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PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE La purificazione consiste nel separare la proteina target dalle igliaia di proteine nor al ente presenti

nell!ospiti" Il li#ello di purificazione ric$iesto dipende dall!uso c$e si de#e fare della proteina stessa" Strategie per purificazione di proteine %copo& ottenere la proteina pura e atti#a in odo #eloce ed efficiente& ' Ridurre il nu ero di step ' Protocolli standardizzati ' Co pati(ili con il anteni ento della funzionalit) proteica e con le applicazioni successi#e* saggio enzi atico+ cristallizzazione+etc", Uso di Affinity tags In olti casi l!introduzione di tag specifici+ costituiti da se-uenze presenti solo nella proteina di interesse+ e capaci di legare in aniera seletti#a ligandi specifici+ per ette la separazione delle proteine contenenti affinit. tags per cromatografia di affinit su colonna+ in cui i ligandi #engono legati alla resina utilizzata co e fase stazionaria" In -uesto caso la purificazione risulta olto rapida ed efficace" Ese pi di tag con i rispetti#i ligandi sono&

/ 0%T ' 0 / 12P ' 1altosio / (iotina ' A#idina / Poli'3is ' Nic$el+ Zinco / Proteina A 4 Anticorpi / Flag 4 %e-uenza D56DDDD6 *peptide leader del gene 78 del fago la (da, / 3A 4 5P5D9PD5A *E oagglutinina dell!influenza, / 1.c 4 E:6LI%EEDL *Proteina c' .c u ana, Purificazione della proteina ;taggata< ediante Cro atografia di affinit) = Un ligando ad alta affinit) per la proteina > legato alla atrice = La proteina di interesse si lega al ligando e #iene i o(ilizzata sulla colonna = Le altre proteine #engono ;la#ate< #ia" = La proteina di interesse #iene eluita usando una soluzione di ligando" Le proteine rico (inanti #engono spesso espresse co e proteine di fusione in #ettori specifici" Il #ettore possiede un sito di inserzione della se-uenza codificante ;in FRA1E< con la traduzione se-uenza c$e codifica per una proteina o un fra ento di proteina all!N o al C ter inale della proteina da purificare"

:uesto TA0 o FLA0 > una ;etic$etta< o ;(andierina< di riconosci ento c$e pu? essere seletti#a ente legata ad anticorpi+ ligandi o recettori specifici per cro atografia di affinit)" Il fra ento FLA0 #iene poi ri osso per azione di una proteasi specifica+ il cui sito di riconosci ento #iene anc$!esso progettato sul #ettore in odo da risultare nella posizione adatta ad ottenere la proteina di interesse nella for a integra e nati#a" Tag ideale = Consentire alla proteina rico (inante di legarsi alla colonna con ele#ata affinit) e specificit) = Tale lega e do#re((e essere re#ersi(ile in condizioni non troppo drastic$e *e#itare denaturazione durante eluizione, = Non do#re((e interferire con la nor ale funzione della proteina rico (inante" Il tag di Istidina Il tag di istidina > co posto da sei residui di istidina consecuti#i c$e possono essere posti sia all!C'ter inale c$e all! N'ter inale" Per la purificazione della proteina contenente il tag di istidine si effettua una cro atografia e la fase stazionaria > rappresentata da una resina do#e la coda di polistidina aggiunta alla proteina+ per ette la sua separazione dalle altre co ponenti attra#erso una procedura di affinit)" 0li ioni presenti in soluzione *Nic$el Ni@@,+ for ano dei lega i di coordinazione con gli anelli i idazolici delle istidine della proteina rico (inante e con i residui della atrice+una #olta effettuata la separazione+ la proteina #iene eluita con una soluzione contenente ele#ate concentrazioni di i idazolo *da A8 1 a AB8 1,+ il -uale co peter) con la proteina per il lega e con la atrice" L!eluizione pu? essere fatta anc$e con P3 acido o EDTA" %i utilizza co e #ettore do#e inserire il nostro fra ento il siste a di #ettori pET" Il tag GST Il 0%T *0lutation'%'Transferasi, lega con alta affinit) il 0lutatione+c$e ricordia o +> un tripeptide co posto da acido gluta ico+cisteina e glicina" Per purificare la proteina di interesse si fa una cro atografia di affinit) su colonna sfruttando appunto il lega e del tag 0%T al glutatione *sefarosio C2," La fase solida -uindi consiste nel glutatione i o(ilizzato su (iglie di sefarosio" :uando si introduce nella colonna la proteina di fusione col il 0%T'tag succede c$e -uest!ulti a si lega alla fase solida" Le fasi sono & ' carica ento del ca pione ' la#aggio per ri uo#ere i conta inanti ' eluizione specifica della proteina di fusione con glutatione li(ero "

%uccede c$e il glutatione li(ero in eccesso co pete con il glutatione coniugato alla atrice e pertanto spiazza la proteina legata c$e si ritro#a nella fase o(ile e #iene raccolta nell!eluato" %i possono aggiungere se-uenze per proteasi& Fattore Da+ Enteroc$inasi+ Tro (ina+ TE9 etc"

9ettore p0ED Il #ettore p0ED > un #ettore co erciale c$e consente di produrre una proteina di fusione al C'ter inale *E!, della 0%T *glutatione'%'transferasi," %u(ito dopo la 0%T c!> il sito ultiplo di clonaggio *1%C, do#e #iene inserito il cDNA della proteina codificante" Un sito di taglio per proteasi facilita il recupero della proteina"

Fusione con MBP (Maltosebinding-protein ' alE di E. coli& 1altose'(inding protein *12P, ' C8 FDa ' for a co plesso sta(ile con altosio ' si utilizza colonna di a ido *a ilosio con lega i crociati, ' si eluisce con altosio 78 1 ' si pu? tagliare con proteasi e ripassare su colonna
Per produrre un proteina di fusione e poterla isolare si operano i seguenti passaggi& ' in presenza di un pro otore forte clono in un plas ide il cDNA di un TA0 *o##ero una se-uenza etic$etta+ nel tuo caso il 12P di p1AI, e il cDNA della proteina di interesse *c$ia ia ola D," In -uesto odo -uando si atti#a la trascrizione si crea un RNA unico c$e codifica per la proteina rico (inante" La proteina rico (inante presenter) un do inio di lega e al altosio allGN' ter inale e la proteina di interesse al C'ter inale *12P'D, ' liso le cellule ed eluisco una colonna cro atografica c$a $a co e fase stazionaria il altosio" In -uesto odo la proteina di fusione resta legata *dato c$e $a il 12P di p1AI allGN'ter inale, e posso isolarla"

Siste!a TAP "Tande! Affinity Purification# Utile per la purificazione di co plessi proteici" Tale tecnica per ette di purificare un co plesso proteico ediante due cro atografie di affinit) se-uenziali+ ed in -uesto odo si riduce considere#ol ente il li#ello di interattori aspecifici e conte poranea ente si incre enta la #eridicit) del risultato" PiH specifica ente la Tandem Affinity Purification *TAP, si (asa sulla possi(ilit) di purificare una proteina due #olte consecuti#e *cio> in tandem, e+ in (ase alle condizioni saline+ di purificare conte poranea ente con la proteina d!interesse anc$e i suoi e#entuali interattori" Entrando nello specifico+ il TAP > un epitopo costituito in se-uenza da& il do inio peptidico della proteina A riconosciuto aspecifica ente dalle i unoglo(uline *PAP,+ il sito di taglio della Tobacco Etch Virus *TE9,+ il do inio di lega e alla Cal odulina *C(D, *Figura 7I," Il PAP ser#e per i unoprecipitarte la proteina di fusione con una resina di agarosio legata alle Ig0" %uccessi#a ente+ la resina #iene la#ata e la proteina di fusione eluita ediante un taglio enzi atico sito'specifico da parte di una proteasi #irale *TE9, assente in cellule eucariotic$e" In -uesto passaggio > racc$iusa l!essenza del siste a TAP+ ossia il #antaggio di poter eluire una proteina di fusione dalla resina in condizioni nati#e" Per e#itare conta inazioni del ca pione+ nel TAP > stato inserito un ulteriore passaggio di purificazione grazie al do inio C(D" Il #antaggio dell!utilizzo del C(D consiste nel fatto c$e l!efficienza di lega e di tale do inio > sensi(ile alla concentrazione di calcio" Infatti+ il C(D si lega ad una resina legata a Cal odulina solo in presenza di ioni calcio" Per cui+ per eluire la proteina di fusione dalla resina' Cal odulina (asta utilizzare un c$elante del calcio co e+ ad ese pio l!E0TA" MA$IP%&A'I%$( P)%T(I*A Ingegneria proteica Continua su Lezione J *ulti e pagine,