PROTENAS

La verdadera educacin consiste en obtener lo mejor de uno mismo. Qu otro libro se puede estudiar mejor que el de la Humanidad? Mahatma Gandhi

22/10/2012.

REPBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA MINISTERIO DEL PODER POPULAR PARA LA EDUCACIN SUPERIOR UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE BIOANLISIS CTEDRA DE BIOQUIMICA I

UNIDAD I: PROTENAS

INTEGRANTES:

GORDON, JENNIFER HERNNDEZ, STEFANI MRQUEZ, VALERIA OLIVEROS, MARA J.

C.I. 19.967.638 C.I. 18.995.884 C.I. 21.323.888

C.I 19.314.631

Caracas, 22 de Octubre de 2012.

INTRODUCCIN Las protenas son polmeros de 20 -aminocidos unidos mediante enlaces peptdicos y van a mostrar una amplia variacin en sus tamaos y formas. Sus propiedades qumicas y fisiolgicas dependen no slo de su tamao y forma, sino tambin de las propiedades de los aminocidos que las componen. Las protenas son molculas extremadamente complejas con el fin de mantener la multiplicidad de sus funciones. Desempean una enorme variedad de funciones: unas transportan y almacenan molculas pequeas; otras constituyen gran parte de la organizacin estructural de las clulas y tejidos. La contraccin muscular, la respuesta inmunitaria y la coagulacin de la sangre se producen mediante protenas. Todas las protenas son polmeros, y los -aminocidos son los monmeros que se combinan para formarlas, en donde el grupo amino esta unido al carbono , el carbono contiguo al grupo carboxilo; de all proviene el nombre de -aminocidos. Al carbono de cada aminocido tambin estn unidos un tomo de hidrogeno y una cadena lateral . La variedad de cadenas laterales permite que las protenas gocen de una gran versatilidad estructural. Los distintos -aminocidos se diferencian por sus cadenas laterales. En condiciones fisiolgicas los aminocidos se encuentran como formas zwitterion a pH neutro en las que el grupo carboxilo ha perdido un protn y el grupo amino ha ganado uno.

En los genes de todos los organismos estn codificados veinte aminocidos diferentes que incorporan a las protenas y poseen una preferencia absoluta del ismero L. Los aminocidos pueden unirse entre ellos de modo covalente por formacin de un enlace amida entre el grupo -carboxilo de un aminocido y el grupo -amino de otro; producida por eliminacin de los elementos del agua. Esta unin covalente se denomina enlace pepitico y los productos que se forman a partir de esta unin se llaman pptidos. El enlace peptdico se encuentra en un plano, y la forma trans es favorecida. Este enlace es metaestable y puede hidrolizarse fcilmente en presencia de catalizadores. Los oligopptidos y los polipptidos se forman por la polimerizacin de los aminocidos mediante estos enlaces. Para estudiar las Protenas se aprovechan las diferencias que existen entre ellas. Tales diferencias pueden ser de solubilidad, tamao, masa, carga elctrica o afinidad con otras molculas, por consiguiente existen diversas tcnicas que permiten analizar desde un punto de vista cualitativo y cuantitativo, el contenido proteico de diferentes muestras entre ellas las de carcter biolgico. Cualitativas: Factores que afectan la solubilidad: El estudio de los factores que afectan la solubilidad de las protenas, ha permitido idear gran cantidad de mtodos para precipitar estas sustancias de sus soluciones.

 Reacciones de coloracin: Son debida a la interaccin entre uno o ms radicales de los aminocidos que constituyen una protena y los reactivos que se emplean en cada una de las pruebas. Cuantitativas: Mtodo de Lowry: Es un mtodo colorimtrico de valoracin en donde a las muestras se le aade un reactivo que forma un complejo coloreado con las protenas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de Lambert-Beer. Mtodo de Biutet: Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos). Estos son los comnmente empleados para la determinacin y cuantificacin de las Protenas, en donde ambos requieren la realizacin de una curva de calibracin. Tcnicas de Separacin y Anlisis Cromatografa: Permite separar uno o varios componentes presentes en mezclas proteicas y en general depende de las afinidades diferenciales de los solutos entre dos fases inmiscibles.

 Electroforesis:

Permite

caracterizar

diversas

protenas

basndose en los pesos moleculares, carga, forma y tamao de las mismas. El trabajo en el laboratorio implic: Reconocer las caractersticas generales de aminocidos, pptidos y protenas como factores que afectan su solubilidad y reacciones de coloracin generales y especificas Desarrollar procedimientos bsicos para el aislamiento de la casena de la leche y su respectiva valoracin. Conocer los fundamento y el manejo de las metodologas generales que permitan separar y cuantificar diversas molculas presentes en diversas muestras. En donde se requiri del total dominio de algunos conceptos bsicos en relacin con el tema, conocer tericamente las experiencias que se desarrollaron y los posibles resultados.

SEMANA I PARTE I: FACTORES QUE AFECTAN LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTENAS.

FUNDAMENTO TERICO Para entender ms la siguiente practica debemos considerar y conocer los siguientes conceptos:

Un pptido: son un tipo de molculas formadas por la unin de varios aminocidos mediante enlaces pptidos.

Aminocido: es una molcula orgnica con un grupo amino y un grupo carboxilo unidos a un carbono central.

La unin de varios aminocidos da lugar a cadenas llamadas polipptidos o simplemente pptidos, que se denominan protenas cuando la cadena polipptida supera a los 50 aminocidos. Aunque se han descrito ms de 300 aminocidos diferentes, solo 20 de ellos suelen encontrarse como sustituyentes de las protenas.

Las protenas: Las protenas son macromolculas formadas por cadenas lineales de aminocidos. Las protenas desempean un papel fundamental para la vida y son las biomolculas ms verstiles y ms

diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo. Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan:

Estructural. Esta es la funcin ms importante de una protena (Ej: colgeno). Inmunolgica (anticuerpos). Enzimtica (Ej: pepsina). Contrctil (actina y miosina). Homeosttica: colaboran en el mantenimiento del pH (ya que actan como un tampn qumico). Transduccin de seales (Ej: rodopsina). Protectora o defensiva (Ej: trombina y fibringeno).

Tambin hay que resaltar los niveles de organizacin de las protenas:

REACCIONES DE PRECIPITACIN Si en una disolucin de protenas se producen cambios de pH, alteraciones en la concentracin, agitacin molecular o variaciones bruscas de temperatura, la solubilidad de las protenas puede verse reducida hasta el punto de producirse su precipitacin.

1. ACCIN DE LA TEMPERATURA. La mayora de las protenas son solubles en el intervalo de 0C y 40C, pero a temperaturas superiores de 40 C se hacen inestables y comienzan a desnaturalizarse con prdida de la solubilidad ocurriendo en consecuencia la precipitacin. Cuando la temperatura es elevada aumenta la energa cintica de las molculas con la que se desorganiza la envoltura acuosa de la protena y se desnaturaliza; as mismo con un aumento de la temperatura las interacciones dbiles ocasionan la desorganizacin de la protena de forma que el interior hidrfobo interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada.

3 ml Sol. Albmina 5%. T= 4C. t= 15min.

SOLUBLE

 3 ml Sol. Albmina 5%. T= 25C. t= 15min.

SOLUBLE

3 ml Sol. Albmina 5%. T= 60C. t= 15min.

PRECIPITADO BLANCO TURBIO

3 ml Sol. Albmina 5%. T= 100C. t= 15min.

PRECIPITADO BLANCO COMPACTO

2. ACCIN DE LOS ALCOHOLES.

Con la adicin de los solventes orgnicos que sean neutros y miscibles en agua como la acetona y etanol el cual fue el reactivo a utilizar; estos solventes disminuyen la solubilidad en agua de muchas protenas de la disolucin. La polaridad del disolvente disminuye cuando se le aaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona con ello disminuye el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la molcula proteica, provocando la agregacin y precipitacin. Los disolventes orgnicos interaccionan con el interior hidrfobo de las protenas y desorganizan la estructura terciaria de la protena provocando su desnaturalizacin y precipitando.

Otro punto de vista es respecto a la constante dielctrica (propiedad fsica que refleja el nmero de dipolos de un solvente); los solventes causan precipitacin de las protenas ya que disminuye la constante dielctrica y por lo tanto aumentan las interacciones proteina-proteina. Dado que la constante dielctrica del etanol (32.7) es menor que la del agua (78.5), su adiccin a una solucin acuosa de protena incrementa la fuerza de atraccin entre cargas opuestas y de esta forma se disminuye el grado de ionizacin de los grupos R de las protenas como anteriormente lo mencionamos provocando agregados y la precipitacin.

3 ml Sol. Albmina 5%. 3 ml de Etanol 95%. T= 25C. t= 5min. 3 ml Sol. Albmina 5%. 3 ml de Etanol 95%. T= 40C. t= 5min.

Precipitado blanco en la interfase, (separados por dos lquidos de diferentes densidades).

PRECIPITADO GRANULAR.

3. ACCIN DE SALES.

La adicin de sales neutras a una solucin de protenas disminuye la atraccin de las molculas protecas aumentando as su solubilidad, todo lo contrario con respecto a la adicin de solventes orgnicos donde aumenta

daba la atraccin. En el caso de las sales hablamos del fenmeno conocido como salting in o solubilizacin por salado; en este caso si se sigue agregando sal se alcanza una concentracin en la que por causa de la competicin de los iones salinos por las molculas de agua, las protenas se deshidratan, ocasionando una disminucin de su solubilidad produciendo una precipitacin salina o salting out. En el momento que los iones compiten por las molculas de agua hay rompimiento de los puentes de hidrogeno o de las interacciones electroestticas, de forma que las molculas proteicas se agreguen y precipiten.

La reaccin que se ve involucrada en la parte experimental es la Reaccin de Robert donde se nota un aumento de la fuerza inica del medio por la adicin de la solucin cida de sulfato de magnesio tambin provoca una disminucin en el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la protena ya que estos compiten por el agua y rompen los puentes de hidrogeno o las interacciones electroestticas provocando que las molculas proteicas precipiten o se agregan.

2 ml Sol. Albmina 5%. 2 ml de Reactivo de Robert. 2 ml Sol. Casena 2%. 2 ml de Reactivo de Robert.

Precipitado blanco (velloso) consistente.

Precipitado blanco (velloso globular) formacin de un slido en el fondo.

2 ml Sol. Gelatina 2%. 2 ml de Reactivo de Robert.

NO PRECIPITO (SOLUBLE)

2 ml Sol. Glicina 1%. 2 ml de Reactivo de Robert.

NO PRECIPITO (SOLUBLE)

2 ml Sol. Resorcina 1%. 2 ml de Reactivo de Robert.

NO PRECIPITO (SOLUBLE)

4. ACCIN DE CIDOS

Algunas protenas en presencia de cidos forman sales insolubles. En el caso que el cido actue con la forma catinica de la molcula de protena se produce un enlace tipo salino entre los grupos aminos (de la protena) y el radical negativo del cido por lo tanto el medio debe presentar un pH por debajo del punto isoelctrico. De igual manera est el caso donde el cido acta con la forma anionica de la protena con los grupos carboxilos y el radical positivo del cido formando un enlace tipo salino y por lo tanto el medio debe tener un pH superior al punto isoelctrico de la protena.

Solucin A: 0.66N de H2SO4

Solucin B: NA2WO4 10 %

2 ml Sol. Albmina 5%. 1 ml de Sol A. 1 ml Sol B.

Precipitado blanco flocular.

2 ml Sol. Casena 2%. 1 ml de Sol A.

1 ml Sol B.

Precipitado blanco compacto.

2 ml Sol. Gelatina 2%. 1 ml de Sol A.

1 ml Sol B.

Precipitado blanco globular velloso.

2 ml Sol. Glicina 1%. 1 ml de Sol A. 1 ml Sol B.

NO PRECIPITO.

2 ml Sol. Resorcina 1%. 1 ml de Sol A. 1 ml Sol B.

NO PRECIPITO.

ANLISIS DE RESULTADOS FACTORES QUE AFECTAN LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTENAS Cuando la protena no ha sufrido ningn cambio en su interaccin con el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa. Se

llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptdica reducida a un polmero sin ninguna estructura tridimensional fija. Cualquier factor que modifique la interaccin de la protena con el disolvente disminuir su estabilidad en disolucin y provocar la

precipitacin. As, la desaparicin total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralizacin de las cargas elctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrgeno facilitarn la agregacin intermolecular y provocar la precipitacin. La precipitacin suele ser consecuencia del fenmeno llamado desnaturalizacin. En una protena cualquiera, la estructura nativa y la desnaturalizada tan slo tienen en comn la estructura primaria, es decir, la secuencia de aminocidos que la componen. En estos casos las protenas se transforman en filamentos lineales y delgados que se entrelazan hasta formar compuestos fibrosos e insolubles en agua. Los dems niveles de

organizacin estructural desaparecen en la estructura desnaturalizada. La desnaturalizacin provoca diversos efectos en la protena: 1. Cambios en las propiedades hidrodinmicas de la protena: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusin.

2. Drstica disminucin

de

su

solubilidad,

ya

que

los

residuos

hidrofbicos del interior aparecen en la superficie. 3. Prdida de las propiedades biolgicas. Una protena desnaturalizada cuenta nicamente con su estructura primaria. Por este motivo, en muchos casos, la desnaturalizacin es reversible ya que es la estructura primaria la que contiene la informacin necesaria y suficiente para adoptar niveles superiores de estructuracin. El proceso mediante el cual la protena desnaturalizada recupera su estructura nativa se llama renaturalizacin. Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificacin de protenas, ya que no todas la protenas reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta. En algunos casos, la desnaturalizacin conduce a la prdida total de la solubilidad, con lo que la protena precipita. La formacin de agregados fuertemente hidrofbicos impide su renaturalizacin, y hacen que el proceso

sea irreversible. Los agentes que provocan la desnaturalizacin de una protena se llaman agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes fsicos (calor)

y qumicos (disolventes orgnicos, pH, fuerza inica). Como en algunos casos el fenmeno de la desnaturalizacin es reversible, es posible precipitar protenas de manera selectiva mediante cambios en:

Polaridad del disolvente. Fuerza inica. El pH. Temperatura.

El estudio de los factores que afectan la solubilidad de las protenas, ha permitido idear gran cantidad de mtodos para precipitar estas sustancias de sus soluciones. Tales cambios fueron estudiados y se explicaran a continuacin: La Accin de la temperatura. solucin de albumina al 5% fue la muestra a ensayar y al

someterla a una temperatura primero de 4C y luego a 25C se obtuv que fueron solubles ya que ambas estaban en el intervalo de OC y 40C, en donde la mayora de las protenas globulares experimentan solubilidad. Cuando la temperatura supera este intervalo como lo fue en el caso de 60C y 100C la albumina precipit, esto como consecuencia del aumento de la energa cintica de las molculas con lo que se desorganizo la envoltura acuosa de la protena, y se desnaturaliz. El aumento de la temperatura destruye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de la protena, de forma que el interior hidrfobo interacciona con el medio acuoso, afectando la solubilidad de la misma, debido a que los iones H+ y OH- afectan la carga elctrica de los grupos de los aminocidos, lo que ocasiona la ruptura de las interacciones electrostticas y se produce la precipitacin de la protena desnaturalizada. Accin de Solventes orgnicos.

La solucin de albumina al 5% al adicionarle etanol a una temperatura de 25C se obtuvo un precipitado y como consecuencia disminuy la solubilidad en agua de gran parte de la protena cuando se le agreg una sustancia menos polar como el etanol, as tambin el grado de hidratacin de

los grupos inicos superficiales de la molcula proteica, provocando la agregacin y precipitacin. Los disolventes orgnicos interaccionan con el interior hidrfobo de las protenas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalizacin y precipitacin. El principal efecto es la reduccin del poder de solvatacin del agua (asociacin de molculas de un disolvente con molculas o iones de un soluto) que puede ser explicado en trminos de una disminucin de la constante dielctrica del agua. Accin de las sales. Se emple el reactivo de Robert (sal cida de sulfato de magnesio) que es una prueba cualitativa para observar si hay protenas, en donde dos de las soluciones empleadas: Albumina 5% y Casena 2% Precipitaron. Esto se debe a que al agregar el reactivo se saturar la capacidad de solubilizacin del solvente y las molculas de sal tienden a competir con las molculas de protenas por el solvente con el objeto de mantenerse en solucin. Al ser la sal ms soluble que la protena, est se une al solvente por consiguiente la protena deshidratada y precipita. Hay que acotar que la solucin de gelatina debi precipitar ya que se trataba de una protena al igual que las otras dos soluciones mencionadas anteriormente, pero por problemas en la muestra no se observ dicho precipitado. Las dos muestras restantes no precipitaron ya que la glicina se trataba de un aminocido libre y la resorcina de un compuesto aromtico no proteico.

Accin de cidos (Tngstico). Se emple para acidificar las soluciones de cido Tngstico, en

donde tres de las muestras empleadas: Albumina 5%, casena 2% y gelatina 2% Precipitaron. Esto se debi a que por ser un precipitante

aninico form sales insolubles con las formas catinicas de la molcula proteica, en donde se produjo un enlace de tipo salino entre los grupos aminos de la protena y el radical del cido. Presentando el medio un valor de pH por debajo del punto isoelctrico ya que es una condicin indispensable para que se d la precipitacin. Las dos muestras restantes no precipitaron ya que la glicina se trataba de un aminocido libre y la resorcina de un compuesto aromtico no proteico; no es como tal unas protenas.

SEMANA I- PARTE II: AISLAMIENTO DE LA CASENA.

FUNDAMENTO TERICO.

200 ml de leche LOS ANDES. 20 ml de agua. HCL gota a gota hasta obtener pH aproximadamente de 4,8.

REPOSAR 15 MINUTOS.

Filtrar con un pauelo

3 lavados al slido (casena) con alcohol.

Recoger la casena y colocarla en un vidrio de reloj a temperatura ambiente.

Un lavado con ter.

Protenas Totales (Cantidad gr/dl)

Leche los Andes

Terico Casena
gr/100ml 2.40 % 100

Prctico Casena
gr/100ml 6,36 % 265

3gr/100ml

Aislamiento de la Casena de la leche

Informacin Nutricional
Energa (cal) Grasa (g) Carbohidratos (g) Protenas (g) Calcio (mg) 130 7 10 6 240 *Tamao de 200 ml 11% 3% 13% 45%

 Protenas Totales
6g -------------- 200ml X -------------- 100ml

2.40g/100ml

2.40g -------------- 200 % 6,36g-------------- X

530% / 200ml 265% / 100ml

ANLISIS DE RESULTADOS Aislamiento de la casena de la leche La leche es una secrecin nutritiva de color blanquecino opaco

producida por las glndulas mamarias de las hembras de los mamferos y sirve de alimento nutritivo, ya que contiene: protenas, lpidos, lactosa, sales inorgnicas y vitaminas. La casena es una fosfoprotena presente en

la leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogur o el queso), esta protena conjugada que posee fsforo como grupo prosttico. En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha denominado caseingeno. Como muchas otras protenas de origen animal, esta es de un alto valor biolgico, ya que posee todos los aminocidos esenciales para el desarrollo y crecimiento normal del ser humano. Por otro lado, existen otros tipos de protenas contenidas en la leche como la lactoalbmina y la lactoglobulna. La separacin de la casena se realiz mediante la precipitacin con cido y junto a sta, cierta cantidad de grasa que se extrajo con solventes orgnicos en los que la casena fue insoluble. La grasa se extrajo con ter y el alcohol para deshidratar. Al acidificar se evidencia, que al disminuir el pH de la leche se van rompiendo los enlaces entre los grupos fosfato y el ion calcio, al reducirse la ionizacin de los fosfatos. Luego, las repulsiones entre las micelas se reducen, al acercarse el pH al punto isoelctrico de la casena (4.7). El pH de la leche es aproximadamente 6,6 estando a ese pH la casena se encuentra cargada negativamente y solubilizada como sal clcica. Al aadir el cido a la leche, la carga negativa de la superficie de la

micela se neutraliz (los grupos fosfato se protonaron) y la protena neutra precipit. Ca2+ Caseinato + 2HCl Casena + CaCl2

El rendimiento de casena obtenido experimentalmente fue muy elevado en comparacin con los datos que suministraba la informacin nutricional de la leche con la que se trabaj, obtenindose un porcentaje mayor de lo esperado, con una diferencia de 3,96 g/100ml del valor terico. Los posibles factores que influyeron en los valores obtenidos se atribuyen a la presencia de: H2O y grasas, ya que se trabaj con leche pasteurizada y no descremada; debido a que esta evitaba en gran parte que interfiera la grasa en el proceso de aislamiento. Por otro lado, la notable variacin de resultados puede atribuirse a posibles fallas cometidas por parte de los experimentadores durante la ejecucin del procedimiento. Las fallas ms comunes en el proceso de aislamiento son las asociadas a la incorrecta extraccin de grasas.

SEMANA II- PARTE I: REACCIONES DE COLORACIN.

Reacciones de coloracin:

REACCIONES DE COLORACIN: GENERALES Y ESPECFICAS FUNDAMENTO TERICO. Las reacciones de coloracin se deben a los enlaces de los radicales R que forman los aminocidos que constituyen las protenas. Estas pueden ser especificas o generales. Reacciones Generales: Se utilizan para reconocer la presencia de protenas y o sus derivados en materiales biolgicos entre estas tenemos: Reaccin de Biuret:

Los pptidos y protenas producen una reaccin coloreada muy usada para la valoracin de los mismos, llamada reaccin de Biuret molcula formada a partir del calentamiento de la urea 180C. La reaccin se basa en la formacin de un compuesto de color violeta, debido a la formacin de un complejo en medio alcalino entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno y el oxgeno que forma parte de los enlaces peptdicos (- CONH -) que se destruye al liberarse los aminocidos por lo que estos no dan positivo. Se necesitan 2 ms uniones peptdicas para que se forme el complejo coloreado es por ello que esta prueba sirve para la identificacin de tripptidos en adelante, la cantidad de color producido es proporcional a la concentracin de enlaces peptdicos en las protenas.

Solucin A: Hidrxido de sodio 40%.

Solucin B: Sulfato de cobre 1% 2 ml Sol. Albmina 5%. 2 ml Sol A. 2 ml Sol B.

2 ml Sol. Casena 2%. 2 ml Sol A. 2 ml Sol B.

Coloracin Violeta Intenso (positivo)

Coloracin Violeta Claro (positivo)

2 ml Sol. Gelatina 2%. 2 ml Sol A. 2 ml Sol B.

Coloracin Violeta Intenso (positivo)

2 ml Sol. Glicina 1%. 2 ml Sol A. 2 ml Sol B.

Coloracin Azul (negativo)

 2 ml Sol. Resorcina 1%. 2 ml Sol A. 2 ml Sol B.

Coloracin Verde (negativo)

2 ml Sol. Histidina 1%. 2 ml Sol A. 2 ml Sol B.

Coloracin Azul (negativo)

2 ml Sol. Arginina 1%. 2 ml Sol A. 2 ml Sol B.

Coloracin Azul (negativo)

2 ml Sol. Tirosina 1%. 2 ml Sol A. 2 ml Sol B.

Coloracin Azul (negativo)

Reaccin de Ninhidrina: Es un agente oxidante poderoso y lleva a cabo la determinacin oxidativa de los grupos alfa-amino, liberando amoniaco, bixido de carbono y el correspondiente aldehdo, as como la forma reducida de la ninhidrina. El amoniaco entonces reacciona con un mol adicional de ninhidrina oxidada y un mol de ninhidrina reducida para dar una sustancia de color azul violeta, todas las protenas, peptonas, pptidos y aminocidos que tengan un grupo carboxilo y amino libre darn positivos.

Solucin: Ninhidrina 1% en alcohol. 2 ml Sol. Albmina 5%. 8 gotas de Ninhidrina. 5 min en agua a 100 C
2 ml Sol. Casena 2%, 8 gotas de Ninhidrina. 5 min en agua a 100 C

Coloracin Azul (positivo).

Coloracin Violeta (positivo).

2 ml Sol. Gelatina 2%, 8 gotas de Ninhidrina. 5 min en agua a 100 C 2 ml Sol.Resorcina 1%, 8 gotas de Ninhidrina. 5 min en agua a 100 C 2 ml Sol.Arginina 1%, 8 gotas de Ninhidrina. 5 min en agua a 100 C. 2 ml Sol.Histidina 1%, 8 gotas de Ninhidrina. 5 min en agua a 100 C.

Coloracin Violeta (anillo) (positivo)

Incoloro (negativo)

Coloracin Violeta (positivo)

Coloracin Violeta (positivo)

2 ml Sol. Glicina 1%. 2 ml Sol A. 2 ml Sol B.

Coloracin Violeta (positivo)

2 ml Sol. Tirosina 1%. 2 ml Sol A. 2 ml Sol B.

Coloracin Violeta (positivo)

Reacciones Especficas: Son aquellas que se utilizan para determinar la presencia de protenas y sus derivados en la muestra. Entre ellas tenemos: Reaccin Xantoproteica: Se utiliza para la identificacin del grupo hidroxibenceno, la reaccin es debida a la nitracin del anillo bencnico con el cido ntrico concentrado, para dar productos de color amarillo, que se tornan anaranjados al aadir lcali, debido a la formacin de sales. En las condiciones del experimento solo la tirosina y el triptfano darn positivo a la prueba la fenilalanina no porque es ms difcil de nitrar por lo que requerira de cido sulfrico como catalizador. Formndose primero un precipitado blanco al aadir el cido ntrico concentrado al calentar, ese precipitado de vuelve amarillo y si la solucin se hace alcalina, el precipitado finalmente se torna anaranjado.

Solucin A: Hidrxido de sodio 40%.

Solucin B: cido Ntrico concentrado

Reaccin Xantoproteica
Al mezclar la muestra con HNO3 Al calentar 4 min a 100C Al agregar 1 gota de NaOH Grupo R Aminocidos Presentes.

2 ml Albumina

Coloracin Amarilla.

Coloracin Amarilla

Coloracin Naranja (Positivo)

Anillo bencnico

Tyr. Trp. Phe.

2 ml Casena

Coloracin Amarilla.

Coloracin Amarilla.

Coloracin Naranja (Positivo)

Anillo bencnico

Tyr. Trp. Phe.

2 ml Gelatina

Incoloro (negativo)

Incoloro (negativo)

Coloracin Naranja (Positivo)

Anillo bencnico

Tyr. Trp. Phe.

2 ml Glicina 2 ml Resorcina

Incoloro (negativo) Coloracin Vinotinto.

Incoloro (negativo) Coloracin Vinotinto

Incoloro (negativo) Coloracin Naranja (Positivo) Anillo bencnico -

2 ml Histidina 2 ml Arginina 2 ml Tirosina

Incoloro (negativo) Incoloro (negativo) Coloracin amarilla

Incoloro (negativo) Incoloro (negativo) Coloracin amarilla

Incoloro (negativo) Incoloro (negativo) Coloracin Naranja (Positivo) Anillo Bencnico tirosina. -

Reaccin de Million: Llamada tambin de Hofmann, es especfica para determinar tirosina, aunque lo que se determina son los grupos hidroxifenilos que pueden nitrarse fcilmente. El reactivo es una solucin de nitrato mercrico con acido ntrico; el color rojo que se forma al reaccionar la tirosina con el reactivo se cree que se debe al complejo mercrico con los derivados nitrofenol. Cuando se aade el reactivo a una solucin proteica, se forma primero un precipitado blanco, que corresponde a la protena coagulada por el calor, pero si la protena contiene tirosina, ese cogulo tomara un color rojo al prolongar el calentamiento.

Solucin A: Mercurio Metlico 100g.

Solucin B: cido Ntrico 140 ml.

Reaccin de Milln
Al mezclar la muestra con 5 gotas del reactivo de Milln. Al calentar 2 min a 100C Grupo R Aminocidos Presentes.

2 ml Albumina

Precipitado Precipitado Blanco Rojo. (Positivo) Precipitado Hidroxibenceno.

Tyr.

2 ml Casena

Precipitado Blanco.

Rojo. (Positivo)

Hidroxibenceno.

Tyr.

2 ml Gelatina 2 ml Glicina 2 ml Resorcina 2 ml Histidina 2 ml Arginina

Precipitado Blanco. Incoloro (negativo)

Negativo Incoloro (negativo) Incoloro (negativo) Incoloro (negativo) Incoloro (negativo) Precipitado Hidroxibenceno. -

Precipitado Blanco.

Incoloro (negativo)

Incoloro (negativo)

2 ml Tirosina

Precipitado Blanco.

Rojo. (Positivo)

Hidroxibenceno.

Tirosina

Reaccin de HopsKings-Cole: Los derivados indol dan productos de condensacin cuando se tratan con aldehdos aromticos en presencia de cido sulfrico o clorhdrico; el aminocido triptfano contiene un grupo indol y por eso la reaccin es especfica para el triptfano. Cuando se agrega el reactivo a una solucin y se aade lentamente una capa de cido sulfrico concentrado, se formara un anillo de color violeta en la interface de los lquidos.

Reactivo Glioxlico(p/v): Mg 10g en 250 ml sol. Sat. Ac. Oxlico. cido sulfrico concentrado.

Reaccin Hopkins- Cole

Al mezclar la muestra con 2 ml del Reactivo Glioxlico y con 2 ml acido sulfrico Grupo R Aminocidos Presentes.

Formacin de interfase 2 ml Albumina violeta (Positivo) Formacin de interfase 2 ml Casena violeta (Positivo) 2 ml Gelatina 2 ml Glicina No se Form una interfase Anillo Indol. Anillo Indol. Anillo Indol

Trp.

Trp.

Trp.

No se Form una interfase

2 ml Resorcina 2 ml Histidina No se Form una interfase No se Form una interfase Anillo Indol

2 ml Arginina

No se Form una interfase

2 ml Tirosina

No se Form una interfase

Reaccin de Sakaguchi: Es una reaccin de los compuestos que contengan grupo guanido o guanidino. De ah que sea una indicacin de la presencia de arginina libre o en protenas. La prueba consiste en tratar la muestra con alfa-naftol e hipoclorito de sodio o hipobromito de sodio con lo cual se desarrollara un color rojo pardusco.

Hidrxido de Sodio 40%.

Hipoclorito de Sodio 5%.

-naftol en etanol 1%

Reaccin de Sakaguchi.
Al mezclar la muestra con 10 gotas de NaOH , 3 gotas de -naftol y 20 gotas de NaOCl Grupo R Aminocidos Presentes.

3 ml Albumina

Coloracin Rojo parduzco. (Positivo) Coloracin Rojo guanidino

Arg.

3ml Casena

parduzco. (Positivo) Coloracin Rojo

guanidino

Arg.

3ml Gelatina

parduzco. (Positivo)

guanidino

Arg. .

3ml Glicina 3ml Resorcina 3ml Histidina 3ml Arginina 3ml Tirosina

Incoloro (negativo)

Incoloro (negativo)

Incoloro (negativo) Coloracin Rojo parduzco. (Positivo) Incoloro (negativo) guanidino Arg. -

Reaccin de Tiogrupos: Esta reaccin dar positiva con aquellos

aminocidos que presenten azufre en su estructura, como son la cistena, cistina y metionina. La reaccin consiste en someter la muestra a una hidrlisis alcalina con hidrxido de sodio segn la siguiente ecuacin; de esta manera el sulfuro de sodio se encuentra libre para reaccionar con el acetato de plomo obtenindose una coloracin negra o marrn evidenciando la presencia de azufre en la muestra.

Solucin A: Hidrxido de sodio 40%.

Solucin B: Acetato de plomo 10%

Reaccin de Tiogrupos
Al mezclar la muestra con 0.5 ml de NaOH y 2 gotas de Acetato de Plomo. Grupo R Aminocidos Presentes.

0.5 ml Albumina 0.5 ml Casena 0.5 ml Gelatina

Precipitado Negro (Positivo) Precipitado Negro (Positivo) Incoloro (negativo)

Azufre (S).

Cys. Met. Cys. Met. Cys. Met.

Azufre (S).

Azufre (S).

0.5 ml Glicina 0.5 ml Resorcina 0.5 ml Histidina 0.5 ml Arginina 0.5 ml Tirosina

Incoloro (negativo)

Incoloro (negativo)

Incoloro (negativo) -

Incoloro (negativo)

Incoloro (negativo)

Reaccin de Pauly: Las molculas proteicas que poseen grupos imidazol (Histidina) e Hidroxibenceno (tirosina) en su estructura

reaccionan con el reactivo de cido sulfanilco diazotizado formando compuestos de diazonio naranja y amarillo.

Nitrato de sodio al 5% Carbonato de Sodio 1% cido Sulfanilico 1% en HCL 1N

Reaccin de Pauly
Al mezclar la muestra con 1 ml de cido sulfanilico, 1 ml de NaNO2 y 2ml de Na2CO3 Grupo R Aminocidos Presentes.

2 ml Albumina 2 ml Casena 2 ml Gelatina 2 ml Glicina 2 ml Resorcina 2 ml Histidina 2 ml Arginina 2 ml Tirosina

Coloracin Amarillo (Positivo) Coloracin Amarillo (Positivo) Coloracin Amarillo (Positivo) Incoloro (negativo) Coloracin amarillo tenue (Positivo) Coloracin amarillo (Positivo) Incoloro (negativo) Coloracin amarillo (Positivo)

imidazol e Hidroxibenceno imidazol e Hidroxibenceno imidazol e Hidroxibenceno -

His. Tyr. His. Tyr. His. Tyr. -

Hidroxibenceno Histidina

imidazol

Hidroxibenceno

tirosina

SEMANA II- PARTE II: CROMATOGRAFA EN PAPEL.

MTODOS CROMATOGRFICOS. La cromatografa, permite separar uno o varios componentes presentes en mezclas moleculares, mediante una serie de procedimientos. Se basa en una diferencia de afinidades de los solutos entre dos fases inmiscibles. Una fase es estacionaria, la cual puede ser un slido poroso, finamente dividido o un lquido puesto en capas delgadas sobre un material de soporte inerte. La fase mvil puede ser un lquido puro o una mezcla de soluciones o puede ser un gas. Existen muchos tipos de cromatogrfias en la presente practica se estudiara la cromatografa en papel y de exclusin molecular. CROMATOGRAFA EN PAPEL: FUNDAMENTO: Es un mtodo de separacin que consta de una fase mvil que se desplaza por capilaridad en el papel de filtro, dicha fase la constituye la mezcla orgnica saturada con agua. Y el papel de filtro conforma la fase estacionaria. PROCEDIMIENTO: MUESTRAS o Tirosina 1% (p/v) en agua. o Arginina1% (p/v) en agua. o Mezcla de ambos aminocidos REACTIVOS Solvente Fase Mvil: Butanol 8ml. cido actico 2ml. Agua 10ml. Ninhidrina 0.5% en acetona

1. Cortar el papel de filtro del tamao rectangular, luego trazar una raya horizontal de 1cm en uno de los extremos.

2. Marcar tres x de distancias iguales. 3. Luego se siembra la muestra usando una pipeta automtica. 4. A medida que se va sembrando se va secando con el secador. 5. Se prepara la parte orgnica, luego se deja reposar para decantarlo y separarlo de la parte acuosa. 6. Se decanta y se vierte en la cubeta. 7. Se enrollan los papeles de filtro en los tubos de vidrio q se encuentran en la parte superior dejando que donde se coloc la muestra toque la solucin. 8. Se deja por un tiempo determinado y luego se saca para que sequen y se revelan con una solucin de ninhidrina. REVELADO: Una vez esperadas las 24 horas sacar el papel y dejar sacar al aire. Al papel de filtro se le salpica solucin de ninhidrina, luego se seca usando aire caliente con el secador y se procede a leer.

Resultados
Distancia recorrida por la muestra Distancia del frente del solvente Rf

Muestra

Tirosina 1% (p/v) en agua. Arginina 1% (p/v) en agua.

7.6 cm

14 cm

0.54

4.5 cm

14 cm

0.32

Luego proceder a determinar el Rf de cada muestra y comparar Rf de patrones con las muestras.

ANLISIS DE RESULTADOS REACCIONES DE COLORACIN Y CROMATOGRAFA EN PAPEL. Se realizaron dos experimentos, los cuales fueron las reacciones de coloracin generales, as como una gran variedad de reacciones

especficas; el otro experimento fue la cromatografa de papel. En el caso de las reacciones de coloracin, especficamente en las generales, se practicaron 2 tipos: la reaccin de Biuret y la reaccin de Ninhidrina. En la reaccin de Biuret los resultados positivos fueron: la albumina, casena y gelatina, esto se debe a que poseen 2 o ms enlaces peptdicos, ya que esta reaccin es especfica para las protenas que presenten estas caractersticas. Las dems muestras fueron negativas: glicina, Histidina, arginina y tirosina, esto se debe a que se tratan de aminocidos, los cuales no poseen enlaces peptdicos como para que den positivo en la reaccin. En el caso de la resorcina, dio tambin un resultado negativo, ya que no se trata de un aminocido, pptido o protena, sino que es un compuesto aromtico no proteico. En cambio, en el caso de la reaccin de Ninhidrina dio positivo para: albumina, casena, gelatina, glicina, Histidina, arginina y tirosina, ya que son tanto: aminocidos, pptidos o protenas, esto se debe a que poseen un extremo amino libre y un extremo carboxilo libre, para los que la Ninhidrina reacciona. En el caso de la resorcina obtuvo un resultado negativo, ya que, es un compuesto aromtico no proteico y no posee los extremos terminales a los cuales reacciona dicha reaccin.

Ambas reacciones generales demostraron ser eficaces para el reconocimiento de protenas, pero la Ninhidrina es ms general ya que abarca tanto: aminocidos, pptidos y protenas, en cambio la reaccin de Biuret es ms especfica, porque solo reacciona con los pptidos que posean 2 o ms enlaces peptdicos. Por otra parte, en las reacciones especificas se practicaron diversas de ellas las cuales fueron: la reaccin Xantoproteica, Milln, Hopkins-cole, Tiogrupos, Sakaguchi y Pauly, los resultados fueron diversos ya que estas reacciones se rebelan en presencia de compuestos qumicos en las cadenas laterales de: los aminocidos, pptidos o protenas. En el caso de la reaccin Xantoproteica, las muestras que dieron positivos fueron: albumina, casena, gelatina, resorcina y tirosina; esto se debe a que estas protenas y aminocidos poseen en sus cadenas laterales un anillo bencnico, por consiguiente estas muestras poseen los aminocidos: Fenilalanina, Tirosina y Triptfano, ya que son aminocidos aromticos; en el caso de las muestras que dieron negativas en esta reaccin se debe a que no poseen dicha estructura en sus cadenas laterales. Cabe destacar que la resorcina a pesar de no ser ni aminocido o protena, arrojo un resultado positivo ya que es un compuesto aromtico. En el caso de la reaccin de Milln los resultados positivos fueron de: albumina, casena, gelatina y tirosina, esto se debe a que en sus cadenas laterales poseen un radical de Hidroxibenceno, caracterstico de la tirosina al este reactivo es especfico. Las otras Muestras dieron negativo, ya que no poseen dicho aminocido. En cambio en el caso de la reaccin de Hopkins-Cole, las muestras cuyo resultado fue positivo fueron: albumina, casena y gelatina. Esto se debe a que estas protenas poseen el grupo qumico del anillo indol,

especifico del aminocido Triptfano. Las muestras que dieron negativo, se debe a que no poseen ni el anillo indol ni el aminocido triptfano. En la otra reaccin especfica, la cual fue la reaccin de Tiogrupos, la muestra que dio un resultado positivo fue la albumina, esto se debe a que en su estructura presenta azufre, la cual es caracterstica de los aminocidos como cistena y metionina. Las dems muestras dieron negativo, a pesar de que en el caso de la casena y la gelatina poseen cistena y metionina pero en pocas cantidades, lo que hace que no reaccione el reactivo con las protenas. En el caso de la reaccin de Sakaguchi, las muestras que dieron positivo fueron: albumina, casena, gelatina y arginina. En este momento esta reaccin positiva se debe a la presencia del grupo guanidino, el cual es especfico para el aminocido arginina, por consiguiente quiere decir que en las estructura de estas muestra presentan dicho aminocido. Las dems muestras reaccionaron negativas por no poseer arginina. La reaccin de Pauly da un resultado positivo en el caso de que en la estructura de las protenas o aminocidos presenten: el grupo imidazol, el cual es caracterstico del aminocido Histidina, las muestras que poseen ese aminocido fueron: albumina, casena y gelatina, pero solo dieron positivo para la reaccin la albumina y la casena, ya que la gelatina posee en pocas cantidades. El otro grupo al cual la reaccin de Pauly es especfica, es al hidroxibenceno caracterstico de la tirosina, y en este caso dieron positivo: albumina, casena, gelatina, resorcina y tirosina, recordando una vez ms que la resorcina no es un aminocido pero igual da positivo por poseer el grupo hidroxibenceno en su estructura. Las muestras que dieron negativo, es porque no poseen ninguno de los dos aminocidos.

Estas reacciones tanto generales como especficas, son de gran utilidad en el Laboratorio clnico, ya que pueden determinar cualitativamente la presencia de protenas, pptidos o aminocidos, presentes en una muestra biolgica, lo cual podra estar relacionado a alguna patologa, por lo que ayudara al diagnstico y a la bsqueda del tratamiento ms adecuado para el paciente. El otro experimento realizado fue la de la cromatografa en papel, la cual es fundamental para el anlisis bioqumico, debido a su capacidad de separar de manera eficiente molculas pequeas como aminocidos, oligopptidos, nucletidos y oligonucletidos. En esta cromatografa el solvente moja al papel por capilaridad debido a su naturaleza fibrosa; el componente acuoso del solvente se une a la celulosa del papel y forma con este una fase estacionaria de tipo gel. El componente orgnico del solvente contina migrando lo que constituye la fase mvil. Las velocidades de migracin de las distintas sustancias que se requieren separar estn gobernadas por sus solubilidades relativas en la fase estacionaria polar y la fase mvil no polar; en un solo paso del proceso de separacin cada soluto se distribuye de acuerdo a su coeficiente de particin por lo tanto, las molculas se separan de acuerdo a sus polaridades, de manera que las nos polares se mueven ms rpido que las polares. Las muestras usadas para este experimento fueron metionina y glicina como patrn y una mezcla de ambas para comparar y confirmar la presencia de esos aminocidos en la dicha mezcla. Partiendo de que la metionina es un aminocido esencial y por el contrario la glicina es un aminocido no esencial pero ambas son no polares, se tom este fundamento para colocarlos a recorrer por capilaridad en la fase estacionaria que fue un soporte de papel de filtro junto con las muestras sembradas, de

este modo se determinara la velocidad de migracin de una sustancia que puede expresarse segn la relacin Rf que es la distancia recorrida por la sustancia considerada y distancia recorrida por el frente del solvente. Para un sistema de solventes y un tipo de papel determinado cada sustancia tiene un valor de Rf caracterstico y en este caso fue de 14cm. Al revelar la cromatografa con Ninhidrina, la metionina recorri una distancia de 7.6 cm, por lo que obtuvo un Rf de 0.54, lo que indica que la muestra de metionina que compone la fase mvil, es ms soluble a la fase mvil que era una solucin de: butanol, cido actico y agua, por lo que subi por capilar una mayor distancia. En el caso de la glicina, la distancia que recorri fue de 4.5cm y su Rf fue de 0.32, lo que indica que este aminocido es menos soluble en la fase mvil que la metionina. As como tambin en el caso de la mezcla, las distancias recorridas fueron la misma, confirmando entonces la presencia de dichos aminocidos en la mezcla.

SEMANA III: CUANTIFICACIN DE PROTENAS Y CROMATOGRAFADE EXCLUSIN MOLECULAR.

PARTE I: CROMATOGRAFA DE EXTRACCIN MOLECULAR

Mezclar: 0,4 ml Gelatina 3% (p/v) + 0,2 ml. Riboflavina 0,3 % (p/v).

En la Bureta: Sephadex G-25. Agua destilada

PREPARACIN DE LA COLUMNA CROMATOGRAFICA

Suspender 4g de Sephadex G-25 en NaCl 0,85%

Con varilla de vidrio y lana de vidrio: Obturar la punta de la columna

PASADAS LAS 3 HORAS: Vertir por la pared de la columna la suspencin del gel, manteniendolo HIDRATADO.

PROCEDIMIENTO: 1. Marcar 10 tubos de ensayo 3,5 ml. 2. Lentamente agregar la mezcla a separar por las paredes de la columna. 3. Colectar el eluido, manteniendo hidratada la columna hasta obtener la dcima fraccin. 4. Leer la D.O y Positividad de Biuret.

Biuret
1 Fraccin 2 Fraccin 3 Fraccin 4 Fraccin 5 Fraccin 6 Fraccin 7 Fraccin 8 Fraccin 9 Fraccin 10 Fraccin -

D.O
0,00 0,24 0,11 1,4 0,69 0,37 0 0.35

GRFICO DE POSITIVIDAD DE BIURET Y D.O

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Biuret D.O

SEMANA III PARTE II: CUANTIFICACIN DE PROTENAS (MTODO DE BIURET Y MTODO DE LOWRY).

CUANTIFICACIN DE PROTENAS
Las protenas ocupan un lugar de mxima importancia entre las molculas constituyentes de los seres vivos (biomolculas). Prcticamente todos los procesos biolgicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de molculas. Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para muchos otros propsitos. Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, b) para la formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes. MTODO DE BIURET.
Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero). Las caractersticas ms importantes de la reaccin son: La reaccin del Biuret se aplica, a partir de los tetrapptidos, a todos los pptidos y protenas. Su rango de determinacin es de 1 a 6 mg/ml. No depende de la composicin de aminocidos. Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reaccin.

La reaccin de biuret es una reaccin coloreada (violeta) debida a la formacin de un complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que poseen ms de un enlace peptidico, como las protenas.

Reaccin de Biuret.

MUESTRA Patrn de Protenas 5,4g/dl Suero Sanguneo (100L + 400 L H2O)

REACTIVOS

Reactivo de Biuret

Tubo Patrn (L) Agua (L) Biuret (mL) O.D Concentracin Patrn

0 0 500 5 0 0

1 10 490 5 0.17 0.54

2 20 480 5 0.18 1.08

3 30 470 5 0.19 1.62

4 50 450 5 0.20 2.7

5 65 435 5 0.23 3.51

6 100 400 5 0.28 5.40

O.D Muestra de Suero: 0.21 R = 0,6911 Calibracin:

MTODO DE LOWRY

El mtodo de Lowry utiliza el reactivo de fenol-Folin-Ciocalteu. En este mtodo se desarrollan dos reacciones coloridas: primero se desarrolla un color de poca intensidad con el cobre en medio alcalino; despus se forma un color azul-verde con el reactivo mencionado, que contiene molibdato de sodio y tungstato de sodio en presencia de cido fosfrico y clorhdrico, que reacciona con los aminocidos aromticos (tirosina), fenilalanina y triptfano de la protena. En este experimento se preparar una curva de calibracin utilizando albmina. La curva de calibracin se construye llevando a cabo la reaccin de Lowry con concentraciones crecientes de albmina, lo que genera tubos con intensidad creciente de color. La intensidad del color formado se puede interpolar en la curva de calibracin de la albmina, y as determinar un valor aproximado.

MUESTRA

REACTIVOS Sol A: Na2CO3 4% p/v en NaOH 0,1 N, CuSO4 2%, C4H4O6KNa 4% (100:1:1) Sol B: Reactivo Folin Ciocalteau

Patrn de Albmina 1mg/ml Orina

Tubo Patrn (L) Agua (L) Sol. A (mL)

1 0 500 5

2 20 480 5

3 40 460 5

4 60 440 5

5 80 420 5

6 100 400 5

Agitar y calentar por 15 min a 40C Sol. B (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Mezclar vigorosamente y dejar a temperatura ambiente 30 min O.D

Concentracin Patrn

0 0

0,39 0.2

0,60 0.4

0,75 0.6

1 0.8

1,2 1

O.D Muestra de Orina Concentrada: 0,39 O.D Muestra de Orina Diluida: 0,09 Calibracin: A = m* C + b

C orina concentrada =

A b m

Lo mismo se aplica para la diluida.

ELECTROFORESIS. La electroforesis es una tcnica para separacin de molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico. La separacin puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte solido (electroforesis en papel), o bien a travs de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolucin (electroforesis libre). Dependiendo de la tcnica que se use, la separacin obedece en distinta medida a la carga elctrica de las molculas y a su masa. Cuando se ha completado la electroforesis, las molculas ms pequeas han llegado al nodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adicin de un colorante especfico para hacerlas visibles. Factores que afectan a la electroforesis. En general la electroforesis depende directamente del campo elctrico y este depende de distintos parmetros. Basndose en la ley de ohm se tiene que: V=IR Diferencia de Potencial (V): define el campo elctrico; la velocidad de avance es directamente proporcional a ella. Resistencia (R): la movilidad de las molculas es inversamente proporcional a ella. Intensidad (I): cuantifica el flujo de carga elctrica, se relaciona directamente con la distancia recorrida por las molculas.

Por ltimo, otro factor que afecta significativamente a la electroforesis es la temperatura, esta es importante puesto que por el efecto Joule el paso de una corriente elctrica va a producir calor y este es directamente proporcional a la diferencia de potencial y a la resistencia. Por lo tanto, es necesario

controlar de manera estricta la temperatura para que esta no afecte a la muestra desnaturalizndola, y otros factores como el pH ya que definir la carga de la protena, fuerza inica del medio, forma tamao y estructura primaria, intensidad del campo elctrico.

Tipos de electroforesis. Electroforesis en gel es un grupo de tcnicas empleadas por los cientficos para separar molculas basndose en propiedades como el tamao, la forma o el punto isoelctrico. La electroforesis en gel se utiliza generalmente con propsitos analticos, pero puede ser una tcnica preparativa para purificar molculas. Electroforesis de zona: las protenas son molculas anfteras su carga neta depende del pH del medio. Normalmente, la separacin electrofortica de protenas se hace a pH alcalino, en el que la mayora de las protenas presentan una carga global negativa. Tambin se puede trabajar a pH cidos, pero no demasiado bajos, ya que las protenas precipitan en medio cido (bsicamente se usa en la deteccin de variantes de la hemoglobina). Isoelectroenfoque: en lugar de separar las protenas en funcin de su carga a un pH dado, se separan en funcin de su punto isoelctrico (pI): el pI es el pH en el que la carga neta de la protena es nula, y depende de la composicin aminoacdica de la protena. Se crea un gradiente de pH mediante anfolitos (estabilizan el pH a lo largo del gel). Cada protena migrar hasta alcanzar su pI, punto en el cual precipitar al acumularse (de ah el nombre, isoelectroenfoque). Separacin por tamao: permite separar protenas y cidos nucleicos. En el caso de las protenas, deben ser tratadas con SDS (sodio

dodecil sulfato) para que su carga sea negativa y todas migren hacia el nodo (no es necesario hacer eso con los cidos nucleicos, ya que tienen carga negativa); la separacin se hace en medios de soporte en el que se ha creado un tamiz molecular (matriz), que hace que las protenas ms pequeas corran ms que las ms grandes. Electroforesis en suero sanguneo: la electroforesis es una tcnica de laboratorio, en la cual el suero sanguneo (la parte lquida de la sangre sin clulas) se coloca en un papel especialmente tratado y luego se expone a una corriente elctrica. Las protenas en el suero se mueven en el papel para formar bandas que muestran la proporcin de cada fraccin de protena. Una fraccin puede contener varios tipos diferentes de protenas. Las protenas individuales, con excepcin de la albumina,

generalmente no se miden; sin embargo, s se miden las fracciones o grupos de protenas. Los niveles de las fracciones de protenas se pueden calcular midiendo la protena srica total y luego multiplicando eso por el porcentaje relativo de cada fraccin de protena. Las protenas sricas se clasifican como albmina y globulinas. La albmina es la protena de mayor concentracin en el suero. Trasporta muchas molculas pequeas, pero tambin es importante para impedir que el lquido se escape de los vasos sanguneos hacia los tejidos. Las globulinas se dividen en alfa-1, alfa-2, beta y gammaglobulinas. En general, los niveles de las protenas alfa y gammaglobulinas aumentan cuando hay inflamacin en el cuerpo.

Valores normales: Protena total: 6.4 a 8.3 g/dL Albmina: 3.5 a 5.0 g/dL Alfa-1 globulina: 0.1 a 0.3 g/dL Alfa-2 globulina: 0.6 a 1.0 g/dL Beta globulina: 0.7 a 1.2 g/dL Gammaglobulina: 0.7 a 1.6 g/dL Algunas enfermedades al alterarse los valores normales: La disminucin de la protena total puede indicar: Cirrosis. Desnutricin. Sndrome nefrtico. Enteropata gastrointestinal por prdida de protenas.

El aumento de las protenas alpha-1 globulina puede deberse a: Enfermedad inflamatoria aguda. Cncer. Enfermedad inflamatoria crnica (por ejemplo artritis reumatoidea).

El aumento de las protenas alfa-2 globulinas puede indicar: Inflamacin aguda. Inflamacin crnica.

La disminucin de las protenas alfa-2 globulinas puede indicar: Hemolisis.

El aumento de las protenas beta globulinas puede indicar:

Hiperlipoproteinemia. Terapia de estrgenos.

La disminucin de las protenas beta globulinas puede indicar: Trastorno de coagulacin congnito. Coagutopata de consumo. Coagulacin intravascular diseminada.

El aumento de las protenas gama globulinas puede indicar: Mieloma mltiple. Enfermedad inflamatoria crnica (por ejemplo, artritis reumatoidea, LES). Hiperinmunizacin. Infeccin aguda.

CLCULOS: Albmina
2,9 ----------100% 2,9 0,11

Alfa 1
----------- 100% ----------x=0,11 3,87%

x ----------- 58,88% x=1,7

Alfa 2 2,9 x ----------- 100% ----------x=0,36 12,55% 2,9 x

Beta 1 ----------100%

----------- 12,28 x=0,35

Beta 2 2,9 ----------- 100% x ----------- 1,55% x=0,044

Gamma 2,9 ----------x ----------x=0,31 100% 10,87%

ANLISIS DE RESULTADOS Cromatografa de extraccin molecular La cromatografa de filtracin en gel, tambin denominada de exclusin por tamao o de tamiz molecular, las molculas se separan segn su forma y tamao. En esta tcnica, la fase estacionaria est compuesta por microesferas de un material hidratado esponjoso que contiene poros con un rango relativamente estrecho de dimetro. Si en una columna esos tamices moleculares se pasa una solucin acuosa con molculas de distintos tamaos, las que son demasiado grandes para ingresar a los poros se excluyen del volumen de solvente ubicado en el interior de las microesferas. Por lo tanto, estas molculas grandes atraviesan la columna con ms rapidez, esto es, en un volumen menor de eluyente, que las molculas que logran ingresar en los poros Las especies qumicas con masas moleculares por debajo del lmite de exclusin de un gel se eluirn de el en el orden de sus masas; las ms grandes se eluirn en primer trmino. Esto se debe a que el tamao de los poros en todo el gel varia dentro de un rango limitado, de manera que las molculas ms grandes tienen a su disposicin menor volumen interior del gel que las pequeas. Este efecto es la base de dicha cromatografa. En el laboratorio se procedi a separar un mezcla de Gelatina al 3% (p/v) que es una protena cuyo peso molecular es de aproximadamente de 300.000 Dalton y Riboflavina al 0.3% (p/v) que es la vitamina B 2 el cul tiene un color amarillo caracterstico, cuyo peso molecular es de 376,37 Dalton. Para saber en cul de las fracciones obtenidas se encontraba la Riboflavina, por lo que se procedi a leer su absorbancia a una de 430 nm, especfico para el color amarillo caracterstico en este caso de la vitamina. El mayor pico de absorbancia de observ en la 4 fraccin del eluido. Cabe

resaltar que la Riboflavina se obtuvo en las primeras alcuotas por tener un mayor peso molecular. Grficamente se puede observar la separacin de los dos

compuestos, ya que uno se encontr en la fraccin nmero cuatro y la otra en la fraccin nmero. Esto ocurri debido a que las molculas mayores que los poros (Riboflavina) no pueden entrar en ellos, por lo que "pasan de largo" y avanzan por la columna con mayor rapidez que las de tamao menor, que pueden entrar en los poros y as realizan un recorrido mayor, avanzando ms lentamente a lo largo de la columna; en este caso la molcula que entr dentro del Sephadex fue la Gelatina, en consecuencia fue la ltima en eluir.

Cuantificacin de protenas Algunos de los mtodos que permiten cuantificar la cantidad de protenas que se encuentran presentes en una muestra biolgica es el mtodo de Lowry. Tiene la ventaja de ser extremadamente sensible, capaz de detectar cantidades del orden de 10 microgramos de protena; por eso es un buen mtodo para analizar las protenas en la orina, ya que sta, debe poseer cantidades muy bajas de protena. Cuando se trata con mezclas biolgicas complejas, se puede perfectamente calibrar el mtodo con alguna protena comercial, como se realiz con la solucin patrn de Albmina 1 mg/ml La reaccin que tiene lugar en el mtodo de Lowry es bastante compleja. Se desarrolla en las siguientes fases: 1.-Reaccin previa de la protena en medio alcalino con iones Cu 2+, en presencia de tartrato para evitar la precipitacin. Es esencialmente idntica a

la reaccin del Biuret, formndose un complejo de coordinacin entre el cobre y el nitrgeno peptdico. 2.-Reaccin con el reactivo de Folin-Ciocalteau para fenoles (cido fosfomolibdotungstico), que se reduce por medio de los grupos fenol (y en menor medida imidazol e indol) presentes en la protena a un complejo de color azul oscuro, que se mide colorimtricamente. El complejo coloreado, cuya composicin es desconocida, se puede cuantificar con una curva de calibracin que se hace a partir de la albmina patrn, midiendo la absorbancia a 660 nm. Conclusin: Los picos obtenidos en la grfica, despus de la cromatografa resultado de la prueba de Biuret y la absorbancia; representaron zonas individuales de la Gelatina y de la Riboflavina, que al compararlas se pudo observar que hay diferencias en sus dimensiones moleculares. Por lo cual la tcnica de separacin por medio de la Cromatografa por exclusin molecular fue conveniente. El mtodo de Lowry nos indica la cantidad de protenas que se encuentran presente en la orina, la concentracin obtenida es de 0,28 para la concentracin la cual corresponde con los valores normales de las protena en orina. Otro mtodo de cuantificacin de protena fue Buiret, donde se pudo valorar cuantitativamente las protenas presentes en el suero sanguneo, obtenindose una concentracin 2,9 mg/ml . Sin embargo debemos tomar en cuenta los valores normales de las protenas en el suero sanguneo , al compararlos con el resultado obtenido presenta un error, debido a que este

no es compatible con la vida humana. Este margen de error es producto de un mal manejo de la utilizacin de las pipetas al realizar el experimento.

GLOSARIO Albmina: es una protena que se encuentra en gran proporcin en el plasma sanguneo, siendo la principal protena de la sangre y una de las ms abundantes en el ser humano. Es sintetizada en el hgado. Aminocido: es una molcula orgnica con un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxilo (-COOH ) unidos a un carbona central. Anftero: es aquella sustancia que puede reaccionar ya sea como un cido o como una base. Arginina (arg o R) es uno de los 20 aminocidos que se encuentran formando parte de las protenas. En el tejido heptico, la arginina puede ser sintetizada en el ciclo de la ornitina (o ciclo de la urea). Se clasifica, en poblacin peditrica, como un aminocido esencial. Este aminocido se encuentra involucrado en muchas de las actividades de la glndulas endocrinas. Casena: (del latn caseus, "queso") es una fosfoprotena (un tipo de heteroprotena) presente en la leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha denominado caseingeno. Cistena: es un -aminocido con la frmula qumica

HO2CCH(NH2)CH2SH. Se trata de un aminocido no esencial, lo que significa que puede ser sintetizado por los humanos. Coloide: en fsica y qumica un coloide, sistema coloidal, suspensin coloidal o dispersin coloidal es un sistema fisicoqumico formado por dos o ms fases, principalmente: una continua, normalmente fluida, y otra dispersa en forma de partculas; por lo general slidas.

Desnaturalizacin: es un cambio estructural de las protenas o cidos nucleicos, donde pierden su estructura nativa, y de esta forma su ptimo funcionamiento y a veces tambin cambian sus propiedades fsico-qumicas. Enlace peptdico: es un enlace entre el grupo amino (NH2) de un aminocido y el grupo carboxilo (COOH) de otro aminocido. Fenilalanina: es un aminocido. Se encuentra en las protenas como L-fenilalanina (LFA), siendo uno de los ocho aminocidos esenciales para humanos. Gelatina: es una mezcla coloide (sustancia semislida), incolora, translcida, quebradiza e inspida, que se obtiene a partir del colgeno procedente del tejido conectivo de animales hervidos con agua. Glicina o glicocola: es uno de los aminocidos que forman las protenas de los seres vivos. Histidina: es un aminocido esencial (no puede ser fabricado por el propio organismo y debe ser ingerido en la dieta). Es uno de los 22 aminocidos que forman parte de las protenas codificada genticamente. Pptidos: son un tipo de molcula formadas por la unin de varios aminocidos mediante enlaces peptdicos. Plasma: es la fraccin lquida y acelular de la sangre, es decir, se obtiene al dejar a la sangre desprovista de clulas como los glbulos rojos y los glbulos blancos. Est compuesto por un 90% de agua, un 7% de protenas, y el 3% restante por grasa, glucosa, vitaminas, hormonas, oxigeno, gas carbnico y nitrgeno, adems de productos de desecho del metabolismo como el cido rico. Protenas: son macromolculas formadas por cadenas lineales de aminocidos unidos por enlaces peptdicos.

Punto isoelctrico: es el pH en el cual la sustancia anftera tiene carga neta cero. El concepto es particularmente interesante en los aminocidos y tambin en las protenas. Renaturalizacin: al proceso en la cual una protena desnaturalizada (cuando la protena ha sido alterada y ha cambiado su estructura terciaria pero mantiene su estructura primaria). Regresa a su conformacin anterior que se conoce como estructura nativa (original). Tirosina: es uno de los 20 aminocidos que forman las protenas. Se clasifica como un aminocido no esencial en los mamferos ya que su sntesis se produce a partir de la hidroxilacin de otro aminocido.

REFERENCIAS BIBLOGRAFICAS