Mtodo cromognico-fluorognico para el aislamiento e identificacin de Escherichia coli O157:H7 con el empleo del medio CromoCen ECCS

BioCen cdigo !"#$

El mtodo incluye una fase de identificacin presuntiva con el empleo del medio cromognico CromoCen ECCS para el aislamiento e identificacin de Escherichia coli O157:H7 en muestras de diferentes alimentos !aranti"a los resultados en 1#$%& ' y re(uiere la confirmacin adicional con las prue)as r*pidas de citocromo o+idasa, !-. /!lutamato descar)o+ilasa0 o 1ndol y aglutinacin con antisueros O157 y H7 &ipos de muestras 'ue pueden ser procesadas por este mtodo: alimentos c*rnicos no procesados trmicamente o cual(uier otro tipo de alimentos en los (ue se sospec'e la presencia de Escherichia coli O157:H7 Resumen de la aplicacin El medio )asa su funcionamiento en la com)inacin del sustrato cromognico 5$)romo$&$cloro$2$indolyl$ $.$ galactopiransido /3$!-40 para la deteccin de la en"ima $.$galactosidasa y del sustrato fluorognico &$ metilum)eliferil$$.$glucurnido /56!0 para la deteccin de la actividad glucuronidasa, (ue con7untamente con la degradacin del sor)itol presente en el medio, posi)ilita la diferenciacin de Escherichia coli O157:H7 /56! negativa, sor)itol negativa0 de E. coli, los coliformes y otras )acterias !ram$negativas, permitiendo un procedimiento sencillo, mediante el cual Escherichia coli O157:H7 se identifica por la aparicin de colonias de coloracin a"ul verdosa, con )ordes trasl8cidos y sin fluorescencia )a7o lu" 69 a 2:: nm En la fase confirmativa, se comprue)a la presencia de este microorganismo con las prue)as r*pidas de Citocromo o+idasa, !-. /!lutamato descar)o+ilasa0 o 1ndol y las serolgicas Otras )acterias !ram$nagativas pueden ser diferenciadas o identificadas presuntivamente en este medio, tales como Salmonella spp y Pseudomonas 4a com)inacin de nutrientes en el medio, con7untamente con in'i)idores para los microorganismos !ram$ positivos, permite el adecuado crecimiento y recuperacin de los microorganismos de inters Procedimiento /9er es(uemas del mtodo0 Siem(ra en placas e identificacin) 4os mtodos de siem)ra en el medio CromoCen ECCS dependen del tipo de muestras a ensayar y el propsito /identificacin o recuento0 ;ara la identificacin se recomienda la siem)ra por agotamiento del inculo en la superficie por estr<as y=o el mtodo de inundacin de la superficie ;ara el recuento, se recomienda el mtodo de inundacin de la superficie Es importante (ue el la)oratorio reci)a muestras (ue no 'ayan sufrido da>os o cam)ios en su composicin y estado -seg8rese (ue el pH no disminuya a valores inferiores a &,5 durante el proceso de pre$ enri(uecimiento /si se re(uiere para E. coli O157:H7 Salmonella0 El pH de alimentos *cidos y acidificantes es m*s esta)le en agua peptona )uferada de do)le concentracin El mtodo de siem(ra por agotamiento del inculo en la superficie *por estr+as, consiste en sem)rar un inculo con el o)7etivo de o)tener colonias aisladas para su estudio Colo(ue la placa con el medio de cultivo CromoCen ECCS so)re una superficie lisa Se esterili"a a la llama un asa de nicrom, se enfr<a y se toma el inculo Se levanta ligeramente la tapa de la placa de ;etri y se va arrastrando el inculo desde un )orde de la placa al otro reali"ando l<neas rectas en "ig$"ag )ien apretadas, avan"ando 'acia el centro Se gira la placa en un *ngulo de apro+imadamente de 7? a @? A y se reali"a el estriado entrecru"ando los cuadrantes En el 8ltimo cuadrante se reali"a el "ig$"ag menos frecuente, es decir, con l<neas m*s separadas para garanti"ar el aislamiento de las colonias Este mtodo puede 'acerse flameando el asa al pasar de un cuadrante a otro, so)re todo si el inculo de partida est* muy concentrado El mtodo de siem(ra por inundacin de la superficie , se e7ecuta distri)uyendo 'omogneamente el inculo con ayuda de una esp*tula de .rigalsBy Colo(ue la placa so)re una superficie lisa 4evante ligeramente la tapa de la placa de ;etri e inocule de ?,1 a ?,5 m4 de la porcin de ensayo, en el centro de la placa con medio CromoCen ECCS .istri)uya la muestra so)re toda la superficie con una esp*tula de .rigalsBy estril /em)e)er en alco'ol y flamear0, girando esta 8ltima siempre en posicin totalmente 'ori"ontal con respecto al plano de la placa .e7e la placa en reposo por 5C1? min para (ue la muestra penetre en el lec'o del agar ;ara E. coli O157:H7: ;ara algunas muestras, los procedimientos esta)lecidos pueden recomendar el enri(uecimiento de las muestras sospec'osas previo a su identificacin en diferentes medios de enri(uecimiento, tales como agua peptona alcalina, incu)ando a 25 D % EC por 1#$%& ' El recuento se reali"a a partir de la siem)ra de la muestra o sus diluciones directamente en la placa sin ning8n paso previo de enri(uecimiento 1ncu)e el medio a 25 % AC durante 1#$%& '

%plicacin en muestras de alimentos

;ara E. coli y coliformes: El recuento se reali"a a partir de la siem)ra de la muestra o sus diluciones directamente en la placa sin ning8n paso previo de enri(uecimiento 1ncu)e el medio a 25 % AC durante 1#$%& ' ;ara la identificacin y=o recuento de coliformes fecales, se recomienda incu)arlo a &% % AC ;ara Salmonella: 1ncu)e la suspensin inicial para el pre$enri(uecimiento no selectivo a 27 D 1 AC durante 1# D % ' procediendo luego al enri(uecimiento selectivo ;ara esto, transfiera ?,1 m4 del cultivo o)tenido a un tu)o (ue contenga 1? m4 de Caldo Fappaport 9asiliadis con Soya /CF9S0G transfiera 1 m4 del cultivo o)tenido a un tu)o (ue contenga 1? m4 de /Caldo Hetrationato /CHHI00 1ncu)e el CF9S inoculado a una temperatura de &1,5 AC por %& D 2 ' y el CHH, a 27 D 1 AC durante %& D 2 ' Henga especial cuidado para (ue la temperatura de incu)acin no e+ceda los &%,5 AC Con posterioridad a la incu)acin, utili"ando los cultivos procedentes de CF9S y CHHI, inocule con la ayuda del asa la superficie de la placa de -gar 3 4 . /medio selectivo0, por agotamiento del inculo con el o)7etivo de o)tener colonias aisladas En caso de no contar con placas grandes, utilice dos placas pe(ue>as, una a continuacin de la otra, utili"ando la misma asa ;roceda de igual forma con el medio CromoCen ECCS, sem)rando por estriado /agotamiento del inculo0 en las placas Fealice tantas rplicas como sean necesarias a partir de cada uno de los medios de enri(uecimiento selectivo 1ncu)e las placas invertidas a 27 D 1 AC /3 4 . y CromoCen ECCS0, agr8pelas en no m*s de & placas por columnas Con posterioridad a la incu)acin, e+amine las placas de am)os medios para determinar la presencia de colonias t<picas de Salmonella y las at<picas /sospec'osas0 (ue pudieran considerarse Salmonella En el caso de muestras en las cuales no sea detectado crecimiento de colonias sospec'osas en el medio CromoCen ECCS, se proceder* a ensayar las colonias sospec'osas provenientes de 3 4 . con las prue)as )io(u<micas esta)lecidas en el est*ndar 1SO :57@ .e manera similar, se proceder* a identificar las colonias (ue pudieran ser consideradas como at<picas en el medio CromoCen ECCS -lgunos rganos regulatorios pueden e+igir la confirmacin de E. coli por algunas prue)as adicionales a la deteccin de actividad galactosidasa y glucuronidasa, respuestas caracter<sticas en el medio CromoCen ECCS En este caso, la confirmacin de las colonias sospec'osas de E. coli se puede e7ecutar con la prue)a de glutamato decar)o+ilasa y=o la prue)a r*pida de indol /positivas am)as0 1ncu)e la placa en una incu)adora )acteriolgica a 25 D % EC por 1#$%& ' ;ara la deteccin y=o recuento de coliformes fecales, as< como para diferenciar Pseudomonas aeruginosa de otras especies de Pseudomonas productoras de pigmento pioverdina, se recomienda incu)arlo a &% % AC En la incu)adora, colo(ue las placas en posicin 'ori"ontal, con la tapa 'acia a)a7o, en columnas de no m*s de & placas -l finali"ar la incu)acin, o)serve el crecimiento y proceda a identificar el microorganismo 4uego de la incu)acin, e+amine las placas para determinar la presencia de colonias t<picas de los microorganismos diana y las at<picas (ue pudieran considerarse dentro de estos microorganismos. Interpretacin En el medio CromoCen ECCS, el crecimiento t<pico de Escherichia coli O157:H7 se identifica por la presencia de colonias de color a"ul verdosas, con )ordes trasl8cidos, sin fluorescencia, citocromo o+idasa negativas, !-. o indol positivas 4os coliformes /e+cepto E. coli O157:H70 pueden crecer en el medio como colonias violetas o a"ul verdosas, de diferentes tonalidades de violeta, ro7as con centro verdoso o violetas con fluorescencia amarilla o verdosa, tam)in pueden presentarse de color a"ul con o sin 'alo a"ul El medio )rinda posi)ilidades adicionales de diferenciacin para el personal de)idamente entrenado seg8n se e+plica a continuacin: 4as cepas de Escherichia coli crecen en el medio como colonias violetas o a"ul verdosas, en su mayor<a con fluorescencia a"ul 4as cepas de Klebsiella spp crecen en el medio como colonias violetas, mucoides, con o sin fluorescencia amarilla o verdosa 4as cepas de Enterobacter spp crecen como colonias ro7as con centro verdoso y fluorescencia amarilla Pantoea agglomerans crece en el medio como colonias a"ules con o sin 'alo a"ul 4as cepas de Citrobacter spp o Serratia spp crecen como colonias de diferentes tonalidades de violeta Salmonella spp crece como colonias ro7as o ro7as con centro )eige, )ordes trasl8cidos con o sin fluorescencia amarilla y con o sin precipitado )iliar Pseudomonas aeruginosa se distingue en el medio por la presencia de colonias rosa p*lidas con fluorescencia verdosa 4as colonias incoloras o con pigmentacin propia son caracter<sticas de otras )acterias !ram$ negativas
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4os microorganismos !ram$positivos resultan in'i)idos en el medio

Ventajas

5*s r*pido 4a identificacin presuntiva de Escherichia coli O157:H7 se reali"a en un per<odo m*+imo de %# ' 4a deteccin directa de la actividad en"im*tica en el medio eleva la e+actitud del an*lisis Esto permite la identificacin directa /o con un m<nimo de prue)as adicionales0, cuyos resultados no presentan diferencia con la identificacin reali"ada por )io(u<mica tradicional

5*s f*cil de utili"ar Io necesita esterili"acin durante su preparacin .isminucin de la carga de tra)a7o asociada al procesamiento de las muestras 5*s preciso Su Sensi)ilidad y Especificidad diagnsticas son superiores a las de los medios convencionales destinados al mismo propsito para los microorganismos de inters 5*s confia)le 4a presencia de colonias coloreadas no permiten confusin

Composicin y preparacin de los medios de cultivo y reactivos 1) Medio CromoCen- ECCS Composicin: Jases nutritivas$17,? gG 5e"cla cromognica$1,&# gG Sor)itol$7,5 g, Cloruro de sodio$5,? g, -gar$12,? g 1)1 .reparacin .e acuerdo a la cantidad deseada, pesar el polvo en proporcin de &&,? g=4 de agua destilada o desioni"ada -7ustar el pH, de ser necesario, el cual despus de esterili"ar de)er* encontrase en 7,? D ?,% Hervir 'asta disolucin completa y distri)uir /O ES&E01213%0 E/ %4&OC2%5E) 1)" .reparacin de las placas del Medio CromoCen- ECCS) Hransfiera inmediatamente a un )a>o con temperatura de && a &7 EC .ispense el medio en placas de ;etri estriles y de7e solidificar 1nmediatamente ante de su uso, se(ue las placas en posicin invertida en el 'orno a temperatura entre 25$55 EC, por un tiempo suficiente 'asta (ue la superficie del medio est seca ") .rue(a de Citocromo o6idasa 4a prue)a de)e reali"arse con un asa de platino para evitar los resultados falsos positivos E+isten 2 mtodos para su deteccin: en placa directa, indirecto de Kovacs y el mtodo de tiras o discos impregnados con el reactivo tetrametil /o dimetil0CpCfenilendiaminaG este 8ltimo tiene la venta7a de ser m*s r*pido, m*s econmico, y (ue el reactivo permanece esta)le por lo menos 'asta : meses despus de preparado Procedimiento: Homar con un asa de platino, previamente esterili"ada a la llama, la colonia de inters y frotarla so)re el papel de filtro impregnado con el reactivo Interpretacin: 4a presencia de una coloracin a"ul o marrn /en dependencia del reactivo (ue se use0 indica una prue)a positiva y por consiguiente la presencia de la en"ima citocromo o+idasa en el microorganismo $) .rue(a 07pida de indol Prueba de Arnold Weaver 5edios de cultivo: Caldo de triptona /-gua de peptona0 conteniendo triptfano Composicin: Hidroli"ado en"im*tico de case<na$ 1?,? gG cloruro de sodio$ 5,? g $)1 .reparacin: Suspender 15 g en 1 4 de agua destilada o desioni"ada, me"clar )ien, distri)uir y esterili"ar a 1%1 EC por 15 min $)" .rocedimiento: 1nocule con gran a)undancia un cultivo puro proveniente en cantidades de ?,& m4 de caldo de triptona /agua de triptona0 conteniendo triptfano 1ncu)e a 27 AC durante % ' -gregue reactivo de Kovac y agite suavemente 1nterpretacin: El color ro7o en la capa reactiva indica formacin de indol !) .rue(a 07pida de 8%9 *8lutamato descar(o6ilasa, :orma de presentacin: Jul)o con 5 m4 del reactivo suficiente para %5 prue)as Almacenamiento: El reactivo de)e ser almacenado entre % C # C Ja7o estas condiciones el producto permanecer* 8til 'asta la fec'a de caducidad (ue figura en la eti(ueta Manipulacin: Io de7ar (ue el reactivo se contamine por mal mane7o de las muestras -segurarse (ue los )ul)os est*n )ien cerrados tras su uso para evitar la contaminacin y desecacin del reactivo Hras su utili"acin colocar los )ul)os en refrigerador, asegur*ndose (ue los recipientes (ueden en posicin vertical
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Procedimiento: 1 ;ermitir (ue el reactivo alcance la temperatura del am)iente % .ispensar en tu)os de cultivo transparentes y estriles ?,% m4 de solucin salina al ?,#5 L estril 2 ;icar una colonia de inters y suspenderla en la solucin salina antes mencionada & - la suspensin preparada se le a>ade ?,% m4 del reactivo de !-. en condiciones aspticas 5 El tu)o se incu)a a 25 AC durante & ' o)servando cada 2? min Interpretacin: Cual(uier cam)io de color de amarillo a verde o a"ul se considera como reaccin positiva Almacenamiento del medio CromoCen ECCS: 5antener el frasco con el medio des'idratado 'ermticamente cerrado en lugar seco, fresco, protegido de la lu", a temperatura de 15 a 2? EC Se podr* almacenar las placas listas para el uso por un per<odo de 2? d<as a temperatura de % a # EC, protegidas de la lu" Para mayor in ormacin diri!irse a: .epartamento de ventas: 1ng Carlos ;rendes, tel #$#1$7?$%&, e$mail: prendesM)iocen cu -sistencia tcnica: .rC Faisa N'ur)enBo, tel ?&7$:#$%&&1, e$mail: raisaM)iocen cu 9iagramas de flu;o para la determinacin de Escherichia coli O157:H7 en muestras de alimentos con el empleo del medio CromoCen- ECCS
%: %islamiento e identificacin de E" coli O157:H7 por el mtodo cromognico con el medio CromoCen- ECCS 5uestra en agua peptona )uferada /opcional, si es para recuento, no e7ecutar0 /Homogeneice0 1ncu)e a 25 D % EC por %& ' 1nocule la placa de CromoCen- ECCS por agotamiento del inculo en la superficie /estr<as0 o por inundacin de la superficieG ?,%$?,5 m4 para muestras l<(uidas, directamente de la muestra o del cultivo en caldo, o con el tama>o de muestra recomendadoG o a partir de diluciones 1ncu)e a 25 D % EC por 1# $ %& ' 1dentifi(ue E. coli O157:H7 como colonias de color a"ul verdosas, con )ordes trasl8cidos, sin fluorescencia, 4as colonias son confirmadas para su reaccin positiva a la prue)a de citocromo o+idasa, !-. /o indol0 y aglutinacin con antisueros O157 y H7 ;rocese los resultados B: 9eteccin identificacin <=o recuento de E" coli coliformes < Pseudomonas# por el mtodo cromognico con el medio CromoCen- ECCS ;repare la muestra seg8n su origen y el mtodo de siem)ra a emplear ;ara muestras slidas, suspenda la muestra en agua peptonada, agua peptonada tamponada, o seg8n proceda .e ser necesario, prepare diluciones seriadas seg8n los niveles de contaminacin esperados 1nocule la placa de CromoCen- ECCS por agotamiento del inculo en la superficie /estr<as0 o por inundacin de la superficie con ?,%$?,5 m4 para muestras l<(uidas, directamente de la muestra, caldos, o a partir de las diluciones seriadas 1ncu)e a 25 D % EC por 1# $ %& ' ;ara coliformes fecales o para diferenciar Pseudomonas aeruginosa de otras Pseudomonas /opcional0 incu)e a &% D % EC por 1# $ %& ' 1dentifi(ue y=o cuente las colonias diana seg8n se descri)e en el presente mtodo Confirme si es necesario con las prue)as adicionales (ue se descri)en /!-. o indol para E. coli, o citocromo o+idasa para Pseudomonas0
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;rocese los resultados

C: Deteccin, identificacin y/o recuento de Salmonella, por el mtodo cromognico con el medio CromoCen- ECCS