TIROSINASA I- II-III

Determinacin de la actividad enzimtica Determinacin de la actividad de tirosinasa al variar la concentracin del sustrato, PH y temperatura optima de la tirosinasa Determinacin de la constante de Michaelis-Menten y la velocidad mxima

Por:

Jaidy Moreno Mosquera CC. 1128396793 Cindy Paternina Pitala C.C. 1017178584

Informe de laboratorio de Bioqumica

Profesor: Edwin Patio

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES BIOLOGA MEDELLN

31 de marzo 2011

CALCULOS Y RESULTADOS
Tabla 1.

T (min)/Tubo 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

0.095 0.099 0.110 0.129 0.150 0.172 0.191 0.209 0.230 0.249

0.168 0.174 0.209 0.253 0.296 0.335 0.378 0.417 0.451 0.483

Absorbancia 0.250 0,265 0.257 0,271 0.305 0,403 0.362 0,415 0.413 0,519 0.461 0,528 0.507 0,534 0.549 0,541 0.588 0,535 0.619 0,527

0.368 0.370 0.444 0.524 0.596 0.653 0.679 0.685 0.685 0.685

0,412 0,426 0,514 0,587 0,605 0,624 0,628 0,628 0,628 0,619

Grfica 1.1

Absorbancia vs Tiempo
0.3 0.25 0.2 0.15 Tubo 1 0.1 0.05 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 Tiempo (min)

Absorbancia

Absorbancia vs Tiempo
0.6 0.5 Absorbancia 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 Tiempo (min) Tubo 2

Grfica 1.3

Absorbancia vs Tiempo
0.7 0.6 0.5 Absorbancia 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 Tiempo (min) Tubo 3

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 1 2

Absorbancia vs tiempo

Series1

Absorbancia vs Tiempo
0.8 Absorbancia 0.6 0.4 0.2 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 Tiempo (min) Tubo 5

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 1 2 3 4 5 6 Series1

CALCULOS Tubo 1: ( ( )( ) )

Tubo 2: ( ( )( ) )

Tubo 3: ( ( )( ) )

Tubo 4: ( ( )( ) )

Tubo 5: ( ( )( ) )

Tubo 6: ( ( )( ) )

Tabla 2.

Tubo 1 2 3 4 5 6

[S]f 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018

vi 0,043 0,082 0,099 0,113 0,129 0,037

1/[S] 333,333 166,666 111,111 83,333 66,666 55,555

1/vi 23,255 12,195 10,101 8,849 7,751 2,027

Grfica: Velocidad inicial vs concentracin.

0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 0.005 0.01 0.015 0.02 Series1

Grfica 2.2. Grfica de Lineweaver-Burk

25 y = 0.0649x + 1.8691 20

15 Series1 10 Linear (Series1)

0 0 100 200 300 400

( )

TIROSINASA III
DETERMINACION DEL PH PTIMO DE LA TIROSINASA

Tubo PH ABSORBANCIA

1 3.0 0.114

2 4.5 0.131

3 6.0 0.268

4 7.2 0.239

5 10 0.253

0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8 10 12 Series1

DETERMINACION DE LA TEMPERATURA PTIMA Tubo temperatura absorbancia 1 4C 0.440 2 25C 0.459 3 37C 0.421 4 55C 0.400 5 94C 0.163

0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 20 40 60 80 100 Series1

ANLISIS Y DISCUSIONES En la prctica realizada se trat de analizar la cintica de la enzima tirosinasa, variando la concentracin de sustrato y observando el cambio en la velocidad. La velocidad inicial de las reacciones se hall mediante el clculo de las pendientes de las curvas para cada uno de los tubos en las grficas de Absorbancia vs tiempo. Para hallar las pendientes se tomaron los puntos que mejor representaban el segmento con comportamiento lineal de la curva. Las curvas de la Absorbancia vs tiempo del producto formado describen claramente la cintica de la reaccin. La primera regin, donde la curva es constante, pues no hay un cambio significativo de la Absorbancia, describe el estado pre-estacionario de la reaccin durante el cual no se ha saturado toda la enzima, no se ha estabilizado la concentracin del complejo enzima-sustrato (ES). Posteriormente inicia la formacin de producto durante el cual la curva tiene un comportamiento prcticamente lineal hasta que llega a un punto donde la concentracin del producto formado empieza a estabilizarse, mantenindose constante, los sitios activos de la enzima ya estn saturados o ya no hay mas sustrato para convertir en producto. Debido a que la absorbancia es directamente proporcional a la concentracin de una sustancia, las graficas realizadas de absorbancia vs tiempo presentan el mismo comportamiento de una grafica concentracin vs tiempo. Tericamente se calcul la velocidad mxima ( ) y el Km para la tirosinasa mediante la recta de regresin de la grfica de Lineweaver-Burk (Grfica 2.2) arrojando valores de 0.00891 M/s para la velocidad mxima y de 0.0347 M para el Km. El valor de la velocidad mxima terica, mucho mayor que la velocidad para las concentraciones de sustrato usadas, no se alcanz con las concentraciones de sustrato usadas. En cambio el valor del Km si se encuentra entre los valores de las concentraciones utilizadas en los tubos. Este valor de Km considerablemente grande para la tirosinasa en comparacin

con otras enzimas, podra estar indicando que es poco afn al sustrato L-Metildopa. de sustrato a la cual se ha alcanzado la mitad de la velocidad mxima. En la determinacin de PH ptimo para la enzima tirosinasa observamos que el rango de PH donde trabaja mejor la enzima va de 5 7 evidenciando en este intervalo una mejor actividad enzimtica, segn los valores de absorbancia obtenidos y donde se observ que el ph ptimo (intensidad mxima de la actividad enzimtica donde todo las molculas del sustrato se convierte en producto) fue de 6.0 mostrando en este una mayor densidad ptica; Por encima o por debajo del rango hay alteraciones en los estados de ionizacin de los residuos de aminocidos que forman la enzima alterando la carga neta y por lo tanto alterando su estructura 3D y como consecuencia hay menos afinidad de la enzima por su sustrato o evita que se forme el complejo ES. En el caso de temperatura tambin existe tambin un rango donde la catlisis enzimtica es favorable este hecho se debe a que en general, la velocidad de la reaccin se incrementa con la temperatura hasta que un punto mximo es alcanzado. Este incremento se debe a que aumenta el nmero de molculas ricas en energa que pueden pasar la barrera energtica de estado de transicin, para formar a los productos. Por encima de este rango hay perdida de la actividad enzimtica como resultado de la desnaturalizacin de la enzima perdida de la estructura 3D. Y por debajo causa una desactivacin temporal de la enzima y por lo tanto disminuye la velocidad de la reaccin. Para el caso de la tirosinasa observamos que no hay prdida completa de la actividad enzimtica en el rango de temperatura en que evaluamos a la enzima pero si hubo una disminucin de la velocidad a ambos lados de la temperatura ptima (T. ambiente).