Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
Cocii se aaz: n grmezi sau asemntor unei ciorchini de struguri ca, de exemplu, germenii din genul Staphylococcus; n tetrade la genul Micrococcus; n baloturi de cte 8 coci orientai n cele 3 direcii ale spaiului la genul Sarcina; n lanuri la genul Streptococcus; n diplo, ca dou flcri de lumnare care se unesc prin bazele lor, la specia Streptococcus pneumoniae; n diplo, ca dou boabe de cafea care se privesc fa n fa prin concavitile lor ca, de pild, la Neisseria gonorrhoeae (gonococ) i Neisseria meningitidis (meningococ); izolai, care nu sunt de interes medical. Bacilii se aaz: cel mai adesea izolai i n poziii ntmpltoare unul fa de cellalt ca, de exemplu, majoritatea bacililor gram-negativi; grupai cte doi (diplobacili) sau n lanuri scurte ca, de exemplu, genul Klebsiella; dispui n lanuri ca bacilii din genul Bacillus (bacilul crbunos); dispui n mod caracteristic sub forma unor majuscule sau litere chinezeti cum sunt bacilii difterici (Corynebacterium diphteriae); n palisad, ca scndurile unui gard (bacilii difterimorfi).
3.Enumerati componentele constante si facultative ale celulei bacteriene Nucleu bacterian este un nucleoid sau echivalent nuclear, cu o struct primitiva in comparative
cu nucleul celulelor eucariote si reprezinta 2% din greutatea uscata a bacteriei.
Citoplasma system coloidal, alcatuit din 80% apa , in care se gaseste o cantiate mare de molecule organice, ioni anorgnici, enzyme, ARN, vacuole si incluzii. Mezozomii struc membranare care se form prin invaginarea membrane citoplasmatice sub forma de buzunar sau in deget de manusa, prezente la bacteriile gram + si ocazional la cele gram -. Peretele cellular comp celulara obligatorie care inconjoara mb citoplasmatica; struct rigida,specifica bacteriilor. Capsula invelis compact, intim legat de celula bacteriana, cu o latime de cel putin 0.2um. Cili sau flagelii bacterieni apendici filamentosi ai speciilor bacteriene mobile, cu originea in citoplasma bacteriana; servesc ca organe de locomotie. Pili bacterieni apendici filamentosi,rigizi,mai scurti decat flagelii, in numar mare si cu dispozitie in general peritricha; in general la bacteriile gram -. Sporii forme primitive de diferentiere celulara, cu rezistenta crescuta la factorii de mediu si care apar endocelular in conditii nefavorabile de viata.
gram negative conine acid diaminopimelic. La bacteriile gram - pozitive dou tetrapeptide de pe 2 lanuri paralele nvecinate sunt legate printr-un pentapeptid. La bacteriile gram - negative, tetrapeptidele se leag ntre ele printr-o simpl legtur peptidic. Menionm c acidul diaminopimelic i acidul N-acetil-muramic sunt componente care nu au fost gsite n natur dect la bacterii. Structura stratului structurilor speciale. Deosebim 3 tipuri de structuri speciale: gram-pozitiv, gram-negativ i acido-alcoolorezistent. La bacteriile gram - pozitive, peptidoglicanul reprezint 50-90% din greutatea uscat a peretelui celular, are o grosime de 15-30 nm i conine pn la 200 de lanuri paralele de murein. Stratul structurilor speciale este redus i alctuit din polimeri hidrosolubili care sunt acizii theicoici: acidul ribitoltheicoic i gliceroltheicoic. Acetia pot ptrunde pn la membrana citoplasmatic legndu-se covalent de aceast - acizii theicoici de membran sau numai pn la perete - acizi theicoici de perete. Ei reprezint antigenele de supafa ale bacteriilor gram-pozitive. Peretele celular al bacteriilor gram-pozitive este sensibil la aciunea lizozimului care rupe legturile dintre acidul N-acetil muramic i N-acetilglucozamin i a penicilinei care nhib sinteza peptidoglicanului. La bacteriile gram-negative, peptidoglicanul are o grosime de 4-5nm, reprezentnd numai 10% din greutatea uscat a bacteriei. Stratul superficial este ns mult mai complex dect la bacteriile gram pozitive fiind alctuit dintr-o membran extern, lipoproteine i lipopolizaharidul de perete. Membrana extern este format dintr-un strat dublu fosfolipoproteic ce cuprinde o cantitate foarte mare de molecule proteice. Aceste proteine, bine definite la majoritatea speciilor bacteriene, sunt denumite Omp (outer membrane proteins) sau Momp ( major outer membrane proteins). Membrana extern se leag de protoplast prin intermediul unei lipoproteine i a proteinei OmpA din membrana extern. Proteinele nespecifice ale membranei externe cu funcie de porine, cum sunt trimerii OmpF i OmpC, delimiteaz nite canale umplute cu ap prin intermediul crora pot difuza n spaiul periplasmic substane hidrosolubile. Proteinele specifice au funcii de transport pentru anumite substane, unele dintre ele fiind i receptori pentru bacteriofagi. Proteinele de suprafa pot avea la unele bacterii rol n patogenitate, ca de exemplu cele 7 proteine de suprafa al shigellelor care le asigur invazivitatea. Deasupra membranei externe a bacililor gram-negativi se afl lipopolizaharidul de perete (LPZ) sau endotoxina bacililor gram-negativi. LPZ este o toxin termolabil, care se elibereaz n mediul nconjurtor de ctre bacteriile gram-negative numai dup liza lor i foarte reactiv n organismul gazd. Astfel, lipidul A produce febr, activeaz mecanismele aprrii antiinfecioase i n exces produce ocul endotoxic cu evoluie grav, chiar fatal. Spaiul periplasmic. Sistemul structural dublu al peretelui celular la bacteriile gram-negative creeaz un compartiment ce se ntinde de la membrana celular pn la membrana extern, numit spaiu periplasmic. El conine peptidoglicanul i un gel care favorizeaz nutriia bacteriei prin coninutul n enzime degradative ca, de pild, fosfataze, nucleaze, proteaze etc. Tot aici sunt prezente enzimele de inactivare ale unor antibiotice cum sunt beta-lactamazele i cefalosporinazele.
stocheaz unele enzime n spaiul periplasmic la bacteriile gram-negative ce vor fi eliberate dup necesiti, spre deosebire de bacteriile gram-pozitive care i elimin enzimele direct n mediul extern; prezint receptori pentru bacteriofagi; este sediul antigenelor de suprafa, fiind deci implicat n rspunsul imun al macroorganismului; este sediul unor factori de patogenitate; are rol n diviziunea bacterian i n procesul de sporulare.
este o membran cu permeabilitate selectiv, ndeplinind funcia de barier osmotic ce regleaz schimburile celulei bacteriene, n ambele sensuri cu mediul nconjurtor. Permeabilitatea selectiv a membranei citoplasmatice permite realizarea n interiorul celulei, pentru unele substane, concentraii de 105 ori mai mari dect n afara celulei, secret numeroase enzime hidrolitice ce se elibereaz n mediul nconjurtor unde scindeaz substratul nutritiv n uniti absorbabile, unele proteine legate de membrana citoplasmatic joac rolul de chemoreceptori, ndeplinete rolul mitocondriilor de la celulele eucariote, fiind sediul enzimelor lanului respirator i al fosforilrii oxidative, deci centrul energogenezei celulare, este sediul sintezei acizilor grai, a fosfolipidelor, este implicat n sinteza peretelui celular, al polizaharidelor capsulare, participnd activ la creterea i diviziunea celulei bacteriene, la formarea sporului bacterian, constituie o posibil int pentru aciunea unor chimioterapice ca, de pild, polimixinele.
suprahelicat n jurul unui miez de ARN, dispoziie necesar funcionalitii materialului nuclear. n mod obinuit, nucleoidul este situat n centrul celulei bacteriene i poate fi legat de membrana citoplasmatic prin intermediul mezozomilor. Funcia nucleului bacterian const n depozitarea informaiei genetice necesar autoreplicrii, organizrii structurale i funcionale a celulei bacteriene, deci a caracterelor ce definesc specia. n afar de ADN cromozomial, la unele bacterii sunt prezente molecule circulare mici, extracromozomiale de ADN care se numesc plasmide i care se replic independent de cromozomul bacterian. Vom reveni asupra lor n capitolul de genetic bacterian.
Pe baza complexitii lor, elementele care ndeplinesc aceast condiie se pot grupa n trei categorii: - secvene de inserie (IS); - transpozoni (Tn); - bacteriofagi. Secvenele de inserie nu conin nici o gen i nu au nici o alt funcie (cunoscut) n afar de cea de inserie. Sunt cele mai simple elemente transpozabile. Dup inseria lor pot aprea modificri n expresia unor gene sau modificri n rata incidenei deleiilor n regiunile adiacente situsului lor de inserie. Transpozonii difer de secvenele de inserie prin complexitate i prin faptul c poart gene care confer bacteriilor funcii noi, detectabile, de exemplu: - rezistena la antibiotice; - capacitatea de sintez a unor enzime; - producerea de enterotoxine; - sinteza antigenelor bacteriene de suprafa (de exemplu K 88 la E. coli); - sinteza unor factori de colonizare intestinal etc. Spre exemplu bacteriofagul Mu (numele rezult prin prescurtarea mutator, pentru c a fost identificat ca factor mutagen la tulpini de E. coli) are un genom de 30kb i o structur linear. Dup infectarea celulei bacteriene, bacteriofagul Mu se inser n cromozom la ntmplare i ul terior n diferite poziii ale cromozomului bacterian apar copii ale acidului nucleic Mu. Atunci cnd structura genetic Mu va prsi genomul bacterian va prelua o parte din structura genetic bacterian (circa 100-150 pb).
Succesiunea specific a nucleotidelor este transpus ntr-o secven specific de aminoacizi care intr n constituia lanului polipeptidic din proteina n curs de formare.
Mobilitatea i direcia micrii cililor pot fi influenate de concentraia unor substane din mediu (chimiotactism pozitiv sau negativ) i de temperatur. Ei sunt sediul antigenelor flagelare (H), importante n identificarea bacteriilor. Cilii bacterieni nu se observ dect pe preparate colorate special. n practica de rutin nu se evideniaz flagelii, ci mobilitatea bacteriilor, fie prin examinarea lor pe un preparat nativ ntre lam i lamel n care se urmresc micrile bacteriilor, fie prin nsmnarea tulpinii pe un mediu semisolid prin neparea n profunzime a mediului. Dac bacteria crete nu numai pe traseul nsmnrii i difuzeaz n mediu, ea este mobil.
coloraii speciale, la cald, care permeabilizeaz nveliurile sporale pentru colorani (coloraia Mller). Pe preparatele native ntre lam i lamel efectuate din culturi, sporii apar ca nite formaiuni rotunde, refringente. Ultrastructura i compoziia chimic a sporilor asigur acestora o mare rezisten la agenii fizici i chimici, ceea ce face ca ei s fie considerai forme de rezistena ale bacteriilor. De importan deosebit pentru medicin este rezistena sporilor la cldur, de care trebuie s se in cont la sterilizare.
echipamentul enzimatic superoxiddismutaza si catalaza, fie ca enzimele exista n mediul de cultura. Astfel, bacteriile din genul Streptococcus sunt lipsite de catalaza, dar pot fi cultivate n conditii de aerobioza pe medii cu snge, care suplineste catalaza. bacterii microaerofile folosesc respiratia si fermentatia, dar necesita o concentratie mai mare de bioxid de carbon dect cea din atmosfera pentru reactii de carboxilare. Astfel, unele specii, ca cele din genurile Neisseria, Brucella, Campylobacter, necesita concentratii de bioxid de carbon de 6-10%.
operaia de introducere a unei cantitai de germeni ntr-un mediu de cultur artificial, n timp ce pentru culturile celulare, ou embrionate i mai ales animale de experien folosim termenul inoculare. Cultivarea se realizeaz prin nsmnarea bacteriilor pe medii de cultur. Mediile solide sau lichide care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice necesare creterii i multiplicrii bacteriene se numesc medii de cultur. Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea ntr-un mediu de cultur poart numele de cultur bacterian.
26.Ce este o colonie bacterian ? Cum se pot obine colonii bacteriene izolate ?
Pe medii solide, germenii nsmnai n suprafa produc colonii. Colonia este totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie este o clon bacterian. Coloniile izolate se pot obine de exemplu prin tehnica nsmnrii prin dispersie (cu ansa bacteriologic sau cu tamponul). Dup prelevarea cu ansa a unei poriuni din produsul patologic,
inoculul este dispersat pe latura unui viitor poligon; se resterilizeaz ansa; se verific temperatura, prin atingerea mediului ntr-o zon nensmnat, ct mai periferic; cu ansa steril se traseaz a doua latur a poligonului; se resterizeaz ansa i se repet procedeul descris pn la realizarea a 4-5 laturi, fr a atinge prima latur. n acest mod, pe ultimele laturi ale poligonului se vor putea observa dup trecerea timpului necesar multiplicrii bacteriene, colonii izolate, bine individualizate.
28.Aspectele culturilor bacteriene pe medii solide; corelaii ntre acestea i patogenitate; exemple
Introducerea mediilor de cultura solide a nsemnat un progres urias n tehnicile de diagnostic, deoarece permite dezvoltarea distincta a microbilor, sub forma de colonii izolate. O colonie bacteriana este o micropopulatie ce rezulta din nmultirea unui singur microb pe un mediu, vizibila n general cu ochiul liber. Cel mai simplu mediu solid este geloza simpla, ce se obtine prin adaugarea la bulion a unei substanta gelificabile, care de regula este geloza, un polizaharid obtinut din alga marina agar-agar. La aceast mediu simplu se pot adauga diferite ingrediente (snge de oaie, ser, ascita, extract de drojdie etc.) pentru a putea cultiva bacteriile pretentioase. Caracterele culturale sunt foarte importante n identificarea microbilor. Ele se apreciaza fie cu ochiul liber, fie cu ajutorul unei lupe. Elementele ce se descriu, n general, sunt dimensiunea, forma, pigmentul, consistenta, aderenta la mediu, activitatea hemolitica si unele modificari pe care microorganismele le produc n mediul respectiv.
Coloniile cu aspect neted, cu marginile regulate si care se suspenda omogen n ser fiziologic se numesc colonii de tip S (smooth), pe cnd coloniile aceleiasi specii, cu suprafata rugoasa, relief si margini neregulate si care aglutineaza sponatan n ser fiziologic - colonii de tip R (rough). n general, cu unele exceptii, coloniile S apartin tupinilor virulente, pe cnd cele R sunt nevirulente. Cultivarea microbilor pe medii solide permite, de asemenea, numaratoarea de germeni ntr-un anumit produs. Acest aspect este deosebit de important deoarece n multe infectii criteriul de implicare etiologic este numarul bacteriilor n produsul de examinat (infectii urinare).
29. Aspectele culturilor bacteriene pe medii lichide; corelaii ntre acestea i patogenitate; exemple
Mediile lichide se folosesc cel mai adesea pentru nmultirea unor microbi care se gasesc n numar mic ntr-un anumit produs. Cel mai simplu mediu folosit n laboratorul de bacteriologie este bulionul care se prepara din decoct de carne de vaca, peptona si clorura de sodiu. Cultivarea unui produs pe medii lichide are dezavantajul ca nu permite nsa obtinerea unei culturi pure. Caracterele culturale ale microbilor pe medii lichide difera. Astfel, bacteriile apartinnd familiei Enterobacteriaceae tulbura uniform mediul, altele, ca de pilda bacteriile strict aerobe (Pseudomonas, Nocardia) formeaza pelicule la suprafata mediului. Altele formeaza agregate care se dezvolta sub forma de grunji ce se depun pe peretele eprubetei sau la fundul mediului (Streptococcus). Unele bacterii secreta n mediu pigmenti difuzibili ca de exemplu bacilul piocianic (Ps.aeruginosa).
iradierea cu raze UV sau raze ionizante; sterilizarea chimica, metoda evitata n general deoarece doar ctiva dezinfectanti, foarte toxici si iritanti (ca de exemplu, formaldehida, oxidul de etilen etc.) folositi n conditii riguros controlate, sunt capabili sa omoare toate formele de viata inclusiv sporii, fara a deteriora obiectele de sterilizat. Trebuie specificat, nsa, ca sterilizarea nu este identica cu distrugerea fizica a bacteriei, cu toate ca cele doua notiuni se folosesc des una n locul celeilalte. Acest aspect este foarte important, deoarece solutiile perfuzabile, care sunt sterile dar contin bacterii omorte, a caror produsi de degradare au efecte pirogene, dau reactii toxice a caror gravitate merge pna la socul endotoxinic. Deci, apa si lichidele care vor servi la prepararea solutiilor injectabile sau perfuzabile trebuie sa fie nu numai sterile, dar sa aiba un grad pronuntat de puritate. Dezinfectia se refera n general la distrugerea tintita a potentialului infectios n scopul de a mpiedica raspndirea microbilor dintr-un anumit focar de infectie, rezultatul nefiind ntotdeauna omorrea tuturor formelor microbiene, mai ales a endosporilor. Dezinfectantele sunt substante puternic bactericide, cel mai des toxice pentru organismul uman. Dezinfectia se aplica acolo unde sterilizarea nu se poate efectua: mobilier, asternuturi de pat, bazine de not, ncaperi etc. Metodele de dezinfectie sunt: dezinfectia prin caldura umeda si consta in fierbere si pasteurizare dezinfectia chimica. Principalele clase de substante dezinfectantate sunt: a) halogenii si compusii halogenati (Cl2, NaOCl2, I2, iodoform, CH3, cloramine); b) compusi oxidanti (apa oxigenata H2O2 solutie 3%, peroxidul de sodiu, Na2O2 folosit si la mastile de gaz pentru retinerea CO2, KMnO4, solutie 102-105) c) compusii borului acid boric, H3BO3, solutie 3% si tetraboratul disodic, solutie 5 % mai bine tolerat de mucoase); d) compusii organo-metalici (fenosept, solutie 2103 argint coloidal, AgNO3, solutie 102-105 ) e) alcoolii si derivatii (alcoolul etilic,C2H5OH,1 g/2m3 aer la umidatate maxima 20-30% si esteri) f) aldehide (formaldehida CH2, solutie 40% si polimarizata: paraformaldehida HO-(CH2-O)n-H, cu n=10-50 si trioximetilen, trimerul ciclic, conditionat in comprimate a 1,1 g); g) fenoli si derivati (tricrezolul amestec de orto, meta si paracrezol, rezorcina, in unguente si eugenolul, in stomatologie si esteri) i) detergent.
antimicrobian a antisepticelor i dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc+, detergenii *anionici (spunuri, perlan etc), cationici (sruri cuaternare de amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu propilenglicolul)]. e). Substane care altereaz acizii nucleici: coloranii bazici (violet de genian, albastru de metilen, fucsin bazic etc), derivaii de acridin, de exemplu rivanolul. Dintre exemplele prezentate mai sus,alcoolul etilic de 70, diferii derivai halogenai, hipermanganatul de potasiu 1, peroxidul de hidrogen, rivanolul, sunt exemple de substane antiseptice. Dorim s menionm i s subliniem c att n cazul antisepticelor ct i n cazul dezinfectantelor este important ca substana utilizat s aib concentraia corespunztoare, s fie aplicat pentru o durat de timp corespunztoare, s se afle n termenul de garanie. Aceeai substan chimic (de ex. cloramina) poate intra n categoria antisepticelor sau n categoria dezinfectantelor, n funcie de concentraie (concentraia este mai mare n al doilea caz).
concentratie mare, proteine, gelatina etc. Formele vegetative sunt distruse n prima zi, iar sporii se transforma n forme vegetative ce vor fi distruse zilele urmatoare. Reamintim, nsa, ca sporii bacteriilor termofile nu se distrug prin aceasta metoda. autoclavarea este metoda folosita pentru instrumentarul de chirurgie iar n laboratoarele de microbiologie pentru sterilizarea mediilor de cultura si a materialului infectios. Sterilizarea are loc ntr-o atmosfera saturata de vapori de apa la 121C, la o presiune de 1 atm, timp de 20-30 de minute, n aparate speciale numite autoclave sau la 134C, la o presiune de 2 atm. 10-15 minute.
37. Congelarea i liofilizarea bacteriilor definiie, efecte asupra viabilitii germenilor, aplicaii
Temperaturile joase (n jur de 0-4C) au n general un efect bacteriostatic. La temperaturi sczute, reaciile biochimice ncetinesc, multiplicarea poate fi stopat. Majoritatea produselor biologice/patologice pot fi transportate (meninnd viabilitatea germenilor i ncetinind n acelai timp multiplicarea acestora) la o temperatur de circa 4C. O serie de culturi pot fi de asemenea meninute la temperatura frigiderului pentru o durat limitat de timp n vederea prezervrii i posibilitii de a repeta anumite teste de identificare etc. n funcie de viteza cu care are loc rcirea, ntlnim situaii diferite, cu urmtoarele posibile efecte asupra structurilor celulare bacteriene. a). Congelarea lent, la temperaturi mai mici -21,3C are efecte bactericide prin formarea de cristale de ghea i prin hiperconcentrarea salin cu denaturarea proteinelor; b). Congelarea brusc la -70C are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea n mas a apei fr apariia cristalelor de ghea; c). Liofilizarea (criodesicarea) reprezint congelarea brusc concomitent cu desicaia (deshidratarea n vid). O suspensie microbian n mediu protector, liofilizat, poate fi pstrat n fiole nchise timp ndelungat (de exemplu vaccinul BCG).
(coad). Capul este alctuit dintr-un nveli proteic caracteristic virusurilor (capsida) i adpostete ADN. Coada este un cilindru rigid nvelit ntr-un manon proteic asemntor miozinei i se termin cu o plac hexagonal ce conine o enzim de tipul lizozimului. De placa bazal se aprind 6 fibre cu rol n fixarea bacteriofagului pe suprafaa bacteriei. Ataarea bacteriofagului pe suprafaa peretelui bacterian este determinat de existena unor receptori de perete, specifici. Aceast specificitate este de tip enzimatic i st la baza lizotipiei 2. Dup ataare are loc contracia manonului proteic i bacteriofagul i injecteaz numai ADN n celula bacterian. Interaciunea dintre bacteriofag i celula-gazd Bacteriofagii exist n stare de virioni extracelulari, iar la infectarea unei bacterii ei pot duce la doua tipuri de infecii: Infecie litic: determinat de fagii viruleni. La finele ciclului de multiplicare bacteria infectat este lizat elibernd fagii nou-formati. Infectie nelitica sau lizogen: determinat defagii temperai (moderai). Ei infecteaz bacteriile fr a le distruge.
39,4%). Acest fapt se explic prin evoluia n decursul a mai multor mii de ani a procariotelor comparativ cu a eucariotelor n general i a omului n particular. Comparaiile coninutului de C+G ale diferitelor organisme i microorganisme au fost folosite drept fundament n vederea stabilirii relaionrii/legturii genetice. Timina fiind susceptibil la alterri fotochimice (lumin UV), bacteriile cu un coninut bogat de C+G este posibil s fi evoluat n medii supuse unei lumini solare foarte puternice sau unor temperaturi nalte, iar cele cu coninut redus de C+G s-ar fi dezvoltat n locuri mai protejate. Aadar, compoziia n baze azotate, numit i procentul de C+G, este diferit n funcie de specie, dar se pstreaz constant n cadrul unei anumite specii. Procentul de C+G se calculeaz dup formula: (C+G)/ (C+G+A+T). De exemplu acest raport difer la diferitele specii bacteriene, sper exemplu este 26,8% la Clostridium perfringens, 40% la Streptococcus pneumoniae, 40,5% la Proteus vulgaris, 51,7% la Escherichia coli, 53% la Proteus morgani i67% la Pseudomonas aeruginosa. Aa cum a fost precizat de ctre diveri autori, compoziia de baze azotate este un index taxonomic. (1) La celulele procariote ADN-ul este inelar, mpachetat n nucleoidul din citoplasm. La bacteria intestinal E. coli cele 4,7 milioane de perechi de baze alctuiesc o macromolecul de 1,4 milimetri lungime, dar numai 2 nanometri lime. Aceasta conine 4.400 de gene deja secveniate. n ciuda lungimii sale, de peste o mie de ori diametrul celular, ADN-ul este extrem de bine nfurat n nucleoid, n aproximativ jumtate din diametrul celular. ADN-ul apare ca o macromolecul format din dou catene polinucleotidice antiparalele i complementare rsucite n dublu helix. Cele dou catene sunt unite prin puni de hidrogen formate ntre bazele azotate opuse (A=T i GC). Modelul structural al ADN-ului a fost propus de ctre Watson i Crick n anul 1953. Complementaritatea bazelor azotate este cea mai important proprietate a acizilor nucleici i condiioneaz toate proprietile ADN-ului, mai ales cea de autoreplicare i cea de transfer al informaiei genetice.
fost dat de Lederberg n 1952, iar importana lor practic a fost sesizat n 1963 de Watanabe, o dat cu descoperirea posibilitii transmiterii prin plasmide a rezistenei la antibiotice ntre bacterii . Bacteriile conin foarte frecvent plasmide, descriindu-se peste 1.000 de tipuri diferite. Lungimea acestor molecule variaz ntre 1-150 mm i greutatea molecular ntre 2-3 milioane (3x103 pn la 450x103 perechi de baze). Plasmidele mici se gsesc de obicei ntr-o celul bacterian n 10-40 de copii, pe cnd cele mari n numr mai redus de 1-3 copii. n aceeai celul nu pot coexista mai multe plasmide nrudite (cu mecanism comun de control al replicrii), ele fiind incompatibile, spre deosebire de cele nenrudite (cu mecanism distinct de reglare al replicrii), care sunt compatibile. Compatibilitatea exprim competiia plasmidelor pentru un anumit situs de legare n celula bacterian. Plasmidele pot fi: conjugative, care se pot transfera singure la alte bacterii, ca de exemplu plasmidele de rezisten la antibiotice R, neconjugative, care nu pot prsi ele nsi bacteria de origine, ci numai prin intermediul unui alt plasmid conjugativ sau a unui bacteriofag (de exemplu plasmidul care codific secreia de beta-lactamaz la S.aureus) episomi, care se pot integra prin recombinare n cromozomul bacterian, pierzndu-i astfel autonomia de replicare. Un exemplu de episom este factorul de sex F (plasmidul F sau factorul de fertilitate). Determinanii genetici eseniali ai plasmidelor codific informaiile legate de replicarea lor autonom, iar cei accesorii caractere fenotipice neeseniale supravieuirii celulei bacteriene n condiii naturale: gene de transfer (tra), de rezisten la antibiotice (factorul R), de secreie a colicinelor (factorul col), de secreie a unor toxine, de metabolizarea unor substraturi, de rezisten la unii ioni i compui organometalici etc. Unele plasmide nu au un efect observabil asupra fenotipului bacteriei i se numesc plasmide criptice. Pentru medicin important este cunoaterea plasmidelor de virulen i a celor care confer bacteriilor rezistena la antibiotice. Plasmidele de virulen poart determinanii genetici ai unor factori de virulen la bacterii, ca de exemplu secreia de enterotoxina (termolabil i termostabil) i factorul de colonizare la Escherichia coli, hemolizina la Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis i E.coli, exfoliantina la S. aureus, gena de invazivitate la Shigella etc.
donoare, bacterii Hfr care au factorul F+ integrat n cromozom, de asemenea masculine, bacterii F care au factorul F+ ca plasmid autonom, dup ce acesta a fost integrat n cromozom i l-a prsit rupnd un fragment ADN din cromozom. i aceste celule dunt donoare, deci masculine.
capsula. Transformarea s-a pus n eviden ulterior la numeroase genuri cum sunt, de pild, Streptococcus, Haemophilus, Bacillus, Neisseria, Salmonella etc. i se petrece nu numai ntre tulpiile aceleiai specii, ci i ntre specii diferite. Transformarea genetic este posibil numai dac bacteria receptoare se afl n stare de competen, stare care-i permite nglobarea de ADN strin. Competena este o stare fiziologic temporar a bacteriei, care variaz n funcie de specie i de faza de multiplicare n care se afl bacteria. Dup unii autori, celulele competente au pe suprafaa lor un antigen special numit factor de competen. n timpul strii de competen se modific structura peretelui celular, care devine mai poros, ncrcat electropozitiv, favoriznd legarea ADN-lui strin. Transformarea depinde n egal msur i de unele proprieti ale ADN transformant, cum sunt structura dublu catenar i o dimensiune minim a moleculei de 1 x 106 daltoni. Cu toate c transformarea s-a descoperit experimental i se practic astzi pe scar foarte larg n tehnicile de inginerie genetic, ea se petrece n mod natural n mediile n care triesc mpreun multe specii bacteriene i unde procesul de liz a celulelor bacteriene este frecvent, ca de exemplu n colon . Aici se pun n libertate cantiti mari de ADN care, dac ntlnete celule bacteriene n stare de competen, va ptrunde i se va recombina cu genomul acestora, conferindu-le caractere noi. Majoritatea bacteriilor nu sunt n mod natural capabile de transformare dar experimental s-au dezvoltat metode de inducere artificial a strii de competen foarte utile ingineriei genetice.
49.Conjugarea bacterian
Conjugarea este transferul de material genetic de la o bacterie donoare la una receptoare printr-un proces de mperechere, ce se realizeaz prin contactul direct dintre cele dou celule. Prin conjugare se pot transmite plasmide, precum i gene cromozomiale (prin intermediul factorului F+). Conjugarea la bacilii gram negativi. Factorul F+ poate fi situat, aa cum s-a mai artat, ntr-un plasmid, favoriznd transferul acestuia sau n cromozomul bacterian, fcnd posibil transferul unor gene cromozomiale de la o bacterie la alta. Celulele bacteriene care au factorul F+ integrat n cromozom se numesc Hfr (high freqency of recombination ), deoarece ele pot transfera material genetic cromozomial cu o frecven mare, ceea ce duce la recombinarea unor gene din cromozomul bacteriei donoare cu material genetic al cromozomului celulei receptoare. Prin intermediul factorului F+ inserat n cromozom se poate transfera o copie ntreag a cromozomului celulei donoare la cea receptoare. Transferul integral dureaz n jur de 100 minute. Procesul de mperechere este un mijloc ideal de localizare a genelor pe cromozomul celulei donoare. Ca celul donoare se alege o tulpin Hfr. Aceasta va fi cultivat cu celule F-. Prin agitare puternic a mediului se intrerupe procesul de mperechere la anumite intervale de timp, i se caut recombinani printre celulele receptoare. Cu ct ntreruperea recombinrii se produce mai repede cu att gena studiat se afl mai aproape de vrful moleculei de ADN transferat. Transferul prin conjugare a plasmidelor este condiionat de prezena n plasmid a genelor de transfer tra, care sunt responsabile de sinteza sex-pilului i de transferul plasmidului. Conjugarea ncepe prin sinteza sex-pilului care va adera de receptori specifici prezeni pe peretele celular al bacteriei receptoare. Dup formarea legturii dintre celula donor i cea receptor are loc replicarea de transfer a plasmidului. O caten parental de ADN va rmne n celula donor, iar a doua va trece n celula receptoare, pe tiparul lor sintetizndu-se catene complementare. Din punct de vedere medical importante sunt plasmidele conjugative de rezisten - plasmidele R. Dintre proprietile plasmidelor de rezisten ale bacililor-gram negativi, 3 sunt de interes medical deosebit : frecvena transferrii: frecvena transferului multor plasmide slbatice pe receptori adecvai este relativ sczut 10-4/ cel., i se datoreaz faptului c plasmidele tulpinilor slbatice sunt reprimate, adic produc un represor care inhib activitatea propriei gene de transfer. Dac se incubeaz donorii i receptorii mpreun mai multe ore, numrul de celule recombinante cresc; spectrul de gazde: plasmidele transferabile R circul ntre specii diferite. Acest transfer are loc i n laborator i n macroorganism. S-a descris astfel transferul de plasmide de la bacilul coli nepatogen la salmonele sau shigelle. Nu s-a observat ns transferul plasmidelor de la bacterii gram-negative la cele gram-pozitive; determinanii de rezisten R: caracteristici pentru plasmidele conjugative sunt determinanii de rezisten multipli. S-au evideniat astfel la tulpinile izolate din spital plasmide ce au factori de rezisten fa de toate chimioterapicele uzuale (ampicilina, cefalosporine, streptomicina, tetraciclina, cloramfenicol, kanamycina, gentamicina, sulfonamide). Conjugarea la bacterii gram-pozitive S-au descris procese de mperechere i la bacteriile gram-pozitive ca, de pild, la genurile Streptococcus, Streptomyces, Clostridium, procesul bazndu-se pe performana celulei receptoare. Celula receptoare produce un peptid cu mol. mic (GM=1000 daltoni) care determin sinteza unor substane proteice de agregare de ctre celula donoare cu afinitate pentru unele substane adezive de pe suprafaa receptorului. Se produce astfel o legtur strns ntre receptor i donor cu formarea unei puni intercelulare care permite transferul de material genetic. Prin analogie cu substanele atrgtoare la insecte peptidul ce induce substana de agregare a fost desemnat ca sexpheromon.
capabile s distrug sau s inhibe multiplicarea unor microorganisme implicate etiologic n bolile infecioase. Au o aciune selectiv asupra celulelor microorganismelor, exercitnd aciuni minime asupra celulelor organismului gazd. Aceste substane pot fi: - antibacteriene, - antivirale, - antifungice, - antiparazitare. n mod clasic, n aceast grup de medicamente au fost incluse i antineoplazicele (ex. dactinomycina, doxorubicina, bleomycina). Exist i antibiotice folosite ca: inhibitori enzimatici (ex. Lipstatin, sintetizat de Streptomyces toxytricini), imunosupresori (ex. Ciclosporina, sintetizat de Tolypocladium inflatum), hipocolesterolemiante (ex. Lovastatin, sintetizat de Aspergillus terreus), insecticide, ierbicide etc.
b). Cefalosporinele - din generaia I (de exemplu cefalotina, cefaloridina); - din generaia a II-a (de exemplu cefamandola, cefoxitina, cefuroxima); - din generaia a III-a (de exemplu cefotaxima, ceftriaxona); - din generaia a IV-a (de exemplu cefepima, cefpiroma). Cefalosporinele se mai pot clasifica i n: cefalosporine de uz oral (cefacitril, cefapirin, cefazedon, ceftezol etc); cefalosporine de uz parenteral (cefalotina, cefaloridina, cefazolina, cefamandola etc); cefalosporine care prezint o mai bun stabilitate n prezena beta-lactamazelor (cefuroxima, cefoxitima, cefotetanul, cefixima etc); cefalosporine cu activitate fa de Pseudomonas aeruginosa (ceftazidima, cefpiroma, cefepima, cefoperazona, cefsulodimul etc). c). Alte antibiotice beta-lactaminice - monobactamii (de exemplu aztreonamul); - penemii (de exemplu ritipenemul); -carbapenemii (de exemplu imipenenul, meropenemul, imipenemul + cilastatina; cilastatina este un inhibitor al dehidro-peptidazei); - oxacefemii (ex. latamoxef); - carbacefemii (ex. loracarbef). d). Inhibitori de beta-lactamaze (ex. acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul). 2. Glicopeptidele (teicoplanina i vancomicina); Vancomicina este utilizat n tratamentul infeciilor cu S. aureus meticilino-rezistent. Se administreaz intravenos deoarece nu se absoarbe n tractul gastrointestinal. Printre reaciile adverse amintim reaciile anafilactice, febr, eozinofilie, neutropenie, pierderea auzului. 3. Aminoglicozidele - streptomicina (care este de fapt un oligozaharid); - kanamicina, gentamicina, amikacina, spectinomicina, tobramicina, netilmicina etc.; 4. Ciclinele (ex. tetraciclina, oxitetraciclina, minociclina, doxiciclina etc); 5. Ansamicinele (ex. rifampicina, rifabutina); 6. Macrolidele (ex. eritromicina, claritromicina, azitromicina, telitromicina); 7. Polipeptidele ciclice (polimixina B, colistinul); 7. Antibioticele care nu se ncadreaz n nici una din grupele de mai sus - cloramfenicolul; - lincosamidele (lincomicina i clindamicina); - acidul fusidic (cu o structur asemntoare steroizilor); - streptograminele (pristinamicin, quinupristin, dalfopristin); - oxazolidinonele (linezolid); - mupirocinul; ultimele 4 grupe de medicamente au fost descoperite n special ca rspuns la apariia tulpinilor de stafilococ rezistente la meticilin etc.
anumite subpopulaii din acea specie n circumstane date; de exemplu, antibioticul acioneaz ca un presor selectiv (pacientul are o infecie n care majoritatea populaiei bacteriene este sensibil la agentul antimicrobian, dar exist tulpini care prezint rezisten; n aceste condiii, tulpinile sensibile vor fi inhibate sau distruse n timp ce tulpinile rezistente vor fi selectate; aceast situaie nu poate fi detectat dect utiliznd tehnicile de testare a sensibilitii bacteriilor la antibiotice i chimioterapice, de ex. antibiograma difuzimetric standardizat). Rezistena dobndit poate fi cromozomial sau extracromozomial. Mecanisme biochimice implicate n rezistena la antibiotice - producerea de ctre bacterie a unei enzime care inactiveaz antibioticul, de exemplu penicilinaza stafilococului auriu (codificat plasmidic) care inactiveaz nucleul beta-lactamic al penicilinelor sau diferitele tipuri de beta-lactamaze produse de bacteriile Gram-negative (ex. de enterobacterii); - scderea permeabilitii peretelui sau membranei citoplasmatice pentru antibiotic (de exemplu formele L); - elaborarea n exces de ctre bacterie a unor enzime complementare, care limiteaz sau anuleaz aciunea antibacterian a antibioticului, exercitat la nivelul enzimei respective; - alterarea intei intracelulare (ex. modificarea proteinelor ribozomale); - amplificarea sintezei de acid paraaminobenzoic, anulndu-se astfel prin diluare aciunea inhibitorie a sulfamidelor etc
56.Definii noiunea de CMI i CMB; cum se determin i care este utilitatea determinrii CMI i CMB ?
Concentratia minima inhibitorie (CMI) a unui antibiotic pentru o anumita tulpina bacteriana este cea mai mica concentratie care inhiba complet multiplicarea tulpinii respective. Concentratia minima bactericida (CMB) a unui antibiotic pentru o tulpina este concentratia minima care omoara tulpina. Cu ct CMI sau CMB sunt mai mici fata de nivelul seric maxim pe care l poate atinge un antibiotic, cu att acesta este mai activ. Majoritatea antibioticelor se administreza la intervale de timp fixe n functie de perioada de njumatatire a antibioticului. n unele cazuri, timpul de njumatatire este att de scurt nct este necesara administrarea continua a antibioticului prin perfuzie. La administrarea intermitenta a unui antibiotic, concentratia plasmatica depinde de doza, de intervalul administrarii, de absortia si eliminarea antibioticului. Cu ct perioada de resorbtie este mai lunga cu att concentratia va fi mai mica. Prin eliminare se nteleg procesele prin care se inactiveaza principiul activ al unui antibiotic sau se elimina din organism. De obicei eliminarea are loc prin filtrare glomerulara sau prin secretie tubulara. Mai rar, unele antibiotice se pot elimina prin intestin, dupa ce urmeaza un ciclu enterohepatic de retrorezorbtie sau sunt metabolizate n ficat prin reactii de oxidare, reducere, hidroliza sau conjugare. Raportul dintre concentratia sanguina a chimioterapicului si cea din focarul infectios depinde de pe de o parte de diferitele proprietati fizico-chimice ale chimioterapicului iar pe de alta parte de macroorganism. Constanta de disociere (pK), solubilitatea, dimensiunea moleculara a antibioticului si
alti factori cum sunt perfuzarea diferitelor organe si tesuturi, pH-ul plasmei si n focarul infectios etc. influenteaza repartizarea regionala si astfel raportul dintre concentratia plasmatica si cea din focar. Recent s-a introdus o alta varianta de antibiograma pe mediu solid, testul E, care permite stabilirea precisa a CMI. n loc de microcomprimate se aplica pe mediul de cultura nsamntat fsii de hrtie de filtru impregnate cu antibiotic n concentratie crescnda. Astfel, la un capat al fsiei concentratia este minima iar la celalalt capat maxima. Dupa diametrul zonei de inhibitie corespunzatoare fiecarei concentratii se va putea calcula CMI. Cunoscnd CMI pentru antibioticele la care un germene este sensibil, nivelul seric maxim care se poate realiza si capacitatea de difuziune a antibioticului n focarul infectios se va putea alege varianta optima de tratament.
tractului respirator, digestiv i n uter, fiind rapid ndeprtate de mijloacele de aprare ale organismului. Sngele, lichidul cefalorahidian, lichidele sinoviale, din seroase, esuturile profunde sunt sterile. Prezena microbilor n aceste zone are ntotdeauna o semnificaie patologic.
Inflamatia poate evolua spre vindecare cu restitutio ad integrum a tesuturilor sau cu sechele. Deznodamntul unei reactii inflamatorii depinde de extinderea procesului inflamator, de microorganismele implicate, precum si de reactivitatea gazdei. Cele 3 evenimente majore ale inflamatiei sunt: vasodilatatia capilara locala, modificarile structurale microvasculare, acumularea leucocitelor la locul injuriei. Vasodilatatia capilara. Mediatorii plasmatici ai inflamatiei, ca, de pilda, complementul, exista sub forma unor precursori care, asa cum am vazut, devin biologic activi numai dupa activare. Activarea C3 a complementului este o etapa critica a inflamatiei. C3a si C5a rezultate n cursul activarii complemenetului sunt anafilatoxine puternice ce determina degranularea mastocitelor cu eliberarea unor mediatori chimici. O parte dintre acestia sunt preformati, asa cum este histamina. Ea are actiune vasodilatatoare asupra capilarelor, crescnd totodata si permeabilitatea acestora. n consecinta, se produce o exudare din capilare spre zona infectata a plasmei cu mediatorii pe care aceasta i contine. Modificarile structurale microvasculare si acumularea de leucocite. Sub actiunea unor mediatori chimici rezultati n timpul activarii complementului si secretati de macrofagele stimulate de toxine bacteriene se modifica endoteliul capilar, care permite adeziunea PMN de acesta. PMN sunt atrase de factorii chemotactici de natura bacteriana, de cei produsi n urma activarii complementului si de cei rezultati din degranularea mastocitelor. Ele vor parasi capilarul prin diapedeza si se vor ndrepta catre focarul inflamator unde vor distruge microbii prin fagocitoza.
62.Definii noiunile de infecie, infecie inaparent, stare de boal i stare de purttor de germeni
Infecia reprezint un tip particular de relaie ntre microorganismele condiionat patogene i patogene pe de o parte i organismul gazd pe de alt parte. Pentru ca s se declaneze un proces infecios i s apar infecia, microorganismele trebuie s ptrund n organismul gazd, s depeasc barierele i mecanismele de aprare, s-l colonizeze, s se multiplice i eventual s intre ntr-un lan de transmitere prin intermediul cruia poate contamina o nou gazd. Infecia inaparent nu se asociaz cu semne sau simptome i ar putea fi decelat numai prin examene de laborator. Spre deosebire de infecia latent, infecia inaparent este limitat n timp i poate contribui la crearea unei stri de imunitate (ex. infecia cu Neisseria meningitidis, infecii cu Haemophilus influenzae etc). Starea de boal (manifest clinic sau fr ca modificrile aprute s fie exteriorizate i constatabile de ctre medicul clinician) se datorete interaciunii dintre microorganism (bacterie, parazit, virus, fung, prion) - gazd i este urmat de apariia unor simptome (de ex. temperatur peste 39C, cefalee, eliminarea unor scaune diareice etc.) i de reacii funcionale din partea gazdei (de ex. stare general modificat, senzaie de febr, frisoane, creterea numrului de respiraii pe minut, creterea numrului de bti cardiace pe minut etc). Infecia nu este urmat obligatoriu de starea de boal, putnd fi inaparent, subclinic sau latent. Starea de purttor de germeni se refer la bolnavul cu o stare infecioas, la persoana aflat n convalescen, nainte de eradicarea infeciei suferite dar i la persoanele aparent sntoase care adpostesc germeni patogeni (de exemplu Salmonella typhi la nivelul veziculei biliare, microorganismul putndu-se cantona la acest nivel dup o febr tifoid). Starea de purttor reprezint atingerea unui echilibru relativ ntre cele dou verigi, de multe ori fiind nsoit de eliminarea n mediu a germenilor care au produs infecia i se afl n diferite focare latente (precum n exemplul de mai sus, situaie n care starea de purttor se elimin doar prin extirparea veziculei biliare)
Rspunsul imun (RI) include totalitatea evenimentelor care au loc dup introducerea unui Ag, i anume: activarea limfocitelor, eliberarea a diverse molecule, multiplicarea celulelor specifice, producerea de limfocite T citotoxice sau de anticorpi capabili s se fixeze pe Ag i s participe la eliminarea acestuia (direct sau indirect). Dup acest prim contact (ca i n cursul imunizrii consecutive), sistemul imun produce limfocitele T i B de memorie, capabile s reacioneze mai rapid, mai amplu, cu ocazia unei reintroduceri ulterioare a aceluiai antigen. Principala caracteristic a imunitii este specificitatea. O alt caracteristic foarte important a RI, n condiii fiziologice, este capacitatea de a discerne ntre self i non-self i de a reaciona numai fa de moleculele care ndeplinesc definiia de antigen. Rspunsul imun poate fi de tip umoral, mediat prin anticorpi sau de tipcelular, mediat de ctre celule.
n afar de antigenele timodependente mai exist i antigene timoindependente. Acestea sunt n general antigene cu epitopi repetitivi (care se repet n mod regulat de-a lungul moleculei ca, de exemplu, polizaharidul pneumococic), ele avnd proprietatea de a stimula direct limfocitele B, fr participarea limfocitelor T. Aceste antigene induc un rspuns n anticorpi discret i fr memorie imunologic
germnativi dac au fost stimulai antigenic. Zona paracortical conine limfocite T care sunt n contact strns cu celulele dendritice (prezentatoare de antigen). Zona medular conine limfocitele T i B, plasmocite, dispuse n cordoane i macrofage aezate de-a lungul traveelor conjunctive. n trecerea limfei de la vasul limfatic aferent spre cel eferent, antigenele sunt fagocitate de macrofagele din zona medular. Fiecare ganglion limfatic are o vascularizaie arterial i venoas proprie. Limfocitele circulante intr n ganglion la nivelul endoteliului specializat al venulelor postcapilare a zonei paracorticale. Limfocitele nu pot prsi ganglionul dect prin vasul limfatic eferent. Pentru a ajunge din nou n circulaia sanguin trebuie s strbat toat circulaia limfatic pna la vena subclavicular. Splina este format din pulpa roie implicat n distrugerea eritrocitelor mbtrnite i pulpa alb care reprezint esutul limfoid al splinei. Acest esut este organizat n jurul arteriolelor centrale, constuituind arii limfoide periarteriolare. Ele cuprind o zon adiacent arteriolei care conine limfocite T, n jurul acestei zone dispunndu-se limfocitele B, organizate fie n foliculi primari nestimulai, fie n foliculi secundari stimulai ce conin centri germinativi. n zona marginal a centrilor germinativi se gsesc macrofage i celule dendritice. Limfocitele intr i prsesc splina prin capilarele aretriolei centrale situate n zona marginal, deoarece splina ne dispune de un drenaj limfatic asemntor ganglionilor limfatici. Sistemul imun al mucoaselor (MALT)1este format din esut limfoid ataat mucoasei gastrointestinale, respiratorii i a tractului uro-genital i este deosebit de important n aprarea antiinfecioas dobndit deoarece este principala barier antiinfecioas fa de microorganismele care ptund n organism pe cale digestiv, respiratorie i urogenital. Mai bine cunoscut este esutul limfoid asociat bronhiilor (BALT2) cu rolul de a capta antigenele venite pe calea aerului i esutul limfoid asociat intestinului (GALT3) care preia antigenele venite pe cale digestiv. BALT este format din foliculi i alte agregate limfocitare dispuse n ntreg sistemul bronic, mai ales la bifurcaia broniilor, bronhiilor i bronhiolelor. Dispune de o reea foarte organizat de capilare, arteriole, venule i vase limfatice eferente ceea ce arat c joac un rol de filtru pentru toate antigenele care ajung aici, fie pe cale respiratorie, fie circulatorie. Antigenele venite pe cale respiratorie sunt preluate de celulele M sau Owen). GALT este alctuit din plcile lui Peyer (aglomerri submucoase de limfocite B i T de-a lungul intestinului care sunt stimulate de antigenele ce ptrund pe cale digestiv) i limfocitele intraepiteliale.
molecula CD4+. Limfocitele T supresoare (Ts) limiteaz expansiunea clonal a limfocitelor B i T stimulate antigenic participnd la reglarea intensitii rspunsului imun. Limfocitele T citotoxice (Tc) sunt stimulate prin antigene care sunt exprimate la suprafaa celulei gazd ca, de pild, celule virus infectate, celule infectate cu microbi cu habitat intracelular sau celule tumorale pe care sistemul imun nu le mai recunote ca self. Markerul de suprafaa este tot CD8+. Limfocitele TDH1 sunt limfocite care au pe suprafaa lor marker CD4+ fiind responsabile de producerea hipersensibilitii de tip ntrziat (vezi capitolul de hipersensibilitate). Ele secret dup stimulare antigenic limfokine care activeaz macrofagele ce adpostesc bacterii cu habitat facultativ sau obligator intracelular. Limfocitele T cu memorie se formeaz n timpul rspunsului primar, ele avnd o viaa de aproximativ 40 de ani. Memoria lor imunologic ns se intinde pe o perioad de 10-15 ani.
pentru imunoglobuline i complement. n cadrul procesului de recunoatere, fagocitare i prelucrare a structurilor strine sau a structurilor proprii modificate, spre deosebire de PMN care distrug complet structurile fagocitate, sistemul MM produce un anumit grad de distrugere, cu conservarea gruprilor specifice, necesare stimulrii rspunsului imun.
rezistenta antiinfectioasa: declansarea inflamatiei. Activarea complementului aduce dupa sine declansarea reactiei inflamatorii prin produsii intermediari rezultati pe parcursul activarii. Astfel, C5a este un puternic factor chemotactic si chemokinetic pentru PMN pe care le va aduce n focarul infectios. C3a si C5a sunt anafilatoxine care vor duce la o degranulare fiziologica a mastocitelor cu eliberarea unor mediatori chimici vasoactivi; citoliza. Celulele pe care s-a fixat complementul si care n mod fiziologic sunt celulele straine organismului (bacteriile, n cazul de fata) sunt lizate sub actiunea complexului de atac al membranei. n cazuri patologice, complementul se poate fixa de celulele proprii organismului producnd distrugerea acestora; opsonizarea. Fagocitele au pe suprafata lor receptori pentru C3b. Astfel, microbii de care s-a fixat C3b vor adera de celulele fagocitare fiind fagocitati mai eficient.
76.Cooperri celulare directe, n rspunsul imun 77. Cooperri celulare (indirecte) mediate de citokine, n rspunsul imun 78. Prezentai schematic principalele cooperri celulare ce intervin n rspunsul imun 79.Precizai succesiunea de evenimente din cadrul rspunsului imun umoral, pn la sinteza de anticorpi
Cnd limfocitul B este stimulat corespunztor prin limfocitul T-helper sau mai rar de antigene timoindependente, el ncepe s se divid transformndu-se n limfoblati care dau natere la plasmoblati, apoi la plasmocite. Toate celulele provenite dintr-un singur limfocit B aparin unei singure clone celulare, productoare a milioane de anticorpi identici care vor fi eliberai n mediul intern. Pe suprafaa limfocitelor B se gsete BCR care permite celulelor B s recunoasc antigenele
specifice. Cele mai multe limfocite B sunt sub control direct al limfocitelor T-helper care stimuleaz activitatea lor i T-supresoare care o deprim. Exist ns i limfocite timoindependente, care nu necesit cooperarea cu limfocitele T reglatoare fiind stimulate direct de antigen. Dup stimulare antigenic, limfocitele se difereniaz, n afar de plasmocite secretoare de anticorpi, i n limfocite B cu memorie, care sunt celule cu via lung, fiind responsabile de un rspuns umoral rapid la o stimulare ulterioar cu acelai antigen.
titrul Ac produi este mult mai nalt; persistena acestora este mai lung (Ac produi se menin timp mai ndelungat, luni de zile). Diferena dintre RIP i RIS este datorat n primul rnd existenei limfocitelor cu memorie. Dup eliminarea Ag, n organism continu s circule celule cu memorie, reacia imun la al doilea contact cu acelai Ag avnd caracteristicile de mai sus. Memoria imun se stabilete din timpul RIP i este specific. Determinarea claselor IgM i IgG are o dubl importan practic: face posibil distincia ntre o afeciune recent i una mai veche i permite recunoaterea unei infecii congenitale (cu anumite excepii).
imunoglobulin, acionnd la nivelul aminoacidului Leucin din structura lanurilor grele. Duce astfel la apariia unui fragment cu greutate molecular destul de mare format la rndul su din 2 fragmente Fab unite *acest fragment poart numele de F(ab)2+. Fragmentele unei Ig sunt urmtoarele: - Fab: prima jumtate a lanului greu i ntregul lan uor, legate ntre ele printr-o punte disulfuric, obinute sub aciunea papainei, prin scindarea naintea regiunii balama, cu un singur situs de legare; - F(ab) 2: cele dou fragmente Fab i regiunea balama, care rezult dup aciunea pepsinei, constituie un fragment superior celor dou fragmente Fab i conine dou situsuri de legare; - Fc: jumtile terminale ale celor dou lanuri grele unite prin puni disulfurice la nivelul regiunii balama; - pFc: cuprinde fragmentele peptidice rezultate dup aciunea pepsinei, cu ntregul domeniu CH3 situat dup aminoacidul 333 al lanului greu; - Fd: corespunde primei pri a lanului greu dup aciunea papainei, cu formarea fragmentului Fab, i dup reacia de reducere-alchilare, pentru a extrage lanul uor; - Fv: corespunde prilor variabile ale lanului greu i lanului uor (VH+VL). Pentru Ig, noiunea de domeniu se regsete la lanurile grele n 4 exemplare (IgG, IgA, IgD) sau 5 exemplare (IgM, IgE) i la lanurile uoare n 2 exemplare. Terminologia utilizat este urmtoarea: Lanurile grele: - VH - pentru fragmentul greu variabil (variable heavy), comun tuturor claselor i subclaselor cu aceeai specificitate. - CH 1, CH 2, CH 3 i CH 4, - pentru fragmentul greu constant (constant heavy), care conine diferenele pentru fiecare clas i subclas; de exemplu pentru IgG1 exist fragmentele Cg11 , Cg12 i Cg13 i pentru IgM, fragmentele Cm1, Cm2, Cm3,Cm4. Lanurile uoare: - VL pentru fragmentul uor variabil (variable light), diferit pentru lanurile kappa i lambda: Vk i Vl. - CL pentru fragmentul uor constant (constant light), cu un singur lan Ck i patru Cl funcionale. Domeniile variabile VL i VH formeaz locul unde anticorpul se cupleaz cu determinantul antigenic (epitop). Faa interioar a situsului anticorpului (situs combinativ) vine n contact direct cu epitopul i se numete paratop. Faa exterioar a situsului combinativ se numete idiotip.
IgM se prezint sub forma unei structuri mari (IgM-macroglobulin) pentamerice cu o greutate molecular de 900.000 Da i constant de sedimentare de 19S. Cei 5 monomeri de IgM sunt legai ntre ei printr-un lan J. Datorit greutii moleculare mari, IgM nu trece prin placent. Reprezint 6 -7% din totalul imunoglobulinelor serice, concentraia fiind de 0,5-2mg/ml. Aceast concentraie este atins la vrsta de 1 an. Timpul de njumtire a IgM este de 6 zile. Se cunosc 2 subclase de IgM IgM1 i IgM2, fr a se evidenia ns diferene n activitatea lor biologic. n contextul rspunsului imun, IgM este clasa de anticorpi care apare n rspunsul primar. Prezena anticorpilor IgM fa de un anumit agent infecios indic o infecie acut, recent.Mare parte din anticorpi naturali, ca de exemplu isoaglutininele de grup (anti-A, anti B), sunt IgM. Datorit structurii pentamerice, IgM are 10 situsuri de combinare cu o configuraie care permite legarea preferenial de antigenele corpusculare. Aadar, este deosebit de eficace n legarea microorganismelor, producnd aglutinarea acestora. Prin fixarea complementului se realizeaz concomitent opsonizarea bacteriilor. IgM activeaz complementul pe cale clasic favoriznd deci i bacterioliza.
BCR1, TCR2). Datorit configuraiei de suprafa, antigenele sunt recunoscute de organism ca strine, ca non-self. n unele situaii patologice chiar i unele substane proprii ale organismului pot deveni antigenice, nemaifiind recunoscute de organism ca self. Un agent infecios, indiferent de natura lui, este un mozaic de antigene capabile s produc un rspuns imunitar. Antigenele complete au dou proprieti de baz: imunogenitatea, care este capacitatea unui antigen de a induce un rspuns imunitar (umoral sau/i celular), i antigenicitatea, care este proprietatea antigenelor de a reaciona n mod specific cu efectorii imuni (anticorpi sau limfocite sensibilizate) a cror producere au indus-o. Haptenele sunt antigene incomplete lipsite de imunogenitate, deci de proprietatea de a induce un rspuns imunitar, dar sunt capabile s reacioneze cu anticorpi specifici. Contradicia din definiia de mai sus se explic prin faptul c o hapten devine imunogen legat covalent de o molecul mai mare, numit carrier. Anticorpii care se vor forma vor reaciona la un contact ulterior i cu haptena liber fr ca aceasta s fie asociat cu carrierul. Epitopii. Gruprile unui antigen care sunt recunoscute de organism ca non-self se numesc epitopi. Partea complementar a efectorilor imuni (anticorpi sau receptori de pe suprafaa limfocitelor) se numete paratop. Un antigen poart n general mai muli epitopi diferii fa de care organismul va produce tot atia anticorpi cu paratopi diferii. S-au descris i antigene cu epitopi identici repetitivi. Poziia epitopilor ntr-un antigen este diferit i n funcie de aceast poziie pot fi recunoscui de limfocitele - T sau B. Epitopii care vor fi recunoscui de anticorpi sau limfocitele B sunt proeminene ale unor molecule dispuse la suprafaa antigenului i se numesc epitopi structurali sau epitopi B. Aceti epitopi nu sunt antigenici dect n stare nativ, denaturarea proteinei modificnd aspectul acestor epitopi.
Reacia antigen-anticorp este o reacie ntre un antigen (Ag) i un anticorp (Ac) i const n legarea gruprii determinante de pe suprafaa antigenului (epitop - o proeminen) cu situsul de combinare de pe suprafaa anticorpului (paratop - o adncitur). (Figura nr. 1) Reacia Ag-Ac are 2 proprieti principale, specificitatea i reversibilitatea. Specificitatea se refer la faptul c un antigen nu este recunoscut dect de anticorpii care au fost produi n urma inoculrii respectivului antigen, iar anticorpii nu recunosc dect antigenul fa de care au aprut. Trebuie menionat c specificitatea nu este absolut, ntruct un Ag cu reactivitate ncruciat, poate reaciona cu un Ac format fa de un alt antigen (reacia ncruciat se explic prin aceea c anumite Ag posed anumite grupri determinante comune). Reversibilitatea complexului Ag-Ac se datoreaz faptului c legturile necovalente sunt reversibile la cald sau pH acid (<3). Legarea antigenului cu anticorpul este determinat de complementaritatea reciproc dintre conturul suprafeei epitopului i paratopului, care apropie la civa Angstromi gruprile chimice care le alctuiesc, permind stabilirea unor fore intermoleculare ntre epitop i paratop (hidrofobe ntre gruprile nepolare, de atracie electrostatic ntre gruprile ionizate de semn contrar). Iniial are loc cuplarea ntre Ag i Ac rezultnd complexe Ag-Ac mici, solubile, care se pot desface relativ uor. n continuare, datorit existenei mai multor situsuri de legare, complexele Ag-Ac mici se reunesc formnd structuri de dimensiuni mai mari, adevrate reele Ag-Ac, care pot fi evideniate fie direct, fie dup utilizarea unor artificii tehnice
n reacia de aglutinare antigenele sunt de natur corpuscular. Reacia de aglutinare const n reacia Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafaa unor particule (bacterii, hematii, latex, cristale de colesterol etc), determinnd aglutinarea acestora prin scderea forelor electrostatice de repulsie dintre particule i formarea unor puni de legtur. Aglutinareaeste mai sensibil dect precipitarea, Ag fiind o particul i nu o molecul solubil. Anticorpii de tip IgM sunt mai aglutinani dect Ac de tip IgG (pentru c au mai multe valene). Exist i Ac neaglutinani (incomplei / blocani) sau care aglutineaz numai la rece.
tipuri de reacii Ag-Ac, i anume: reacii de precipitare reacii de aglutinare reacia de fixare a complementului (RFC) reacii de seroneutralizare. Dac n cazul primelor 2 tipuri de reacii vizualizarea se poate face direct (cu ochiul liber, cu ajutorul unei lupe etc) n cazul RFC i RSN este necesar utilizarea unor sisteme indicator. n continuare vom discuta despre reaciile Ag-Ac n care pentru interpretare este necesar marcarea reactanilor, ceea ce se poate face: - izotopic (radio immunoassay, RIA); - enzimatic (enzyme-linked immunoassay, ELISA); - fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA); - chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA) etc. n prezent aceste metode sunt extrem de folosite avnd avantajul unei mari sensibiliti, sunt automatizate i adaptabile la testri utile n toate disciplinele bio-medicale.
apoi n secreiile mucoase i n circulaie i se leag prin fragmnetul Fc de bazofilele circulante i mastocitele din esuturi. A doua etap a reaciei de tip I este activarea celulelor mastocitare i este declanat de o nou ntlnire cu alergenul. Alergenul se va uni cu IgE fixate pe mastocite i va determina o reacie ncruciat ntre dou molecule de IgE cu interconexiuni ale receptorilor Fc la nivelul membranei iritate a celulei mastocitare. Degranularea apare ca o consecin a influxului de Ca++. Granulele, coninnd mediatori deja sintetizai, migreaz spre suprafaa celulelor mastocitare, fuzioneaz cu membrana extern i i elibereaz constituienii (histamina, serotonina, leucotriene i prostaglandine, factori chemotactici). n urma interaciunii IgE fixate pe mastocit cu alergenul se elibereaz din mastocit acid arahidonic sub aciunea enzimatic a fosfolipazei A2. Acidul arahidonic este metabolizat de lipooxigenaz, sau ciclooxigenaz, producnd noi substane mediatoare. Pe calea lipooxigenazei se produc leukotriene,iar pe cea a ciclooxigenazei, prostaglandine i tromboxan. n a treia faz a reciei de tip I, mediatorii produc variate efecte care dau natere simptomatologiei clinice La nivelul tractului respirator, histamina eliberat determin contracia musculaturii netede a bronhiilor (bronhoconstricia) n decurs de cteva minute. n acelai timp, mediatorii chemotactici eliberai favorizeaz invadarea mucoasei de ctre granulocitele eozinofile i neutrofile, limfocite i trombocite, n decurs de cteva ore. Aceste celule inflamatorii elibereaz ele nsele mediatori, unii dintre ei toxici, de exemplu, aa-numita protein bazic major a eozinofilelor. Aceti mediatori cauzeaz o reacie ntrziat, la 6-10 ore de la contactul cu alergenul, tradus prin: bronhoconstricie, secreie de mucus i edem al mucoasei. Reacia indus de celulele inflamatorii determin o cretere a hiperreactivitii bronice i formeaz baza alergiei sau inflamaia astmatic a mucoasei respiratorii.
O reacie local de tip Arthus este plmnul de fermier datorat inhalrii prafului provenit dela fn mucegit. Personalul care paricip la fabricarea brnzei fermentate de mucegaiuri (Penicillium casei) este susceptibili s fac prin acelai mecansim alveolit alergic extrinsec. Cronicizarea implic i reaciile de tip IV. Reacii locale de tip III se produc i prin eliberarea persistent local de antigen de ctre un agent infecios. Astfel, infecia cu o filarie (Wucheriria bancrofti) este relativ benign, dar parazitul mort care se afl n vasele limfatice iniiaz o reacie inflamatoare responsabil de obstrucia vaselor limfatice cu edeme limfatice gigante : elefantiaza. Chimioterapia antiinfecioas poate determina o eliberare masiv de antigene microbiene prin omorrea microbilor, ceea ce va determina reacii mediate de complexe imune grave, ca, de pild, eritemul nodos lepros ce apare la pacienii bolnavi de lepr tratai cu dapson. Boala serului este o reacie de tip III generalizat i apare la pacieni crora li s-au administrat, n scop terapeutic, doze mari de ser imun heterolog (ser antidifteric sau antitetanic preparat pe cai). Dup 7-10 zile de la admnistrarea serului apar n circulaie anticorpi fa de proteinele de cal. Dac proteinele nu au fost nlturate din circulaie pn la apariia anticorpilor, acetia se vor uni cu ele i complexele imune formate se vor depune pe pereii vaselor. Prin activarea complementului se vor leza pereii vaselor la care se adaug leziunile datorate enzimelor lizozomale pe care PMN, frustrate de a nu putea fagocita complexele depuse pe pereii vaselor, le elibereaz aici. n scurt timp pacienii devin febrili, prezint rash urticarian, adenit generalizat, splenomegalie, tumefieri i dureri articulare, leucocitoz cu neutrofilie i eozinofilie, scderea complementului seric. Frecvent apare albuminurie, care traduce leziuni de glomerulonefrit. Infecii cronice cauzate de streptococi hemolitici, stafilococi, virusuri hepatitice (stimulare antigenic persistent) pot duce la continua formare de complexe imune i afectarea consecutiv a organelor vizate. Un exemplu este glomerulonefrita care apare la la 2-3 sptmni de la debutul unei infeciei cu anumite serotipuri de Streptococcus pyogenes sau S. zooepidemicus. Mecanismul patogenic este similar bolii serului.
secretai de keratinocitele agresate. Corespunde unei infiltrri dermice i epidermice, edemului epidermic i eritemului aprut dup 48-72 ore, care va persista cteva zile. Absena reaciei se datoreaz unui deficit imun celular. Sensibilizarea prealabil cu DNCB (ex. la fotografii) poate declana un oc anafilactic la IgE. Primele modificri apar ncepnd cu a 6-a pn la a 8-a or dup contactul cu alergenul; LT activate i cele cu memorie vor ajunge n circulatie i ulterior n zona inflamat, alturi de monocite, unde vor ndeprta complexul hapten-carrier. Ele nconjoar vasele sanguine, glandele sudoripare, glandele sebacee, foliculii piloi i infiltreaz epidermul. Infiltratul celular se accentueaz progresiv i ajunge maxim spre a 72-a or. Infiltratul conine celule T CD4+ (n majoritate), T CD8+, celule Langerhans, macrofage i bazofile. Aceleai keratinocite, dar i macrofagele, vor produce ulterior PGE, cu rol inhibitor al reaciei inflamatorii. LTs intervin de asemenea n terminarea reaciei de HS (la fel ca i ultravioletele), prin scderea producerii de IL-1. Ultravioletele inhib direct i celulele Langerhans. n concluzie, fenomenele apar n urmtoarea succesiune: celulele Langherhans activeaz LT CD4+ cu memorie; acestea produc diferite citokine: IL-2, IL-3, IFN-g i GM-CSF. Celelalte celule sunt recrutate i activeaz o reacie inflamatorie n care predomin celulele mononucleare. - Hipersensibilitatea de tip tuberculinic (Figura nr. 12) Persoanele infectate cu unul din germenii (M. tuberculosis, M. leprae, Leishmania tropica etc.) / sau care vin n contact cu substanele chimice (beriliu, zirconiu etc.) care pot provoca hipersensibilitatea de tip tuberculinic au LT deja activate. n laborator, pentru sensibilizare se injecteaz la un animal Ag mpreun cu adjuvantul complet Freund (pregtirea animalului prin imunodepresie cu ciclofosfamid permite i utilizarea adjuvantului Freund incomplet). Aceast faz de sensibilizare ncepe cu 2-3 sptmni nainte de testarea HS. Dup injectarea antigenului la animalul sensibilizat, LT specific sensibilizate migreaz n jurul vaselor sanguine (la 12 ore) iar activarea lor duce la secreia de interleukine care recruteaz alte celule nesensibilizate. Infiltratul desparte fibrele de colagen din derm i atinge un maxim la 48-72 ore dup injecie. Celulele observateiniial sunt LT *predomin T CD4+ (raport CD4/CD8 - 2/1)+, ulterior ncep s se acumuleze macrofagele (atingnd un maxim spre finalul celei de a treia zi de la inoculare). Fenomenele sunt maxime la nivelul dermului dar pot atinge i epidermul; keratinocitele exprim la suprafaa lor molecule HLA DR (la 48-96 de ore dup apariia infiltratului limfocitar, fapt care va amplifica rspunsul imun al gazdei), circulaia aferent i eferent a celulelor imunocompetente seamn cu cea observat n hipersensibilitatea de contact; se poate observa o infiltrare uoar cu bazofile; n timp se poate dezvolta o reacie granulomatoas. La om se practic intradermoreacia cu tuberculin (PPD, derivat proteic purificat, un amestec relativ bine standardizat de antigene proteice mycobacteriene). Citirea rezultatului se face dup 72 ore, asigurnd o bun iluminare a zonei examinate (de preferat lumina natural). Se identific existena unei eventuale arii intens eritemato-violacee, circumscriind urma nepturii dermice. Apoi se apreciaz tactil (prin repetate micri ntr-un sens i altul deasupra zonei de reacie) cu pulpa inelarului, limitele unei zone de induraie (perceput ca fiind reliefat) i care corespunde histopatologic infiltraiei dermice (edem, limfocite, macrofage, PMN), reprezentnd rspunsul imun fa de antigenul injectat. Se msoar i se nregistreaz diametrul maxim al zonei de infiltraie (a se vedea i anexa nr. 3). Leziunile dezvoltate la injectarea intradermic de tuberculin se rezolv n mod normal n 5-7 zile; persistena acestora face ca leziunea s se transforme dintr-una tuberculinic ntr-una granulomatoas. - Hipersensibilitatea granulomatoas Este o form mai grav de hipersensibilitate (ntrziat) de tip IV care survine atunci cnd antigenul persist i nu poate fi eliminat. Se caracterizeaz printr-o acumulare i o proliferare de macrofage, care stau la originea granulomului care apare la 21-28 zile dup sensibilizare i poate s persiste mai multe sptmni. Hipersensibilitatea granulomatoas poate succeda diferite hipersensibiliti
ntrziate precedente, n general dup o perioad de 3 - 4 sptmni. Elementul distinctiv al hipersensibilitii granulomatoase este formarea de celule epiteloide, celulele derivate din macrofage, de dimensiuni mari pe seama dezvoltarii reticulului endoplasmatic, cu rolul lor de a ntreine inflamaia prin secreia continu de TNF. Persoanele cu deficit de IFN nu dezvolt granuloame, ns nici nu se apr eficient mpotriva tuberculozei, leprei, leishmaniozei, schistosomiazei etc. Prin fuziunea celulelor epiteloide rezult celule gigante. Mai sunt denumite i celule Langhans. Atenie, sunt diferite de celulele Langerhans! Aceste celule gigante au mai muli nuclei, ns periferici, reticulul endoplasmic este puin dezvoltat, iar mitocondriile i lizozomii sunt n degradare. Se pare ca aceste celule Langhans ar reprezenta etapa final din diferenierea macrofagelor. Reaciile de hipersensibilitate de tip IV observate n patologia uman pot fi observate n trei grupe principale de afeciuni: 1. Eczema de contact care poate aprea datorit bijuteriilor care conin nichel, produselor din piele de animal, produselor cu sruri de crom, cremelor solare, compuilor chimici de cauciuc, produselor farmaceutice (penicilin, streptomicin, neomicin) etc; 2. Maladii infecioase n care agenii patogeni se dezvolt intracelular (tuberculoz, lepr, leishmanioz, listerioz, micoze profunde etc); n cazul M. tuberculosis, leziunea granulomatoas conine pe lng macrofage, celule epiteloide, celule gigante i LT dispuse centrifug, i o zon de necroz central, un fel de puroi numit cazeum. n jurul ntregului ansamblu se afl o zon de fibroz i o cantitate crescut de colagen. n cazul M. leprae, reacia granulomatoas se numete reacia Mitsuda. Apariia de leziuni la injectarea de antigene splenice de la un alt pacient cu sarcoidoz unei alte persoane cu sarcoidoz, constituie pozitivarea testului Kweim. 3. Alte maladii (sarcoidoz ciroz biliar primitiv, hepatitele cronice virale B i C, SIDA, infecia HIV, poliartrita reumatoid, reumatismul articular acut, b. Crohn etc).