paquinema, J) Anafase II. T. biocellata (K-O): K-L-M) Paquinema, N) Metafase I, O) Anafase I.
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Captulo 3 Estudios citogenticos Discusion Este trabajo caracteriza citogenticamente por primera vez las especies P. ornata con 2n = 22 + X1X20, T. bucculenta con 2n = 26 + X1X20 y T. biocellata 2n = 26 + X1X20, siendo este nmero diploide similar entre las tres especies. Estos resultados concuerdan con el reporte realizado por Giroti et al. (2007) donde expone un nmero diploide entre 2n = 28, 29 y 30 para especmenes de la misma familia (gnero Trechalea). Esto era esperado ya que a pesar de que el nmero cromosmico es altamente variable a lo largo del Orden Araneae (Susuki 1954), trabajos en la familia Sparassidae, Salticidae y Lycosidae (citados por Benavente & Wettstein 1977, por Madisson 1982 y por Rodriguez-Gil et al. 2007) muestran que existira un nmero cromosmico constante entre especies de la misma familia. De esta manera, an cuando los individuos de las tres especies son morfolgicamente muy diferentes, los cariotipos se conservan, por lo que los datos citogenticos han sido sugeridos como caracteres tiles para estudios sistemticos (Rodriguez-Gil et al. 2007, Krl et al. 2006). Asimismo, se identific un sistema cromosmico de determinacin sexual (SDCS) de X1X20 para los machos de las tres especies. No encontrndose, en ninguno de los gneros, evidencia que apoye la inestabilidad en el nmero de cromosomas sexuales encontrada por Giroti et al. (2007) y fundamentada por la presencia de un cromosoma B. Por otro lado, se ha sugerido que este sistema X1X20 es ancestral en el Orden Araneae (Brum-Zorrilla & Postiglioni 1980), siendo caracterstico de Mesotholeae la familia ms primitiva de araas (Susuki 1954). Estudios citogenticos en la familia Lycosidae han demostrado que machos de varias especies tambin poseen X1X20, aunque pueden encontrarse algunas especies con sistemas de cromosomas sexuales mltiples (X1X2X3) (Mittal 1963, Postiglioni & Brum-Zorrilla 1981). Segn los ltimos autores la aparicin del tercer cromosoma sexual se debi posiblemente a una falla en la disyuncin o separacin de X 1X20. El comportamiento de los cromosomas sexuales durante la meiosis de las especies P. ornata y T. bucculenta fue similar, observndose que estos se desplazaron unidos en forma paralela hasta su segregacin en anafase. Sin embargo esto no sucedi en T. biocellata, donde los cromosomas sexuales aparecieron distanciados durante la mayor parte de la meiosis, en ocasiones cercanos en forma perpendicular. Slo durante la
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diacinesis se observaron juntos y en paralelo. Estos datos resultan interesantes desde el punto de vista evolutivo, ya que podramos estar frente a una diferenciacin del SDCS en esta especie. Estudios en Lycosidae mostraron que los cromosomas sexuales de algunas especies se encuentran asociados por una placa proteica Junction lamina durante la mayor parte de la meiosis, que asegura su correcta segregacin (Benavente & Wettstein 1977). Sin embargo en otras familias se han detectado otro tipo de estructuras de unin, como proyecciones de la cromatina o por unin directa (Benavente et al. 1982, Benavente & Wettstein 1980, Krl 2007). Los resultados observados en T. biocellata indicaran que estas estructuras, si existen, slo se forman en diacinesis, en donde X1 y X2 estaran asociados en forma paralela. Dado que Lycosidae posee una forma ancestral de SDCS la independencia de X1 y X2 en T. biocellata sugiere que existen modificaciones probablemente innovadoras en esta especie. Bajo esta hiptesis estaramos frente a un paso en la evolucin donde X 1 y X2 podran estar evolucionando hacia una mayor independencia, lo que podra dar lugar a nuevos reordenamientos cromosmicos, como autoduplicaciones, autodivisiones, fusin, fisin, entre otros. Los
reordenamientos cromosmicos han sido sugeridos como promotores en la variabilidad del SDCS, como es el caso del origen del sistema X0 cuya formacin, se sugiere fue o bien por fusin de los X o bien por degradacin de uno de stos (Pekar & Kral 2001, Suzuki 1954). Nuevos estudios en otras especies de la misma familia son necesarios para validar esta hiptesis. Por otro lado, a pesar de que el bandeo G ha sido poco eficiente en invertebrados incluyendo araas (Rodriguez-Gil et al. 2007), existen algunos ejemplos, como el que se incluye en este trabajo, donde esta tcnica ha sido consistente. En este trabajo el bandeo G evidenci diferencias en la distribucin de la heterocromatina entre las tres especies. Mientras en P. ornata se evidenciaron bandas notorias a nivel de los telmeros, stas fueron menos acentuadas y en aparente menor cantidad de bivalentes en T. biocellata, estando casi ausentes en T. bucculenta. Los telmeros son secuencias repetidas de ADN que se encuentran en la zona
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terminal de los cromosomas. Es ADN no codificante y su funcin es bsicamente de proteccin, por lo que son responsables de la estabilidad e integridad cromosmica (Lacadena 1996). Es conocida la presencia de heterocromatina constitutiva (tipo ) a nivel telomrico (Jeppesen & Bower 1987), donde se ha sugerido que se alojan genes tejido-especficos, que en humanos representan un 3% de los genes totales (Saccone et al. 1992). stos ltimos autores sugieren que stas regiones ricas en GC (de la familia H3), podran ser zonas transcripcionalmente ms activas. Dado que el bandeo G utilizado en este trabajo result positivo en la regiones telomricas con pequeos matices diferenciales entre las tres especies, podramos asimilar este tipo de heterocromatina a una heterocromatina dinmica similar a la facultativa. Estos resultados indicaran posibles diferencias en la actividad gentica de P. ornata respecto a las otras dos especies. En P. ornata en estadios de diacinesis, la banda G marc con nitidez tambin a nivel centromrico. Esta informacin puntual requiere de resultados producto de bandeo C de forma de definir la posible presencia de bases GC en dichas regiones. Asimismo, se encontraron diferencias de bandeo a nivel intersticial (brazos cromosmicos) observndose una distribucin de crommeros o bloques -tincin positiva- relativamente homognea a lo largo de los brazos en P. ornata y T. bucculenta, mientras que se observaron bloques de tincin mucho ms marcados y puntuales en T. biocellata. El tipo de distribucin de la heterocromatina a lo largo de los brazos acerca entre s a P. ornata con T. bucculenta y los diferencia de T. biocellata. El bandeo G indica la presencia de una heterocromatina dinmica, y por ende, la probable presencia de genes tejido-especficos que se expresan slo bajo ciertas situaciones, regulando comportamientos u otras actividades similares. Si bien estos datos son slo una base preliminar de informacin, impulsan una discusin acerca de las modificaciones que esta ltima especie estara sufriendo, debido a la influencia que tienen los cambios ambientales sobre la plasticidad del genoma. Estas proyecciones promueven nuevos estudios que permitan diferenciar regiones ricas en GC y probables metilaciones, como mecanismos de regulacin y expresin de genes asociados a aspectos del comportamiento, tales como el cortejo, el ofrecimiento del regalo nupcial del macho a la hembra y la aceptacin de sta.
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Captulo 3 Estudios citogenticos Agradecimientos Se agradece a Nicolas Grasso y a Wanda Iriarte por su ayuda en la puesta a punto y realizacin de las tcnicas y en el manejo del software de imgenes, realizados en el Departamento de Gentica de la Facultad de Veterinaria, UdelaR.
Literatura Arajo, D., D. M. Cella & A. D. Brescovit. 2005. Cytogenetic analysis of Nephilengys cruentata (Araneae, Araneomorphae, Tetragnathidae): standard staining, NORs, C-bands and base-specific fluorochromes. Brazilian Journal of Biology 65, 193-202. Benavente, R. & Wettstein, R. 1977. An ultraestructural cytogenetic study on the evolution of sex chromosomes during spermatogenesis of Lycosa malitiosa (Arachnida). Chromosoma 64, 255-277. Benavente, R. & Wettstein, R. 1980. Ultraestructural characterization of the sex chromosomes during spermatogenesis of spiders having holocentric chromosomes and a long diffuse stage. Chromosoma 77, 69-81. Benavente, R., Wettstein, R. & Papa, M. 1982. Ultraestructural analysis of the X 1X2X30 sex chromosomes during spermatogenesis of Tegenaria domestica (Arachnida). Journal of Cellular Science 58, 411-422. Brum-Zorrilla, N. & Postiglioni, A. 1980. Karyological studies on Uruguayan spiders. I. Banding pattern in chromosomes of Lycosa species (Araneae, Lycosidae). Gentica 54, 149-153. Camacho, J.P.M. 2004. Prefase. Cytogenetics Genome Research 106, 147-148. Crouse, H.V. 1960. The controlling element insect chromosome behavior in Sciara. Genetics 45, 1429-1443. Eisenbarth, I., Striebel, A.M., Moschgath, E., Vogel, W. & Assum, G. 2001. Long-range sequence composition mirrors linkage disequilibrium pattern in a 1.13 Mb region of human chromosome 22. Human Molecular Genetics 10, 2833-2839.
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Captulo 4 Discusin General y Conclusiones CAPTULO 4- DISCUSIN GENERAL Y CONCLUSIONES Este trabajo muestra que la construccin del regalo nupcial tanto en P. ornata como en P. mirabilis es un comportamiento adaptativo, que permite a los machos comer o empaquetar en seda la presa en respuesta a las distintas oportunidades de cpula. De esta forma los machos estn listos para cortejar exitosamente y copular al encontrar a la hembra, y pueden evitar demoras en la captura de una presa para empaquetar, minimizando los riesgos de depredacin y la desercin de la hembra, y optimizando sus posibilidades en la competencia con otros machos por una hembra receptiva. Los rastros de hembras adultas co-especficas son uno de los principales factores desencadenantes de este comportamiento (captulo 2.2) sugiriendo que, como se ha observado en otras especies de araas, existen feromonas sexuales de contacto en la seda de la hembra (Schulz 2004, Huber 2005, Gaskett 2007). Adems, y dado que al igual que en P. mirabilis (Stlhandske 2001, Bilde et al. 2007) la presencia de regalos nupciales en P. ornata mejora el xito de cpula del macho e incrementa la duracin de la cpula (hiptesis de esfuerzo de apareamiento), la construccin temprana no slo asegura el xito en obtencin de pareja sino que asegura mejor calidad de la cpula (captulo 2.3). Ms an, la envoltura en seda de la presa implica costos energticos importantes para los machos de P. mirabilis (captulo 2.4) por lo que la cantidad de seda podra ser un factor relevante para la eleccin femenina, apoyando la hiptesis de esfuerzo de apareamiento del macho. Segn la hiptesis de Zahavi (1975) slo los machos de buena calidad sern capaces de mantener seales honestas superando su costo o handicap, y las hembras elegirn a esos machos cuyos buenos genes se transmitirn a sus hijos. El efecto de las cpulas prolongadas (promovidas por la presencia de regalo) sobre la primera oviposicin de la hembra, representara un beneficio para los machos porque podran minimizar as la competencia espermtica y para las hembras porque rpidamente pueden obtener descendencia antes de envejecer, as como tambin maximizar el nmero de ootecas durante la estacin reproductiva. Sin embargo, esta aceleracin en la oviposicin tambin puede verse bajo una visin de conflicto de intereses (conflicto sexual) que afectara negativamente los intereses de la hembra,
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Captulo 4 Discusin General y Conclusiones
al verse restringida en cuanto a cpulas con otros machos. En este sentido tambin podra evidenciarse a nivel gentico, siendo que se ha planteado el fenmeno de impronta genmica enmarcado en la teora de conflicto sexual en donde la existencia de genes improntados evolucionaran en la medida que existan diferencias de inversin entre sexos, como en el cuidado o alimentacin de la descendencia (Arnqvist & Rowe 2005, Hunter 2007). De existir conflicto entre macho y hembra, se podra encontrar un correlato gentico donde un gen del macho podra estar silenciando la expresin en la hembra. No obstante, el fenmeno de aceleracin en la oviposicin puede ser explicado en un escenario de eleccin crptica femenina, donde el esperma del macho con cortejo copulatorio ms conspicuo y/o costoso podra ser el elegido por la hembra (Eberhard 1996). La ausencia de regalo no incrementa la frecuencia de canibalismo sexual, por lo que se descarta que el regalo nupcial cumpla funciones para evitar que el macho sea devorado por la hembra (captulo 2.3). No se pudo llegar a mayores conclusiones respecto a la hiptesis de inversin paternal, pero est claro que las hiptesis de inversin paternal, evtiacin del canibalismo y esfuerzo de apareamiento del macho, no se excluyen entre s. Por lo que, bien pudo haber sido el origen del ofrecimiento del regalo con un fin alimenticio para la hembra o para los machos evitar ser canibalizados. La existencia de regalo nupcial tambin se demuestra en la especie Trechalea bucculenta perteneciente a la familia Trechaleidae y destaca la ausencia de regalo nupcial en el cortejo de otro Trechalidae, Trechaleoides biocellata (captulo 2.1). Las similitudes comportamentales del cortejo, observadas en las tres especies, podran sugerir que el regalo nupcial es un carcter ancestral para la familia Trechaleidae (sugerido por Costa-Schmidt et al. 2008) y una prdida secundaria en T. biocellata. Bajo esta hiptesis, tanto los ataques de la hembra como la hiperflexin del macho seran comportamientos ritualizados que habran evolucionado de forma de incrementar la claridad de la seal de bsqueda y ofrecimiento del regalo, y se mantendran en T. biocellata a pesar de la prdida del regalo. Sumado a esto, el comportamiento individual de los dos cromosomas X (X1X2) durante la profase I meitica, as como las diferencias en la
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distribucin de la heterocromatina en sta ltima especie sugieren que, evolutivamente, podra estar en un proceso de transformacin (capitulo 3.1). Los resultados abren las puertas para la discusin acerca de las presiones selectivas bajo las que T. biocellata se encuentra, relacionadas a la influencia de los cambios ambientales sobre la expresin gnica (Vrana 2007). Futuras aproximaciones moleculares en relacin a los genes tejido-especficos presentes en la heterocromatina, as como su vinculacin con aspectos comportamentales sern necesarias para evidenciar las hiptesis planteadas en este trabajo. Finalmente, del estudio comparativo con la especie Pisaura mirabilis (Pisauridae) se desprenden nuevas similitudes comportamentales entre las familias Pisauridae y Trechaleidae, que podran afectar las relaciones filogenticas aceptadas actualmente, generando dudas en las clasificaciones basadas en datos morfolgicos y algunos comportamentales. Concretamente, sugieren que Trechaleidae sera familia hermana de Pisauridae, no de Lycosidae. Por ende, nuevos estudios multidisciplinarios que incluyan datos comportamentales, morfolgicos, citogenticos y moleculares permitirn mejorar estas estimaciones de parentesco. Literatura Arnqvist, G. & Rowe, L. 2005. Sexual conflict. Princeton, NJ: Princeton University Press. Bilde, T., Tuni, C., Elsayed, R., Pekar, S. & Toft S. 2007. Nuptial gifts of male spiders: sensory exploitation of females maternal care instinct or foraging motivation?. Animal Behaviour 73, 267-273. Costa-Schmidt, L.E., Carico, J.E. & Arajo, A.M. 2008. Nuptial gifts and sexual behaviour in two species of spider (Araneae, Trechaleidae, Paratrechalea). Naturwissenschaften 95, 731739. Eberhard, W.G. 1996. Female control: sexual selection by cryptic female choice. Princeton University Press, Princeton.
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Gaskett, A.C. 2007. Spider sex pheromones: emission, reception, structures, and functions. Biology Reviwes 82, 27-48. Huber, B.A. 2005. Sexual selection research on spiders: progress and biases. Biological Review 80, 363-385. Hunter, P. 2007. The silence of genes. Is genomic imprinting the software of evolution or just a battleground for gender conflict? European Molecular Biology Organization Rep 8, 441 443. Schulz, S. 2004. Semiochemestry of spiders. In: Advances in insect chemical ecology: 110-150 Card, R.T. & Millar, J.G. (Eds.). Cambridge University Press: Cambridge. Stlhandske, P. 2001. Nuptial gift in the spider Pisaura mirabilis mantained by sexual selection. Behavioral Ecology 6, 691-697. Vrana, P.B. 2007. Genomic imprinting as a mechanism of reproductive isolation in mammals. Journal of Mammology 88, 5-23. Zahavi, A. 1975. Mate selection- a selection for a handicap. Journal of Theoretical Biology 53, 205214.
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Eplogo Actualmente nos encontramos en un momento del crecimiento de la ciencia donde se vislumbra un divorcio entre los datos fenotpicos y genticos (citogenticos, moleculares). Aquellos datos que se encuentran relacionados con aspectos comportamentales y de desarrollo, tienen un importante componente ambiental en su expresin fenotpica. Los genes que gobiernan estas caractersticas son genes tejido-especficos ubicados en una heterocromatina plstica que puede identificarse por el bandeo G cromosmico. El hecho de tener datos fenotpicos (comportamentales) individuales nos permite asociarlos o relacionarnos con registros citogenticos (comportamiento de la cromatina durante la espermatognesis), fundando las bases para estudios cito-moleculares, moleculares. De esta manera, podremos lograr un entendimiento ms profundo de las acciones gnicas sobre caractersticas que tienen amplia influencia ambiental, como lo son las caractersticas comportamentales y de desarrollo. M.J. Albo, F.G. Costa y A. Postiglioni
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Dedicado a mi madre.
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Captulo 5 Agradecimientos CAPTULO 5 - AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer muy especialmente a mis tutores Fernando Costa y Alicia Postiglioni por haberme acompaado y estimulado; guiandome pacientemente en este proyecto,
transmitiendome en cada paso los conocimientos necesarios para lograr buenos resultados. A ambos por su invalorable enseanza de los temas abordados, y ms que importante les agradezco el apoyo moral y cario que me brindaron durante estos aos. Sin ellos este trabajo no hubiera sido posible. A Fernando no solo le debo los conocimientos que como buen maestro supo transmitir fervientemente sino que tambin el agradecimiento de haberme brindado un lugar en su laboratorio del cual me siento halagada de formar parte, gracias! A Alicia no podra explicarle concretamente lo importante que ha sido la experiencia de la citogentica en mi vida, no solo por todo lo que aprend sino por la experiencia de abrir ideas hacia otros campos y e innovar en trabajos multidisciplinarios que sin duda son necesarios para entender los procesos biolgicos hoy por hoy. Tampoco hubiera sido posible este trabajo sin la colaboracin de todos los compaeros del laboratorio y otros colegas que me apoyaron en las salidas de campo y las discusiones en el tema. Fabiana Perez-Montaez, Mariana Trillo, Andre Klein, Macarena Gonzalez, Carlos Toscano-Gadea, Estefania Stanley, Laura Montes de Oca, Natalia Estramil, Anita Aisenberg, Soledad Ghione, Luciana Baruffaldi, Mariangeles Lacava, Andrea Albn, Valentina Lorieto, Rodrigo Postiglioni, Lorena Coelho, Nicolas Grasso, Wanda Iriarte, Fernando Perez-Miles, Carmen Viera, Miguel Sim, Alfredo Peretti, Gilbert Barrantes y William Eberhard. Agradezco muy especialmente a Luiz Ernesto Costa-Schmidt de la Universidad de Ro Grande do Sul, Brasil, por brindarme sus conocimientos en el tema, por las interesantes discusiones y por motivarme desde una visin crtica y entusiasta.
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Captulo 5 Agradecimientos
Un agradecimiento enorme a Trine Bilde por si invitacin y clida recepcin para realizar trabajos en la especie P. mirabilis en el Departament of Biological Sciencies, Genetics and Ecology, en la Universidad de Aarhus, Dinamarca. A Trine Bilde, Sren Toft, Jesper Bechsgaard, Gudrun Winther, Cristina Tuni, Marie Rosenstand Hansen, Anni Kjeldsen, Jan Mouritzen, Henning Petersen, Fabia Febraro, Julieta Genini, Julisa Roncal, Luca De la Torre, Anette stergaard, Anne Kellemann, Isabel Casas, Phonsie, Inta Mellin, Paola Spinella, Cristian Ailln y Sren Frlund, por su hospitalidad y amistad durante mi estada en Aarhus. Un agradecimiento especial a Trine Bilde y Sren Toft por las interesantes y constructivas discusiones en el tema. Agradezco a Maria Jose Ferreiro, Santiango Ruiz y Rafael Cantera del Departamento de Biologa del Neurodessarrollo del IIBCE que amablemente me brindaron medio para la cra de moscas de la fruta (Drosophila malenogaster y Drosophila funebris). Muchas gracias a Fernando Perez-Miles, Gabriel Franccescoli y Susana Gonzalez por haber aceptado integrar el tribunal, por haber ledo pacientemente el trabajo, por sus sugerencias y comentarios que indudablemente mejoraron la versin final de la tesis. Muchas gracias a PEDECIBA por su confianza y apoyo econmico que me premiti participar de un congreso, una pasanta y un curso de posgrado. Los tres eventos me llevaron a profundizar en mis estudios, as como a vincularme con cientficos del exterior iniciando trabajos en colaboracin. A Graciela Boccage e Isolina Plata por la buena gestin y enlace que tuve con el programa. Agradezco al Consejo Directivo del IIBCE Jos. R. Sotelo, Pablo Zunino y Federico Dajas, as como a los compaeros de la administracin del IIBCE Mara del Carmen Ruzic, Carlos Sarlabs, Carolina Saldas, Susana Rodriguez y Adriana Maruri, por su buena disposicin y compaerismo durante mi desempeo como Asistente Acadmica del instituto.
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Captulo 5 Agradecimientos
Finalmente, agradezco a mi familia que me ha apoyado contantemente en todos los vaivenes de estos aos. A mi madre Gloria Graa omnipresente en todo momento, en todo lugar que fuera necesario! A mi padre Jos Albo por sus charlas amenas, a mis tas Ana y Tati Gerhard, Irma y Mary Graa, por su cario muchas veces simplemente desde la distancia. A Norma Chiaramelo por ser segunda mama siempre. A Laura y Toni Albo, a Gonzalo Moccia por ser los hermanos y el primo que siempre estn. A mis amigos, Cecilia Gascue, Valerie Caysials, Silvia Guirin, Nora Garca, Gaston Azziz, Fabiana Condon (y sus retoos que estn creciendo hermosamente Antonio, Octavio, Sinhue, Maria, Ana Luca y Carmela!), Maite de los Santos, Federico Rosconi, Ana Gabriela Sanchez, Ana Victoria Garca, Blanca Gomez, Paola Florio, Claudia Ros, Claudia Morassi, Ignacio Mateo, Sebastian Gavilanes, Sebastian Mombru, Nuria Macas y Leticia Bidegaray.
GRACIAS A TODOS!
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Captulo 6 Apndice I CAPTULO 6 APENDCE I
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Journal of Zoology
Journal of Zoology. Print ISSN 0952-8369
To feed or to wrap? Female silk cues elicit male nuptial gift construction in a semiaquatic trechaleid spider
M. J. Albo1, L. E. Costa-Schmidt2,3 & F. G. Costa1
Instituto de Investigaciones Biologicas 1 Laboratorio de Etolog a, Ecolog a y Evolucion, Clemente Estable, Montevideo, Uruguay cleo de Aracnolog 2 Nu a, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil 3 Biolaw Consultoria Ambiental Ltda., Porto Alegre, Brazil
Keywords Paratrechalea ornata; semiaquatic spider; nuptial gift; female silk cues; courtship behaviour. Correspondence Mar a J. Albo, Laboratorio de Etolog a, Instituto de Ecolog a y Evolucion, Investigaciones Biologicas Clemente Estable, Av. Italia 3318, 11600 Montevideo, Uruguay. Email: mjalbo@iibce.edu.uy Editor: Nigel Bennett Received 8 July 2008; revised 31 October 2008; accepted 6 November 2008 doi:10.1111/j.1469-7998.2008.00539.x
Abstract
By wrapping prey and offering it as a nuptial gift, males can obtain mating and/or parental benets despite some costs. Males of the Neotropical semiaquatic spider Paratrechalea ornata (Trechaleidae) offer females a nuptial gift consisting of a prey item wrapped in silk. What stimulus inhibits males from feeding and elicits gift construction? We hypothesized that signals associated with female silk threads could affect decision-making by males. We investigated three groups of males carrying a captured prey under different experimental treatments. In the treatment S, males were exposed to an arena with female silk; in SF, males were exposed to both silk and a female conned in a cell, and in the control group, males were exposed to a clean arena. Gift construction was observed only in the S and SF groups, with a similar occurrence rate. After touching females (SF group), males did not change their pattern of gift construction. Gift construction occurrence increased with male and female age. The results lead us to assume that the existence of chemical cues associated with female silk elicits male searching behaviour and gift construction, allowing males to decide between eating or wrapping prey according to the possibility of a sexual encounter. Anticipating gift construction, males are ready to mate, diminishing the risks of predation, female desertion or malemale scramble competition. The effect of age on behavioural variation and the rate of construction is discussed. nuptial gifts to prevent female attacks (who are considered sexually cannibalistic; Elgar, 1992; Andrade, 1996, 2003), the occurrence of prey being offered as an elaborated nuptial gift has rarely been recorded. In fact, the only known records of such kinds of nuptial gift are for a Palearctic spider, the pisaurid Pisaura mirabilis (Bristowe & Locket, 1926; Austad & Thornhill, 1986; Nitzsche, 1988; Lang, 1996; Stalhandske, 2001, 2002; Bilde et al., 2006, 2007), and recently for three Neotropical trechaleid species of the genus Paratrechalea (see Carico, 2005; Costa-Schmidt, Carico & Arau jo, 2008). The nuptial gift in spiders consists of a prey item (typically an insect) caught and wrapped in silk by the male, yielding in a round, white package, which is carried in the chelicerae while searching for females. Once a sexual encounter takes place, the male will adopt specic courtship postures and offer the gift to the female. To signal acceptance, the female will grasp the gift with her chelicerae and the pair will adopt the mating position and perform a species-specic palpal insertion pattern (Bristowe & Locket, 1926; Costa-Schmidt et al., 2008). Indirect evidence from previous research on the terrestrial spider P. mirabilis indicates that male nuptial gift construction is prompted by the presence of sexual cues, probably sex pheromones, associated with female silk (Bristowe,
Introduction
The occurrence of chemical signals released by females to elicit male attraction and courtship is widespread among arthropods (Lofstedt, 1993; Foelix, 1996; Huber, 2005; Gaskett, 2007). In spiders, contact sex pheromones associated with female silk threads are the most common semiochemicals (Schulz, 2004; Huber, 2005; Gaskett, 2007). By eliciting active male searching and courtship, female sex pheromones have important roles, such as preventing female attacks and improving the chances of meeting and mating (Platnick, 1971). Pheromones also inform males about female characteristics, such as reproductive status or age (Roberts & Uetz, 2005; Stoltz, McNeil & Andrade, 2007). Information in these semiochemicals could be particularly important for species of spiders in which males show high courtship investment, including species that offer nuptial gifts (Lang, 1996). Nuptial gifts are well documented in insects (Kessel, 1955; Wedell, 2005) and may consist in the transfer of nutrients from males to females during courtship and mating, such as captured prey, regurgitations, glandular uids, parts of or even the males whole body (Thornhill, 1976; Boggs, 1995; Sakaluk, 2000; Vahed, 2007). Although spiders could build
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c 2009 The Authors. Journal compilation c 2009 The Zoological Society of London Journal of Zoology 277 (2009) 284290
M. J. Albo et al.
Nuptial gift construction in a semiaquatic spider
1958; Lang, 1996; Stalhandske, 2001, 2002; Prokop, 2006). However, such evidence does not exist for the semiaquatic species of Paratrechalea. Spider sex pheromones in general are considered to be soluble in water and other polar solvents (Schulz, 2004; Gaskett, 2007) but some semiaquatic pisaurids, and also lycosids, show water-resistant sex pheromones associated with female silk threads (Roland & Rovner, 1983; Lizotte & Rovner, 1989; Arnqvist, 1992). Therefore, following the stimulatory model described for P. mirabilis, we hypothesize that these semiochemicals are good candidates for eliciting nuptial gift construction in Paratrechalea species, anticipating the sexual meeting. The Trechaleidae family is part of the Lycosoidea superfamily, together with 11 other families, including Pisauridae, Lycosidae, Ctenidae and Oxyopidae (Griswold, 1993; Silva, 2003; Coddington, 2005). They are wandering spiders distributed all over the world. The Trechaleidae is a small family, which includes 18 genera and 100 species distributed across the Americas, from Argentina to the USA, and a unique species in Japan (Platnick, 2008; but see Carico, 2008; Carico & Silva, 2008; Silva, Lise & Carico, 2008). Most Trechaleidae species are associated with freshwater courses, and the females carry the egg sac attached to their spinnerets similar to lycosid spiders (Carico, 2005). Paratrechalea ornata is a semiaquatic spider found in south Brazil, north Argentina and Uruguay. Individuals from this species are found along the borders of streams and rivers, where adults and large juveniles can be seen on stones and pebbles emerging from the water current. These spiders are able to walk and capture prey on the surface of water. The occurrence of nuptial gifts has been observed in both Brazilian (Costa-Schmidt et al., 2008) and Uruguayan (M. J. Albo & L. E. Costa-Schmidt, pers. obs.) populations of P. ornata. The main objective of this research was to observe the occurrence of female sex cues and the effect they have on male nuptial gift construction in P. ornata. We also describe in detail some fundamental behaviours associated with nuptial gift construction in the Uruguayan populations. These data support previous descriptions (Costa-Schmidt et al., 2008), which suggest that Brazilian and Uruguayan populations could belong to different species. The results obtained allow us to estimate the implications of silk wrapping according to the current hypotheses on the origin and function of nuptial gifts in arthropods.
Materials and methods

A total of 34 individuals were collected during February and May 2007, from riparian areas of Yerbal Chico Stream (Quebrada de los Cuervos, Treinta y Tres Province, 32155 0 30.5000 S 54127 0 33.1000 W) and Santa Luc a River (Paso del Molino, Arequita, Lavalleja Province, 34116 0 40.1000 S 55114 0 00.8000 W), Uruguay. Most were juveniles and were raised until adulthood under laboratory conditions. Spiders were sexed and kept in individual glass cages (8 cm internal diameter and 11 cm height). We monitored individuals daily to determine the date at which each of them reached adulthood. Individuals were fed weekly with a mixed diet
of termite workers (Nasutitermes spp.), ies Musca domestica and pieces of mealworm Tenebrio molitor. Water was provided daily in cotton wool. Juvenile spiders were raised in a warmed room (24.1 0.9 1C) during autumn and winter (MayJuly), to accelerate their development. Adult and penultimate individuals were maintained at a room temperature of 21.8 3.4 1C, during the same period. All females had not mated previously; 12 males were also unmated and three were collected as adults. Experimental observations were carried out under laboratory conditions, after sunset, from 19 June to 27 July 2007. The experimental cages were horizontal, transparent, plastic bottles (9 cm diameter and 35 cm length) with a layer of pebbles to simulate natural substrate conditions and with a Petri dish of 14 cm diameter containing water. The room temperature during the experimental period (winter: JuneJuly) was 18.7 1C ( 1.6 SD). One day before the experimental trial, each adult male was placed in a Petri dish and fed with a termite to prevent starving. Before the trial, a live y (Telmatoscopus albipunctatus) was given to each male. Immediately after having captured the prey, the males were transferred to the experimental cage. To test the inuence of different stimuli on nuptial gift construction, three treatments were used: presence of female silk (S), presence of female silk plus female (SF) and a control group with no silk or female (C). In both treatments S and SF, the female was placed into the experimental cage 24 h before the experiment, allowing silk deposition. In treatment S, the female was removed after 24 h and a male was placed into the arena. In treatment SF, the female was removed and placed in a small holding at the end of the cage, allowing the male and female to be in direct contact but avoiding mating. For group C, the male was placed in an arena without any female cue. Fifteen males and 15 females were used in each group, at least 1 day after the last moult. All the females were used once in S and once in SF, in a random order. Each male was used once in each group, S, SF and C, in a random order. Spiders were used in a second trial after 3 days. The duration of each trial was 30 min, but if male movements precluding nuptial gift construction were observed, the trial continued until nuptial gift construction was completed. Males and females of all ages were randomly paired for each trial. To analyse the possible effect of age, we compared results from males and females classied into three age categories, according to their age as adults when they were tested: (1) between 1 and 20 days, (2) between 21 and 40 days and (3) more than 40 days. The behaviour and interactions between individuals were registered and timed in data sheets, especially the occurrence and duration of nuptial gift construction. We established two main categories for male behaviours: linear locomotion and non-linear locomotion. Linear locomotion consisted in fast locomotory activity throughout the experimental cage without displaying any courtship units. Non-linear locomotion (or searching behaviour, named stroboscopic movements by Costa-Schmidt et al., 2008) consisted of slow, non-linear locomotion, usually including leg (legs 1 and 2) and palpal vibration, suggesting the incidence of some sexual stimuli.
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M. J. Albo et al.
We used the statistical package Past (Hammer, Harper & Ryan, 2003) to analyse our results. Normality and homogeneity of variances was tested with ShapiroWilk and Levene tests, respectively. For comparing means, we used the Student t-test for two independent samples, MannWhitney U-test and KruskalWallis or ANOVA tests. To compare frequencies, we used the w2 test for two or more independent samples (with Yates correction) and the Fisher exact probability test. We transformed the data whenever it was necessary.
Table 1 Number of prey packing bouts, duration of rst prey packing (in min) and total duration of gift construction (in min) in S (males exposed to female silk) and SF (males exposed to silk and the female) treatments S (6) SF (8) Statistics P 0.89 0.26 0.61
Prey packing occurrence 3.0 1.09 3.1 0.99 U = 22.5 First prey packing duration 2.3 1.21 1.75 0.61 t =1.19 Total duration of 7.9 2.98 13.9 12.3 U = 19.5 gift construction
Results
Nuptial gift construction
Six males in treatment S and eight males in treatment SF constructed a nuptial gift, whereas all males in treatment C ate their prey and did not construct nuptial gifts. We did not observe feeding on prey in groups S and SF. The occurrence of nuptial gift construction was signicantly different among the three groups (w2 2 =10.78; P = 0.0045). In the pair-wise comparisons, we found statistical differences in gift construction occurrence between S and C (w2 = 5.21; P = 0.02), and between SF and C (w2 = 8.35; P = 0.004), whereas S and SF did not differ from each other (w2 = 0.13; P = 0.71). All gifts were constructed during the rst half of the experimental period, in both S and SF groups. To test whether contact with a female inuences nuptial gift construction, data from treatment SF were divided into two periods: before and after contacting a female. Four males did not nd/touch the conned female during the experimental period, and two of them constructed nuptial gifts. Eleven males found females after 10.77 min ( 8.14 SD, range 0.921.6) on average. Five of these males constructed nuptial gifts before making contact with the female, three constructed the gift after contact with the female and three did not construct a nuptial gift after contact with the female. Nuptial gift construction in group SF started at 8.59 min ( 3.38 SD, range 4.912.9 min) in the eight males; this delay in construction was 7.18 min ( 3.27 SD, range 4.912.9) in males that constructed a gift before contacting the female and 10.90 min ( 2.34 SD, range 8.312.7) in those that constructed it after contacting the female. In the S group, the latency for construction of the six males was 9.92 min ( 3.41 SD, range 3.412.3 min). There was no signicant difference in delay in nuptial gift construction between groups S and SF (U = 21, n1 = 6, n2 = 8, P = 0.75). We observed a similar number of sequences of prey packing (basal plate construction plus silk covering) in both treated groups (Table 1). Nuptial gift construction involves sequences of prey packing and periods of gift carrying, as it was described by Costa-Schmidt et al. (2008). In our trials, the male rst releases silk threads on a pebble, spinning a thin basal plate. Following this, the male will deposit the prey onto the basal plate and cover it with silk (silk covering). Finally, the male will bite into the silken prey, removing the package from the surface to which it is attached. Using his chelicerae, palps and third pair of legs, the male
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Values are given as mean standard deviation, with the number of data between parentheses. Comparisons between both treatments were made using the MannWhitney U-test or the Student t-test.
Table 2 Duration (in min) of consecutive prey packing behaviours, analysing separately basal silk layer construction and prey silk covering First Second Third packing (11) packing (11) packing (7) Fourth packing (4)
Basal layer 0.95 0.93 0.45 0.21 0.50 0.45 0.30 0.18 construction Silk covering 0.74 0.25 1.87 0.90 1.31 0.92 1.43 0.62 Only one male performed a fth packing (not included in the table) spending 0.4 min in laying silk basal threads and 2.4 min in silk covering. Data are given as means standard deviations, with the number of data between parentheses.
will then manipulate the package into an ovoid shape, carrying it short distances or remaining in the same site. The male can then re-initiate the gift construction sequence by adding more silk and reinforcing the package. Neither the duration of the rst sequence of prey packing nor the total duration of nuptial gift construction showed signicant statistical differences between groups S and SF. Finally, we tested whether contact with a female affected gift construction, by comparing the duration of the rst prey packing sequence before (ve cases) and after (three cases) female contact in the SF group. The durations were on average 1.83 1.02 and 1.7 0.35, respectively, and we found no signicant differences between groups (t = 0.019, P = 0.98). Taking into account that gift construction was similar between S and SF, we grouped these data for a more detailed description of the consecutive sequences of prey packing. Data from 11 males were analysed (the six cases that constructed gifts in the S group and ve other males of the SF group), considering separately the basal plate construction and the silk covering of the prey. The mean temporal data from consecutive prey packing sequences are shown in Table 2. We found no differences in basal plate construction (ANOVA: F3 = 2.18, P = 0.11), but we found signicant differences in silk covering data (KruskalWallis: H3 = 9.91, P = 0.019). In pair-wise comparisons (Wilcoxon test), we found signicant differences only between the rst and the second silk covering durations (t = 1.0, P =0.007), showing the shortest and the longest values, respectively.
M. J. Albo et al.
Other male behaviours

Male behaviours differed among groups S, SF and C (Table 3). Males in C did not exhibit non-linear locomotion or leg vibration, remaining in a resting position while they ate the prey and performed, at some intervals, linear locomotion. Twelve males in treatment S and 14 males in treatment SF performed non-linear locomotion. We found statistical differences in the frequencies of male non-linear locomotion among the three groups (w2 2 = 31.5; Po0.001). In the pairwise comparisons, even though no differences were found in male non-linear locomotion occurrence between S and SF (w2 = 0.29; P = 0.59), differences were seen between treatments S and C (w2 =16.81; Po0.001) and between treatments SF and C (w2 = 22.63; Po0.001). We compared the occurrence of nuptial gift construction by searching males in treatments S and SF, but no signicant differences were found between these groups (w2 = 0.001; P = 0.97). Leg vibrations were observed before, as well as after, nuptial gift construction. Occurrences of leg vibration did not differ between S and SF (w2 = 1.53; P = 0.22). No differences were found in the occurrences of leg vibration when only searching males were considered (w2 = 0.51; P = 0.48). Most of the males that vibrated constructed nuptial gifts (Table 3), but no differences in nuptial gift occurrence between S and SF vibrating males were found (w2 = 0.04; P =0.84).
and both sexes pulled the gift. Two of these females obtained the gift; one ate it immediately and the other exposed the gift to the male and then ate it. In the remaining pair, the male retained the gift and offered it again, but the female did not grasp it.
Age of males and females

We analysed whether or not adult age affected gift construction, comparing male and female behaviour in three age categories (see Materials and methods). We found signicant differences when comparing male occurrence frequencies (w2 2 = 6.63; Po0.05). In the pair-wise comparisons (Fisher test), young males were different from old males (P = 0.016); however, no differences were found between young and medium males (P = 0.076), or between medium and old males (P = 0.56) (Fig. 1a). We also found signicant differences among the female age categories (w2 2 = 6.39; Po0.05), suggesting that young females elicited gift construction less than the other age groups (Fig. 1b). However, no signicant differences were found in the pair-wise comparisons (the only comparison that came close to the signicance level was that between the oldest and the youngest female: w2 = 3.20; P = 0.07).
No gift construction (a) Gift construction 8 Number of males 6 4 2 0

>4 0 0 20 0 20 21 4 0 21 4 0 >4 0
Female behaviour
Conned females from the group SF behaved differently according to whether or not they were found by the male. The females that were not found (four out of 15 cases) remained immobile inside their holding, intercalating linear locomotion that included escape attempts, but without showing any sexual behaviour. Male and female interactions were observed, exchanging leg tapping through the grid; some males performed hyperexion (sensu Costa-Schmidt et al., 2008), offering the gift (ve cases) or the unwrapped prey (a single case) to the female. Three females grasped the gift through the grid while males performed hyperexion
S S SF S SF
SF
Age categories (b) Number of females S SF SF S SF S
Table 3 Frequencies of male behaviour in the three treatments, discriminating between cases with or without nuptial gift construction Treatment S Gift (6) Linear locomotion 0 Non-linear locomotion 6 Leg vibrations 6 No gift (9) 3 6 3 Treatment SF Gift (8) 0 8 8 No gift (7) 1 6 5 Treatment C No gift (15) 15 0 0
10 8 6 4 2 0
0 20 21 4 0 0 20
>4 0
Linear locomotion consisted of fast linear movements along the experimental cage without courtship; non-linear locomotion consisted of slow movements while searching; leg vibrations were courtship signals performed during non-linear locomotion. Number of data are given between parentheses.
Age categories
Figure 1 Occurrence of nuptial gift construction according to adult age (in days) in S and SF treatments: (a) males; (b) females.
21 4 0
>4 0
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M. J. Albo et al.
Discussion
The results show that cues from conspecic adult females elicit gift construction by males in P. ornata. As gift construction was only observed for treatments where silk cues were present (S and SF groups); we can interpret that contact sex pheromones associated with female silk threads could be responsible for this behaviour. Pheromone deposition on female silk threads eliciting male searching and courtship behaviour is widespread in spiders, including other related families (Lycosidae and Pisauridae) (Foelix, 1996; Huber, 2005; Gaskett, 2007). Female cues could be species-specic, as P. ornata males do not construct gifts when exposed to silk threads of the two other co-occurring trechaleid females: Trechalea bucculenta and Trechaleoides biocellata (M. J. Albo & A. Klein, pers. obs.). In the eld, female P. ornata deposit silk threads on rocks emerging from the water surface (authors, pers. obs.), suggesting that the chemical signals involved are resistant to humidity or direct water action, as has been reported for other species of Lycosoidea (Roland & Rovner, 1983; Lizotte & Rovner, 1989; Arnqvist, 1992). Male detection of females concurs with the sexual behaviour described for this species (CostaSchmidt et al., 2008) and with experimental evidence for P. mirabilis (Bristowe & Locket, 1926; Lang, 1996). Results from the control group exclude the possibility that males spontaneously construct nuptial gifts when they capture a prey during the mating season. The possibility that male previous experience affects gift construction can also be disregarded, because many males had constructed gifts in the S and SF treatments did not do so when exposed to clean arenas (C). Gift construction seems to be an adaptive behaviour, allowing males to feed or to wrap prey in response to mating opportunities, being ready to successfully court and mate on meeting an adult female (see Lang, 1996). Male readiness avoids delays in prey capture for packing when nding a female, and thus minimizes the risks of predation, female desertion or malemale competition for a receptive female. Gift construction in our study always began by the spider making a basal plate before depositing the prey. This behaviour was also observed in Brazilian populations of this species (L. E. Costa-Schmidt, pers. obs.). Basal plate construction may prevent the loss of prey parts and avoid prey sticking to the substrate due to body uids. Coincidently, the rst basal plate construction seems to be longer than subsequent similar behaviours. Males in Brazilian populations of P. ornata obtain a whitish nuptial gift after a single sequence of prey packing (Costa-Schmidt et al., 2008), whereas we observed at least two consecutive sequences for achieving a white nuptial gift, as was described in P. mirabilis (Nitzsche, 1988; Lang, 1996). The second prey packing sequence may be an important step for males to obtain a strong sexual signal, carrying an apparently large gift that visually contrasts with reddish male chelicerae, as was stressed by Costa-Schmidt et al. (2008) and CostaSchmidt & Arau jo (2008) for this species. According to Costa-Schmidt et al. (2008), nuptial gift construction is an obligatory step for mating in this species. Therefore, sexual-selective pressures like female choice and
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malemale competition will exert strongly on males for early nuptial gift construction. However, half of the males used in both treatments did not construct nuptial gifts and ate the prey, in spite of receiving female sexual stimuli. Factors such as male hunger and age of both partners could affect gift construction. All males were fed 1 day before the experimental observation, and so we rule out the rst possibility. On the other hand, because older males construct gifts more frequently than younger males, older males may be more prone to construct nuptial gifts because they are physiologically mature enough and have more reproductive pressures to mate compared with younger males. Recently moulted males of P. mirabilis usually eat their prey (R.O.M. Nitzsche, pers. obs., cited by Lang, 1996). Female age also seems to affect nuptial gift construction due to the latter, which was more frequently observed towards old than young females. Mature unmated females could release more silk threads (more sexual cues) for eliciting gift construction and attracting males, avoiding the risk of remaining unmated. Mature unmated females are more chemically attractive for males than recently moulted females in other lycosoid spiders (Rypstra et al., 2003; Roberts & Uetz, 2005). In disagreement with Brazilian populations, males from Uruguayan populations can mate without nuptial gifts under laboratory conditions (M. J. Albo, unpubl. data). Males lacking nuptial gifts that succeeded in mating were also observed in P. mirabilis (Stalhandske, 2001), although this behaviour was not found by Prokop (2006) in the same species. Geographical variations in the obligatory condition of nuptial gifts for successful mating must be analysed in gift-giving spiders, taking into consideration previous data from P. mirabilis and P. ornata. Variations in the use of nuptial gifts can also help us to analyse the function of gifts as inhibitors of female aggression and/or donors of nutritional benets. Trechaleidae are related to the Lycosidae and Pisauridae families. Many species today included in Trechalidae formerly belonged to Pisauridae, but recent revisions consider that Lycosidae and Trechalidae are closely related families, with Pisauridae being related to both families in the immediate node (Sierwald, 1990; Coddington & Levi, 1991; Griswold, 1993). According to these last relationships, the gift-giving behaviour of Paratrechalea species and P. mirabilis would have evolved independently, but the surprising similarities could suggest a common origin. New data on the biology of species belonging to these families will allow more complete comparative studies for elucidating the origin and evolution of these groups and to also reveal unknown aspects of their amazing reproductive behaviours.
Acknowledgements
We thank Anita Aisenberg, Soledad Ghione, Alicia Postiglioni, Rodrigo Postiglioni and Carlos Toscano-Gadea for their help in the collection of spiders. We thank Anita Aisenberg and Carlos Toscano-Gadea for the critical reading of the rst draft of the paper. Anita Aisenberg and Estefan a Stanley
M. J. Albo et al.
improved the English. Finally, we thank Sren Toft, Nigel Bennet and an anonymous reviewer for their critical comments, which substantially improved the paper.
References
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Captulo 7 Apndice II CAPTULO 7 APENDCE II
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Nuptial gift giving behaviour and male mating effort in the Neotropical spider Paratrechalea ornata (Trechaleidae)
Mara J. Alboa, 1, * & Fernando G. Costaa, 1

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Laboratorio de Etologa, Ecologa y Evolucin, Instituto de Investigaciones Biolgicas
Clemente Estable, Uruguay.
*Correspondence: M.J. Albo, Laboratorio de Etologa, Ecologa y Evolucin, Instituto de Investigaciones Biolgicas Clemente Estable, Av. Italia 3318, 11600 Montevideo, Uruguay email: mjalbo@iibce.edu.uy
Laboratorio de Etologa, Ecologa y Evolucin, Instituto de Investigaciones Biolgicas
Clemente Estable, Av. Italia 3318, 11600 Montevideo, Uruguay
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ABSTRACT The occurrence of nuptial gifts is rare in spiders, being well-known only for a single species, Pisaura mirabilis (Pisauridae), whose males offer to females a prey wrapped in silk during the courtship. Although some males can mate without offering a prey, the function of the gift in this species has been suggested as a male mating effort. Male gift offering has been recently described in Paratrechalea ornata, a Neotropical spider belonging to another family, Trechaleidae. Following the mating effort hypothesis, we expect that P. ornata males with a nuptial gift will be more successful and will perform longer and more complete matings than males with no gifts. Two groups of males were exposed to virgin females: 23 males with no prey (NP group) and 21 males carrying a prey (group CP). Mating success, courtship, mating and first oviposition were registered. Males with wrapped or unwrapped prey showed better mating success, longer copulation and longer palpal insertions than those without prey. Longer copulations correlated with earlier egg-sac construction and oviposition. Some unmated males from NP wrapped prey carrions when they returned to their breeding jars after the trial. Our findings suggest that nuptial gift giving represents a male mating effort also for Paratrechalea ornata. Nuptial gifts would allow males to control mating duration and to accelerate female oviposition, improving sperm supply and paternity, and minimising possible male costs of remating from polyandrous females.
Keywords: spider nuptial gift, oviposition acceleration, male mating effort, Paratrechalea ornata, sexual selection.
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Nuptial gifts are common in invertebrates and have been intensively studied in insects (Boggs 1995; Vahed 2007; Gwynne 2008). In general, gifts could be prey, carrion or plants, regurgitations, salivary and glandular secretions, specialized male body parts and ejaculated substances (Vahed 1998, 2007). Historically, nuptial gifts were defined as potentially nutritive substances donated by males to females during mating (Boggs 1995). It is known that the gift can supply the female with nutrients functioning as parental investment (Thornhill 1976a; Gwynne 1984; Simmons & Parker 1989). In some insects the nuptial gift has a positive effect on female fecundity and can also increase female longevity (Wiklund et al. 1993; Karlsson 1998; Lewis & Cratsley 2008). However, because there is limited knowledge on the gifts nutritional value, and there is evidence that some nuptial gifts improve male success but actually do not provide direct (nutritious) benefits for females, sexual conflict between sexes could be operating (Vahed 1998, 2007; but see Gwynne 2008). In this way, males can manipulate the time of copulation promoting large ejaculates, inducing female refractory period and accelerating oviposition, maximizing their mating effort (Thornhill 1976b; Simmons & Gwynne 1991; Eberhard 1996; Wolfner 1997; Heifetz et al. 2001; Arnqvist & Rowe 2005; Sakaluk et al. 2006). Two other hypotheses can explain the adaptive significance of nuptial gifts, beyond the paternal investment and mating effort: avoidance of sexual cannibalism and sensory exploitation (Vahed 1998, 2007). Cannibalism avoidance was proposed by Bristowe (1958) and Kessel (1955) as a tactic to prevent female attacks, but it lacks of empirical support. Sensory exploitation assume male manipulation over females by offering gifts which affect pre-existing female sensory bias, although not necessarily implying costs for females (intersexual conflict). A good example is the donation of spermatophores in crickets, which provide the gustatory stimuli which females prefer (Sakaluk 2000; Vahed 2007). 3
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The occurrence of nuptial gifts is rare in spiders; in fact the Palearctic species Pisaura mirabilis (Pisauridae) has been the only well-studied species, particularly in the context of sexual selection (Austad & Thornhill 1986; Lang 1996; Drengsgaard & Toft 1999; Stlhandske 2001, 2002; Bruun et al. 2003; Prokop 2006; Bilde et al. 2006, 2007; Andersen et al. 2008; Hansen et al. 2008; Prokop & Maxwell 2009). Males of this species offer to females a prey wrapped in silk during courtship, which is bitten and consumed by the female during mating. Stlhandske (2001) observed that males of Scandinavian populations can also mate lacking donation and without risk of cannibalism. She suggested that the gift facilitates the copulation position, and keeps the female occupied handling it during mating. Larger gifts result in longer copulations and more fertilized eggs (Austad & Tornhill 1986; Stlhandske 2001). In P. mirabilis the gift functions as a male mating effort to facilitate copulations, and the silk wrapping provide direct benefits to males in the form of increased control over mating and longer copulations (Lang 1996; Stlhandske 2001; Bilde et al. 2007; Andersen et al. 2008). Recently, Costa-Schmidt et al. 2008 described that in Paratrechalea ornata (MelloLeito 1943), a Neotropical spider that belongs to the family Trechaleidae, males also build and donate nuptial gifts during courtship and copulation. Paratrechalea ornata is found in Southern Brazil, Northern Argentina, Paraguay and Uruguay (Carico 2005) and like other trechaleids inhabit semi-aquatic environments, especially the borders of streams and rivers. Females carry the egg-sac attached to the spinnerets, similar to the wolf spiders (Lycosidae). In Uruguay P. ornata co-occurs with other larger trechaleid species as Trechalea bucculenta and Trechaleoides biocellata (Albo & Costa unpublished data). As was found in the pisaurid P. mirabilis, males of P. ornata may present either a wrapped or unwrapped nuptial prey gift (Albo et al. 2009). Prey wrapping is trigged after perceiving 4
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female silk cues and increases frequency according to male maturation (Albo et al. 2009). The aim of the present study was to test if nuptial gift implies sexual cannibalism avoidance and/or if it functions as a male mating effort by comparing males with and without nuptial gift in P. ornata. We will also compare the findings with those from P. mirabilis to discuss about the function and evolution of this conspicuous behaviour.
METHODS We collected subadult individuals of P. ornata in February and May 2007, and in April, August and September 2008, from riparian areas of Yerbal Chico Stream (Quebrada de los Cuervos, Treinta y Tres Province, 325530.50S 542733.10W) and Santa Luca River (Paso del Molino, Arequita, Lavalleja Province, 341640.10S 551400.80W), Uruguay. In the lab, the spiders were kept in individual glass jars (8 cm internal diameter and 11 cm height) and raised until adulthood, controlling the dates of moults. Spiders were fed weekly with a mixed diet of termite workers (Nasutitermes sp., Isoptera), flies (Musca domestica, Diptera) and pieces of mealworms (Tenebrio molitor, Coleoptera), providing water daily by wet cotton wool. Juvenile and penultimate spiders were raised in a climate room (24.4 1.8 C) to accelerate their development, while adults were maintained at ambient temperature conditions 20.4 C ( 2.3 SD). All females and males used in the experiments were virgins. Almost all adult individuals were experimentally used 20 days after the final moult. Because these spiders are nocturnal, experimental observations were carried out after sunset under laboratory conditions, from September 28th to December 9th in 2007 and from April 25th to October 27th in 2008. The experimental cages were glass terraria of 30 x 14 cm base and 20 cm height. The base was covered by a thick layer of pebbles, simulating riparian natural conditions, with a fitted petri dish of 14 cm diameter
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with water (Fig. 1). The ambient temperature during the experimental period was 20.4 C ( 2.3 SD). In order to investigate the function of the nuptial gift in courtship and mating, 23 females were exposed to a male with no prey (group NP) and 25 females were exposed to a male carrying a prey (group CP). One day before the experimental trial, a female was placed into the experimental cage allowing silk deposition and habituation, whereas an adult male was placed in a petri dish and fed with a fruit fly (Drosophila sp.) to prevent starving condition. For the mating trials, each male of CP group received a large living fruit fly (Drosophila funebris) and was transferred to the female experimental cage immediately after he captured the prey. In both experiments treatments the trials consisted of two steps. Firstly, we exposed the male to the female silk, isolated from the female presence by an opaque glass barrier. Secondly, after 15 minutes we carefully removed the barrier, allowing male-female encounter. This time period is enough for males to wrap the prey in silk (Albo et al. 2009). If a male did not wrap the prey, we allowed the male to encounter the female carrying the unwrapped prey. Therefore, males from the CP treatment could encounter females carrying either wrapped or unwrapped prey. In cases when the male courted female with a prey but mated without donating it (maintaining the prey in his chelicerae), we included these data in CP for the courtship analyses, but considered them as a separate group (no donation, ND) for the mating analyses. Individuals were not reused, except for three females which were first used in NP and did not mate, and were subsequently reused in CP. To avoid possible effects of female previous experience, we excluded their data from the courtship analysis, but we included them in mating analysis due to their virgin condition. Each trial was stopped when the mating ended, or after 30 minutes when no interactions were observed. Behaviours and 6
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interactions between individuals were timed and registered in data sheets. We registered the occurrence of prey wrapping, male courtship, female sexual receptivity, female gift acceptance and mating (see Costa-Schmidt et al. 2008). Male courtship consisted of nonlinear locomotion (searching behaviour) and foreleg vibrations towards the female. Female sexual receptivity consisted in hyperflexion of forelegs and active behaviour towards the male; female acceptance was defined when female grasped the gift and accepted the mount (CP) or directly accepted the mount (NP). Mating consisted in alternated single palpal insertions with male facing opposite over the female prosoma (like wolf spider mating position), with face-to-face pauses between two insertions. Total mating duration included the entire period between first mount and final dismount; insertion duration was measured from palpal insertion until palpal disengagement. The interval between two insertions included the face-to-face posture. Each mated female was individually raised and the period until first egg-sac construction (latency to oviposit) was recorded, as well as the number of emerged spiderlings. Voucher males, females and spiderlings were deposited in the arachnological collection of the Facultad de Ciencias, Montevideo, Uruguay. We used the Past statistical package (Hammer et al. 2003) and JMP 7 package (SAS Institute, Inc. Cary, NC). We tested normality and homogeneity of variances with ShapiroWilk and Levene tests, respectively. For comparing mean values, we used the MannWhitney U-test and the Student t-test for two independent samples, and the Fisher-exact probability-test to compare frequencies. We also performed ANCOVA, linear regression and correlation analyses.
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RESULTS Courtship and Male Mating Success All males and females found each other in both treatment groups. First male-female encounter occurred after a mean of 12.1 min ( 7.7 SD) in NP and after 8.7 min ( 7.3 SD) in CP, showing significant differences using the Mann-Whitney test (U = 184, N1 = 23, N2 = 25, P = 0.03). In NP group, four males did not court and 19 courted females, whereas all the 25 males courted in CP (Fisher test: P = 0.06). Courtship duration appeared briefer in NP (8.4 7.7 min) than in CP (14.4 15.6 min), but was not statistically significant (Mann-Whitney test: U = 195.5, N1 = 19, N2 = 25, P = 0.33). Nine of the 23 couples mated in NP. In CP, 15 males mated after donating the prey, six did not mate, and four males mated without donating the prey (maintaining it in the chelicerae) during the entire copulation. These last cases were considered separately in the following analyses (see Methods section). Males with a prey (wrapped or unwrapped) mated more frequently than those without it (Fisher exact test: P = 0.03). In CP, six males courted females carrying a wrapped prey and five of them mated; nine males courted females with an unwrapped prey and three mated. No statistical differences were found (Fisher test: P = 0.08). Males that failed to mate carrying an unwrapped (six cases) or a wrapped prey (one case) immediately wrapped or re-wrapped it, and successfully mated afterwards. After trials and once returned to their breeding jars, five unmated and two mated males from the NP group immediately built nuptial gifts by packing carrions of mealworms in silk.
Mating Duration and First Ovisposition
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In Table 1 we show mean values of mating duration and number and duration of palpal insertions in both the NP and CP groups. The CP group showed longer copulations, more and longer insertions, and longer intervals among insertions than NP. We also compared these groups with ND (the group of four males that mated without donate the prey). This last group showed the following mean values: mating duration 3.4 min (3.1 SD), insertion duration 0.8 min ( 0.3 SD), interval among insertion 2.6 ( 3.3 SD), number of insertions 1.8 ( 0.5 SD). We found no differences in mating duration (with NP: U = 7, N1=4, N2 = 9, P = 0.11; with CP: U = 22.5, N1=4, N2 = 17, P = 0.32), insertion duration (with NP: U = 9.5, N1=4, N2 = 9, P = 0.21; with CP: U = 22.5, N1=4, N2 = 17, P = 0.32), interval among insertions (with NP: U = 7, N1=4, N2 = 9, P = 0.09; with CP: U = 23, N1=4, N2 = 17, P = 0.35) or number of insertions (with NP: U = 14, N1=4, N2 = 9, P = 0.55; with CP: U = 20, N1=4, N2 = 17, P = 0.21). The occurrence of a first oviposition was similar in both treatments: 8 from 9 mated females built an egg-sac in NP and 12 from 18 females in CP (data from 3 unmated females used in NP were included in CP; see Methods). We found no statistical differences between these frequencies (Fisher test, P = 0.22). None of the 14 unmated females constructed an egg-sac. The latency of oviposition (period between mating and first egg-sac construction) was longer in NP (24.6 9.9 days) than in CP (14.5 10.1 days) (Mann-Whitney test: U = 18.5, N1=8, N2 = 12, P = 0.03). We found a significant relationship between mating duration and latency of female oviposition (ANCOVA: F = 13.35, P = 0.002); CP showed a significant (inverse) linear relationship (r11 = -0.76, P = 0.006), while NP did not show a significant relationship (r8 = 0.09, P = 0.82) (Fig. 2a). Similar relationships were found between insertion duration and latency of oviposition: ANCOVA (F = 9.79, P = 0.006), in CP (r11 = -0.63, P = 0.04), in NP (r8 = -0.017, P = 0.96) (Fig. 2b). We also tested if female 9
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age and room temperature affected oviposition latencies. We found a no significant relationship (ANCOVA: F = 0.031, P = 0.99). Spiderling emergence was observed only from three egg-sacs in NP and from five eggs-sacs in CP, showing a mean of 44.3 ( 34.5 SD) and 34.8 ( 25.8 SD) spiderlings, respectively, showing no significant differences (Student test: t = 0.45, P = 0.66).
Female Receptivity Sixteen females from NP were receptive towards the courting males and adopted the hyperflexion posture; however, seven of them did not mate. In this group, three females were reluctant, evading male contact, and four females were not courted. Seventeen females from CP were receptive, but two of them did not mate. All females from CP were courted but four of them were reluctant. When we compared the occurrence of mating between the receptive females of NP and CP, significant differences were found (Fisher exact test: P = 0.046). Eight females in NP and eight females in CP initially attacked males, performing a fast jumping, which was avoided by males. In NP, only the receptive females displayed attacks, whereas in CP five receptive females and three unreceptive females attacked males. No differences were found (Fisher exact test: P = 0.10). After attack, both sexes remained face to face until the male started or continued courting while the female stayed motionless. We observed a single case of sexual cannibalism after mating (in CP): the male went away after a single insertion, maintaining the gift grasped by the third pair of legs. The female attacked immediately trying to bite the gift and simultaneously captured and devoured the male. In the no-donating male group (ND) the four females were receptive, two of them attacked males and the four mated.
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Mating Description Considering that the behaviour of the population studied here differs from the behaviour of the Brazilian population studied by Costa-Schmidt et al. (2008), where mating occurs only when the nuptial gift is present, we briefly re-described mating with particular emphasis in cases when the gift is not present. Similarly to the Brazilian population, mating consists in phases of palpal insertion alternated with face-to-face position, in which both male and female grasped the gift. Before palpal insertion, the male clasped the gift with the claws of the third pair of legs and mounted the female attempting to insert the pedipalp. Once the insertion occurred the male maintained the third pair of legs in this position and only took it out when insertion ended, returning to the face-to-face position grasping the gift with the chelicerae. When no donation was present (NP group), we observed that the male behaviour was similar, and male tarsi of third legs clasped the female mouthparts during insertions, but we did not observe direct contact between male and female mounthparts once the insertion finished. When males maintained the gift in the chelicerae (ND group), the mating pattern was similar to the observed in NP. These males persisted retaining the prey in the face-to-face position and we did not observe any difficult for insertion.
DISCUSSION The presence of nuptial gifts in P. ornata enhanced male mating success and increased mating duration, in agreement with reports in gift giving insect species (Sakaluk 1984; Thornhill 1976b; Simmons & Gwynne 1991; Vahed 2007). Similar effects were indicated in the spider Pisaura mirabilis by Stlhandske (2001), who suggested that the gift can improve mating position and facilitate palpal insertion. Despite some males can 11
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successfully mate carrying unwrapped or no prey, our findings suggest that the prey packed in silk and the construction of a true gift in P. ornata improves the male chances of mating. Silk wrapping of the gift could also increase the male control on mating, as suggested by Andersen et al. 2008 for P. mirabilis. The absence of nuptial gift did not increase the occurrence of sexual cannibalism, and the unique case where the female attacked the male was in the presence of a gift. Therefore, we discard the gift could be used by males to avoid being devoured by females in this species. Our results showed that males carrying a nuptial gift (wrapped or unwrapped prey) actively searched for females and found them before males without a gift, suggesting the former had higher motivation for searching and were more successful in achieving copulations. In agreement with this, males lacking a gift actively explored the substrate upon perceiving of female cues as if searching for a nuptial prey, sometimes also avoiding mounting attempt. Receptive females were also active and performed many ritualised attacks, suggesting that these attacks are a signal of receptiveness, or alternatively the female is searching for a nuptial gift. To build and carry a gift prior to female encounter benefits males by facilitating mating and securing longer copulations. The latter is likely to benefit males under sperm competition (Drengsgaard & Toft 1999), and the benefits to males might also compensate costs of capturing prey without feeding on it, releasing high amounts of silk, loosing time and energy without the certainty of meeting the female, and risking predation while wrapping and carrying the gift (see Albo et al. 2009). In contrast to P. mirabilis, where males obtained similar mating success with wrapped and unwrapped prey (Bilde et al. 2007), in P. ornata the silk wrapping improved male mating success. Paratrechalea ornata males carrying a wrapped prey tended to increase their likelihood of mating in the first sexual encounter compared with those presenting unwrapped gifts. 12
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Furthermore, most of the males carrying unwrapped prey initiated prey wrapping after contacting the female, and all males mated after offering a wrapped prey. Results from ND group (the four males that courted with a gift but did not donate it when mated) showed intermediate mating values between NP and CP groups, suggesting that earlier gift construction and gift carrying could improve mating. However, there were few cases for a deeper discussion of this interesting topic. Additional evidence of selective forces on males for wrapping the prey comes from the NP group, where half of the males did not mate despite females apparently being receptive. These males wrapped prey carrions later in their breeding jars. These symbolic or no-nutritious donations were also observed at the field in P. ornata populations, containing a dry prey or even a seed (Albo & Costa unpublished data), and were also reported in P. mirabilis during both laboratory (Nitzsche 1999, Winther and Albo, unpublished data) and field conditions (Bristowe 1958; Nitzsche 1988; Stlhandske 2002). The silk covering by itself could have nutritive value, and probable silk consumption had been reported for some spider species (Miyashita et al. 2004), including in female P. mirabilis during mating (Nitzsche 1988). However, the digestibility of spider silk by spiders is uncertain (Eberhard, pers. com.), raising important doubts about the nutritious value supplied by the symbolic gift. Despite these previous reports and due to the female feeding requirements (Bilde et al. 2007; Prokop & Maxwell 2009), the nuptial gift could be originated as an important nutritional supply for female spiders. Present results did not agree with the hypothesis of paternal investment in P. ornata, as was reported for insects (Thornhill 1976a; Gwynne 1984; Simmons & Parker 1989; Boggs 1995), in spite of the small sample sizes of spiderlings hatched. Therefore, our results suggest that male nuptial gift evolve as a mating effort to increase the male chances to obtain a long mating, assuring 13
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the paternity in a polyandrous context with high levels of sperm competition (Stlhandske 2001; Drengsgaard & Toft 1999). Increased mating duration of P. ornata seemed to accelerate female first oviposition. The nuptial gift by itself did not determine earlier ovipositon but the gift was associated with longer copulations. The effect of copulation duration could arise from increased sperm transfer and even from associated substances in the ejaculate, affecting female oviposition rate and fecundity (Heifetz et al. 2001; Vahed 2006; Gwynne 2008). By promoting longer copulations males could assure the rapid use of their sperm, maximising sperm supply and egg fertilization, and siring most of the offspring (Gwynne 2008). Paratrechalea ornata females are polyandrous (Albo, unpublished data) and males would benefit from accelerating oviposition by minimising sperm competition, but this effect could negatively affect the female interests, as was reported for some insects (Simmons & Gwynne 1991; Sakaluk et al. 2006). Then, male manipulation and conflict of interests could be involved. However, early oviposition in P. ornata could also be an advantage for females because they rapidly can obtain offspring avoiding old age, as well as maximizing clutch number during the breeding season (up to 4 egg-sacs; Albo, unpublished data). From the female perspective, the occurrence of numerous and longer insertions after gift donation could be explained in a scenario of cryptic female choice, where the sperm of males with costly copulatory courtship could be chosen by females (Eberhard 1996). Further research is needed to elucidate these hypotheses. In summary, our findings support the hypothesis that the maintenance of the nuptial gift and its silk wrapping in Paratrechalea ornata are mediated by male mating effort, improving the male chances of mating and possibly providing advantages in sperm competition. These functions of the nuptial gift have received empirical support in the 14
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nuptial gift giving spider Pisaura mirabilis (Stlhandske 2001; Drengsgaard & Toft 1999; Bilde et al. 2007). Further research is particularly needed about the nutritional value of male nuptial gift and female choice in P. ornata and in other gift-giving spider species.
Acknowledgements We thank Anita Aisenberg, Soledad Ghione, Alicia Postiglioni, Rodrigo Postiglioni and Carlos Toscano-Gadea for their help in the collection of spiders. We thank to Maria. J. Ferreiro, Santiago Ruiz and Rafael Cantera from the Department of Biologa del Neurodesarrollo from IIBCE for gently supply us with Drosophila spp. We also would like to thank Trine Bilde, Sren Toft and William Eberhard for constructive discussions. Luiz Ernesto Costa-Schmidt and Trine Bilde critically who read the first draft of the manuscript and Estefana Stanley for improving the English.
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1 2 3 4 5
Tables
Table 1. Total mating duration, number and duration of palpal insertions and interval among insertions (both in minutes) during mating in groups with males carrying no prey (NP) and prey (CP).
Treatment NP (n = 9) Total mating duration Insertion duration Interval among insertions Number of insertions 2.0 3.3 0.6 0.2 1.4 3.1 1.6 0.7 Treatment CP (n = 17) 6.5 6.7 1.2 0.8 5.3 6.3 2.7 1.4 U = 32.0 U = 39.0 U = 35.5 U = 38.0 0.018 0.046 0.028 0.034 Statistics P
6 7 8 9 10 11 All statistical comparisons were performed using the Mann-Whitney U-test. Three unmated females used in NP were reused and mated in CP and data were considered into CP. Data from a single mating from CP were not included because we failed in the correct recording.
20
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Figure Legends
Figure 1. Experimental terrarium containing a dish with water surrounded by pebbles, simulating riparian conditions.
Figure 2. Linear relationship between: (a) latency of female oviposition and total mating duration, and (b) between latency of oviposition and insertion duration. Latency is expressed as log-transformed days and mating and insertion durations as log-transformed minutes. Grey lines and squares indicate data from group NP and black ones those from group CP.
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Figure 1 2 3 4 5
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Figure 2
1,6 1,5 Latency of oviposition 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 -0,5 0 0,5 1 1,5 Mating duration Latency of oviposition
1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 Insertions duration 0,4 0,6
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SELECCIN SEXUAL Y CITOGENTICA EN ESPECIES DE ARAAS DONADORAS DE REGALOS NUPCIALES (TRECHALEIDAE Y PISAURIDAE)

Mara Jos Albo

Orientadora: Dra. Alicia Postiglioni

Co-Orientador: Prof. Fernando Costa

CAPTULO 5 - Agradecimientos 122 CAPTULO 6 Apndice I 125 CAPTULO 7 Apndice II 133

Captulo 1 Introduccin General

CAPITULO 1 - Introduccin General

Captulo 1 Introduccin General

Seleccin sexual y regalos nupciales

Captulo 1 Introduccin General

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comportamientos heredables de alta influencia ambiental con variabilidad en la distribucin de la heterocromatina.

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La distribucin de la heterocromatina durante la meiosis es diferente entre las

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Captulo 2 Estrategias Reproductoras

CAPITULO 2 - ESTRATEGIAS REPRODUCTORAS

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Figura 5. Posiciones copulatorias de a) Trechaleidae y b) Pisauridae. Fotos: M.J. Albo.

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comportamentales, morfolgicos y moleculares permitirn mejorar estas estimaciones de parentesco.

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Nmero de empaquetados de la presa

Duracin 1 empaquetado de la presa

Duracin total construccin del regalo

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Primer empaquetado (n=11)

Segundo empaquetado (n=11)

Tercer empaquetado (n=7)

Cuarto empaquetado (n=4)

Construccin del plato basal Cobertura con seda

Otros comportamientos del macho

Regalo (8) No Regalo (7)

0 Locomocin Lineal 6 Locomocin No-lineal Vibracin de patas I y II 6

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pero sin mostrar comportamiento sexual alguno. Se observaron

Captulo 2 Estrategias Reproductoras

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