Ensaios Toxicolgicos e de Inocuidade

Profas. Yraima Cordeiro e Ana Luisa P. de Miranda

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Bibliografia
CONTROLE BIOLGICO DE QUALIDADE DE PRODUTOS FARMACUTICOS, CORRELATOS E COSMTICOS - 3 EDIO - 2010 Kaneko, Telma Mary; Pinto, Terezinha de Jesus Andreoli; Pinto, Antonio Carlos F.

Ensaios Toxicolgicos e de Inocuidade

Toxicidade a capacidade de certas substncias causarem danos a seres vivos

Medidas de Toxicidade

Estimar o potencial de dano

SEGURANA

Funo da biodisponibilidade da substncia

Testes de Toxicidade
Avaliaes efetuadas nas formulaes em desenvolvimento. Candidatos potenciais aos testes: MP e produto acabado dos produtos de higiene pessoal, cosmticos, perfumes, frmacos e materiais de acondicionamento, alm de correlatos (implantveis ou no).
AGUDA SUB-CRNICA CRNICA

24 h

21 dias6 meses

LONGA DURAO
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Toxicidade Anormal - Inocuidade

Detectar eventuais elementos txicos, estranhos que possam estar presentes na amostra, ou seja, detectar impurezas txicas ou co-produtos. No avalia a toxicidade inerente ao frmaco. Material a ser testado:
MP fonte natural (processo de purificao) Produto acabado (verificar pureza do processo de produo) Material plstico de correlatos e de acondicionamento de parenterais

Produtos a serem avaliados

antimicrobianos, injetveis, oftlmicos, cosmticos, imunoterpicos, correlatos (equipos de infuso e transfuso)
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Avaliao da Toxicidade Aguda com Efeito Sistmico

Produtos aplicados diretamente sobre a pele, bem como aqueles ingeridos, podem ser absorvidos e distribudos via sistema circulatrio atravs de todo o corpo

Principais vias de absoro sistmica: ingesto oral, inalao de vapores ou ps, absoro percutnea Testes realizados:
Administrao oral Aplicao Drmica ou Percutnea Inalao
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Avaliao da Toxicidade Aguda com Efeito Sistmico

Objetivo: Conhecer a inocuidade do composto, e no caracterizar a substncia mediante a determinao da DL50 Teste limite (nica dose) - oficial Dose letal aproximada (doses gradativas em um nico animal, aumentadas at resultar em morte)

Dosagem

Concentrao maior Concentrao menor

Indicadores: Peso > ou < Mortalidade Condio clnica

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*ensaio LD50 oral banido pela OECD (diretiva 401) em 2001

Toxicidade Aguda com Efeito Local

Irritabilidade Cutnea Irritabilidade Ocular Sensibilidade Cutnea Fototoxicidade e Fotossensibilidade

Toxicidade Aguda com Efeito Local Ensaios de Irritabilidade

Os produtos cosmticos e de higiene corporal so destinados a melhorar o conforto, bem-estar e qualidade de vida dos usurios. Garantir ausncia de risco para o consumidor INOCUIDADE Avaliao do Risco condies de uso/reas de contato IRRITAO: agresso integridade de tegumentos ou mucosas traduzida por leses mais ou menos importantes da epiderme. Por definio, uma irritao no mediada por mecanismos imunolgicos. Reaes restritas rea de contato com o produto. SENSIBILIZAO: reao imunolgica, imediata ou tardia (hipersensibilidade)
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Toxicidade Aguda com Efeito Local Ensaios de Irritabilidade

MODIFICAES BIOQUMICAS E FISIOLGICAS INTERAO COM A PELE

PRODUTO

COSMTICOS

Aplicao tpica pele ou ocular Injeo intradrmica ou subcutnea Aplicao intravaginal e intranasal Aplicao na superfcie interna da cavidade oral
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MEDICAMENTOS CORRELATOS COSMTICOS

Toxicidade Aguda com Efeito Local Ensaios de Irritabilidade Cutnea

Friedenwald e cols. (1944); Draize e cols. (1944): Transformar observaes qualitativas de efeitos fisiolgicos em medidas objetivas quantitativas. Modificado por Kay e Calandra em 1962.

Draize, J.H., Woodard, G. & Calvery, H.O. (1944) Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J. Pharmacol. and 11 Exp. Therapeutics. 82, 377390.

Toxicidade Aguda com Efeito Local Ensaios de Irritabilidade Cutnea in vivo

1- Teste de Irritao Primria da pele (Mtodo de Draize) Patch test Pele tricotomizada de coelhos albinos, intacta e aps abraso N=6 rea: 6,0 cm2 Substncia teste: 0,5 mL ou 500 mg Coberto por 2 camadas de gaze Envolver regio com material impermevel Leituras: t=24h e 72h Atribuio de pontuao conforme tabela ERITEMA E EDEMA NDICE DE IRRITABILIDADE
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1/3 CONTROLE 2/4 - TESTE

Avaliao da Toxicidade Aguda com Efeito Local Irritao Primria Mtodo de Draize
Resposta da Pele Formao de Eritema e Escaras Sem eritema Eritema muito leve Eritema bem definido Eritema moderado a severo Severo eritema (vermelho beterraba) a formao de escara (injrias em profundidade) Formao de Edema Sem edema Edema muito leve (pouco perceptvel) Edema leve (bordas de rea bem definida, elevao definida) Edema moderado (Elevao de ~ 1mm) Edema severo (elevao > 1mm ao redor da rea exposta) Valor 0 1 2 3 4

0 1 2 3 4

(Er-Esc) p. int 24h, (Er-Esc) p. int 72h, (Er-Esc) p. abr 24h, (Er-Esc) p. abr 72h, (Ed) p. int 24h, (Ed) p. int 72h, (Ed) p. abr 24h, (Ed) p.abr 72h /8=ndice de Irritao ndice 0 0,04 a 0,99 1,00 a 1,99 2,00 a 2,99 3,00 a 5,99 6,00 a 8,00 Avaliao Sem irritao Pouco perceptvel Leve Branda Moderada Severa

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Comparao de diretrizes para teste de irritao drmica

Especificao dos pr-requisitos EEC (1984) Espcie recomendada Dose Nmero de animais Pele intacta Pele com abraso Tempo de exposio recomendado Perodo de observao Intervalo de tempo para observao Critrio de classificao definido Substncias excludas Coelho albino 0.5 mL ou 500 mg
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Requerimentos de vrias autoridades OECD (1981) US FDA (1980) Coelho albino 0.5 mL ou 0.5g 6 Sim Sim US EPA (1989) Coelho albino 0.5 mL ou 500 mg 6 Sim No especif. Japan MAFF (1985) Coelho albino 0.5mL ou 500mg 6 Sim No especif. 4h Min. 3, mx. 14 dias 0.5, 24, 28, 72h + No

Coelho albino 0.5 mL ou 500 mg 3 Sim No especif.

Sim No especif.

4h Min. 3, mx. 14 dias 0.5, 24, 28, 72h + Sim

4h Min. 3, mx. 14 dias 0.5, 24, 28, 72h + No

24h 3 dias

4h Min. 3, mx. 14 dias 0.5, 24, 28, 72h + No

0 e 48h

No

pH < 2 e > 11.5; subst. txicas

pH < 2 e > 11.5; subst. txicas

No especif.

pH < 2 e > 11.5; subst. txicas

pH < 2 e > 11.5;

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Toxicidade Aguda com Efeito Local Ensaios de Irritabilidade Cutnea Ensaios in vitro Corrositex
(barreira membrana colgena) InVitro international

Episkin (Imedex/LOral) EpiDerm (MatTek) SkinEthic

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Episkin

Episkin: IMEDEX e LOREAL In-Vitro Reconstructed Human Epithelium

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Epitlio humano reconstrudo

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http://www.rsc.org/chemistryworld/News/2007/July/24070701.asp

Clula de Franz

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Necessidade de harmonizar os ensaios

Fevereiro de 2008: diversas agncias americanas sugeriram um desvio de investigao primria in vivo para ensaios in vitro, e ensaios in vivo com organismos inferiores e avaliao in silico para avaliao de toxicidade.

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3Rs
Estatstica da EU: Avaliao toxicolgica regulatria: ~ 10% de todos os animais utilizados; Avaliao de vacinas: ~ 15%; Desenvolvimento e controle de qualidade de medicamentos: ~ 45%; Pesquisa bsica: ~ 30%.

<http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/reports_en.htm>.
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Irritabilidade ocular

FDA, 1933

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Toxicidade Aguda com Efeito Local Teste de Irritao Ocular

Metodologia Coelhos albinos n=6 Instila-se 0,1 mL ou 100 mg no saco conjuntival inferior de um olho de cada animal. As plpebras so fechadas e a seguir, liberadas (no lavar o olho); Leituras em t=1h, 24h (lavagem dos olhos com NaCl 0,9%), 48h, 72h aps instilao pode prosseguir at 7 dias.

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Toxicidade Aguda com Efeito Local Teste de Irritao Ocular

Parmetros avaliados
Eritema Espessura das plpebras e membrana nictante Edema Lacrimejamento Opacidade Danos Capilares Pannus (neovascularizao de crnea) Secreo

Atribuio de escores/pontuao para quantificao do resultado

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Toxicidade Aguda com Efeito Local Teste de Irritao Ocular

Resultado:
Reao positiva (+): qq nvel de ulcerao ou opacidade da crnea, inflamao da ris ou vasos sangneos levemente injetados ou se ocorrer quemose com everso parcial das plpebras; Teste positivo (+): 4 animais apresentam reao positiva; Teste negativo (-): apenas 1 animal exibe reao positiva; Se 2 ou 3 animais +, repetir o teste com mais 6 animais. Ser + se 6 (de 12) apresentarem reao positiva. Repetir se 1 ou 2 animais do 2 teste +. Positivo se qq animal apresentar reao +.
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Evoluo do ensaio
Atualmente: ensaio em 1 animal caso efeitos graves so esperados (irritante severo); se no se espera irritabilidade elevada, avaliar em 3 animais.

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Toxicidade Aguda com Efeito Local Teste de Irritao Ocular in vitro

Produtos: sabonetes, xampus, solues de limpeza, cremes e loes, delineadores, mscaras, desinfetantes, lquidos para enxage bucal, substncias qumicas, pesticidas, com potencial de contato acidental com os olhos.

Hen's Egg Test Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) para materiais no opacos

Ovos brancos Leghorn fertilizados de 10 dias. 6 grupos teste - 3 para avaliar diferentes [produto], 2 controles + e 1 grupo controle (veculo).

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Toxicidade Aguda com Efeito Local Teste de Irritao Ocular in vitro

BCOP: Bovine Cornea Opacity/Permeability Test Alternative Eye Irritation Model
Utiliza corneas bovinas; Ensaio limite que avalia:
Mudanas na transmisso de luz Permeabilidade fluorescena

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Normal

Opacidade: Inchao clulas epiteliais basais

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VALIDATION OF THE BOVINE CORNEAL OPACITY-PERMEABILITY ASSAY AS A PREDICTOR OF OCULAR IRRITATION POTENTIAL. In Vitro Toxicol 1994;7(3):283-90.

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Relao entre modelos in vitro e o tecido animal

O ideal obtermos dados relacionados vascularizao (Het-Cam), opacidade / permeabilizao (BCOP) e citotoxicidade (MTT, RBC).

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Ensaios in vitro

Para uma predio correta: Mimetizar a cintica de exposio, permitir que material teste seja utilizado na mesma forma fsica do que no ensaio em animais; Utilizao da mesma concentrao que no ensaio animal; Deve permanecer em contato com o material teste pelo mesmo perodo de tempo; A relao dos resultados in vitro devem claramente refletir respostas esperadas in vivo. 33

Ensaios in vitro

In vivo (Draize) EU: sistema de classificao reduzido: R36 (irritante para os olhos), e R41 (risco de dano ocular srio).
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rvore de decises - Irritao ocular

No experimental - Dados histricos - Informao fsico-qumica (pH, estrutura) Evidncia + Possvel irritante

Evidncias insuficientes Sugesto de resultado negativo

Ensaios in vitro

Resultado + Possvel irritante

citotoxicidade opacidade inflamao

Sem resposta acima do limiar

Ensaios progressivos em animais - nico animal -Anestesia -volume

Resultado + verdadeiro irritante

verdadeiro negativo

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Toxicidade Aguda com Efeito Local Fototoxicidade

Irritao no imunolgica associada luz (visvel ou UV) que pode ocorrer na pele exposta luz, juntamente com um produto qumico fotoativado em quantidade adequada.

Fototoxicidade Fotossensibilidade Dano celular provocado por ftons Toxicidade local/sistmica devido aplicao do produto em condies de irradiao Fotoalergia Sensibilizao alrgica devido aplicao do produto em condies de irradiao. Aplicao tpica ou sistmica

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Fotoativao
Reao Tipo I ou Tipo II Aes fotodinmicas envolvendo oxignio molecular. Tipo I: no h gerao de oxignio singlete excitado; transferncia de e- leva a gerao de espcies reativas. Interao destas espcies com O2 leva a gerao de espcies reativas de oxignio (superxido). Tipo II: gerao direta de oxignio singlete excitado a partir da transferncia de e do cromforo no estado excitado. Possibilidade de avaliao em ensaios in vitro.
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Toxicidade Aguda com Efeito Local Fototoxicidade

Diferenas entre fototoxicidade e fotoalergia
Caractersticas Ocorre aps 1 exposio Tempo de latncia aps 1 exposio Resposta observada Fototoxicidade SIM NO Similar queimadura solar Alta Fotoalergia NO SIM Varivel, incluindo eritema, edema, formao de vesculas Baixa

Quantidade do fotossensibilizador

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Psoralenos

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Psoralenos

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Psoralenos x DNA

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Produtos da indstria qumica que no geral causam reaes de fotossensibilizao:

Corantes, hidrocarbonetos aromticos policclicos, antimicrobianos. Exemplos de fotoalergenos em humanos: prometazina, benzocana, e cido paminobenzico; Composto fotoativado pode ser o frmaco em si, ou um excipiente do produto farmacutico, ou ainda um metablito, impureza ou produto de degradao. Importncia da avaliao do produto acabado. Fotoirritao/ Fototoxicidade: ambas respostas no imunolgicas um composto fotoativado. Fotoirritao: observada aps exposio tpica. Fototoxicidade: aps exposio sistmica.
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Quando realizar o ensaio

Estudos distribuio: encontrado em [significativa] na pele e/ou olhos? Composto absorve luz UVA ou UVB? Aplicao tpica? Possibilidade de exposio ao sol?

UVA 320 a 400 nm UVB 320 a 280 nm

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Toxicidade Aguda com Efeito Local Fototoxicidade

Parmetro mais utilizado: irritao primria da pele em coelhos albinos, camundongos e cobaias; Aps 1 investigao, avaliar no HOMEM; Fatores que podem influenciar: concentrao, durao da exposio da substncia luz, escolha do veculo.
O veculo pode alterar a penetrao percutnea da substncia teste

Mtodos com injeo intradrmica da substncia; Desvantagens: cuidado ao extrapolar via real de uso; possvel que alguns materiais no fototxicos possam ser convertidos a materiais txicos por metabolizao de determinados indivduos.
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Consideraes gerais para avaliao

Para a maioria dos frmacos, avaliar a substncia sem os excipientes; Para produtos de aplicao tpica: produto acabado e no somente o princpio ativo deve ser avaliado; Veculos aplicados topicamente podem alterar as propriedades pticas da pele humana, como: Veculos farmacuticos (e.g., cremes, gis, loes ou solues) podem reduzir a quantidade de luz refletida, espalhada ou absorvida pela pele ou aumentar a absoro percutnea do composto. Veculos podem aumentar ou reduzir as foto-propriedades adversas ou foto estabilidade de determinado composto. Podem aumentar os efeitos de outros componentes da formulao e ainda influenciar a solubilidade e estabilidade geral do princpio ativo.
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Espcies utilizadas e condies empregadas

Rato, camundongo, porco da ndia, coelho; Controle positivo: 8-MOP, 0,005% em 95% (w/w) EtOH. Aplicao 0,025 mL/cm2 Intervalo entre aplicao e irradiao:30 a 50min (dependendo da taxa de absoro do composto) Observao clnica e pontuao: (4h), 24 a 48h aps irradiao.

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Toxicidade Aguda com Efeito Local Fototoxicidade e Fotossensibilidade Cutnea

UVA (320 400 nm) - 116 min Escuro Escuro Luz Luz Controle + metoxipsoraleno (1/2) Leituras: 24h, 48h, 72h, 96h, SINAIS: Edema e Eritema Peso: 96h

Ensaio in vivo
Pontuao: Draize.

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Ensaio de Fototoxicidade: in vitro e in vivo

Escuro

Claro
controle (+) 100 g S. Teste controle (+) 100 g S. Teste

Observao de eritema e edema

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In vitro
Saccharomyces cereviseae Halo de inibio do crescimento da levedura
Animal 1 escuro
5 mg

Animal 2 claro
5 mg

8-metoxipsoraleno 0,5 mg

2 mg 8-metoxipsoraleno 0,5 mg

2 mg

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Avaliao do potencial fototxico

Metodologia (3T3 NRU): Linhagem de fibroblasto de camundongo. Resposta txica aps primeira exposio da clula a agentes qumicos, e posterior exposio irradiao. A citotoxicidade expressa na determinao da dose dependente que reduz o crescimento celular utilizando-se um corante vital, vermelho neutro. 1 teste para toxicidade in vitro experimentalmente validado (1998) para fins regulatrios. Teste aceito e publicado em 2000 para avaliao de fototoxicidade (3T3 NRU PT) no anexo V da Diretiva 67/548 da EEC.

Fotoalergia: carece de ensaios in vitro, avaliao clnica.

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