Umbral Cientfico

Fundacin Universitaria Manuela Beltrn

umbralcientifico@umb.edu.co
ISSN (Versin impresa): 1692-3375
COLOMBIA




2005
Andrey Alejandro Rincn Riveros
EMPLEO DE COFACTORES PARA INCREMENTAR LA BIOSNTESIS DE
BIOPLASTICOS APLICADOS EN EL TRATAMIENTO BIOTECNOLGICO DE
AGUAS CONTAMINADAS CON COMPUESTOS ORGNICOS E INORGNICOS...
Umbral Cientfico, junio, nmero 006
Fundacin Universitaria Manuela Beltrn
Bogota, Colombia
pp. 34-40




Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina y el Caribe, Espaa y Portugal
Universidad Autnoma del Estado de Mxico
http://redalyc.uaemex.mx

34
Andrey Alejandro Rincn Riveros
1
1
Microbilogo Industrial, Docente Investigador, Grupo de Investigacin Tecnologas de Aprovechamiento de Residuos y Energas Renovables
EMPLEO DE COFACTORES PARA
INCREMENTAR LA BIOSINTESIS DE
BIOPLASTICOS APLICADOS EN EL
TRATAMIENTO BIOTECNOLOGICO
DE AGUAS CONTAMINADAS CON
COMPUESTOS ORGANICOS E
INORGANICOS PROVENIENTES DE
FABRICAS PRODUCTORAS DE CAUCHO
RESUMEN
En este estudio un Gnero de bacterias Gram Negativas es analizado por su habilidad de crecer y acumular
biomateriales de naturaleza extracelular en presencia de un medio litotrfco suplementado con aguas de desecho
industrial que contienen compuestos orgnicos e inorgnicos de industrias procesadoras de caucho. Debido al
conocimiento de la exploracin del mecanismo de transcripcin gentico y el proceso de biologa molecular
denominado polimerasa/depolimerasa de cido hidroxialcanoico presente en bacterias bajo stress metablico, es
posible formular aplicaciones biotecnolgicos costo efectivas que puedan ser tenidas en cuenta para el tratamiento
biolgico de aguas de desecho industrial y produccin de bioplsticos.
Palabras clave: Bacterias, Biotransformacin, Caucho, reduccin de contaminantes, Proceso Batch, ADN
recombinante, cido polihidroxialcanoico.
ABSTRACT
In this study a Genera of Gram Negative bacteria was analyzed for their hability to growth and accumulate
biomaterials of extracellular nature in presence of litotrophic media supplemented with industrial waste
water contaminated that holds organic and inorganic compounds from rubber processed industries. Due to
the knowledge of the exploration of the transcription genetic mechanism and the molecular biology process
denominated polymerase/depolymerase of hidroxialcanoic acid present in bacteria under metabolic stress, it is
possible to formulate cost effective biotechnological applications that can be take into account for biological
industrial waste water treatment and bioplastic production.
Key words: Bacteria, Biotransformation, rubber, reduction of contaminants, Batch process, recombinant DNA,
polyhydroxyalkanoic acid.
INTRODUCCION
Los procesos de vulcanizacin de materiales
con propiedades elastomricas generan
subproductos en sus aguas de desecho
industrial que no son tratados adecuadamente
desde el punto de vista biolgico. Diversos
subproductos orgnicos e inorgnicos poseen
materia orgnica e inorgnica azufrada, entre
ellos los sulfatos. Entre otros compuestos
que no son tratados desde el punto de vista
biolgico estn los cidos como el sulfhdrico
y aditivos como el bisulfto de tetrametilo.
Algunas protenas tambin hacen parte de esta
aguas (Gamgarn, 1996).
Con el fn de adquirir nuevas propiedades de
elasticidad y dureza, desde 1840 la compaa
Goodyear ha implantado mejoras en el
proceso de vulcanizacin, pero ya sabemos
que dichos procesos causan tremendos
impactos ambientales.
La formulacin de procesos biolgicos con
base biotecnolgica son una estrategia que
provee alternativas de soluciones ambientales
que contribuyen con el detrimento del impacto
ambiental que tienen estos compuestos que
contaminan las aguas.
Este estudio pretende formular alternativas
empleando cultivos mixtos de bacterias Gram
negativas presentes en aguas contaminadas que
sirvan como complemento en el tratamiento
biolgico de aguas provenientes de una
industria. A pesar de existir tratamientos de
tipo anoxignico de aguas los cuales son de
bajo costo por tener una baja inversin de tipo
econmica en equipos y reas de tratamiento,
existe un problema con los subproductos de
tipo metablico generados por la reduccin
de iones sulfato en ausencia de oxgeno. Esta
reduccin conduce a la formacin inmediata
de H
2
S el cual es txico en el agua y genera
contaminacin atmosfrica dado el penetrable
olor a huevos podridos.
La presencia de protenas del ltex produce
compuestos rgano sulfurados txicos como
sulfuro de dimetilo y metil mercaptano.
Diversos estudios describen bacterias Gram
negativas de metabolismo litotrfco capaces
de reducir compuestos inorgnicos sulfurados
para conseguir la energa necesaria en procesos
metablicos como generacin de biomasa
y produccin de metabolitos secundarios
como los exopolisacridos que pueden ser
empleados para remover metales presentes en
aguas industriales (Kim et al. 2002., Martn
et al. 2002). Bajo condiciones anoxignicas
Gneros de Thiobacillus novellus son
capaces de transformar compuestos orgnicos
sulfurados; estas bacterias son capaces de
obtener energa a travs de la oxidacin
qumica con compuestos inorgnicos como
agentes donadores de electrones para la
cadena transportadora y empleo de fuentes
carbonadas para manutencin celular a
partir de dixido de carbono por lo que su
metabolismo es quimioauttrofo; en tanto
que otros organismos son capaces de obtener
energa y carbono quimioorganotrfcamente
a partir de la oxidacin de compuestos
orgnicos (energa) y subproductos orgnicos
del metabolismo celular (carbono) entre
36
Debido a la aproximacin del mecanismo
mediante el cual materiales polimricos
como el ltex pueden ser transformados y
posteriormente mineralizados mediante la
maquinaria enzimtica de diversos Gneros
bacterianos que trabajen o no en forma
sintrpica, este estudio analiza alternativas
para el tratamiento biolgico de aguas
industriales provenientes de industrias del
caucho y produccin de biosteres de cido
hidroxialcanoico.
La sntesis enzimtica y su complejidad
trazada mediante complejos enzimticos
genera los sufcientes metabolitos secundarios
(acetilCoA y cofactores reducidos entre otros)
para la biosntesis de material extracelular de
base como una matriz polimrica de adhesin
en futuros fermentadores cerrados empleando
microorganismos que lleven a cabo procesos
de reduccin de compuestos contaminantes
MATERIALES Y METODOS
Aguas contaminadas con material orgnico
e inorgnico sulfurado: 1000 mL de aguas
provenientes de una laguna con presencia
de compuestos sulfurados son el medio
que proveer la energa motriz en procesos
de reduccin y carbono para manutencin
celular.
Microorganismos: Bacilos Gram Negativos
aislados de aguas contaminadas con compuestos
sulfurados fueron aislados en MML y pruebas
posteriores de Gram confirman que las
colonias obtenidas son de bacterias bacilares
Gram negativas, otras pruebas indican que
dichos microorganismos presentan una
caracterstica fenotpica mucoide y con
adhesin positiva a superfcie.
Cultivos bacterianos: Los medios lquidos
fueron elaborados en frascos erlenmeyer
con un volumen total de 500 mL utilizando
un volumen de trabajo de 250 mL de medio
mineral lquido (MML), composicin en (g/L)
Na
2
HPO
4
x 12 H
2
O9 g; KH
2
PO
4
1,5 g;
NH
4
Cl1g; MgSO
4
x 7 H
2
O0,2 g; CaCl
2

x 2H
2
O0,02 g; Fe
(III)
NH
4
-Citrato1,2 mg;
solucin micronutrientes 0.1 mL. pH 7.0 (pH
metro Schott Handy Lab, Alemania). Solucin
Micronutrientes (mg/L): ZnSO
4
x 7 H
2
O10
mg; MnCl
2
x 4 H
2
O3 mg; H
3
BO
3
30 mg;
CoCl
2
x 6 H
2
O20 mg; Na
2
MoO
4
x 2H
2
O3
mg; H
2
O destilada1000 mL.
Fuente carbonada: Aguas contaminadas
con material orgnico e inorgnico sulfurado,
con una relacin frente el medio mineral de
50%v/v.
Proceso fermentativo: con una O.D.= 1.0
(S2100 Diode Array Spectrophotometer
Biochrom, USA) se ha establecido una
concentracin de inculo bacteriano (10
6

UFC/mL) la cual crece en MML que tiene
como fuente extra de electrones y carbono
las aguas contaminadas. El sistema de
fermentacin tipo batch es incubado a
temperatura ambiente en condiciones no
estriles y con una agitacin constante en
shaker orbital de 150 r.p.m. (shaker orbital
procesos medio ambientales, Colombia).
Posteriores observaciones macroscpicas
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Empleo de transformates para incrementar
el Yx/p de polihidroxialcanoatos: La bio-
sntesis de estos materiales tiene una relacin
extrecha con la de aquellos de naturaleza
extracelular, desde el punto de vista gentico,
los genes codifcantes de biosntesis de PHA
y otras protenas relacionadas con el metabo-
lismo son frecuentemente encontrados en un
mismo opern en el cromosoma bacteriano
el cual es inducible bajo factores de presin
ambientales como la composicin del me-
dio empleada en este estudio. En Ralstonia
eutropha H16 y en algunas otras bacterias
Gram negativas, los genes estructurales estn
organizados en el siguiente orden: phaCAB,
PHA sintasa (phaC), 3 cetotiolasa (phaA) y
acetoacetil-CoA reductasa NADPH depen-
diente (phaB). (Figura 2)
Estos mismos tres genes se han encontrado en
Pseudomonas sp 61-3 organizados en un mis-
mo opern pero en diferente orden phaBCA.
(York et al 2001). Si logramos obtener trans-
formantes capaces de desviar las molculas
de acetilCoA destinadas para la fabricacin
de exopolmero mediante un control negativo
del ciclo de los cidos tricarboxlicos, entonces
estos nuevos transformantes obtenidos podrn
aprovechar los desechos industriales que esta-
mos tratando para la fabricacin de bioplstico
(material orgnico presente en las aguas ms
electrones para la cadena transportadora pro-
veniente de fuentes inorgnicas), generando
as una tecnologa que adems de contribuir
con un proceso de reduccin biolgica conlle-
ve a la biofabricacin costo efectiva de mate-
rial de cido polihidroxialcanoico., la otra gran
ventaja consiste en que el sistema ser una
tecnologa dual que permita ser acoplada para
el tratamiento de aguas permitiendo el uso
de reactores que puedan ser libres de Down
Time (Rajkumar y Palanivelu, 2004).
Generaci n de mutantes medi ante
transformacin bacteriana : Para tener
xito en transformaciones bacterianas existen
diversos mtodos reportados por la literatura.
El empleo de tcnicas comerciales como
BacterioMatch para la generacin de estos
mutantes es una alternativa que puede llegar
a ser incluida a futuro en este estudio.
El presente sistema permite la bsqueda
de aquellos hbridos bacterianos que sean
identificados por las nuevas protenas
biosintetizadas y que a su vez sean
caracterizadas de acuerdo a una interaccin
transcripcional de tipo proteico.
El presente plsmido (fgura 1), es un ejemplo
del vector gentico a insertar y del cual
se espera que los nuevos transformantes
sean capaces de biosintetizar steres de
cido hidroxialcanoico con tasas tambien
productoras de exopolisacrido sufiente
para permitir una adhesin celular. Una
vez que el vecotr con su gen blanco ha sido
objeto de insercin mediante una tcnica de
transformacin bacteriana, el sistema ser
capaz de asegurar que el nuevo transformante
transcriba y traduzca la caracterstica
fenotpica deseada, en este caso producir
steres de cido polihidroxialcanoico (Dove
et al. 1997., Joung et al. 2000., Sambrook et
38
Figura 1.
Plsmido pBTHA diseado mediante el programa
Plasmid Processor Ver. 1.02 . La estructura plasmdi-
ca presenta un sitio de multiclonaje de genes MCS
S:2770 E:2790 (restriccin con Not I, EcoR I, Sma I,
BamH I)., Plac-UV5 S:1556 E:1686 regin promotora.,
marcador de seleccin de antibitico con ORF S:3200
E:2770 ., y regin promotora P15A ori S:591 E:1300.
El cassette integrado al sistema (no mostrado, ser
el opern phaCAB (fgura 2) el cual posee los ge-
nes biosintticos para la produccin de steres de
cido hidroxialcanoico de cadena media. Fuente:
Generacin de Biofilm bacteriano: Los
aislamientos presentan la particularidad de
la formacin de material extracelular de tipo
adhesivo a las paredes del reactor tipo Batch
(bioflm bacteriano). A pesar que el bioflm
generado no excede de 2 mm aproximadamen-
te en grosor, se espera mediante posteriores
prcticas experimentales que ste sea mayor
para generar un incremento en el fujo de las
fuentes carbonadas al interior del sistema
bacteriano, para ello es preciso entender que
a partir de un proceso REDOX se incorpor-
an desde el MM suplementado con aguas
contamiandas las molculas de acetilCoA
necesarias en la posterior biosntesis tanto de
polmero extracelular as como de polmeros
intracelulares (Rincn et al. 2004., Steinb-
Figura 2.
Opern phbCAB (inserto regin MCS
en pBTPHA para la sntesis de P(3HB)
Fuente: Madison y Huisman, 1999.
Se puede mejorar la tasa de acumulo de
biopolmero gracias a la movilizacin del
exopolmero al interior celular en forma de
molculas de acetilCoA.
Uno de los mecanismos que favorecen la
tasa de acumulo de polmero intracelular
en bacterias es la defciencia en nutrientes
esenciales para su multiplicacin (N, P, Mg,
etc).
Igualmente existen otras formas de incrementar
dicho rendimiento, por ejemplo se pueden
emplear protocolos para la generacin de
transformantes (fgura I) que sean capaces
de alcanzar altos rendimientos de produccin
de polmero. Dichos mutantes deben incluir
una seal transductora (Plac-UV5 y agente de
seleccin) que a manera de activador propicie
incremento en la actividad polimerizante,
creando as un control negativo en las molculas
de AcetilCoA que son movilizadas desde el
polmero extracelular hacia la formacin de
steres de cido hidroxialcanoicos, pero es
preciso que sean evaluados los mecanismos
de catlisis/sntesis de polmero extracelular
e intracelular respectivamente as como la
naturaleza del polmero la cual debe ser de
aplicacin industrial, como en el caso del
opern phbCAB.
El plsmido propuesto en este trabajo es
un buen material de estudio para analizar
la relacin del mecanismo para el control
de la expresin gnica con los sistemas de
depolimerizacin extracelular y sntesis
CONCLUSIONES
Dado que existen diversos cofactores
presentes en el contaminante a los cuales no
se les ha hecho una caracterizacin qumica,
es necesario estimar si stos propician el
incremento en la taza de movilizacin del
exopolmero para la sntesis de PHA en los
transformantes.
Estrategias de acondicionamiento de
cultivos bacterianos en presencia de material
orgnico e inorgnico sulfurado proveern
bacterias con bajas fases de adaptacin
en el MM y una mayor duracin de la fase
exponencial, haciendo de este sistema
una alternativa promisoria en el empleo
de cultivos que no entren rpidamente
en fase estacionaria y que por el contrario
generen una gran variedad de compuestos
reducidos a partir de los materiales de
desecho industrial.
Estudios futuros basados en tcnicas
de rotulacin de aminocidos con C
14

pueden ser de gran ayuda para descubrir la
incidencia proteica de los desechos de aguas
contaminadas en las bacterias que crecen a
partir de stas y si estos enzimas bacterianos
forman parte de un gran complejo que haga
ms efciente el proceso de transformacin
de tales desechos. (Aldor et al. 2003).
La aproximacin experimental descrita en
este trabajo permite analizar la relacin de
protenas en lechos acuosos contaminados
y su relacin con procesos tipo REDOX en
los cuales las bacterias intervengan para
descontaminar las aguas mediante una
tecnologa de base biotecnolgica., desde
un punto de vista bioqumico, el mecanismo
generador de energa debe estar vinculado
con su metabolismo en el momento
de emplear las molculas de acetilCoA
que provienen del material orgnico
contaminante, todo esto potenciado por
una estrategia de tipo lito trfco presente
en las bacterias aisladas en presencia del
Medio Mineral y aditivos que provean fuerza
motriz de electrones tanto en presencia de
oxgeno (como se ha dado en este estudio),
40
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