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REPBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS MAESTRA EN MICROBIOLOGA

EVALUACIN DE MICROALGAS Y DE BACTERIAS ASOCIADAS PRODUCTORAS DE EXOENZIMAS PARA TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE UNA EXTRACTORA DE ACEITE DE PALMA

Trabajo de Grado presentado ante la Divisin de Estudios para Graduados para optar el grado de Magister Scientarium en Microbiologa.

Autor: Microbiloga Sandra Milena Rodrguez Puerta C.I. 26.946.094

Tutor: Dr. Ever D. Morales A. C.I. 3.638.303

Co-Tutor: Carmen Crdenas C.I. 4.148.207

MARACAIBO-JULIO 2010

EVALUACIN DE MICROALGAS Y DE BACTERIAS ASOCIADAS PRODUCTORAS DE EXOENZIMAS PARA TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE UNA EXTRACTORA DE ACEITE DE PALMA

Sandra Milena Rodrguez Puerta Microbilogo C.I. 26.946.094

Direccin: Calle 27 No 5-149 Barrio Santa Rosa (Colombia-Cesar) Telfono: 005755840394-3126288161 e-mail. Sandraro28@hotmail.com, Saju284@gmail.com

Dr. Ever D. Morales A. C.I. 3.638.303 Tutor

M.Sc. Carmen H. Crdenas L. C.I. 4.148.207 Co-Tutor

A mi Dios por todo su amor A mis padres Israel y Mara Teresa A mis hermanas Ximena y Adriana A ti Julio por tu apoyo incondicional

Agradecimientos

A Dios padre Celestial, por su amor incondicional y por darme fuerza en los momentos difciles y por concederme este triunfo en mi vida. A mis padres Israel Rodrguez y Mara Teresa Puerta, por brindarme esta oportunidad, para un futuro mejor en mi vida, Gracias los quiero mucho. A mis hermanas Ximena Paola y Adriana Patricia, a ti xime que me acogiste en tu casa y me apoyaste en todo y mis seres queridos Carlos, Mi abuelo Marcos (QEPD) y toda mi familia los quiero. A la Empresa Palmas Oleaginosas de Casacar Ltda. por brindarme todo el apoyo en la realizacin de este proyecto. Al Laboratorio de Microorganismo Fotosintticos y Laboratorio del Centro

Investigaciones del Agua por el financiamiento para la realizacin de este proyecto. A mi profe Ever Morales por todos sus conocimientos transmitidos y sabidura en todos estos aos, por su confianza y comprensin para con mi proyecto, y por toda su colaboracin, Gracias mi profe, y que Dios lo bendiga siempre. A la profe Roberta Mora, por sus conocimientos, buenos consejos transmitidos, apoyo en aquellos momentos difciles por ser como una madre y una buena amiga. A mis queridos profesores Laugeny Daz, Mayela Ypez, Beltran Briceo y Gisela Fuenmayor, por todos esos buenos momentos, ayudas y aclaratorias para la realizacin de este proyecto. A la profesora Carmen Cardenas por el apoyo en la realizacin de este proyecto. A la Lic. Yadira y la Seora Oda por su apoyo y asesora en la realizacin de este proyecto. A ti Julio Cesar, que en todo momento siempre has estado ah apoyndome y dndome nimos para la culminacin de este logro en mi vida Gracias. A mis buenos compaeros y amigos Alexandra gracias por toda tu ayuda y paciencia, Jos Leonardo (Cheleo), Jorge, Lita, Charity, Hugo, Nestor, Fidel, Tali, Fabiola Jorfran y todos aquellos que me apoyaron de una forma u otra gracias por todo y por todos aquellos momentos compartidos con ustedes.

A todos Los quiero mucho y mil Gracias que Dios los bendiga, no los olvidare!!!!!!!!!!.

ndice de Contenido

Pg.

RESUMEN ABSTRACT INTRODUCCIN OBJETIVOS MATERIALES Y MTODOS ETAPA 1. Caracterizacin de las lagunas de estabilizacin de la planta extractora de aceite de palma 3.1. Descripcin del rea de estudio y toma de muestras de las Lagunas de Estabilizacin de la Planta Extractora de aceite de palma 3.2. Microorganismos fotosintticos presentes en las Lagunas de Estabilizacin de una Extractora de Aceite 3.2.1. Aislamiento y diversidad de los microorganismos fotosintticos en Lagunas de Estabilizacin de una Extractora de Aceite 3.2.2. Medios de Cultivo 3.2.2.1. Inorgnico a. Medio comercial: ALGAL b. Fertilizante comercial: NITROFOSKA c. Medio comercial: BG11 3.2.3. Tcnicas de Aislamiento 3.2.3.1. Rayado en Placas 3.2.3.2. Diluciones seriadas 3.2.3.3. Uso de Agentes antiparasitarios

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3.3. Cultivo de microalgas aisladas de las lagunas de estabilizacin 3.3.1. Cultivos de los microorganismos fotosintticos aislados en condiciones autotrficas 3.3.1.1. Recuento celular 3.3.1.2. Contenido de pigmentos: clorofila y carotenoides 3.4. Aislamiento e identificacin de cepas bacterianas asociadas a las microalgas 3.4.1. Medio de Cultivo 3.4.2. Identificacin bioqumica de las cepas bacterianas 3.4.2.1. Mtodo de biomerieux vitek ETAPA 2. Determinacin de Exoenzimas de las microalgas identificadas y sus bacterias asociadas 3.5. Determinacin de Exoenzimas 3.5.1. Determinacin de Amilasa 3.5.1.1. Mtodo del almidn (0,2%) en medio slido 3.5.1.2. Mtodo del almidn (0,2%) en medio lquido 3.5.2. Determinacin de Lipasa 3.5.2.1. Mtodo con la yema de Huevo 3.5.2.2. Mtodo con el detergente Tween 80 3.5.2.3. Mtodo con Lecitina al 0,1% 3.5.2.4. Mtodo cuantitativo con el p-nitrofenilpalmitato (p-NPP) 3.5.3. Determinacin de Proteasa 3.5.3.1. Mtodo de hidrlisis de la gelatina 3.5.3.2. Mtodo de hidrlisis de la casena

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3.5.4. Determinacin de Fosfatasa 3.5.4.1.Equipo Olympus AU480 3.5.5. Determinacin de Celulasa 3.5.5.1.Mtodo de la carboximetil celulosa 3.5.6. Determinacin de Ureasa 3.5.6.1.Urea de Rustigian y Stuart ETAPA 3. Ensayos realizados con agua residual de una extractora de aceite de palma 3.6. Ensayos 3.6.1. Ensayos en condiciones autotrficas 3.6.2.Ensayos en condiciones mixotrficas 3.6.2.1. Primer Ensayo 3.6.2.2. Segundo Ensayo 3.6.2.3. Parmetros de Cultivo 3.6.2.4. Exoenzimas a ensayos 1 y 2 3.7. Recuento de bacterias asociadas a los cultivos 3.8. Determinacin de los parmetros fisicoqumicos de las muestras de aguas residuales 3.8.1. Nitrgeno Total Kjeldahl (Standard Methods, 2005) 3.8.2. Fsforo Total (Standard Methods, 2005) 3.8.3. Demanda Qumica de Oxgeno (Standard Methods, 2005) 3.8.4. Aceites y Grasas (Standard Methods, 2005) 3.8.5. Slidos Suspendidos Totales SST (Standard Methods, 2005) 3.8.6.Slidos Suspendidos Voltiles SSV (Standard Methods, 2005)

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3.8.7.Determinacin del pH (Standard Methods, 2005) 3.9. Anlisis Estadstico RESULTADOS Y DISCUSIN ETAPA 1. Caracterizacin de las lagunas de estabilizacin de la planta extractora de aceite de palma 4.1. Microalgas y bacterias asociadas a las microalgas, aisladas de Lagunas de Estabilizacin de una Planta extractora de aceite de palma 4.1.1. Identificacin de microorganismos fotosintticos de lagunas de estabilizacin de una planta extractora de aceite de palma 4.1.1.1. Cultivos unialgales de las microalgas aisladas de las lagunas de estabilizacin 4.1.1.2. Aislamiento e identificacin de bacterias asociadas a los cultivos de microalgas y cianobacterias a. Bacterias Asociadas a Chlorella sp. 1 y 2 b. Bacterias asociadas a Oocystis sp. c. Bacterias asociadas a Scenedesmus sp. d. Bacterias asociadas a la cianobacteria Geitlerinema sp. e. Bacterias Asociadas a Chlorococcum sp. 4.1.2. Microalgas y su relacin con los parmetros fisicoqumicos de las lagunas de estabilizacin de una extractora de aceite de palma 4.1.2.1. Demanda Qumica de Oxigeno (DQO) 4.1.2.2. Slidos Suspendidos Totales (SST) 4.1.2.3. Nitrgeno

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4.1.2.4. Fosforo 4.1.2.5. Aceites y grasas 4.1.3. Variacin del pH en las lagunas de estabilizacin de una planta extractora de aceite 4.2. Exoenzimas en microalgas y en sus bacterias asociadas, aisladas de Lagunas de Estabilizacin de una Planta extractora de aceite de palma 4.2.1. Exoenzimas en microalgas y sus bacterias asociadas 4.2.1.1. Amilasa 4.2.1.2. Lipasa 4.2.1.3. Proteasa 4.2.1.4. Fosfatasa 4.2.1.5. Actividad de celulasa 4.2.1.6.Actividad de ureasa 4.3. Remocin de DQO, Nitrgeno, Fsforo y grasas en agua residual de una Planta extractora de aceite de palma en presencia de microalgas y sus bacterias asociadas 4.3.1. Cultivos mixtos de microalgas productoras de exoenzimas con agua residual de la planta extractora de aceite de palma 4.3.1.1. Crecimiento y contenido de pigmentos en el primer ensayo 4.3.1.2. Crecimiento y contenido de pigmentos en el segundo ensayo 4.3.2. Efecto del pH en los cultivos mixtos de las Microalgas 4.3.3. Anlisis de Remocin de materia orgnica y nutrientes 4.3.3.1. Demanda Qumica de Oxigeno (DQO)

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4.3.3.2. Slidos Suspendidos Totales (SST) y Slidos Suspendidos Voltiles (SSV) 4.3.3.3. Nitrgeno (Nitrgeno Total Kjeldahl) 4.3.3.4. Fsforo Total 4.3.3.5. Aceites y Grasas 4.3.4. Presencia de Exoenzimas 4.3.5. Poblacin de bacterias asociadas a los cultivos CONCLUSIONES RECOMENDACIONES ndice de Referencias ndice de Figuras ndice de Tablas

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Rodrguez Puerta, Sandra Milena. Evaluacin de Microalgas y Bacterias Asociadas productoras de Exoenzimas para Tratamiento de aguas Residuales de una Extractora de Aceite de Palma. Trabajo de grado para optar el grado de Magister Scientarium. Universidad del Zulia, Facultad Experimental de Ciencias, Divisin de Estudios para Graduados, Maracaibo, Venezuela. 2010. 154 p.

RESUMEN La capacidad de los microorganismos fotosintticos y su potencial como productores de exoenzimas puede ser aprovechado para el tratamiento de aguas residuales. Se evalu la diversidad y abundancia de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintticas en lagunas de estabilizacin de una Planta extractora de aceite de palma (Elaeis guineensis) en relacin a los parmetros fisicoqumicos. La presencia de lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa, amilasa y ureasa, tambin fue determinada en estos microorganismos y en su flora bacteriana asociada. Asimismo, se analiz la capacidad de remocin de DQO, nitrgeno, fsforo, slidos totales, grasas y aceites en el agua residual en cultivos unialgales de microalgas y cianobacterias. El estudio se realiz con agua residual (AR) y enriquecida con fertilizante (ARN), en un primer bioensayo. Mientras que, se utiliz adems, agua residual + fertilizante + mezcla orgnica (ARNO) y agua residual + mezcla orgnica (ARO), mezcla orgnica + fertilizante (NO) y en relacin a los controles (control-AR) y agua destilada+ fertilizante (Control) en un segundo bioensayo. Se identificaron 18 microalgas, 8 cianobacterias y 1 bacteria fotosinttica; de las cuales se cultivaron Chlorella sp. 1, Chlorella sp. 2 y Chlorella sp. 3, Scenedesmus sp. 1 y S. ecornis, Chlamydomonas sp., Chlorococcum sp., Oocystis sp. y Euglena sp. y 2 de cianobacterias Geitlerinema sp. y Synechocystis sp.; a partir de las cuales, tambin fueron aisladas 13 cepas de sus bacterias asociadas. La presencia de amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa y ureasa fue detectada en Chlorella sp. 1, Chlorella sp. 2, Chlorella sp. 3, Synechocystis sp., Oocystis sp., Chlorococcum sp. y Geitlerinema sp. Los ensayos diseados con agua residual permitieron deducir que, la remocin de DQO, parece no depender, al menos de las microalgas. En cambio, la de fsforo y de grasas fue ms efectiva cuando dicho residual era ms enriquecido con nutrientes inorgnicos y orgnicos (ARNO). De igual manera, con el agua residual enriquecida (ARN, ARO y ARNO) se produjo una remocin del 99,58% para el nitrgeno. Los resultados sugieren que las cepas de Chlorella sp., Oocystis sp., Scenedesmus sp., Chlorococcum sp. y Geitlerinema sp. productoras de exoenzimas pueden ser utilizadas para el tratamiento de residuales enriquecidas con almidones, protenas y grasas.

Palabras Claves: agua residual, exoenzimas, microalgas, bacterias, remocin.

e-mail: sandraro28@hotmail.com.

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Rodrguez Puerta, Sandra Milena. Evaluation of microalgae and associated bacteria exoenzyme producing for wastewater treatment of an oil palm extractor plant. Grade works for to choose the grade master in microbiology. University of the Zulia, Experimental Ability of Sciences, Division of Studies for Graduate. Maracaibo, Venezuela. 2010. 154 p.

ABSTRACT The ability of photosynthetic microorganisms and potential as exoenzymes producers can be even useful for wastewater treatment. Diversity and abundance of microalgae, cyanobacteria and photosynthetic bacteria from a stabilization pond of palm oil (Elaeis guineensis) extracting plant were evaluated in relation to physicochemical parameters. Presence of lipase, protease, phosphatase, cellulose, amylase and urease were determinate in these microorganisms, as well as its associated bacterial flora. Furthermore, COD, nitrogen, phosphorous, total solids removal and fats and oils in unialgal cultures of microalga and cyanobacteria using wastewaters as a culture medium. The study is achieve with wastewater (WW) and enriched with nutrients (WWN), in an first experiment. While, were used also, wasterwater + fertilizant + organic mixture (WWNO) and wastewater + organic mixture (WWO) and in relation to culture controls (Control WW) and water distillate + fertilizant (Control) in an second experiment. Its identify eighteen microalgae, eight cianobacteria and one photosynthetic bacterial; the which was cultivate Chlorella sp. one, Chlorella sp. two y Chlorella sp. three., Scenedesmus sp. one y S. ecornis, Chlamydomonas sp., Chlorococcum sp., Oocystis sp. y Euglena sp. y two cyanobacterial Geitlerinema sp. y Synechcteocystis sp.; to split the which, also were aislates thirteen cepa associated bacterial. Presence of amylase, lipase, protease, phosphatase, cellulose and urease were determinate Chlorella sp. one, Chlorella sp. two, Chlorella sp. three, Synechocystis sp., Oocystis sp., Chlorococcum sp. and Geitlerinema sp. in experiment design with wastewater will let deduce, removal COD, appear did not depend to less the microalgae. In exchange, the phosphorous and fats were effective where wastewater was enriched with nutrients inorganic and organics (WWNO). While, wastewater enriched (WWN, WWO and WWNO) produced an removal 99,58% for nitrogen. Result to suggest the cepas Chlorella sp., Oocystis sp., Scenedesmus sp., Chlorococcum sp. and Geitlerinema sp. exoenzymes producers can were used for wastewater treatment enriched with almidon, protein and fats.

Keywords: wastewater, exoenzymes, microalgae, bacterial, removal.

e-mail: Sandraro28@hotmail.com.

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Introduccin

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Actualmente, se ha reducido la utilizacin del agua a causa del vertido de residuales industriales, agropecuarios y domsticos, a fuentes hdricas produciendo, alteracin y limitando su capacidad de autodepuracin con el incremento de la descarga de estos residuales a los cuerpos de aguas (Seonez, 1999). Sin embargo, constituyen un recurso muy apreciado de gran valor econmico para el riego y la acuicultura, en virtud de la elevada concentracin de nutrientes presentes en las aguas residuales.

La implementacin de lagunas de estabilizacin para el tratamiento secundario de aguas residuales, ha constituido un proceso de alta eficiencia en la remocin de agentes contaminantes, exceso de nitrgeno, fsforo, DQO y metales, con la finalidad de mejorar la calidad del agua, que pueda ser utilizada para otros fines. En este sentido, los tratamientos biolgicos en estos sistemas y los humedales construidos, han representado una alternativa en el pulimento de aguas residuales, debido a que los costos de operacin y mantenimiento son bajos. Adems, facilitan el reciclaje y reutilizacin del agua (Lau y col. 1995; Romero, 1999). Estos sistemas de Lagunas de estabilizacin se caracterizan tambin, por desarrollar una poblacin microbiana, integrada por bacterias hetertrofas, bacterias autotrficas, microalgas, cianobacterias y protozoarios; que participan en el proceso de remocin de materia orgnica e inorgnica (Romero, 2005).

Las microalgas y cianobacterias, presentes en estos residuales desempean un papel importante en la purificacin de aguas residuales; ya que tienen la capacidad de remover cantidades elevadas de nitrgeno y fosforo, absorber metales y acelerar la inactivacin de bacterias patgenas (Abalde y col. 1995). La importancia y aplicacin de las microalgas en el tratamiento de aguas residuales, tiene sus antecedentes en la poca de Caldwell (1937), quien reporta la capacidad de remocin de nutrientes contenidos en estos efluentes, para favorecer su crecimiento. Posteriormente Oswald (1957), introduce un nuevo concepto al utilizar aguas residuales, para la produccin masiva de microalgas, con un alto contenido proteico, lo que finalmente se consider como un tratamiento terciario de las aguas residuales mediante el cultivo de microalgas (Talbot y col. 1991; Valderrama y col. 2002; De-Bashan y Bashan, 2004).

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Las microalgas utilizadas en el tratamiento de efluentes pueden ser consideradas como una alternativa de tratamiento terciario, debido a los procesos acoplados entre las bacterias aerbicas, degradadoras de la materia orgnica y las microalgas, que Generndose, as una produccin de asimilan los productos de la degradacin y compuestos inorgnicos, para realizar una eficiente bioconversin de la energa solar. oxigeno (Figura 1). biomasa microalgal, mejorando la calidad del efluente y aumentado la concentracin de

Las microalgas que se utilizan en el tratamiento de aguas residuales se caracterizan por soportar elevadas concentraciones de nutrientes, presentar una actividad metablica elevada, contribuir con la oxidacin bacteriana, capacidad de resistir variaciones ambientales y estrategias fisiolgicas para exhibir un crecimiento mixotrfico e interaccin favorable microalga-bacterias (Salazar, 2005).

Figura 1. Ciclo de oxigenacin fotosinttica de aguas residuales. Salazar, (2005).

Entre los microorganismos fotosintticos comunes en lagunas de estabilizacin de aguas residuales urbanas se encuentra una diversidad de microalgas (diatomeas, euglenofitas, clorofitas), cianobacterias (coloniales, filamentosas y unicelulares) (Arauzo y col. 2000) y bacterias fotosintticas (Tabla 1).

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Tabla 1. Microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintticas ms comunes en Lagunas de Estabilizacin. GRUPO Diatomeas Euglenofitas GNEROS REPRESENTATIVOS Cyclotella, Gomphonema, Nitzschia, Navicula. Euglena, Phacus, Ankistrodesmus, Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, Scenedesmus rubescens, Scenedesmus obliquus Chlamydomonas, Oocystis, Stichococcus. Microcystis, Anabaena, Oscillatoria, Phormidium, Anabaenopsis, Arthrospira, Spirulina, Synechocystis. Thiopedia

Clorofitas

Cianobacterias Bacterias

Fuente: Safonova (2004); Salazar (2005); Escorihuela (2007).

De igual manera, se incluyen un registro de microalgas y cianobacterias cultivadas en diferentes efluentes y en diversos pases para la produccin de biomasa con fines agroalimentario (Tabla 2). En estas experiencias se refleja el amplio cultivo de Chlorella sp., Scenedesmus sp. y de Spirulina sp. en Asia y Amrica; con la particular caracterstica anloga de que son cosmopolitas, crecidas en los diversos cuerpos de agua y de elevada capacidad de crecimiento en nutrientes orgnicos.

Tabla 2. Uso de microalgas para el tratamiento de aguas residuales en lagunas de alta tasa de oxidacin en diversos pases. PRODUCTIVIDAD PAS INFLUENTE MICROALGA (g.m2.d-1) Israel Municipal domstico Scenedesmus sp. Euglena sp. Chlorella sp. 44.2 Taiwn Digerido porcino Spirulina sp. Chlorella sp. 15-25 India Orina humana Spirulina sp. 10-12 India Melaza (caa) Scenedesmus sp. 15-20 Tailandia Tapioca Spirulina sp. 7-10 Singapur Desecho porcino Cultivo mixto 5.4-5.0 E.U. Estircol de ganado Chlorella sp. 30 Malasia Aceite de coco Chlorella sp. 2.7-12.8 Brasil domstico Scenedesmus sp. Chlorella sp. 27-10 Fuente: Kojima y col. (2001).

La biomasa microalgal obtenida en estos sistemas de tratamiento, puede ser cosechada o recuperada con un adecuado manejo de parmetros fisicoqumicos, variacin en cuanto a los volmenes de cultivo, con altas densidades microalgales de

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cepas de microalgas activadas (adaptadas al efluente) y con residuales con bajos tiempos de retencin (Tabla 3). Adems, las microalgas se utilizan en diferentes aplicaciones comerciales como alimento de valor nutricional, alimentos en animales, industria cosmtica y productos de alto valor nutricional como los cidos grasos, pigmentos e isotopos bioqumicos estables (Correa, 1994; Apt y Behrens, 2002; Salazar, 2005; Yamaguchi, 2005; Spolaore, 2006).

Tabla 3. Uso de biomasa de microalgas cultivadas en aguas residuales. MICROALGAS Chaetoceros, Chlamydomonas, Chlorella, Chlorococcum, Cyclotella, Dunaliella, Haematococcus, Haslea ostrearia, Nannochloropsis oculata. Arthrospira, Chlorella, Dunaliella salina, Aphanizomenon flos-aquae. Chlorella, Scenedesmus, Arthrospira. EMPLEO Acuacultura Moluscos, bivalvos, crustceos, rotferos, Rhodomonas, Cladceros, Coppodos y peces. Alimentacin en Humanos Alimentacin animal Avicultura, ganado porcino, ganado vacuno, perros, gatos y caballos. Fertilizantes diversos Arrozales y cultivos diversos. Chlorella vulgaris, Dunaliella salina, Arthrospira, Nannochloropsis oculata, Porphyridium pupureum, Phaeodactylum tricornutum, Isochrysis galbana, Nitzschia laevis. Fuente: Salazar, (2005); Spolaore, (2006) Produccin de hidrgeno, metanizacin y cidos orgnicos e industria cosmtica.

Anabaena, Nostoc

Los cultivos microalgales, al igual que algunas especies de cianobacterias (lvarez y Gallardo, 1989; Sallal, 1986; Talbot y De la Noe, 1993; De la Noe y Picard, 1985; Oswald, 1988a,b; Tam y Wong, 1990), se han empleado con xito en la remocin de nutrientes de aguas residuales con un alto contenido de nitrgeno y fsforo (PrzytockaJusiak y col. 1984; Rodrgues y Oliveira, 1987; Gantar y col. 1984; Voltonia y col. 2005; Larsdotter y col. 2007) y en la absorcin de metales (Devars y col. 2000; Tam y col. 2001).

Entre otras estrategias fisiolgicas de estos microorganismos, se encuentran la capacidad de producir exoenzimas degradadoras de compuestos orgnicos en las aguas residuales, a fin de generar sustratos ms asimilables para su crecimiento y metabolismo. Esto significa, que la carga orgnica en estos efluentes puede ser

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degradada por esta maquinaria enzimtica; con lo cual la DBO5 es removida en funcin del tiempo y actividad metablica de bacterias, microalgas y cianobacterias presentes (Hosetti y Patil, 1992). Las aplicaciones de los grupos de enzimas dependen de la necesidad de hidrolizar polmeros complejos para incrementar su posterior degradacin microbiolgica.

La produccin de enzimas extracelulares, tales como; amilasa, proteasa, lipasa, celulasa y fosfatasa constituye una propiedad bien conocida en microalgas y cianobacterias; por ser utilizadas con carcter taxonmico, para identificacin a nivel de especies. Tal es el caso de las microalgas Chlorococcum y Spongiococcum quienes producen enzimas proteolticas extracelulares y enzimas amilolticas (Archibald y Bold, 1970; Deason, 1976). 1978; 1980). Por ejemplo, la habilidad de hidrolizar gelatina es una caracterstica de las especies de Chlorella, Ankistrodesmus y Scenedesmus (Kessler, En las diatomeas, Navicula y Nitzschia se ha detectado actividad agaroltica, proteoltica y fosfatasa (Tanaka y Ohwada, 1987). Tambin se ha descrito, en un estudio enzimtico la fosfatasa alcalina en Phaeodactylum tricornutum, Nannochloris y Nannochloropsis, que estas diatomeas usan fuentes de fosforo inorgnico, mediante el uso de p-nitrofenil fosfato y 4-metil-umbeliferil fosfato (Ruiz y col. 1997; Lubian y col. 1992).

Otra enzima degradante de polmeros utilizados de forma similar son las celulasas, proteinasas y amilasas. Una aplicacin particular que puede describirse como tratamiento de residuos, es el empleo de proteinasas en las preparaciones comerciales de detergentes, utilizadas como polvo de lavado biolgico. Adems de, estas hidrlisis de materiales polimricos, existen tambin aplicaciones de enzimas capaces de degradar compuestos altamente txicos que podran inhibir procesos de tratamiento basado en el empleo microbiolgico (Raymond, 2001).

Las actividades enzimticas asociadas a la pared celular de plantas vasculares, hongos y bacterias, tambin se han encontrado en especies de Chlorella y Scenedesmus, dada la existencia de glicosidasas, fosfatasas y esterasas (Burczyk y Loos, 1995). De igual

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manera, en Chaetoceros ceratosporus se ha demostrado la actividad de una fosfodiesterasa utilizando sustratos lipoflicos (Yamaguchi y col. 2005).

Esta capacidad de produccin de exoenzimas por parte de las microalgas, de su flora bacteriana asociada, y de otros microorganismos heterotrficos, puede ser utilizada como herramienta para inducir una mayor eficiencia en la degradacin de materia orgnica existente en aguas residuales. Las enzimas extracelulares o ectoenzimas que estn unidas a la superficie de la clula y las de forma libre como las Exoenzimas son absorbidas dentro de las sustancias polimricas extracelulares (EPS) de la matriz del lodo del tratamiento de aguas residuales (Cadoret y col. 2002); las hidrolasas son importantes especialmente para la velocidad de la hidrlisis de la digestin anaerobia (Figura 2).

Figura 2. Mecanismo de accin de las enzimas hidrolticas sobre la materia orgnica. (1) Limitacin de la transferencia de masa, (2) EPS, (3) Intermediarios metablicos, (4) Condiciones del aceptor de electrones, (5) pH y Temperatura. Todos tienen un efecto sobre la actividad de las enzimas involucradas en el tratamiento de aguas residuales. Burgess y Pletschke, (2008).

En el tratamiento aerbico las hidrolasas estn libres en el medio o contenidas en una matriz de EPS; y en el proceso anaerbico estas enzimas estn libres en el ambiente extracelular o en este caso en las enzimas degradadoras de carbohidratos

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(glicohidrolasas) contenidas o inmovilizadas en un complejo cataltico llamado celulosoma (solo presente en algunas bacterias) (Burgess y Pletschke, 2008). Higuchi y col. (2005) clasifico las enzimas extracelulares del lodo digestado anaerbicamente en aguas residuales en dos: Enzimas de Clulas-libres dispersada en el lquido y las Enzimas ligada-clula asociadas a la superficie de la clula del microbio.

Al respecto, se ha descrito el uso de lipasas asociadas a cultivos de especies de Nitrosomonas, Nitrobacter, Pseudomonas, Xanthomonas, Micrococcus, Planocococcus y Criptococcus, para eliminar depsitos de grasa procedentes de las paredes de las tuberas que transportan el efluente de aguas residuales (Arias y Lastra, 2002; Gaseosa y Hube, 1990). Asimismo, Leal y col. (2002), han descrito la produccin de una lipasa extrada de Penicillium restrictum para la remocin de DQO en tratamientos anaerbicos de aguas residuales, con alto contenido de grasas.

En este sentido, se han desarrollado paquetes biotecnolgicos integrados por fuentes de microalgas y bacterias para formular productos comerciales (Enzymplus 16 y Oxydol), capaces de remover y acelerar el proceso de depuracin biolgica de las aguas residuales de procedencia domstica, agropecuaria e industrial (Ecobiotec, 2006). Es por ello, que reviste sumo inters, en el rea de la biotecnologa de microalgas en nuestros pases, incursionar en nuevas lneas de investigacin sobre remocin de materia orgnica de aguas residuales en funcin del uso de exoenzimas. Y considerando, la falta de experiencias y conocimiento sobre la aplicacin de inculos enriquecidos con microalgas-bacterias productoras de exoenzimas como catalizadores en el pulimento de aguas residuales, se ha realizado el presente estudio, referente a la deteccin de exoenzimas por parte de microalgas y su flora bacteriana asociada, aislada de aguas residuales y a su posterior evaluacin como fuentes de remocin de materia orgnica y de nutrientes de residuales.

En este sentido, se ha seleccionado un sistema de Lagunas de Estabilizacin de una Planta extractora de aceite de palma africana (Elaeis guinenesis) de la Repblica de Colombia, para considerar la produccin de exoenzimas por microorganismos

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fotosintticos presentes en estas aguas residuales, y en virtud del incremento constante de la produccin de estos residuales, por el ascenso de esta actividad agroindustrial en Colombia y Venezuela. Por lo cual, se plante como objetivo principal:

Evaluar microalgas y bacterias asociadas productoras de exoenzimas para tratamiento de aguas residuales de una Planta extractora de aceite de palma.

Los objetivos especficos fueron los siguientes:

Identificar las microalgas y bacterias asociadas aisladas de lagunas de estabilizacin de una extractora de aceite de palma.

Determinar presencia de exoenzimas en las microalgas y bacterias asociadas.

Relacionar las poblaciones de microalgas con el contenido de grasas y aceites, Nitrgeno total Kjeldahl, Fosfato y DQO existentes en lagunas de estabilizacin.

Demostrar la remocin de DQO, nitrgeno y fsforo de aguas residuales de la Planta extractora de aceite de palma, enriquecida con grasas, almidones y urea en presencia de microalgas y sus bacterias asociadas productoras de exoenzimas.

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Materiales y Mtodos

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Para el alcance de los objetivos planteados se realizaron las siguientes etapas experimentales: la 1 etapa consisti en la caracterizacin de las lagunas de estabilizacin de la planta extractora de aceite de palma Elaeis guinensis (aislar, identificar y cultivar los microorganismos fotosintticos y sus bacterias asociadas); la 2 etapa fue la determinacin de exoenzimas de las microalgas identificadas y sus bacterias asociadas y la 3 etapa fue la realizacin de los ensayos con agua residual de una extractora de aceite de palma.

ETAPA 1. Caracterizacin de las lagunas de estabilizacin de la planta extractora de aceite de palma 3.1. Descripcin del rea de estudio y caracterizacin de las lagunas de estabilizacin de la planta extractora de aceite de palma Se realizaron cuatro muestreos en las lagunas de estabilizacin de la Planta Extractora de Aceite Palmas Oleaginosas de Casacar Ltda, ubicada en los predios de la hacienda Centenario a 9 50N y 73 20W (Instituto Geogrfico Agustn Codazzi) jurisdiccin del corregimiento de Casacar, municipio de Codazzi Departamento del Cesar, Colombia.

El sistema de lagunas de estabilizacin de la Planta Extractora de aceite, comprende cinco lagunas en serie, comunicadas por medio de compuertas; de las cuales 2 lagunas son facultativas y 3 de maduracin o pulimento (Figura 3). El sistema se mantiene de las aguas residuales provenientes del proceso de extraccin de aceite de la planta. Las muestras se colectaron en frascos de plstico (Ambar-Anlisis Biolgicos) y de vidrio (Aceites y grasas) con capacidad de 1 litro en los seis sitios seleccionados del sistema de estabilizacin.

De acuerdo a los sitios de muestreos fijados en el sistema de lagunas y en funcin de las visitas realizadas se colectaron un total de 24 muestras; las cuales fueron evaluadas para la determinacin de los parmetros fsico-qumicos y la diversidad de microorganismos fotosintticos presentes en las muestras por recuento celular.

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Fuente de Alimentacin (Agua Residual Cruda)

Colector y Bombeo Agua Residual

L A G U N A S D E E S T A B I L I Z A C I N

L-1

L-2

L-3

L-4

L-5

Recoleccin de Efluentes Tratados (Agua para Riego de Cultivos)

Punto de Muestreo

Figura 3. Sistema de Tratamiento de aguas residuales de las Lagunas de Estabilizacin de Palmas Oleaginosas de Casacar Ltda-Colombia.

3.2. Microorganismos fotosintticos presentes en las lagunas de estabilizacin de una extractora de aceite

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3.2.1. Aislamiento y diversidad de los microorganismos fotosintticos en lagunas de estabilizacin de una extractora de aceite De las muestras colectadas de las lagunas de estabilizacin se realizaron observaciones en fresco tomando una alcuota de cada muestra, y de las observaciones al microscopio se procedi a la toma de microfotografas de todas las especies encontradas en las muestras. Para cada muestra en fresco se determin diversidad y poblacin de los microorganismos fotosintticos. La identificacin de cada espcimen fue realizado siguiendo los catlogos y claves taxonmicas de bibliografa especializada (Yacubson, 1969; 1972; 1974a;b; 1980a;b; 1984-1985; Prescott, 1970; Whitford y Schumacher, 1973; Jimnez, 1976; Ortega, 1984; Marshall, 1986; Infante, 1988; Dillard, 1999; Brard-Therriaault y col. 1999; Rodrguez, 2000; Ramrez, 2000; Lobo y col. 2002; Garduo y col. 2008). La identificacin de las especies de cianobacterias se realiz siguiendo las claves dicotmicas revisadas por Anagnostidis y Komrek (1985; 1988; 1990); Komrek y Anagnostidis (1979; 1986, 1989); las claves de Hoffman (1988) y Anand (1990) y SantAnna y col. 2006; De M. Bicudo, y col. 2006.

Para el aislamiento de los microorganismos fotosintticos, se procedi a inocular muestras procedentes de las lagunas, en medios de cultivos lquidos (ALGAL y fertilizante NITROFOSKA). Estos fueron mantenidos durante 15 das y luego transferidos a medio slido mediante rayado en placa y diluciones seriadas. Una vez observadas las colonias se hicieron crecer en medio lquido con la finalidad de determinar las caractersticas morfolgicas de cada cepa aislada.

3.2.2. Medios de Cultivo

3.2.2.1. Inorgnico

a. Medio comercial: ALGAL: Para los cultivos lquidos, se utiliz agua destilada esterilizada por autoclave a 121C y 15 libras de presin durante 20 minutos. Posteriormente el agua se enriqueci con el medio nutritivo (Tabla 4) a una

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concentracin equivalente a 4,0 mM de NaNO3. (Fbregas y col. 1989). Los cultivos en medio slido se prepararon con agar-agar (1,5%), suplementados con nutrientes ALGAL; y correspondieron a los medios autotrficos.

Tabla 4. Composicin qumica del medio de cultivo ALGAL. COMPUESTO CANTIDAD (g/100g) MICRONUTRIENTES Oligoelementos Citrato Frrico 1,000 Cloruro de Zinc 0,061 Cloruro de Manganeso 0,566 Molibdato Sdico 0,110 Cloruro de Cobalto 0,010 Sulfato de Cobre 0,010 EDTA 0,900 Vitaminas Tiamina 0,200 Biotina (del 0.02%) 0,130 Cianocobalamina (del 0.09%) 0,180 MACRONUTRIENTES NO3Na 90,81 PO4H2Na.2H2O 6,41 *cido etilendiaminotetractico.

b. Fertilizante comercial: NITROFOSKA: Los cultivos lquidos se prepararon con agua destilada o potable esterilizada por autoclave a 121C y 15 libras de presin durante 20 minutos, y posteriormente el agua enriquecida con el medio nutritivo (Tabla 5) a concentraciones de 1,0 y 5,0 mL/L.

Tabla 5. Composicin qumica del fertilizante NITROFOSKA FOLIAR (Insecticidas Internacionales, CA). MACROELEMENTOS Nitrgeno 10,00% (N) Fsforo 4,00% (P2O5) Potasio 7,00% (K2O) Magnesio 0,2% (MgO) Azufre 0,8% (S) MICROELEMENTOS (ppm) Hierro (Fe) 70 Boro (B) 11

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Cobre (Cu) Manganeso (Mn) Zinc (Zn) Cobalto (Co) Molibdato (Mo) 12 8 2 12 1

c. Medio comercial: BG11: Las cianobacterias fueron cultivadas en medios slidos y lquidos con nutrientes BG11 (Rippka, 1988); el cual presenta nitrgeno combinado de concentraciones entre los medios KRATZ, MYERS y CHU-10; adems de su extensa utilizacin en muchos laboratorios para estimular el crecimiento de las cianobacterias debido a su alto contenido en nitrgeno (NaN03 17,6 mM) y de concentraciones adecuadas de calcio, zinc, manganeso, cobre, magnesio, borato, molibdeno y EDTA (Tabla 6).

Solucin I

Solucin II Solucin III Solucin IV

Tabla 6. Composicin del medio BG11 (Rippka, 1988). COMPUESTO CONCENTRACIN (gr) VOLUMEN FINAL (mL) NaNO3 75,0 500 MgSO4.7H2O 3,75 1,8 CaCl2.2H2O 2,0 500 K2HPO4.3H2O EDTA 0,05 Ammonium(III) Citrato 0,3 500 Acido Ctrico (C6H8O7) 0,03 1000 H3BO3 2,86 1,84 MnCl2.2H2O 0,22 ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O Co(NO3)

El medio consta de cuatro soluciones: Para preparar 1,0L de medio completo, se aaden 10mL de Solucin I; 10 mL de Solucin II; 10mL de Solucin III y 1 mL de solucin IV.

3.2.3. Tcnicas de aislamiento

3.2.3.1. Rayado en placas: Para esta tcnica se utilizaron placas de medio ALGAL, en donde se colocaron unas gotas de la muestra en un extremo de la placa y luego se realizo una extensin por agotamiento con asa de platino. Las placas Al sembradas se mantuvieron en condiciones controladas de Luz y temperatura.

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visualizarse las primeras colonias aisladas se procedi a observar al microscopio indicando el gnero, y se transfiri a una placa con medio slido para su reaislamiento para obtener cultivos unialgales. Las colonias aisladas se trasfirieron a medio lquido y se revisaron peridicamente.

3.2.3.2. Diluciones seriadas: Se utilizo esta tcnica debido a que permite reducir la densidad celular y separar las especies presentes en las muestras de agua colectadas. Se prepararon una serie de 5 tubos con 9,9mL de medio ALGAL y se les aadi 0,1mL de agua de las muestras colectadas.

3.2.3.3. Uso de agentes antiparasitarios: Debido a la presencia de parsitos en algunos cultivos unialgales o mixtos, se aplic Zentel a 500mg.L-1, entre 24 y 48 horas. Luego el cultivo fue lavado con medio de cultivo fresco, por decantacin y al lograr la eliminacin de los protozoarios se transfirieron nuevamente a medio de cultivo fresco.

3.3. Cultivos de microalgas aisladas de las lagunas de estabilizacin 3.3.1. Cultivos de los microorganismos fotosintticos aislados en condiciones autotrficas 3.3.1.1. Recuento celular: La poblacin de los organismos en las muestras colectadas, se determino por recuento celular mediante cmara de Neubaer. Estas fueron fijadas previamente con 5-10 gotas de lugol y analizadas por triplicado. De igual manera, a las muestras por triplicado de 10mL colectadas del cultivo lquido, se les determin el crecimiento de los microorganismos fotosintticos cada tres (03) das hasta alcanzar la fase estacionaria, de acuerdo a la siguiente frmula:

DC =

C x 104 x Fd No de cuadrantes

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Donde: DC: Densidad celular en Clulas mL-1. C: Nmero de clulas observadas. Fd: Factor de dilucin = (Volumen final)/(Volumen inicial).

Los valores de densidad celular reportados corresponden al promedio de las densidades de las rplicas de cada tratamiento.

3.3.1.2. Contenido de pigmentos: clorofila y carotenoides: El contenido de clorofila y de carotenoides fue determinado durante el crecimiento de los cultivos unialgales o mixtos cada tres das. A estos se les extraa, 5 o 10mL por triplicado para cada rplica de cultivo y luego sedimentados en una centrifuga HETTICH ROTINA 35. Al precipitado se le adicionaba 2mL de acetona:metanol (2:1), y luego se resuspenda en vortex y se guardaba a 4C durante 24h. El sobrenadante luego era analizado en un Spectronic 21 a 480, 664 y 647nm para carotenoides y clorofilas a y b, respectivamente. Los valores de clorofila fueron luego obtenidos a partir de las frmulas de Jeffrey y Humprhrey, (1975) para clorofitas:

Clorofila a (g/mL) = (11,93 A664 1,93 A647)

Clorofila b (g/mL) = (20,36 A647 5,50 A664)

Para determinar el contenido de carotenoides se utiliz la ecuacin de Strickland y Parson (1972): Carotenoides (g/mL) = (4 x A480)

3.4. Aislamiento e identificacin de cepas bacterianas asociadas a las microalgas

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Para el aislamiento de las bacterias asociadas a cada cultivo no axnico de microalgas y cianobacterias, se utiliz de igual manera el medio de cultivo organotrfico con extracto de levadura, peptona y glucosa (Tabla 7).

3.4.1. Medio de Cultivo: Se prepar medio slido con agar-agar al 1,5%; enriquecido con extracto de levadura, peptona y glucosa y con adicin de medio ALGAL a una concentracin equivalente a 4,0mM de NaNO3, a fin de incrementar el crecimiento de las bacterias asociadas y de las microalgas, el medio slido se prepar en agar 15g/L (Blanco, 1990).

Tabla 7. Composicin del medio organotrfico complejo. NUTRIENTES g/L Extracto de levadura 5,0 Peptona 1,5 Glucosa 2,5 20ml/L Medio Algal (4mM de NaNO3)

La poblacin bacteriana asociada a la microalga se determin mediante el recuento en placa. La cuantificacin bacteriana se realiz segn el mtodo de dilucin en placas (Madigan y col. 2004), mediante diluciones seriadas de las muestras hasta 10-7, empleando solucin salina fisiolgica (SSF) al 0,85% como solvente. De cada tubo de dilucin y de la muestra madre, se tom 0,1mL para ser sembrado en placas preparadas del medio slido organotrfico. La muestra se disemin con asa de vidrio estril y las placas se incubaron a 37 C durante 48 y 72 horas (Incubadora P Selecta, modelo 2000994).

Las cepas bacterianas seleccionadas se sembraron en placas de agar tripticasa de soya (TSA), para proceder a la caracterizacin macroscpica de las colonias, tomando en cuenta la elevacin, borde, forma, tamao, color, opacidad y superficie de la colonia. Adems, se realiz la tincin de Gram, en la cual se observo: forma, arreglo y tincin (McFaddin, 2000; Mata y col. 2003; Murray y col. 1999; 2007). Las cepas ya seleccionadas se reaislaron en placas de agar nutritivo, en caldo nutritivo y sembradas en agar conservacin para su preservacin y congelamiento a 20C, respectivamente.

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3.4.2. Identificacin bioqumica de las cepas bacterianas

Las cepas bacterianas seleccionadas y caracterizadas, se sometieron a pruebas bioqumicas para su identificacin. Para ello, se emplearon protocolos convencionales reportados en la literatura para cada grupo morfotintorial bacteriano (Mc Faddin, 2000; Murray y col. 1999; 2007). Entre las pruebas bioqumicas se aplicaron las de crecimiento en Agar McConkey, comportamiento en agar TSI, catalasa, oxidasa, reduccin de nitratos, prueba de oxidacin-fermentacin en medio O/F glucosa, produccin de indol, gas y cido; descarboxilacin de lisina, ornitina, prueba de DNAasa, fermentacin de azcares simples y polialcoholes (arabinosa, fructosa, lactosa, maltosa, melobiosa, ramnosa, trehalosa, adonitol, inositol, manitol y sorbitol) y produccin de ureasa, entre otras (Mc Faddin, 2000; Murray y col. 1999; 2007).

3.4.2.1. Mtodo de biomerieux vitek.

Para la confirmacin de las bacterias

aisladas se utiliz el equipo de Biomerieux Vitek. Inicialmente se prepar el inculo equivalente al patrn de turbidez No. 3 de MacFarland. Luego, se tom un tubo de 12x75mm estril y transferido al soporte de llenado, al cual se le agreg 1,8mL de solucin salina al 0,45-0,5%. Posteriormente, se extrajo suficiente cultivo de la superficie de los medios de agar apropiados para lograr una suspensin densa Lechosa (mnimamente un patrn de turbidez No. 3 de MacFarland) y luego se introdujo el tubo en el colorimeter Vitek para comprobar el patrn de turbidez el tubo tiene que estar en la Zona amarilla, 27%T-37%T. La tarjeta se marc con el nmero apropiado para la bacteria en estudio y tambin la prueba de oxidasa (+) o () para el caso; luego se coloc la tarjeta y el tubo de transferencia en el soporte de llenado Vitek, con la parte larga del tubo de transferencia insertado en el tubo de ensayo; si el tubo de transferencia se insert correctamente en la tarjeta, por el tubo se extendi bien la muestra en la tarjeta. La tarjeta se sell utilizando el sistema Vitek 60/120 (modulo de sellador); luego se coloc la unidad de tarjeta/tubo de transferencia en el soporte de llenado del sellador. El sellador corto el tubo de transferencia de la tarjeta y sello el puerto de la tarjeta, luego se incubo las tarjetas con las muestras hacia arriba durante 4 horas a 35-37 C en una incubadora sin CO2 (Vitek, 2003).

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ETAPA 2. Determinacin de Exoenzimas de las microalgas identificadas y sus bacterias asociadas 3.5. Determinacin de Exoenzimas La presencia de las exoenzimas: amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa y ureasa en cada microalga, cianobacteria y bacteria asociada fue evaluada tanto en medio lquido y slido organotrfico.

3.5.1. Determinacin de Amilasa

3.5.1.1. Mtodo del almidn (0,2%) en medio slido: Sobre las placas de agaralmidn se realizaron pozos usando varilla de vidrio estril de 1cm de dimetro y removiendo el agar por succin y despus se inocularon las cepas a examinar, hasta un total de 4 o 6 pozos por placa mximo. Estas fueron incubadas a 30-35 C durante 48 horas y hasta 5 das en los casos dudosos. Tras la incubacin se inundan las placas con una solucin alcohlica de iodo al 2%. La hidrlisis del almidn se manifiesta por la aparicin de un halo claro alrededor del pozo de crecimiento, en tanto que el resto de la placa se tie de color azul oscuro. Se considero que la actividad amiloltica es mayor cuanto ms amplia es la zona clara (Mc-Faddin, 2003; Aguilar y col. 2000; Moronta, 2001).

3.5.1.2. Mtodo del almidn (0,2%) en medio lquido: Este ensayo se bas en la reduccin de la intensidad del color azul del lugol, resultado de la hidrlisis enzimtica del almidn y la formacin del complejo iodina-almidn. Se utiliz 0,4mL del cultivo unialgal de cada microalga, se centrifug a 4.000r.p.m (el sobrenadante), 0,5mL de la solucin del almidn al 0,2% y 1mL del buffer fosfato (0,1M, pH 6,0). Luego la mezcla fue incubada a 50 C por 10min. De all se le agreg 0,50mL de HCl a 0,1N y se le adicion 0,50mL de la solucin I/KI (al 2% KI y al 0,2% I). Estas muestras fueron luego analizadas mediante densidad ptica (DO) a 690nm en un espectrofotmetro Milton Roy Spectronic 21D. Una unidad de la actividad enzimtica se defini como la cantidad de enzima que causa la reduccin del 0,01% de la intensidad del color azul de la

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solucin iodina-Almidn a 50 C en 1min/mL. La actividad enzimtica se determin como unidades por gramo de sustrato seco (U/g) (Swain y Ray, 2007).

3.5.2. Determinacin de Lipasa

3.5.2.1. Mtodo con la yema de Huevo: Para la preparacin de la emulsin de yema de huevo se limpiaron y sumergieron los huevos de gallina en etanol al 95% durante una hora. De manera asptica, se separ la yema de huevo y con una pipeta estril se agreg a 500mL de agar base, hasta luego obtener un homogeneizado de la suspensin. El medio de cultivo seleccionado fue el Agar-Agar 15g/L y despus de la esterilizacin, se agreg la suspensin de yema de huevo estril a 500mL al medio slido fundido estril con agitacin constante con un vortex y se enfri a 55-60 C. Luego de solidificarse el gel, se realizaron pozos usando varilla de vidrio estril de 1cm de dimetro y se removi el agar por succin. Luego se adicionaron alcuotas de las muestras de microalgas a un volumen de 0,5mL dentro de los pozos, cada microorganismo se sembr por separado y se incub a 25 C + luz y a 37 C en oscuridad durante 5 das (Mc-Faddin, 2003). La reaccin fue positiva (+); cuando se observ la presencia de una zona opaca en el medio alrededor del crecimiento, como producto de la precipitacin de los cidos grasos. Negativo (-) cuando no ocurri ningn cambio en el aspecto de las colonias o del medio de cultivo.

3.5.2.2. Mtodo con el detergente Tween 80:

Se utiliz medio slido con

peptona (5,0g), NaCl (2,5g), CaCl.2H2O (0,05g), Agar-Agar (15g) y Tween 80 (5mL/L). Una vez preparadas las placas se realizaron pozos usando varilla de vidrio estril de 1cm de dimetro y se removi el agar por succin. Luego se adicionaron las muestras de 0,5mL dentro de los pozos. La reaccin fue positiva (+); cuando se observ la presencia de una zona clara alrededor del crecimiento, como producto de la precipitacin de los cidos grasos. Negativo (-) ningn cambio en el aspecto de las colonias o del medio de cultivo (Pratt y col. 2000; Mc-Faddin, 2003).

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3.5.2.3. Mtodo con Lecitina al 0,1%: Se utiliz medio slido con lecitina de val natural 1200mg (100% soya natural), con adicin de 1,2mL/0.25L de tritn X-100, AgarAgar (15g/L) y se calent el medio a 100 C con agitacin constante hasta su disolucin completa. Una vez preparadas las placas, se realizaron pozos usando varilla de vidrio estril de 1cm de dimetro y se removi el agar por succin. Las muestras fueron previamente centrifugadas tomando el pellet de 0,5mL y se adicionaron en los pozos. La hidrlisis de la lecitina se manifest por la aparicin de un halo claro alrededor del pozo de crecimiento; se considero que la actividad fue mayor cuanto ms amplia fue la zona clara.

3.5.2.4. Mtodo cuantitativo con el p-nitrofenilpalmitato (p-NPP): Este ensayo se realiz en funcin de la estimacin colorimtrica del para-nitrofenol (p-NP) a 410nm, en el cual se liber como resultado de la hidrlisis de p-NPP. Una unidad de la actividad enzimtica fue definida como 1mol de p-nitrofenol liberado por minuto (mol/min). Para ello, se utiliz el tritn X-100 como agente solubilizante. El cultivo de microalgas fue centrifugado a 4000r.p.m por 10min y el sobrenadante se utiliz como fuente de la enzima. A 30mg del sustrato p-NPP, se le adicion 10mL de isopropanol y luego fue mezclado con una disolucin de 207mg de deoxicolato de sodio en 90mL de buffer fosfato a pH 7,0. De esta disolucin se utiliz 2,4mL por 0,1mL del sobrenadante libre de clulas del cultivo unialgal. Luego fue incubada por 15min a 37 C y se midi la densidad ptica (DO) a 410nm (Winkler y Stuckmann, 1978; Gupta y col. 2002). La Actividad enzimtica se calcul aplicando la siguiente expresin y las unidades expresadas en U/mL.

Concentracin de p-NPP = A410 x 2,71 x 103 M-1 cm-1

3.5.3. Determinacin de Proteasa Para la proteasa se aplicaron dos mtodos con el objeto de identificar las enzimas de tipo proteoltico (gelatinasas) que licuan/hidrolizan la gelatina (Mtodo cualitativo) y la casena (Mtodo cuantitativo).

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3.5.3.1. Mtodo de hidrlisis de la gelatina: Se utilizaron tubos conteniendo gelatina (caldo nutritivo a 4,0mM de medio algal + gelatina 10-20%) en forma de taco y sembrados por puncin con el inculo de cada microalga. Tanto los tubos inoculados como los controles fueron incubados a 37 C durante 6 das. La prueba fue positiva para aquellas microalgas y bacterias capaces de hidrolizar la gelatina con la subsecuente prdida de la habilidad de gelificarse de nuevo, una vez colocados los tubos a 4 C durante 30 minutos (Mc-Faddin, 2003; Kassana y col. 2007).

3.5.3.2. Mtodo de hidrlisis de la casena: Para esta prueba, se prepar antes una disolucin de casena al 2% en buffer Tris fosfato pH 7,8 de la cual se tomaron 5mL, para ser aadidos a un volumen igual del sobrenadante del cultivo de bacterias o de microalgas. Esta mezcla luego fue incubada a 37 C durante 5 minutos. La reaccin se detuvo con la adiccin de 5mL de cido triclorocetico al 5% (TCA). Para la casena se defini la unidad de la enzima por la cantidad liberada en TCA equivalente a 0,001 A280 por minuto a 37 C a un pH de 7,8. La actividad se calcul con la siguiente formula (Sharma y col. 1996).

Unid/mL = A280 (ensayo) A280 (blanco) tiempo x mL de enzima 3.5.4. Determinacin de Fosfatasa

3.5.4.1. Equipo olympus AU480: Para esta enzima utilizamos los siguientes reactivos: Amortiguador de ALP-SL; R2, y Sustrato de ALP-SL. Las concentraciones para la prueba fueron: 0,84mol/L de 2-amino-2-metil-1-propanol (pH 10,4 a 25 C), 2,0mmol/L de acetato de magnesio, 1,0mmol/L de sulfato de zinc, 2,0mmol/L de EDTA, 50mmol/L de p-nitrofenilfosfato, 50mmol/L de fenol y un conservador. Las condiciones establecidas fueron: longitud de onda (Primaria) 415nm, (Secundaria) 660nm, temperatura de 37 C, paso de luz 1cm, tipo de reaccin cintica, tiempo de reaccin 5 minutos, volumen de muestra 5L, volumen de reactivo, R1 280L; R2 70L, volumen total 355L y una relacin de muestra/reactivo 1/70.

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El equipo olympus Au480 tiene dos sondas permanentes: una sonda de muestreo (2 a 50L) y una sonda de reactivo (20 a 300L); las cuales tomaron los volmenes precisos para cada reactivo indicado para la determinacin de fosfatasa. En la Fosfatasa Alcalina en olympus AU480: El Sustrato es p-nitrofenilfosfato en 2-amino-2-metil-1propanol; el tipo de la reaccin en la presencia de magnesio es medido dicromticamente a 410/520nm (Hodgin y col. 1988). El valor normal es 31 a 110U/L (unidades por litro) en plasma. Las fosfatasas alcalinas son enzimas que se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente alta en huesos, hgado, placenta, intestinos y rin. disminucin en plasma tienen significado clnico. Tanto el aumento, as como su Su elevacin puede indicar una

enfermedad heptica, pero tambin pueden elevarse en otras enfermedades o incluso ser parte de fenmenos fisiolgicos como crecimiento y embarazo. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios.

3.5.5. Determinacin de Celulasa 3.5.5.1. Mtodo de la carboximetil celulosa: El medio slido se prepar con carboximetilcelulosa de sodio (0.1%), y agar (1%) en 0,1M buffer de fosfato de sodio pH 6,3 y luego se autoclav a 120 C por 2 minutos. Despus de solidificarse el gel se horadaron unos pozos usando varilla de vidrio estril de 1cm de dimetro y se removi el agar por succin. Las muestras de 0,5mL fueron inoculadas dentro de los pozos e incubadas a 37 C por 16 horas. El rojo congo fue utilizado como indicador para mostrar las zonas claras de la actividad celuloltica (Bremer y col. 1995).

3.5.6. Determinacin de Ureasa

3.5.6.1. Urea de Rustigian y Stuart: Se utiliz el caldo con urea de Rustigian y Stuart, pH 6,8. El medio utilizado contena: fosfato monopotsico KH2PO4 9,1g, fosfato disdico Na2HPO4 (buffer de Sorensen) 9,5g, extracto de levadura 0,1g, urea 1-2% 12g, rojo de fenol 0,01g y agua estril 1000mL. Como indicador se utiliz el rojo de fenol (Morou y col. 2000). Se consider positiva (+) la prueba cuando el medio cambi

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completamente a un color lila tenue. A diferencia del resultado negativo (-), el medio no cambio quedando del mismo color inicialmente (Mc-Faddin, 2003).

ETAPA 3. Ensayos realizados con agua residual de una extractora de aceite de palma La evaluacin de la microalgas como tratamiento terciario de aguas residuales de una extractora de aceite de palma africana, se realiz mediante cultivos discontinuos en dos ensayos:

3.6. Ensayos

3.6.1. Ensayos en condiciones autotrficas: Para las microalgas se utilizaron los nutrientes inorgnicos ALGAL y NITROFOSKA; para las cianobacterias se aplic el medio BG11. El inculo para cada cultivo lquido proceda de un cultivo en medio slido con estos nutrientes hasta que eran escalados a volmenes suficientes para desarrollar cultivos hasta de 500mL (Figura 4). Para ello, se utilizaron envases cilndricos de vidrio de 250 y 1000mL de capacidad.

Figura 4. Cultivos en condiciones de laboratorio.

3.6.2. Ensayos en condiciones mixotrficas: En este caso se utiliz como medio de cultivo, el agua residual vertida antes de su entrada al sistema de Lagunas de estabilizacin de la Planta extractora de Aceite (Figura 5). Muestras de estos efluentes, de 50 litros, con un pH inicial de 3,75 fueron neutralizados previamente hasta pH 7 con

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NaOH, para luego ser incubadas con agitacin constante mediante vortex y durante 10 das. Una vez finalizada la agitacin, se obtuvo un sobrenadante y un sedimento correspondiente al lodo del residual. Solo, se seleccion la fraccin soluble al 25% y sin esterilizar, como fuente de nutrientes para los cultivos y para la determinacin de la remocin de los compuestos presentes en el residual soluble.

Figura 5. Agua residual antes de ser vertidas a las Lagunas de Estabilizacin.

3.6.2.1. Primer Ensayo. Los cultivos se realizaron con agua residual no estril, respecto al volumen de cultivo de 150mL y fueron iniciados con un inculo mixto de 2,0 x106 cel.mL-1 de las microalgas Chlorella sp. y Scenedesmus sp. (Figura 6). Adems, tambin se contempl una serie de cultivos con agua residual enriquecida con NITROFOSKA. Entre los controles se seleccionaron dos: uno con agua residual sin microalgas, y otro control, correspondiente a un cultivo autotrfico (agua potable estril enriquecida con NITROFOSKA 5mL/L). experimento, fueron los siguientes: Es decir, los tratamientos en dicho

a) b) c) d)

Agua residual con microalgas (AR). Agua residual con microalgas + NITROFOSKA (ARN). Agua Residual (Control)-(AR). Agua estril con microalgas + NITROFOSKA (Control).

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Figura 6. Primer Ensayo (Tratamientos).

3.6.2.2. Segundo Ensayo. En este caso, el medio de cultivo fue el agua residual, previamente incubada mediante agitacin y a una concentracin del 25%. Los cultivos se iniciaron con una densidad celular de 2,0 x106 cel.mL-1 de cada especie de microalga (Chlorella, Chlamydomonas, Oocystis, Scenedesmus, Chlorococcum y Geitlerinema); y luego mezcladas para iniciar el cultivo mixto. Adems, el medio de cultivo fue enriquecido con almidn* (0,1%), urea* (0,1%) y Lecitina* (0,1%) (Figura 7), a fin de simular un medio residual con alta carga orgnica. El cultivo de control se desarroll en condiciones autotrficas, cuyo medio de cultivo fue agua potable estril enriquecida con NITROFOSKA a 5mL/L.

Los tratamientos evaluados fueron los siguientes:

a) b) c) d) e) f) g)

Agua residual + inculo mixto de microalgas (AR). Agua residual + inculo mixto de microalgas + NITROFOSKA (ARN). Agua residual + inculo mixto de microalgas + mezcla orgnica* (ARO). Agua residual +inculo mixto de microalgas + NITROFOSKA + mezcla orgnica (ARNO). Agua residual (Control)-(AR). Agua potable estril + inculo mixto de microalgas+ NITROFOSKA (Control). Agua potable estril+ inculo de microalgas + NITROFOSKA + mezcla orgnica (NO).

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Figura 7. Segundo Ensayo* (Tratamientos).

3.6.2.3. Parmetros de Cultivo: Los cultivos autotrficos y mixotrficos (agua residual) fueron iniciados con una densidad celular entre 1,0 y 2,0x106 cel.mL-1 y mantenidos con aireacin constante, iluminacin lateral suministradas por lmparas fluorescentes, fotoperiodo de 12:12 horas, utilizando lmparas fluorescentes Philips Daylight de dos tubos de 40W, a una intensidad luminosa de 156 mol quanta.m-2.s-1, y a 282C.

3.6.2.4. Exoenzimas en Ensayos 1 y 2: En este caso se tom 10mL de cada uno de los tratamientos realizados para cada tipo de ensayo se centrifug a 4.000r.p.m. en una centrifuga tipo HETTICH ROTINA 35, tomando el pellet para realizarle las exoenzimas en medio slido a las cuales se les realiz pozos usando varilla de vidrio estril de 1cm de dimetro y removiendo el agar por succin y despus se inocularon 0,5mL de cada tratamiento, las exoenzimas determinadas fueron lipasa, amilasa 02%, celulasa y urea al 0,1% para el ensayo 1, y en el ensayo 2 a parte de estas se le realiz adems la lecitina al 0,1%.

3.7. Recuento de bacterias asociadas a los cultivos

Se realiz por el mtodo de Contaje de Placa Heterotrfico (9215.B), al inicio y final de cada experimento. Para ello, se tomaron 10mL de la muestra y se diluyeron en 90mL de solucin salina al 0,85% estril, lo cual represent la dilucin 10-1, y luego hasta

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obtener una dilucin de 10-7. La finalidad de realizar estas diluciones es que el nmero de colonias en las placas se encuentre entre 30 y 300. Se tom 0,1mL de cada dilucin utilizando una micropipeta y se agregaron en placas de petri estriles de Agar nutritivo, dispersando el inoculo con una asa de Hockey y se incubaron las placas invertidas a 35C durante 24-48 horas, luego de las cuales se realiz la observacin y contaje de las colonias formadas (Standard Methods, 2005).

Para realizar el clculo de las Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/mL) se utiliz la siguiente ecuacin:

UFC/mL = (N de colonias x Fd)/Vm

Donde:

Fd: Factor de dilucin (Volumen final/Volumen de muestra) Vm: volumen de muestra (mL).

3.8. Determinacin de los parmetros fisicoqumicos de las muestras de aguas residuales Para el anlisis fsico-qumico de las diferentes muestras agua se siguieron los procedimientos descritos en el Standard Methods for Examination the Water and Wastewater (21th Edition 2005).

Las muestras de agua residual colectadas, eran preservadas en volmenes de 1 litro por cada una de las muestras por duplicado, con 1mL de cido Sulfrico concentrado (H2SO4) para la realizacin de DQO y para los dems anlisis, el resto de las dems muestras fueron mantenidas en refrigeracin. Todos los anlisis fueron realizados en el Centro de Investigaciones del Agua (CIA) de la Universidad del Zulia. As mismo, fueron analizadas muestras de los cultivos realizados con agua residual, tanto al inicio y como al final de cada ensayo. Todas las muestras fueron pasadas a travs de un filtro de borosilicato GF7547MM con la finalidad de eliminar la interferencia causada por las

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microalgas. Los anlisis se hicieron por duplicado, a excepcin de la DQO que se realiz por triplicado.

3.8.1. Nitrgeno total kjeldahl (Standard Methods, 2005): El nitrgeno total Kjeldahl se hizo un proceso de digestin previo a la destilacin en el que el nitrgeno orgnico se convierte en amonaco. Por lo tanto el nitrgeno total Kjeldahl incluye el nitrgeno orgnico y el amoniacal. El mtodo a emplear es el Semi-Micro Kjeldahl (4500-Norg-C). Para la digestin se agregaron 6mL de solucin digestora de cido Sulfrico/Perxido de Hidrgeno (H2SO4/H2O2) en una relacin 1/3. Luego se coloco la muestra en el digestor Tecator 2020 a 250C hasta que el volumen se reduje aproximadamente a 25mL. Luego se realizo el mtodo de Destilacin PreliminarTitulacin (4500-NH3.B). Este ensayo se basa en la conversin de equilibrio entre el in amonio y el amonaco libre, y la liberacin del amonaco gaseoso junto con el vapor que es producido con la ebullicin del agua. Para este anlisis se emplearon muestras de 50mL, a las cuales se le agregaron 15mL de solucin de Hidrxido de Sodio (NaOH)Tiosulfato de Sodio (Na2S2O3) para incrementar el pH.

La muestra se destil en una unidad de destilacin Bchi 315 y se colect en un Erlenmeyer de 125mL de capacidad que contena 25mL de solucin mixta de cido brico (H3BO3), hasta obtener un volumen entre 75 y 100mL. La cantidad de amonio en la muestra se determina por la cantidad de cido brico consumido en el Erlenmeyer. Esto se midi titulando la muestra con una solucin de cido sulfrico (H2SO4) 0,02N. Para determinar la concentracin de nitrgeno total Kjeldahl se emple la siguiente frmula:

Nitrgeno (mg/L) = [(T B) x N x 14 x 1000)] Vm

Donde:

T: Volumen de cido gastado en la titulacin (mL). B: Volumen de cido gastado en la titulacin del blanco (mL). N: Normalidad del cido (0.02N).

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Vm: Volumen de muestra (mL).

3.8.2. Fsforo total (Standard Methods, 2005): Se determin el contenido de fosfato mediante el mtodo Colorimtrico con cido Vanadomolibdofosfrico (4500P.C), para esto se emplearon 25mL de muestra y se le agreg 1mL de reactivo vadanatomolibdato, constituido por una solucin de molibdato de amonio ((NH4)6Mo7O24.4H2O) y metavanadato de amonio (NH4VO3) producindose un complejo de color amarillo con el fosfato. El desarrollo del color se midi cuantitativamente luego de 20 minutos usando un espectrofotmetro HACH DR/2000 midiendo la absorbancia a 430nm. Con el valor de la absorbancia, y la curva de calibracin obtenida en el laboratorio se calcul el contenido de fosfato (mg/L) mediante la siguiente expresin:

PO4-3 (mg/L) = Abs430 0,0039479 0,1164871 Donde: Abs430: Absorbancia de la muestra medida a longitud de onda de 430nm.

3.8.3. Demanda Qumica de Oxgeno (Standard Methods, 2005): El contenido de materia orgnica se oxida empleando un agente qumico fuerte (K2Cr2O7) en medio cido (H2SO4) utilizando un catalizador (AgSO4) para facilitar la oxidacin de determinados tipos de compuestos orgnicos. Para la determinacin de la DQO se emple el mtodo Colorimtrico de Reflujo Cerrado (5220 D). Se tomaron 2mL de muestra en tubos de ensayo con tapa refractaria de 16 x 100mm previamente preparados con 3mL de solucin de cido Sulfrico concentrado (H2SO4) + Sulfato de Plata (AgSO4) y 1mL de solucin de Dicromato de Potasio (K2Cr2O7) preparado con Sulfato de Mercurio horas. (HgSO4). Los tubos se agitaron hasta lograr una mezcla homognea y se colocaron en un digestor HACH modelo 2100A a 140 C durante dos Luego de la digestin se midi la absorbancia de los tubos en el espectrofotmetro HACH DR/2800 a 600nm. Con el valor de la absorbancia, y la curva de calibracin obtenida en el laboratorio se calcul la DQO (mg/L) mediante la siguiente expresin:

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DQO (mg/L) = (Abs600 x 3204,5135) 5,884

Donde: Abs600: Absorbancia de la muestra medida a 600nm. 3.8.4. Aceites y Grasas (Standard Methods, 2005): Para la determinacin de Aceites y grasas se emple el mtodo gravimtrico (5520-B, F.). Para esto se tom 50mL de la muestra en un erlenmeyer de 100mL previamente secado y pesado hasta un peso constante (P1) (diferencia entre pesadas consecutivas no mayor a 0.0005 g). Luego se transfiri el volumen de la muestra a un embudo de separacin verificando que la llave de salida este cerrada. Posteriormente, se lav la botella que contena la muestra y el cilindro donde se midi el volumen con 30mL del solvente de extraccin (mezcla de n-Hexano/metil-terbutil-ter). Despus, se transfiri el lquido de lavado a uno que contena la muestra; se agit el embudo de separacin por dos minutos. Seguidamente, se separ la capa acuosa y la orgnica en el embudo de separacin, drenndose el solvente a travs de un embudo, al cual previamente se le haba colocado un disco de papel de filtro Whatman No. 1 y con aproximadamente 10g de sulfato de sodio (Na2SO4) anhidro en un erlenmeyer de 100mL, llevado a peso constante.

El paso siguiente, consisti en adicionar 30mL de solvente, al embudo de separacin con la muestra, y se repitieron las fases de agitacin y extraccin, por lo menos dos veces. Finalmente, se combinaron las capas orgnicas en el mismo erlenmeyer de 100mL, se lav el papel filtro y el Na2SO4 con 10 20mL del solvente de extraccin, la evaporacin del solvente fue en un rotavapor a una temperatura de 85 C hasta que estuviera totalmente seco, se enfri en un desecador durante 30min y se peso el baln (sea este valor P2). El resto de la muestra contenida en el embudo de separacin se descart. Con el peso del erlenmeyer sin la muestra y el del erlenmeyer con la muestra se calcul, el contenido de grasas y aceites, mediante la siguiente expresin:

Grasas y Aceites (mg/L) = (P2 P1) x 106 Vm

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Donde:

P2: Peso del baln + residuo (g). P1: Peso del baln vaco (g). Vm: Volumen de muestra (mL).

3.8.5. Slidos Suspendidos Totales SST (Standard Methods, 2005): Para la determinacin de la concentracin de slidos suspendidos totales (2540-D) en la muestra se procedi de la siguiente manera: se realiz una preparacin previa al papel de filtro de fibra de vidrio GC50 de 47mm de dimetro, el mismo se lav con agua destilada y se coloc en una capsula de aluminio, la cual se calent durante 5 minutos en una mufla marca Thermolyne tipo 48000 furnace a una temperatura de 600C, transcurrido ese tiempo se sac y se dej enfriar en un desecador durante aproximadamente 15 minutos para luego pesarlo, correspondiendo este al peso uno (1).

Una vez pesado se coloc el papel de filtro en el equipo de filtracin al vaco, se midieron 50mL de muestra con un cilindro graduado y se filtr dicho volumen de muestra, quedando en el papel de filtro los slidos suspendidos contenidos en ese volumen de muestra, el papel de filtro se coloc de nuevo en la capsula de aluminio y se llev a una estufa donde se sec a una temperatura de 103105C durante una hora. Transcurrido ese tiempo, se sac de la estufa y se dej enfriar en un desecador durante aproximadamente 15 minutos para luego pesarlo, correspondiendo este al peso dos (2). La concentracin de slidos suspendidos totales se determin mediante la siguiente expresin: SST (mg/L) = (P2 P1) x 106 Vm

Donde:

P1: Peso del papel de filtro + Cpsula de aluminio (g). P2: Peso del papel de filtro + Cpsula de aluminio + slidos de la muestra (g). Vm: Volumen de la muestra (mL).

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3.8.6. Slidos Suspendidos Voltiles SSV (Standard Methods, 2005): Para la determinacin de la concentracin de slidos suspendidos voltiles (2540-E) en la muestra se procedi de la siguiente manera: Luego de la determinacin de los slidos suspendidos totales se coloca la capsula con el papel de filtro en una mufla a 600C durante 5 minutos, transcurrido ese tiempo se sac y se dej enfriar en un desecador durante aproximadamente 15 minutos para luego pesarlo, correspondiendo este al peso tres (3). La concentracin de slidos suspendidos voltiles se determin mediante la siguiente expresin:

SSV (mg/L) = (P2 P3) x 106 Vm Donde: P2: Peso del papel de filtro + Cpsula de aluminio + SST (g). P3: Peso del papel de filtro + Cpsula de aluminio + slidos no voltiles (g). Vm:Volumen de la muestra (mL).

3.8.7. Determinacin del pH (Standard Methods, 2005): Se realizo in situ a las muestras de agua colectadas de las Lagunas de estabilizacin la medicin de temperatura con un termmetro de mercurio de apreciacin 0,1C (marca Bannan), pH (pH-metro de campo marca Orion) y salinidad (salinmetro-refractrmetro C-1, modelo SZJ-S), con el fin de determinar las condiciones ambientales donde se encontraron las microalgas y cianobacterias; y las bacterias asociadas a estas. A los cultivos de microalgas, luego de su aislamiento y purificacin, se midi el pH (Mtodo 4500-H+.B), realizndose cada dos (02) das hasta alcanzar la fase estacionaria, utilizando un pHmetro CORNING, que lee directamente en unidades de pH. destilada estril antes de introducirlo a los cultivos. Para evitar la contaminacin, el electrodo se lav con alcohol isoproplico al 70% y luego con agua

3.9. Anlisis estadstico Se realiz un anlisis de varianza (ANOVA) de un factor para la comparacin de

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medias, aplicando la prueba Tukey a un nivel de significancia de 0,05 y un anlisis de correlacin lineal utilizando el coeficiente de correlacin de Pearson para realizar la comparacin entre grupos y estudiar la relacin entre los mismos (Pardo y Ruz, 2002). Estos anlisis se realizaron utilizando programa SPSS 10.0 para Windows.

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Resultados y Discusin

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ETAPA 1. Caracterizacin de las Lagunas de Estabilizacin de una Planta extractora de aceite de palma

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Microalgas y bacterias asociadas a las microalgas, aisladas de Lagunas de Estabilizacin de una Planta extractora de aceite de palma

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4.1.1. Identificacin de microorganismos fotosintticos estabilizacin de una planta extractora de aceite de palma

de

lagunas

de

En las lagunas de Estabilizacin de la planta extractora de aceite de palma (Elaeis guineensis) de la empresa Palmas Oleaginosas de Casacar Ltda, Colombia, se observo la presencia de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintticas en todas las lagunas, indicando su adaptacin en estas aguas residuales. Todas, crecieron bien en medios slidos y lquidos, con el medio comercial ALGAL, BG11 y NITROFOSKA. As como tambin, las bacterias asociadas a los cultivos de microalgas crecieron satisfactoriamente en agar nutriente.

La diversidad de los organismos en las lagunas de oxidacin se evidencio en todos los muestreos, encontrando mayor diversidad en las lagunas 2, 3 y 4. En la laguna 2 se encontr al grupo de microalgas y bacterias fotosintticas. Mientras que, en la laguna 3 y 4, el grupo con mayor diversidad fue el de microalgas y cianobacterias. En todas las lagunas se observo una predominancia de las Chlorophyta con un alto ndice de dominancia del gnero Chlorella. En cambio, Cyanophyta y Euglenophyta presentaron ndices de dominancia intermediarios, seguido por las Crysophyta.

Las microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintticas observadas en las lagunas de estabilizacin, fueron 27 cepas (Tabla 8), con predominio de 5 cepas, correspondiente a las especies de Chlorella, Scenedesmus, Euglena, Phacus y Thiopedia en todas las lagunas y para todos los muestreos; mientras que las otras 22 cepas se encontraron en menor proporcin.

Tabla 8. Microorganismos observados en los muestreos de las lagunas de Estabilizacin. NOMBRE DEL LAGUNAS DE ESTABILIZACIN NMERO ORGANISMO 1 2 3 4 5 1 Oocystis sp. ++ 2 ++ + Kirchineriella lunaris 3 Chlorella sp. +++++ +++ +++++ +++ ++ 4 Clorofita N.I. + + 5 Hyaloraphidium sp. + + + 6 Coelastrum sp. ++ 7 Scenedesmus sp. . +++++ +++++

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8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Chlorococcum sp. Ankistrodesmus sp. Monoraphidium sp. Chlamydomonas sp. Closteriopsis sp. Pandorina sp. Haematococcus sp. Euglena sp. Phacus sp. Navicula sp. Nitzschia sp. Cianobacterias Lyngbya sp. Oscillatoria sp. Synechococcus sp. Merismopedia sp. Synechocystis sp. Geitlerinema sp. Pseudanabaena sp. Chroococcus sp. Bact. Fotosinttica Thiopedia sp. ++ ++ ++ +++ ++ +++++ ++ + + + ++ +++ ++ + +++ ++ +++ +++++ +++++ ++ + +

+++ ++ +++ ++++ ++

+++++ ++++ ++ +

++ + + ++ ++ + +++ ++

+++++

+++++

++

+: Presente, ++: Escasa cantidad, +++: Regular Cantidad, ++++: Abundante, +++++: Dominante. N.I.: no identificada.

Las microalgas observadas en fresco de las Lagunas de Estabilizacin fueron 27 gneros; de las cuales solo se lograron aislar en medios de cultivos slidos, las Chlorophyta: Chlorella, Scenedesmus, Oocystis, Chlamydomonas, Chlorophyta N.I. (Forma de banano) y Chlorococcum. En cuanto a representantes de la Divisin Cyanophyta, se encontr Oscillatoria, Pseudanabaena, Lyngbya, Synechocystis y Geitlerinema. Phacus y Euglena de la Divisin Euglenophyta, y de la Divisin Chrysophyta, Nitzschia y Navicula.

Al momento de realizar reaislamiento en medio de cultivo lquido se obtuvieron solo cultivos unialgales de las especies de Chlorella, Scenedesmus, Chlamydomonas, Oocystis y Chlorococcum, Geitlerinema y Euglena. No obstante, el cultivo de Euglena se mantuvo activo hasta 12-15 das. En cuanto a los cultivos mixtos, se lograron mantener tres combinaciones: (Chlorella + Scenedesmus), (Euglena + Chlorella), (Navicula + Chlorella + Thiopedia) (Tabla 9).

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Tabla 9. Microalgas y cianobacterias observados durante el periodo de estudio en las Lagunas de Estabilizacin de una Planta extractora de aceite de palma. MEDIO LIQUIDO MEDIO LQUIDO MEDIO SLIDO (OBSERVACIN DIRECTA) (CULTIVOS UNIALGALES-MIXTOS) Oocystis sp. Oocystis sp. Oocystis sp. Chlorella sp. Chlorella sp. Kirchineriella lunaris Chlorella sp. Scenedesmus sp. Scenedesmus sp. Clorofita N.I. Chlorococcum sp Chlorococcum sp. Hyaloraphidium sp. Chlamydomonas sp. Chlamydomonas sp. Geitlerinema sp. Coelastrum sp. Haematococcus sp. Euglena sp.-Chlorella sp. Scenedesmus sp. Oscillatoria sp. Euglena sp.-Navicula sp. Chlorococcum sp. Geitlerinema sp. Chlorella sp.-Navicula sp.-Thiopedia Ankistrodesmus sp. Pseudanabaena sp. Monoraphidium sp. Euglena sp. Chlorella sp.-Scenedesmus sp. Chlamydomonas sp. Navicula sp. Closteriopsis sp. Nitzschia sp. Pandorina sp. Haematococcus sp. Lyngbya sp. Oscillatoria sp. Synechococcus sp. Merismopedia sp. Synechocystis sp. Geitlerinema sp. Pseudanabaena sp. Chroococcus sp. Euglena sp. Phacus sp. Navicula sp. Nitzschia sp. Thiopedia sp.

De las 27 cepas de microalgas, cianobacterias y bacteria fotosinttica, observadas en las lagunas de estabilizacin solo se aislaron 12 cepas en medio slido, y 6 cepas en medio lquido, y las microalgas que se mantuvieron en medio lquido pero en conjunto con otras microalgas fueron 4 cepas. Esto indica que al final del proceso de aislamiento se pudieron aislar y mantener bajo condiciones de laboratorio, solo 6 cepas.

Algunos de los gneros encontrados en estas aguas residuales coinciden con las encontradas en aguas residuales municipales, industriales, agrcolas y de acuacultura. Tal es el caso de las especies de: Chlorella, Scenedesmus, Ankistrodesmus, Oocystis, Euglena, Chlamydomonas, y Nitzschia. Entre las especies de Cianobacterias, se han

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reportado Oscillatoria, Chroococcus, Synechocystis, Synechococcus, Geitlerinema, Pseudanabaena, Lyngbya y Merismopedia.

Figura 8. Micrografias (400x). (1) Primer Muestreo. a. Scenedesmus sp. b. Oscillatoria sp. c. Oocystis sp. d. Pandorina sp. e. Lyngbya sp. f. Chroococcus sp. (2) Segundo muestreo. g. Thiopedia sp. h. Pseudoanabaena sp. i. Euglena sp. j. Monoraphidium sp. k. Synechococcus sp. l. Ankistrodesmus sp. (3) Tercer muestreo. m. Haematococcus sp. n. Geitlerinema sp. o. Kirchineriella lunaris.

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Mientras que, entre las bacterias fotosintticas, Thiopedia (Sallal, 1986; Peinador, 1999; Oudra y col. 2000)

En el primer, segundo, tercer y cuarto (1-2-3-4) muestreo respectivamente (Figura 8) se encontraron diversidad de microorganismos fotosintticos (Tabla 10); indicndonos que las microalgas pueden encontrarse en las lagunas en cualquier poca del ao, sin embargo, una sucesin de tipos de microalgas se produce durante las temporadas. Algunos estudios han reportado microalgas, cianobacterias, diatomeas, ciliados y bacterias fotosintticas en varios lugares del mundo y por ende en varios tipos de clima. As; Peinador (1999); Colon, (2008) encontraron especies de Microcystis y Oscillatoria en poca seca y Calothrix, Merismopedia, Microcystis, Leptolyngbya, Oscillatoria, Pseudanabaena, Phormidium y Planktothrix en poca de lluvia, en dos ros usados como receptores de agua residuales y en el cabo rojo de Costa Rica.

Thajuddin y Subramanian (2005), reportaron en las costas de India a Trichodesmium erythraeum, Ammeatoidea normanii, Dichothrix spiralis, Oscillatoria borneti, fluminenensis, polonicum,

Pseudoanchobrosa

Radaisia

violcea,

Siphononema

Anabaena, Aulosira, Calothrix, Cylindrospermum, Gloeocapsa, Nostoc, Rivularia, Scytonema y Tolypothrix. reportado. Y en lagos de la Florida: Anabaena, Aphanocapsa, Dactylococopsis, Merismopedia, Oscillatoria, Dactylococcopsis, Microcystis y Lingbya Y en Sao Paulo, Brasil en aguas tropicales y subtropicales del sur de Amrica 4 especies del genero Romeria, Geitlerinema unigranulatum, Arthrospira, Planktothricoides y Hormoscilla por Komrek y Komrkov (2007).

La Chlorophyta, como Chlorella, Scenedesmus, Micractinium, Ankistrodesmus y Chlamydomonas y las Euglenophyta como Euglena suelen predominar en las lagunas de tratamiento de aguas residuales y los gneros de microalgas flagelares como Euglena, Leponicinclis, Chlamydomonas asociados con Micratinium; la biomasa es baja en las lagunas 1, 2 y 3 probablemente al efecto del pH alto y concentraciones de NH3-N altas y en las lagunas 4 y 5 es mayor (Wrigley y Toerien, 1990).

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Las especies predominantes de algas dependen de las condiciones de crecimiento, en particular la temperatura, carga orgnica, oxgeno, disponibilidad de nutrientes, y la depredacin. Otras especies son encontradas en estas lagunas como las cianobacterias como Aphanothece, Microcystis, Anabaena y Oscillatoria

Tabla 10. Diversidad de microorganismos fotosintticos en Lagunas de estabilizacin de una Planta extractora de aceite. LAGUNAS LAGUNAS MUESTREOS MICROALGAS ANAEROBIAS FACULTATIVAS (VECES)*** (1-2)* (3-4-5)** 2 1-2-3-4 1-2-3-4 1 1 X 2-3 X X 1-2-3 X X 1-2-3 X 1 X 1-2 X 1-2 X 1 X 1-2 X 1 X X 1-2-3-4 X X 1-2 X X 1-2-3-4 X X 1-2-3 X 2-3-4 X 2 X 1-2-3-4 X X 1-2-3-4 X 1-2-3-4 X X 1-2-3-4 X 1-4 X X 1-2-4 X 2-3 (1-2)* Nmero de lagunas anaerobias. (3-4-5)** Nmero de lagunas facultativas. Veces*** se realizaron hasta 4 muestreos. X X X X Oocystis sp. Kirchineriella lunaris Chlorella sp. Hyaloraphidium sp. Coelastrum sp. Scenedesmus sp. Chlorococcum sp. Ankistrodesmus sp. A.falcatus Monoraphidium sp. Chlamydomonas sp. Closteriopsis sp. Pandorina sp. Lyngbya sp. Oscillatoria sp. Synechococcus sp. Merismopedia sp. Synechocystis sp. Geitlerinema sp. Pseudanabaena sp. Chroococcus sp. Euglena sp. Phacus sp. Navicula sp. Nitzschia sp. Thiopedia sp. Haematococcus sp. X X X

Los gneros encontradas en las lagunas de estabilizacin de un planta extractora de aceite de palma coinciden con los estudios realizado por Vinces y col. (1971) indicando que en este estudio se estudiaron lagunas de estabilizacin de agua residuales

60

municipales en San Juan Lima-Per observando mayor diversidad de Chlorophyta (19 gneros) Actinastrum, Crucigenia, Chlorogonium, Elakatothrix, Gleocystis, Micractiniun, Palmella, Pascheriella, Sphaerocystis, Stephanoptera, Tetraspora, Myrmecia y Tetrastrum. Cyanophyta (12 gneros) Anacystis, Anabaena, Aphanocapsa, Calothrix, Chroococcus, Gleocapsa, Nostoc, Scytonema, Spirulina, y Thalpophila. Euglenophyta (2 gneros) Euglena y Phacus. Crysophyta (4 gneros) Chloromeson, Diceras, Ceratoneis y Surirella y Pyrrophyta (1 gnero) Peridinium. Esta diversidad mayor es debido a que la lagunas tienen longitudes de 7000m2; siendo ms grandes que lagunas de empresas industriales. Salazar, (2005); indico otro grupo como las Cryptophytas con el gnero de Chryptomonas con una aplicacin del 25% para lagunas de oxidacin del agua residual domestica de las instalaciones (laboratorios de docencia e investigacin, cafetera, actividades deportivas, aulas de clases) de la Universidad Autnoma Metropolitana de Iztapalapa. Escorihuela y col. (2007), en un estudio de una laguna con agua residual en la Universidad del Zulia Maracaibo (Centro de Investigaciones del Agua CIA), report mayor incidencia del grupo Cyanophytas (Synechocystis), Chlorophyta (Chlorella) y Euglenophytas (Euglena).

En sistema de tratamiento de agua residual municipal de Esmoruz-Portugal como Planktothrix mougeotii, Microcystis aeruginosa, Pseudanabaena mucicola y en industrias de papel encontramos dominancia de cianobacterias como Oscillatoria, Phormidium, Geitlerinema y Pseudanabaena; adems de Chroococcusa (Vanconcelos y Pereira, 2001; Kirkwood y col. 2001).

61
d e

Figura 9. Micrografias (400x). (4) Cuarto Muestreo. a. Navicula sp. b. Synechocystis sp. c. Phacus sp. d. Nitzschia sp. e. Merismopedia sp.

Las bacterias fotosintticas purpuras, tales como, Chromatium, Thiocystis, Thiocapsa y Thiopedia tambin crecen en lagunas facultativas, y en nuestro caso, slo se observ Thiopedia, en el cuarto muestreo (Figura 9). Estas bacterias dependiente de sulfuros para su crecimiento, aportan la coloracin rosada-roja a las aguas residuales y son indicadoras de sobrecarga orgnica. En lagunas de estabilizacin de aguas residuales municipales de Rosario-Argentina, se han descrito, la presencia de Thiocapsa y Thiopedia como bioindicadoras de condiciones anxicas y frecuentes durante todo el tiempo de estudio (Igallinella y col. 2000).

4.1.1.1. Cultivos unialgales de las microalgas aisladas de las lagunas de estabilizacin Todas las microalgas (Chlorella sp., Scenedesmus sp., Chlorococcum sp., Oocystis sp. y Chlamydomonas sp.) crecieron satisfactoriamente en cultivos autotrficos con el fertilizante, inclusive de inmediato exhibieron fase exponencial, desde el inicio del cultivo hasta los das 9 y 12 (Figura 10a). Scenedesmus sp. produjo la mayor densidad celular, con 36,89 x106 cel.mL-1; seguido de Chlorella sp. Mientras que la menor densidad lo fue para Oocystis con 16,85 x106 cel.mL-1. Sin embargo, esta microalga es de poco crecimiento, comparada al resto de las clorofitas evaluadas.

Para el caso de, la cianobacteria Geitlerinema sp., cuyo crecimiento se sigui mediante turbidez, tambin expres su fase exponencial desde el inicio hasta los 21-22 das, para

62

luego alcanzar la fase estacionaria (Fig. 10b). De acuerdo a las curvas de crecimiento obtenidas, se sugiere que todas estas microalgas se adaptaron fcilmente al medio y condiciones de cultivo; lo cual significa, su posible utilizacin para estudios a nivel de laboratorio.

40 35

DC (x 106 cel.mL -1 )

30 25 20 15 10 5 0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
Chlorella sp. Scenedesmus sp. Chlamydomonas sp. Oocystis sp. Chlorococcum sp.

Edad del cultivo (das)

0,9 0,8 0,7

DC (DO750nm)

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

Geitlerinema sp.

Edad del Cultivo (das)

Figura 10. a. Crecimiento comparativo de microalgas Chlorophyta. b. Crecimiento de la cianobacteria Geitlerinema sp., seguido mediante turbidez.

63

4.1.1.2. Aislamiento e identificacin de bacterias asociadas a los cultivos de microalgas y cianobacterias.

De acuerdo a las diferentes pruebas bioqumicas, se identificaron cepas de: Corynebacterium durum, Bacillus sphaericus, Delftia acidovorans, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella stomatis, Pasteurella aerogenes, Stenotrophomonas maltophilia, Brevundimononas diminuta y Staphylococcus hominis (Tabla 11 y 12). Al menos en, agua residual de aceite de oliva se ha detectado Bacillus sphaericus (Eusbio y col. 2007) y Stenotrophomonas maltophilia, asociada a la biodegradacin de polifenoles (Lee y col. 2002).

a. Bacterias Asociadas a Chlorella sp. 1 y 2: Se identific a Corynebacterium durum, bacilo gram positivo con forma de bastn, en el frotis teido aparecen en empalizada o como clulas individuales que yacen en ngulos agudos unas con otras en formaciones en V (Figura 11). Las colonias son pequeas, de color blanco, con bordes irregulares y un poco mucoide. Tambin, se encontr Bacillus sphaericus; cuyas caractersticas morfolgicas son las siguientes: bacilos gram-positivo grandes con esporas terminales esfricas en agar nutriente las colonias son de color blanco con bordes irregulares y grandes; en agar sangre las colonias son de color amarillo opaco con bordes irregulares algunas son pequeas y otras grandes (Figura 12).

Figura 11. Corynebacterium durum.

64

Figura 12. Bacillus sphaericus.

b. Bacterias asociadas a Oocystis sp.: En esta microalga se identificaron Bacillus sphaericus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella stomatis y P. aerogenes. Entre las caractersticas de A. actinomycetemcomitans se distinguen, las de ser un bacilo gram-negativo pequeo, con colonias lisas o rugosas y opacas, con apariencia del borde de un cigarrillo cuando es cortado. En cambio, las especies de Pasteurella son bacilos gram-negativos, no motiles, cocoides pequeos individuales, en pares o en cadenas. En agar sangre son grisceas opacas y son mucoides, con bordes irregulares y pequeas. P. aerogenes las colonias en placas de Agar sangre en 1 da estn a 0,5 a 1mm de dimetro, convexas, lisas, translucientes y no hemolticas; al igual que otras especies P. aerogenes es ureasa + y produce gas en glucosa. P. stomatis su diferenciacin incluye acidificacin de maltosa y manitol, produccin de Indol y descarboxilacin de Ornitina.

c.

Bacterias asociadas a Scenedesmus sp.: De esta microalga se aislaron e

identificaron: Corynebacterium durum, Bacillus sphaericus, Delftia acidovorans y Staphylococcus hominis. Las caractersticas de D. acidovorans, la distinguen como bacilo gram-negativo, aislado o en pares. Adems, son catalasa y oxidasa positiva, reducen el nitrato a nitrito, oxidan fructosa y manitol y producen una pigmentacin amarilla en los cultivos. D. acidovorans tambin, ha sido descrita como una bacteria ambiental, localizada en suelo y agua, y al parecer no es patgeno en humanos (Rocco y Knutson, 2005). Para el caso de, Staphylococcus hominis, este se presenta como un

65

coco gram-positivo, que ocurre en grupos y menos a menudo en pares, ttradas o cadenas (3 o 4 clulas), no es motil, ni formador de esporas. Las colonias en agar sangre son pequeas de color amarillas-naranjas o cremas y no pigmentadas, lisas y con bordes irregulares.

d. Bacterias asociadas a la cianobacteria Geitlerinema sp.: .De las cincos bacterias, solo se identificaron tres y a continuacin se describen sus caractersticas: Stenotrophomonas maltophilia, bacilo gram-negativo, cuyas colonias son lisas, brillantes y de color blanco a amarillento (Figura 13). Brevundimononas diminuta bacilos gramnegativo sus colonias son circulares, convexas y brillantes, con mrgenes lisos y son de color amarillas o rosadas en agar sangre (Figura 14). Staphylococcus hominis, ya descrita y asociada tambin a Scenedesmus. La cepa C-12 Blanca, bacilos Gram (-), de tamao grande y con esporas subterminales y la cepa C-12 Naranja, de cocobacilos Gram (+) y oxidasa y catalasa positivas.

Figura 13. B. diminuta bacilo gramnegativo.

Figura 14. Colonias de Stenotrophomonas maltophilia.

66

e. Bacterias Asociadas a Chlorococcum sp.: En esta microalga se encontraron tres bacterias asociadas: otra especie de Delftia diferente a la aislada de cultivo de Scenedesmus, la cepa C-42, de bacilos Gram () pequeos y la cepa C-13, de bacilos Gram (+) con esporas subterminales; y con oxidasa y catalasa positivas.

Los procesos biolgicos del agua residual domestica pueden ser aerobios y anaerobios; en donde se producen unos floculos los cuales pueden permanecer en la superficie o se hunde y alcanzan un dimetro de 20-50cm. Entre las bacterias de los floculos predominan las representantes de gneros con metabolismo aerobio-oxidativo como Zooglea, Pseudomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Corynebacterium, Acinetobacter, Micrococcus y Flavobacterium. Pero tambin se presentan bacterias anaerobias facultativas, que son fermentativas en ausencia de sustratos oxigenados, de los gneros Aeromonas, Enterobacter, Escherichia, Streptococcus y distintas especies de Bacillus. Todas las bacterias contribuyen con las cpsulas de muclago y con las microfibrillas al crecimiento colonial y a la formacin de los floculos reportado por Chacn, (2010); coincidiendo algunos de estos gneros con los cultivos de microalgas y cianobacterias aisladas de las aguas residuales de una extractora de aceite de palma.

Otros microorganismos que tambin intervienen en el tratamiento aerobio de aguas residuales son: Citrobacter, Serratia, mohos y levaduras que actan mas de componentes acompaantes que de degradantes y algunas algas como Anabaena sp. que convierte los poliuretanos en H2; Chlorella sp. los alginatos los convierte en glicolato y Dulaniella sp. los alginatos en glicerol reportado por Chacn, (2010).

Los resultados obtenidos indican que se aislaron 12 cepas en medio slido, y 6 cepas en medio lquido. Adems, de lograrse cultivos mixtos con otras 4 microalgas. Esto indica que al final del proceso de aislamiento se pudieron aislar y mantener bajo condiciones de laboratorio, solo 6 cepas. De estos cultivos unialgales, se identificaron y aislaron 13 cepas de bacterias, asociadas a los cultivos de Chlorella sp. 1 y sp. 2, Scenedesmus sp., Oocystis sp., Geitlerinema sp. y Chlorococcum sp. en donde predominaron 5 cepas como Chlorella sp., Scenedesmus sp., Euglena sp., Phacus sp. y

67

Thiopedia sp. en todas las lagunas y para todos los muestreos, las otras 22 cepas se encontraron en menor proporcin.

En cuanto a las pruebas bioqumicas, se identificaron 13 cepas de bacterias, de las cuales se identificaron: Corynebacterium durum, Bacillus sphaericus, Delftia y acidovorans, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella stomatis, Pasteurella aerogenes, Stenotrophomonas maltophilia, Brevundimononas diminuta Staphylococcus hominis. Mientras que, se aislaron las C-12 Blanca, C-12 Naranja, C13 y la C-42, no identificadas.

4.1.2. Microalgas y su relacin con los parmetros fisicoqumicos de las lagunas de estabilizacin de una extractora de aceite de palma Los muestreos realizados a las lagunas de estabilizacin de una planta extractora de aceite de palma permitieron determinar la abundancia y diversidad de los microorganismos fotosintticos por muestreo. De igual manera fueron caracterizadas las muestras de aguas en funcin de los parmetros fisicoqumicos a fin de establecer posibles relaciones con la poblacin de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintticas presentes en este sistema de estabilizacin. 2008, 01 de diciembre 2008 y el 05 de mayo 2009. Para ello, se realizaron cuatro muestreos en las siguientes fechas: 30 de junio 2008, 14 de septiembre del

En el muestreo 1, la poblacin de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintticas fue de 17,65; 4,35 y 0,04 x106 cel.mL-1 respectivamente. Entre las microalgas, las Chlorophyta fueron las ms abundantes, con 16,50 x106 cel.mL-1; mientras que, las Euglenophyta y las Crysophyta presentaron los valores ms bajos a nivel de clorofita, con 0,73 y 0,42 x106 cel.mL-1 (Figura 15).

Entre los gneros de mayor abundancia en Chlorophytas, se observ a Chlorella sp. con 13,86 x106 cel.mL-1 y seguido en orden descendente por Scenedesmus sp., Chlamydomonas sp., Monorhaphidium sp., Ankistrodesmus sp., Oocystis sp. y

68

Tabla 11. Caractersticas bioqumicas y diferenciales de Bacterias Gram-positivas asociadas a las Microalgas.
Caractersticas Bilis Esculina 10% Bilis Esculina 40% Cloruro de Na 6% Caldo Esculina Gelatina al 4%

Novobiocina

L-Arabinosa

Fenilalanina

Tetrazolium

Bacitracina

Bacterias Asociadas a las Microalgas Catalasa Oxidasa

Optoquinona

Trehalosa

Melobiosa

Melixitosa

Celobiosa

Sacarosa

Rafinosa

Motilidad

Glucosa

Esculina

Piruvato

Gelatina

Lactosa

Arginina

Maltosa

Almidn

Glicerol

Salicina

Salicina

Sorbitol

Manitol

Imelina

Ribosa

Nitrato

Xilosa

Urea

Indol

Chlorella Scenedesmus Chlorella Oocystis

Corynebacterium durum

NR

+/-

NR NR NR

NR NR NR

+/-

NR NR

+/-

R NR NR

Bacillus sphaericus

NR

O.F. + +

D.C.

VP

Tabla 12. Caracterizacin bioqumica y de proliferacin de las Bacterias Gram-negativas asociadas a los cultivos de microalgas.
Caractersticas

Pirolinodonil-A.a

Bacterias Asociadas a las Microalgas D-Arabinosa L-Glutamato L-Arabinosa L-Isoleucina Arginina-A. a L-Aspartato L-Histidina Fosfatasa L-Leucina Celobiosa Sacarosa Ramnosa Aconilato Malonato Catalasa Rafinosa L-Prolina Motilidad Glucosa DNAasa Esculina L-Serina Oxidasa Lactosa Manosa Arginina Adonitol Maltosa Ornitina

D-Trehalosa

Scenedesmus Chlorococcum

Delftia acidovorans A. actinomycetemcomitans

+ + + + -

+ + + + + + +

+ +

+ + -

+ + + + -

+ + + + +

+ -

+ -

+ + +

+ -

+ -

NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR + + NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR

+ -

NR NR +

+ + + + + -

NR NR + NR

+ +

+ -

NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR + + NR NR NR NR

Oocystis

Pasteurella stomatis Pasteurella aerogenes

Geitlerinema Scenedesmus Geitlerinema

S. maltophilia Brevundimononas diminuta Staphylococcus hominis

NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR + + + + + + + + + +

NR NR NR NR NR NR NR NR + NR NR NR NR NR NR + + -

NR NR

NR NR

NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR

NR

NR NR NR NR NR NR NR +

Coagulasa

-Lactosa

Acetato

Butirato

Sorbitol

Inositol

Manitol

Cistina

ONPG

Citrato

Nitrato

Xilosa

Lisina

Urea

Indol

RM a

VPa

a. (VP)Voges-Proskauer; (RM) Rojo de Metilo; (A-A) Arginina-Arilamidasa; (P-A) Pirolinodil-Arilamidasa.

69

Chlorococcum sp., con un total de 2,64 x106 cel.mL-1. Las cianobacterias, estuvieron representadas por Merismopedia sp. con 1,93 x106 cel.mL-1, Synechocystis sp. con 1,92 x106 cel.mL-1 y en menor proporcin por Oscillatoria sp. con 0,51 x106 cel.mL-1. En cambio, se cuantificaron 0,51 y 0,22 x106 cel.mL-1 para Euglena sp. y Phacus sp., respectivamente, como euglenofitas.

35
DC (x10 6 cel.mL -1)

30 25 20 15 10 5 0 1 2 4,35 0,04 8,48 3,33 0,11 17,65

31,19

0,52

4,60 0,00 0,30 0,02 4

Muestreos Microalgas Cianobacterias

Bac. Foto.

Figura 15. Poblacin de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintticas en Lagunas de estabilizacin de una Planta extractora de aceite de palma, orden cronolgico de los muestreos. Muestreo 1: junio-2008, muestreo 2: Septiembre 2008, muestreo 3: diciembre 2008, muestreo 4: mayo 2009.

En el muestreo 2, la abundancia de microorganismos fotosintticos, continu en el siguiente orden descendente: microalgas>cianobacterias>bacterias fotosintticas, con densidades de 8,48; 3,33 y 0,11 x106 cel.mL-1, respectivamente. De igual manera, las Chlorophyta las ms abundantes con 7,97 x106 cel.mL-1 y su representante Chlorella sp. con 5,73 x106 cel.mL-1. Entre las clorofitas, continuaron presente en un 2,24 x106 Entre las diatomeas y euglenofitas, se cel.mL-1, los gneros Scenedesmus, Chlamydomonas, Chlorococcum, Monorhaphidium, Oocystis y Ankistrodesmus (Chlorophyta). encontr la ms abundante, Navicula sp. y Euglena sp. con 0,10 y 0,36 x106 cel.mL-1 respectivamente. Mientras que, de las cianobacterias, Merismopedia sp. fue la ms observada, con 2,01 x106 cel.mL-1.

70

En el muestreo 3, la mayor abundancia tambin correspondi a las microalgas con 31,19 x106 cel.mL-1; la cual fue las ms elevada de todos los muestreos. Adems, las clorofitas mantuvieron su hegemona en cuanto a las ms abundantes en el sistema de estabilizacin, con 30,08 x106 cel.mL-1. Es relevante, destacar que Chlorella sp. contribuy con el 96,3%, en relacin a la poblacin total de microorganismos fotosintticos y tan solo Chlorococcum sp. y Monorhaphidium sp., aportaron con 0,03 x106 cel.mL-1. En cambio, las cianobacterias estuvieron representadas en un 3,5%, de la poblacin total y mientras que, no fue observada presencia de bacterias fotosintticas en este muestreo (Figura 15).

Para el muestreo 4 observamos que la abundancia mayor fue en la microalgas con 4,45 x106 cel.mL-1, cianobacterias con 0,30 x106 cel.mL-1 y las bacterias fotosintticas con 0,02 x106 cel.mL-1. De acuerdo a la distribucin poblacional de los microorganismos fotosintticos en las diferentes lagunas y por muestreo se obtuvo, la mayor abundancia de clorofitas en las lagunas 2, 3 y 4 en el primer muestreo, 2,64 x106 cel.mL-1, 2,79 x106 cel.mL-1 y 4,84 x106 cel.mL-1, respectivamente. Y para el caso de las cianobacterias con 3,09 x106 cel.mL-1 en la laguna 3. En el segundo muestreo en las lagunas 3, 4 y 5 tambin hubo la mayor dominancia en las clorofitas con 1,61 x106 cel.mL-1, 1,76 x106 cel.mL-1 y 1,87 x106 cel.mL-1 respectivamente; mientras que en la laguna 3, continuaban predominando las cianobacterias con 2,95 x106 cel.mL-1. Para el tercer muestreo De igual observamos que las clorofitas mantuvieron su dominio en las lagunas 1, 2 y 3 con 1,42 x106 cel.mL-1, 14,22 x106 cel.mL-1 y 11,41 x106 cel.mL-1 respectivamente. manera, para el muestreo 4 se obtuvo la mayor densidad en clorofitas con 1,47 x106 cel.mL-1, 1,31 x106 cel.mL-1 y 1,33 x106 cel.mL-1 respectivamente en las lagunas 1, 2 y 3. Con respecto a las cianobacterias se determin su predominio en la laguna 1 con 0,27 x106 cel.mL-1 y 0,22 x106 cel.mL-1 respectivamente para el tercer y cuarto muestreo (Figura 16). Estos resultados tambin, indican que el mayor ndice de abundancia se encontr en las lagunas anaerobias del sistema, especficamente la laguna nmero 2.

71

5
DC (x106 cel.mL-1 )

4 3 2 1 0 E1A S1A E2A

E3F

E4F

Lagunas de Estabilizacin Microalgas Cianobacterias

E5F

S5F

Bfot

DC (x106 cel.mL-1 )

0 E1A S1A E2A

E3F

Lagunas de Estabilizacin Microalgas

E4F

E5F

S5F

Cianobacterias

Bfot

72
16 14
DC ( x106 cel.mL-1 )

12 10 8 6 4 2 0 E1A E2A

E3F

Lagunas de Oxidacin Microalgas Cianobacterias

E4F E5F

Bfot

2,0

1,5

DC ( x106 cel.mL-1 )

1,0

0,5

0,0 E1A E2A

E3F E4F E5F

Lagunas de Oxidacin Microalgas Cianobacterias

Bfot

Figura 16. Abundancia de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintticas segn los sitios de muestreos en lagunas de estabilizacin de una Planta extractora de aceite de palma, de acuerdo al orden de los muestreos. a. Muestreo 1. b. Muestreo 2. c. Muestreo 3 y d. Muestreo 4.

73

4.1.2.1. Demanda Qumica de Oxigeno (DQO): La demanda qumica de oxigeno constituye un parmetro esencial para caracterizar la calidad del agua residual y su anlisis permanente indicar la efectividad de su remocin en el transcurso del tiempo, del tipo de laguna y de las condiciones de operacin de la misma. Los resultados obtenidos a travs de los muestreos en las diferentes lagunas, aportan una variabilidad de los valores de remocin, los cuales aproximan hacia una reduccin de la DQO con la transferencia del efluente desde la laguna 1 hasta la 5 (Tabla 13).

Tabla 13. DQO (mg.L-1) en las lagunas estabilizacin de acuerdo a cada muestreo.

Muestreos
Laguna 1 2 3 4 1 787,66 941,21 914,51 687,52* 2 14.804,49 14.847,22 7.626,38* 13.736,32 3 1.243,25 8.004,04* 4.771,58 4.303,79 4 1.830,43* 1.381,23* 569,83 883,20

5 460,54 8.267,28 1.723,33 1.031,83 *: Lagunas con los valores ms elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.

De igual manera, estos resultados parecen no relacionarse con los obtenidos para el nitrgeno, fsforo y grasas, en el sentido que se registra un claro descenso de los niveles respectivos, segn se va transfiriendo el agua residual de una laguna a otra, hasta llegar a la nmero 5, en donde se considera tericamente que debe contener los valores ms bajos, como producto del proceso de remocin obtenidos gradualmente.

4.1.2.2.

Slidos Suspendidos Totales (SST): Los slidos indican que a

medida que el residual va pasando por las diferentes lagunas este va disminuyendo a valores bajos de 78,00mg.L-1 removiendo casi la totalidad de los slidos en estas lagunas de estabilizacin. Asimismo se puede afirmar que este parmetro no tiene ninguna relacin con la densidad encontrada de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintticas en estas lagunas, a su vez estas no co-ayudan al aumento de la concentracin de los slidos en las lagunas de estabilizacin.

74
Tabla 14. SST (mg.L-1) en las lagunas estabilizacin de acuerdo a cada muestreo.

Muestreos
Laguna Laguna 1 Laguna 2 Laguna 3 Laguna 4 1 266,00 432,00 80,00 60,00* 2 3.060,00 1.436,00 600,00* 420,00 3 11.400,00 390,00* 263,33 127,50 4 530,77* 330,00* 185,00 133,33

Laguna 5 80,00 166,00 78,00 440,00 *: Lagunas con los valores ms elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.

Tabla 15. SSV (mg.L-1) en las lagunas estabilizacin de acuerdo a cada muestreo.

Muestreos
Laguna Laguna 1 Laguna 2 Laguna 3 Laguna 4 1 160,00 316,00 64,00 40,00* 2 20,00 5,00 0,00* 2,50 3 14.800,00 650,00* 1.663,33 1.032,50 4 392,31* 290,00* 155,00 110,00

Laguna 5 44,00 4,00 330,00 376,00 *: Lagunas con los valores ms elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.

Para los muestreos, M-1 (Muestreo 1); M-2 (Muestreo 2); M-3 (Muestreo 3) y M-4 (Muestreo 4); para la materia orgnica compuesta por (DQO, SST y SSV), en DQO indica que para M-1, M-2 y M-3 (941,21-14.847,22-8.004,04mg.L-1 respectivamente), la laguna 2 aporta la mayor DQO, mientras que en M-4 la laguna 1 (1.830,43mg.L-1) aporta la mayor DQO (Tabla 13). En SST indica que, en M-1 la laguna 2 (432,00mg.L-1) aporto la mayor cantidad de SST, y en el muestreo M-2, M-3 y M-4, la laguna 1 (3.060,00-11.400,00-530,77mg.L-1) aporto la mayor cantidad de este parmetro (Tabla 14). Para SSV, en M-1 la laguna 2 (316,00mg.L-1) aporto la mayor cantidad de SSV, pero en M-2, M-3 y M-4, la laguna 1 (20,00-14.800,00-392,81mg.L-1) aporto la mayor cantidad de SSV (Tabla 15).

El fitoplancton puede aprovechar estos compuestos, junto con el dixido de carbono atmosfrico, el amonaco y el ortofosfato del agua residual, como sustancias nutritivas para su crecimiento; es de considerar, que una parte de los slidos en suspensin estn formados por materia orgnica, algas o microorganismos; observamos que en los

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muestreos la variacin de los slidos es debida a la cantidad de materia orgnica que poseen las aguas residuales de una extractora de aceite.

La actividad fotosinttica del fitoplancton genera oxgeno que puede ser utilizado por las bacterias aerobias hetertrofas para degradar la materia orgnica y disminuir la DBO5 del agua residual (Garca, 1998). Pero observamos tambin que cuando hay poca cantidad de nutrientes las microalgas y bacterias fotosintticas proporcionan una poblacin alta indicndonos que estos microorganismos al tener la cantidad suficiente de materia orgnica la ptima crecen bien; y cuando hay unos valores intermedios en DQO, SST y SSV las microalgas como bacterias bajan en su poblacin. Tambin la cantidad de materia orgnica se ve influenciada por la calidad del fruto de la Palma de Aceite (Elaeis guineensis), debido a que en los periodos de lluvia el fruto viene con un alto ndice de descomposicin debido a que los recolectores (Camiones) se demoran para transportarlos hasta el sitio donde este es procesado (Extractora de Aceite). A su vez la carga orgnica en las lagunas de oxidacin de una extractora de aceite es influenciada por los periodos de mayor produccin y toneladas de la palma africana recibidos para el proceso de extraccin del aceite, indicndonos que los meses de mayor produccin son de abril a noviembre donde es el periodo de Invierno y HAY mayor produccin para este tipo de plantaciones (Fedepalma, 2008)

4.1.2.3. Nitrgeno: En relacin al orden de entrada de los efluentes desde la laguna 1 hasta la laguna 5, se registr igualmente, la mayor concentracin de nitrgeno en este sentido y con los valores ms elevados en el muestreo 2 y 4 (Tabla 16). Es por ello que, a la salida del sistema se verifica una excelente remocin de nitrgeno; con lo cual se sugiere que el sistema de estabilizacin es eficiente.

En trminos de la cantidad de microalgas como referencia, se describe una amplia distribucin de dicha poblacin en todos los rangos de concentracin de nitrgeno, el hecho de que los valores ms elevados de poblacin se fueron obteniendo para las lagunas 4, 3, 2 y 1; conforme se realizaron los muestreos 1, 2, 3 y 4, se sugiere la existencia de otros factores combinados que expliquen la variabilidad de la poblacin

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por laguna. Incluso, el elevado contenido de nitrgeno en la laguna 1, de acuerdo al cuarto muestreo deduce que, tampoco esta condicin restringe el crecimiento microalgal.

Tabla 16. Nitrgeno Total (mg.L-1) en las lagunas estabilizacin de acuerdo a cada muestreo.

Muestreos
Laguna 1 2 3 4 1 104,72 111,72 6,72 3,36* 2 6.594,00 1.358,00 770,00* 175,00 3 252,00 60,48* 43,68 23,52 4 5.474,00* 3.796,80* 2.811,20 896,00

5 3,92 161,00 4,48 201,60 *: Lagunas con los valores ms elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.

4.1.2.4.

Fsforo: Los anlisis de fsforo realizados por laguna y muestreo,

tambin son indicativos de una buena remocin a partir de la laguna 1, hasta terminar en la laguna 4 y 5 (Tabla 17). Por otra parte, se observa que los residuales no portan concentraciones elevadas de fsforo y por lo tanto, se registran valores bajos en la laguna 5. Es conocido, que la remocin de fsforo no alcanza niveles ptimos, tanto en procesos qumicos como en los biolgicos.

Tabla 17. Fsforo Total (mg.L-1) en las lagunas estabilizacin de acuerdo a cada muestreo.

Muestreos
Laguna 1 2 3 4 1 47,86 46,49 4,53 3,50* 2 223,21 94,01 91,22* 56,88 3 28,07 14,72* 8,09 4,55 4 28,03* 15,56* 10,80 9,57

5 5,84 28,98 3,59 7,64 *: Lagunas con los valores ms elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.

Igualmente, la poblacin microalgal, de cianobacterias y bacterias fotosintticas, tambin se ubicaron en diferentes niveles de concentracin de fsforo, desde los ms bajos, de 3,50 hasta de 91,22 mg.L-1 (Tabla 17); lo cual indica que la distribucin de estos microorganismos no dependi exclusivamente del fsforo para su crecimiento.

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4.1.2.5. Aceites y Grasas: Los valores ms elevados de grasas y aceites en los cuatro muestreos fueron obtenidos en la laguna 1; lo cual evidencia la alta carga de materia orgnica que directamente recibe este reservorio como producto de la extraccin del aceite de palma. Adems, se demuestra la eficiente remocin de grasas desde la laguna 1 hasta la 5 (Tabla 18). Es decir, se observa la tendencia de una remocin drstica en la laguna 2, para luego definirse otra remocin en la quinta laguna.

En relacin a la poblacin de microalgas encontrada por laguna y por muestreo (Figura 16a, 16b, 16c y 16d) se infiere que los valores de poblacin de microalgas se determinaron a una concentracin de grasas y aceites, entre 31,03 y 16.244,44mg.L-1; lo que significa que su contenido no parece influir en el crecimiento de las microalgas. Sin embargo, a los niveles ms elevados entre 19.465,54 y 411.251,11mg.L-1 (Tabla 18), presentes en la laguna 1, hubo crecimiento significativo de microalgas, pero no alcanzaron poblaciones que superara a las obtenidas en otras lagunas.

Por otra parte, es importante destacar que, la concentracin ms elevada de grasas y aceites se detect en el muestreo 1 (Figura 17); lo cual estara relacionado principalmente con el volumen de extraccin de aceite de palma procesado para esa fecha del muestreo.

Tabla 18. Grasas y aceites (mg.L-1) en las lagunas de estabilizacin de acuerdo a cada muestreo.

Muestreos
Laguna 1 2 3 4 1 411.251,11 13.151,11 12.022,22 16.244,44* 2 125.042,57 3.998,65 3.655,41* 4.939,19 3 119.465,54 8.264,19* 15.073,65 27,03 4 31,03* 8,33 5,38 3,89

5 8.962,22 2.725,00 13,51 3,33 *: Lagunas con los valores ms elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.

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Grasas y Aceites (mg.L-1 )

120000 92326,22 100000 80000 60000 40000 20000 0 28072,16 28568,78 10,39

Muestreos
M-1 M-2 M-3 M-4

Figura 17. Grasas y aceites (mg.L-1) en las lagunas de estabilizacin de acuerdo a los muestreos.

4.1.3. Variacin del pH en las lagunas de estabilizacin de una planta extractora de aceite La determinacin del pH constituye un parmetro esencial para detectar grado de acidez o de alcalinidad de las aguas residuales segn el tipo de laguna, sea anaerbica facultativa o de maduracin. De tal forma, que los diferentes procesos biolgicos, qumicos y fisicoqumicos sean considerados en funcin de los valores obtenidos de pH. De acuerdo, a los muestreos realizados se observ poca variabilidad desde la entrada de la primera laguna (L1) hasta la salida de la ltima laguna de maduracin (L5). En este orden se apreci un incremento del pH desde 7,51 hasta 8,95 en el primer muestreo. De la misma manera, ocurri en los otros muestreos, en donde se registra el menor pH en la primera laguna y a medida que avanza el sistema de laguna el pH incrementa, de pH 9,07 a 10,51 en el segundo muestreo y de pH 6,00 a 8,30 en el cuarto muestreo (Tabla 19).

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Tabla 19. Monitoreo del pH en las Lagunas de Estabilizacin. Laguna 1 L1E L1S L2S L3S L4S L5E L5S 7,51 7,70 7,60 7,73 9,44 9,42 8,95 Muestreos 2 9,07 9,35 9,90 10,30 10,88 10,37 10,51 3 8,00 8,38 7,70 8,30 8,75 8,80 8,90 4 6,00 6,98 7,20 7,70 7,90 8,20 8,30

Diversos estudios reportan una oscilacin del pH en torno a la neutralidad y alcalinos dependiendo del tipo de residual que se est procesando. A propsito, Hosetti y Patil, (1992), indican que, el pH vara tambin en funcin de la concentracin de CO2 que se est generando como producto metablico y dado que las actividades de los consorcios microbianos se adaptan a los cambios que puede afectar el pH.

Los elevados valores de los parmetros fisicoqumicos del sistema de estabilizacin durante los cuatro muestreos, reflejan el exceso caracterstico de materia orgnica, N, P y de grasas tpicos de estos residuales. Sin embargo, a pesar de estos niveles Es decir, la elevados en todas las lagunas, estos ejercen un efecto sobre la adaptacin, diversidad, abundancia y competencia de los microorganismos fotosintticos. variabilidad en el tamao de la poblacin de las microalgas y cianobacterias, est condicionada al acceso de estos; a la materia orgnica, fuentes de nitrgeno y fsforo, entre otros. De tal manera que, las variaciones de la poblacin estaran modulas por las concentraciones de DQO, N y P, existentes en las lagunas. As, se puede inferir, que la mayor poblacin observada en el primer y tercer muestreo, podra estar influenciada por las concentraciones de Nitrgeno (46,09 y 76,83mg.L-1); ya que las concentraciones ms elevadas para el segundo y cuarto muestreo (1.811,60 y 2.635,92mg.L-1) se reduce la poblacin total de 11,92 x106 cel.mL-1 a 4,91 x106 cel.mL-1. En cambio, el fsforo y las grasas-aceites, parecen no ejercer influencia directa sobre los cambios poblaciones de microalgas y cianobacterias.

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Exoenzimas en microalgas y en sus bacterias asociadas, aisladas de Lagunas de Estabilizacin de una Planta extractora de aceite de palma

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4.2.1. Exoenzimas en microalgas y sus bacterias asociadas

La presencia de las exoenzimas amilasa, fosfatasa, ureasa, proteasa y celulasa, fue estudiada en las microalgas Chlorella (cepas sp. 1, sp. 2 y sp. 3), Scenedesmus (sp. 1 y S. ecornis), Chlorococcum, Oocystis, Chlamydomonas, Euglena y en las cianobacterias: Synechocystis y Geitlerinema; as como en sus bacterias asociadas (Tabla 20, 22 y 24); ya que en estos microorganismos demostraron excelente crecimiento y adaptacin en condiciones de laboratorio.

4.2.1.1. Amilasa: De acuerdo al mtodo en medio slido con almidn (0,2%), se encontr, que los mayores dimetros de los halos estuvo en el siguiente orden descendente: Chlorella sp. 2> Chlorococcum sp.> Scenedesmus ecornis> Chlorella sp. 1; siendo los valores promedios para Chlorella sp. 2, y Chlorococcum de 6,290,16cm y 3,181,42cm respectivamente. Mientras que, la menor produccin del halo se obtuvo en las especies de Chlamydomonas, Geitlerinema y Synechocystis con 0,450,18cm, 0,600,57cm y 0,630,07cm respectivamente (Figura 18).

En cuanto a la deteccin de amilasa en las bacterias asociadas, se observ una formacin de halos muy pequeos como para ser medidos sus dimetros. En cambio, no se demostr presencia de amilasa en las bacterias A. actinomycetemcomitans y P. aerogenes asociadas a la microalga Oocystis sp.; en Brevundimononas diminuta y cepa blanca C-12 asociadas a la cianobacteria, Geitlerinema sp. y en las cepas C-42 y C-13 asociadas a la microalga Chlorococcum sp. (Tabla 20).

El hecho de encontrar una mayor produccin de amilasa en bacterias, que en microalgas, sugiere que estas presentan capacidad mixotrfica, de utilizar compuestos orgnicos, como el almidn como sustrato para la asimilacin de glucosa en el medio de cultivo. No obstante, se esperaba una elevada actividad en las bacterias, en funcin de su mayor versatilidad y velocidad para utilizar diversos sustratos en su medio natural; ya que al menos en otras especies de bacterias, esta descrita una alta actividad

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de amilasa. Tal es el caso de cepas de Thermoactynomyces y Thermomonospora productoras verstiles de -amilasas. Adems, del gnero Bacillus sp. caracterizado por una gran variedad de amilasas, producida por B. licheniformes, B. subtilis y B. coagulans. En bacterias acido lcticas tambin se ha descrito en Lactobacillus As como en amylophilus, L. amylovorans, L. plantarum y L. manihotivorans.

Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus pneumoniae y en Salmonella typhimurium (Simpson y Russell, 1998; Aguilar y col. 2000; Haq y col. 2003; Swain y Ray, 2007).

Figura 18. Presencia de amilasa en medio slido (almidn al 0,2%) en microalgas y bacterias asociadas. a. Oocystis, b. Chlorella, c. Scenedesmus, d. cepa bacteriana C-12 Naranja, e. A. actinomycetemcomitans, f. S. maltophilia.

Los resultados sobre la deteccin de amilasa en las microalgas, tambin indican que en los cultivos slidos con almidn, no hubo presencia de crecimiento bacteriano; con lo cual se sugiere que la expresin de dicha enzima, obedece ms a la actividad intrnseca de cada microalga, y no a la de su flora bacteriana asociada.

Los anlisis de amilasa determinados en cultivo lquido y mediante espectrofotometra, tambin indicaron que la cepa de Chlorella sp. 2, fue la de mayor capacidad hidroltica sobre almidn, con 1,155U/g, seguido de Scenedesmus sp. y Chlorococcum sp. con

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0,960U/g y 0,956U/g respectivamente. Mientras que, para el cultivo mixto de Chlorella sp. 1 y S. ecornis se determin una actividad de 1,050U/g (Figura 19).

1,6

Chlorella sp. 2 Scenedesmus sp. Chlorococcum sp.

1,2

Chlorella sp./S. ecornis

U/g

0,8

0,4

0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Edad del Cultivo (horas)

Figura 19. Variacin de la actividad amilasa (U/g) en microalgas, en funcin del tiempo (h).

Microalga Chlorella sp 1 Scenedesmus sp. 1 Oocystis sp. Euglena sp. Chlorococcum sp. Synechocystis sp. Scenedesmus ecornis. Chlorella sp 2 Chlorella sp 3 Geitlerinema sp. Chlamydomonas sp .

Tabla 20. Amilasa en microalgas y bacterias asociadas. Amilasa Halo(cm) Microalga Bacterias asociadas +++ ++ ++++ ++ ++++ ++ +++++ +++++ ++ + + 2,11 1,70 1,77 0,80 3,18 0,63 2,73 6,29 1,35 0,60 0,45 Geitlerinema sp. Scenedesmus sp. Chlorella sp. C. durum B. sphaericus C. durum B. sphaericus D. acidovorans S. hominis B. sphaericus A. actinomycetemcomitans P. stomatis P. aerogenes S. hominis S. maltophilia B. diminuta C-12 Blanca C-12 Naranja C-42 Delftia sp. C-13

Amilasa + + + + + + + + + + + + -

Oocystis sp.

Chlorococcum sp.

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Es importante resaltar que la actividad de amilasa expres un incremento con el tiempo de exposicin del sustrato en el cultivo, hasta unas 6 y 8 horas, para las diferentes microalgas, y luego parece describir una fase estacionaria, por el mantenimiento de la actividad enzimtica ms o menos constante. Aun cuando a las 12 horas, se observ un incremento ligero de la hidrlisis del almidn para todas las microalgas. inoculacin del sustrato (Figura 19). Esto significa que, la amilasa puede ser detectada a cualquier tiempo a partir de la

En cultivos lquidos con diferentes concentraciones de almidn (0.5, 1.0, y 3.0%) tambin se ha descrito presencia de actividad de amilasa en condiciones mixotrficas y heterotrficas de Chlorella sorokiniana, aislada de un embalse de agua; lo cual demostr la elevada capacidad de esta microalga en condiciones axnicas de expresar una amilasa inducible a la presencia de almidn en el medio de cultivo (Moronta, 2001).

La presencia de amilasas en estas microalgas procedentes de aguas residuales de una planta extractora de aceite de palma, confiere un aporte valioso para el diseo de inculos productores de estas enzimas hidrliticas que puedan acelerar el proceso de remocin de materia orgnica. A propsito, se ha reportado que las amilasas alcalinas son las principales responsables de la hidrlisis del lodo biodigerido en el tratamiento de aguas residuales y constituyen una herramienta para prevenir contaminantes ambientales; adems de ser utilizadas en la industria de detergentes (Burgess y Pletschke, 2008). De igual manera, Nybroe y col. (1992) demostraron que el almidn hidrolizado en lagunas de estabilizacin municipal, es un reflejo del incremento en la actividad de la -glucosidasa presente en el lodo activado del sistema, aunado a la intervencin del sulfuro, como activador de la actividad de -glucosidasas en la degradacin de celulosa (Watson y Pletschke, 2006).

4.2.1.2. Lipasa: La presencia de lipasa mediante el uso del medio de cultivo con yema de huevo fue observada en especies de Chlorella, Scenedesmus, Chlamydomonas y Euglena. De acuerdo, al dimetro del halo de hidrlisis se encontr que el mayor halo se produjo en las cepas de Chlorella sp. 2 y 1, respectivamente con

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4,970,39cm y 4,730,01cm, seguido de Scenedesmus sp. con 3,140,70cm y S. ecornis con 2,560,58cm con y sin peptona. La menor hidrlisis se presento en Chlorella sp. 3, y Chlamydomonas sp. con halos de 0,150,00cm y 0,150,00cm respectivamente, seguido por el gnero Euglena sp. con un halo de 0,240,08cm (Figura 20).

Figura 20. Lipasa en microalgas. Medio Yema de Huevo: a. Chlorella sp.1, b. Chlorococcum, c. Oocystis. Medio Tween 80: d. Euglena, e. Oocystis, f. Chlorella sp. 3.

Cuando se analiz la presencia de lipasa con tween 80 (con o sin peptona), se observ el mayor halo de actividad en Chlorella sp. 2 con 3,150,15cm y en Oocystis sp. con 1,500,35cm. En cambio, Geitlerinema sp. y Euglena sp. demostraron poca actividad hidroltica sobre este sustrato, con 0,330,04cm y 0,370,01cm respectivamente. Para el caso del mtodo espectrofotomtrico con para-nitrofenil palmitato (p-NPP), se detect la mayor actividad en las tres cepas de Chlorella con 0,8040,001; 0,6080,03 y 0,5040,002U/mL, en Chlorella sp. 2, Chlorella sp. 1 y Chlorella sp. 3 respectivamente. Este mtodo tambin permiti detectar en Chlamydomonas, la presencia de otra lipasa, debido a que se obtuvo una actividad de 0.3020,001U/mL, al menos moderada, en relacin a las otras microalgas y cianobacterias. Caso similar para Oocystis sp., que a

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pesar de haber exhibido una actividad moderada en los medios con yema de huevo y tween 80, no acus actividad significativa con el sustrato p-NPP (Tabla 21). Estos resultados sugieren que, la deteccin de lipasa obedece tambin al tipo de sustrato utilizado y en consecuencia, al tipo de esterasa que pueda actuar sobre los mismos. Es decir, en presencia de yema de huevo se describe a una lecitinasa (fosfolipasa); con p-nitrofenilpalmitato se demuestra una lipasa especfica para hidrolizar el ester entre un grupo aromtico y el cido graso; y en presencia de tween 80, la de una lipasa actividad y solubilizada con este detergente.

Las lipasas o enzimas lipolticas son usadas para la hidrlisis de grasas, sntesis de glicridos-esteres y modificacin de lpidos, se caracterizan por intervenir la interface agua/lpido y dada su alta especificidad respecto al tipo y posicin especifica del residuo del acido graso, tiene aplicaciones en el rea de los biosurfactantes, industria alimentaria, oleoqumica, procesamiento del caf, en cosmtica, perfumera y en el tratamiento de aguas residuales (Khan y col. 2003; Singh y col. 2006; de Azeredo y col. 2007). De tal manera que, las lipasas encontradas en las microalgas evaluadas, pudiesen ser base de estudios destinados a la produccin de las mismas; con lo cual se destaca que Chlorella, Scenedesmus y Oocystis, exhibieron la mayor actividad lipasa, comparada a otras microalgas y cianobacterias evaluadas. Mientras que, de acuerdo a los dos mtodos utilizados se estableci el siguiente orden descendente de actividad: Chlorella sp. 2>Chlorella sp.1>Scenedesmus sp.1>Scenedesmus ecornis>Oocystis sp.

En relacin, a las bacterias asociadas a los cultivos de microalgas, se encontr una baja actividad de lipasa. Al menos con yema de huevo, se obtuvo, un mayor dimetro de los halos. En este caso, Pasteurella stomatis asociada a Oocystis sp., las cepas C12 Naranja y C-12 Blanca asociada a Geitlerinema sp. y la cepa C-42 asociada a Chlorococcum sp., resultaron ms evidentes para lipasa (Figura 21). Mientras que, para el ensayo con p-NPP todas las cepas bacterianas exhibieron valores entre 0,010,03 U/mL (Tabla 22).

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Estos resultados contribuyen a sugerir que, las bacterias en comparacin con las microalgas presentaron una menor hidrlisis enzimtica de lipasa. No obstante, las actividades lipolticas de las cepas aisladas de microalgas y bacterias asociadas, de residuales de una extractora de aceite de palma, pueden tener un papel importante en la eliminacin de grasas de las plantas de tratamiento de aguas residuales con una elevada cantidad de grasa.

Es posible, que en condiciones ambientales y en presencia de los residuales de la laguna estudiada, se pueda estimular la produccin de lipasas en las bacterias y quizs en mayor grado en las microalgas. Al respecto, se ha descrito la participacin de Acinetobacter, en la degradacin de grasas en los procesos de tratamiento de lodos activados de una planta extractora de aceite de oliva (Chappe y col. 1994).

Figura 21. Presencia de lipasa en bacterias asociadas. Medio Yema de Huevo: a. Stenotrophomonas maltophilia, b. Staphylococcus hominis, c. Actinobacillus actinomycetemcomitans, Medio Tween 80: d. cepa C-12 Naranja, e. cepa C-42 Bacillus sphaericus, e. Staphylococcus hominis.

Las lipasas son utilizadas para hidrolizar aceites y grasas en el tratamiento de aguas residuales industriales y en el tratamiento diario de aguas residuales; la utilizacin de una tecnologa enzimtica asociada con el tratamiento biolgico anaerbico de aguas

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Microalga Tween 80* Halo Chlorella sp. 1 ++ 0,70 Scenedesmus sp. ++ 1,21 Oocystis sp. +++ 1,74 Euglena sp. + 0,37 Chlorococcum sp. ++ 0,85 Synechocystis sp. + 0,55 ++ 1,35 Scenedesmus ecornis Chlorella sp. 2 +++++ 3,04 Chlorella sp. 3 ++ 1,55 Geitlerinema sp. + 0,35 Chlamydomonas sp. ++ 0,75 *Con peptona; **Sin Peptona. Halo (cm). Tabla 21. Lipasa en Microalgas. Tween 80** Halo Yema Huevo* + 0,35 +++++ +++ 1,20 +++++ +++ 1,25 ++++ + 0,38 + + 0,15 ++ ++ 0,65 + +++ 1,10 ++++ +++++ 3,25 +++++ + 0,45 + + 0,30 +++ + 0,20 + Halo 4,72 3,64 2,62 0,18 0,95 0,35 2,15 4,70 0,15 1,45 0,15 Yema Huevo** +++++ ++++ +++ + ++ ++ ++++ +++++ + +++ + Halo 4,74 2,65 1,79 0,30 0,85 0,60 2,97 5,25 0,15 1,20 0,15 Lipasa p-NPP (U/mL) 0,608 0,038 0,009 0,011 0,022 0,008 0,075 0,804 0,504 0,302

Tabla 22. Lipasa en bacterias asociadas a microalgas, mtodo en placa y espectrofotomtrico (p-NPP). Tween 80 Yema Huevo Lipasa p-NPP (U/mL) Microalga Bacterias Asociadas + + 0,02 C. durum Chlorella sp. + + 0,03 B. sphaericus + + 0,02 C. durum Scenedesmus sp. D. acidovorans + 0,01 + + 0,02 S. hominis + + 0,03 B. sphaericus 0,02 A. actinomycetemcomitans Oocystis sp. +++ 0,01 P. stomatis 0,02 P. aerogenes + + 0,02 S. hominis + + 0,01 S. maltophilia Geitlerinema sp. + 0,02 B. diminuta C-12 Blanca +++ 0,02 C-12 Naranja ++ +++ 0,03 C-42 + ++++ 0,02 + + 0,01 Chlorococcum sp. Delftia sp. C-13 0,02

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residuales disminuye la grasa que afecta el lodo en reactores anaerbicos (Leal y col. 2002; 2006).

Mudryk y Skrczewski, (2006), estudiaron el lago estuarino Gardno encontrando una comunidad fototrfica dominada y por cianobacterias aeuginosa Anabaena y cepas flos-aquae, bacterianas

Aphanizomen-non

flos-aquae

microcystis

heterotrficas que son activamente lipolticas, las cuales transforman y modifican los compuestos de lpidos en cuerpos de agua. Tambin se ha reportado que las actividades lipolticas en digestores anaerbicos de aguas residuales aumentan su actividad por la presencia de sulfuros y sulfitos y son inhibidas por sulfatos (Whiteley y col. 2003a;b).

4.2.1.3. Proteasa: Todas las microalgas dieron positivo para la licuefaccin de la gelatina e hidrlisis de la casena (Figura 22), con lo cual se infiere que ambos sustratos pueden ser utilizados por estos microorganismos fotosintticos. Para el caso, de la actividad sobre casena se reportaron los valores ms altos para Scenedesmus sp., Chlorococcum sp. y Chlorella sp. 3 con 0,7010,009U/mL, 0,6950,007U/mL y 0,6560,005 U/mL respectivamente. Solo Euglena sp. y Chlamydomonas sp. mostraron bajas actividades, con 0,2950,006U/mL y 0,4860,003U/mL (Tabla 23).

Tabla 23. Exoenzimas (proteasa, ureasa, celulasa y fosfatasa) en microalgas. Microalga Chlorella sp. 1 Scenedesmus sp. Oocystis sp. Euglena sp. Chlorococcum sp. Synechocystis sp. S. ecornis Chlorella sp. 2 Chlorella sp. 3 Geitlerinema sp. Chlamydomonas sp. ND: determinada PROTEASA (casena) Gelatina (U/mL) + 0,578 + 0,701 + 0,579 + 0,295 + 0,695 + 0,627 + 0,510 + 0,593 + 0,656 + ND + 0,486 FOSFATASA (U/mL) Rango (31-115) 35 0 0 0 0 1 0 33 32 39 0 CELULASA Halo Celulosa (cm) + 0,4 + 0,3 + 0,3 + 0,1 + 0,1 + 0,2 + 0,3 + 0,5 + 0,4 + 0,1 UREASA Urea (0,1%) + + + + + + + + + + +

90

La presencia de proteasa en estas microalgas y al menos en Synechocystis, favorece la opcin de incluir la factibilidad de ser utilizadas tambin, para la hidrlisis de derivados de protenas en residuales. De tal manera que, contribuiran en su desempeo como agentes removedores de materia orgnica en aguas residuales enriquecidas.

Figura 22. Licuefacin de la gelatina en microalgas.

En las bacterias asociadas a las microalgas como Corynebacterium durum, Bacillus sphaericus, Staphylococcus hominis, Stenotrophomonas maltophilia, Brevundimononas diminuta, C-13, C-42 y C-12 Naranja en la prueba de Gelatina fueron negativas para esta prueba a diferencia de Delftia acidovorans, C-12 Blanca, Pasteurella stomatis, Pasteurella aerogenes y Actinobacillus actinomycetemcomitans que fueron positivas para la licuefaccin de la gelatina.

Para la determinacin de proteasa con el mtodo de la casena, las cepas C-12 Naranja obtuvo una actividad enzimtica de 0,8360,003U/mL, la cepa C-12 Blanca con 0,7580,013U/mL, Bacillus sphaericus con 0,6990,015U/mL y Delftia acidovorans con 0,6590,008U/mL; siendo los valores ms altos (asociadas a las microalgas Chlorella sp., Scenedesmus sp. y Geitlerinema sp.) a diferencia de las dems bacterias que produjeron los valores ms bajos entre 0,149-0,535U/mL.

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El gnero Bacillus constituye uno de las ms importantes fuentes de proteasas. Al respecto, se han indicado diversas cepas alcalofilas de este gnero, tales como: B. licheniformes, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. megaterium, B. polymyxa, B. thermoproteolyticus, B. thurigensis y B. pumilus; y en el gnero Exiguobacterium sp. con actividad de proteasa en placas de agar leche, similar al mtodo utilizado en este estudio (Takami y col. 1990; Kumar y Bhalla, 2004; Kasana y Yadav, 2007). Asimismo, se ha descrito en B. sphaericus, la purificacin y caracterizacin de una proteasa alcalina extracelular aislado de suelo alcalino en los Himalayas (Singh y col. 2001).

Actualmente, en el campo de la biotecnologa ambiental, se ha tomado en cuenta, la actividad proteoltica de biopelculas en lodos de aguas residuales (Cadoret y col. 2002). Tales enzimas estn asociadas a la chlorophyta Mougeotia, diatomeas pennadas, a la cianobacteria Oscillatoria y a la comunidad de bacterias en dichos tapetes microbianos. Entre la metodologa desarrollada, en estos consorcios, se ha postulado la determinacin de proteasa extracelular involucrando molculas fluorescentes unidas a celulosa con una lecitina (Francoeur y col. 2001).

En ambientes extremos de bajas temperaturas, como en la Antrtida, se han evaluado bacterias heterotrficas proteolticas; de las cuales, casi la mitad, producen proteasas extracelular dependientes de temperatura, pH o concentraciones de sal. glucosidasas y lipasas (Alam y Singh, 2002). De igual manera, se les ha detectado tambin, presencia de amilasa, ureasa, fosfatasas, -

4.2.1.4. Fosfatasa: En las tres cepas de Chlorella sp. 1, 2 y 3 y en la cianobacteria, Geitlerinema sp. slo se detect la presencia de fosfatasa con valores entre 32 y 39U/mL (Tabla 23). Es posible, que la concentracin de fosfato en el medio de cultivo utilizado para las microalgas, sea aun inhibitorio, como para detectar actividad significativa de fosfatasa. Los niveles de fosfatasas se disparan cuando se aproxima una limitacin o deficiencia de fosfato en el medio. Diversos autores han demostrado que la expresin de la fosfatasa est involucrada con la estrategia fisiolgica de detectar el poco fosfato que pueda estar presente en el medio de cultivo o

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natural (Kumar y col. 2000). Es decir, a medida que se incrementa el consumo de fosfato en el medio, se van expresando actividades de fosfatasas extracelulares. Quizs, para Chlorella sp. y Geitlerinema sp., se mantenga la actividad bajo las condiciones de cultivo que se estudiaron o realmente tengan mayor capacidad de produccin de estas enzimas.

Para las bacterias asociadas que exhibieron actividad fosfatasa, se produjeron valores ms bajos que las microalgas; los cuales estuvieron entre 1-8U/mL y siendo estas actividades las correspondientes a las bacterias asociadas a Chlorococcum sp. y Chlorella sp. (Tabla 24). Es posible que, estos resultados tambin se relacionen con las concentraciones remanente de fosfatos en los medios de cultivos de las bacterias, y por lo tanto, se requieren tambin, ajustes de pH, para valorar la presencia de fosfatasas alcalinas y cidas.

La presencia de fosfatasas alcalinas y cidas han sido reveladas en especies de grupos diferentes de microalgas marinas. As, Kuenzler y Perras, (1965) reportaron la actividad de fosfatasa en 27 cepas de 6 clases diferentes de algas, encontrando en 13 cepas, ambos tipos de fosfatasa. Por otro lado, Burzyk y Loos, (1995) reportaron actividad de fosfatasas en clulas y pared celular de Chlorella vulgaris, C. kessleri, C. pyrenoidosa, C. fusca y Scenedesmus obliquus.

La actividad de la Fosfatasa alcalina ha sido detectada tambin en Anabaena oryzae, Anabaena flos-aque, Synechococcus sp., Plectonema boryanum, Anabaena sp. y la diatomea Phaeodactylum tricornutum Bohlin (Ruiz y col. 1997; Kumar y col. 2000). Estos autores demostraron que los niveles altos de fosfatos en el medio de cultivo disminuye la expresin de la actividad, y los cultivos deficientes en fosforo bajo oscuridad, reflejaron un 77% menos actividad que los cultivos con iluminacin. Lubin y col. (1992), reportaron fosfatasa cida para cepas de Nannochloris sp. y fosfatasa alcalina en N. maculata, Nannochloropsis salina y N. gaditana. fsforo intracelular. De igual manera, demostraron que la actividad de la fosfatasa alcalina disminuye por el consumo de

93
Tabla 24. Exoenzimas (Proteasa, Ureasa, Celulosa y Fosfatasa) en bacterias asociadas a las microalgas.
PROTEASA Microalga Bacterias Gelatina C. durum Chlorella sp. B. sphaericus C. durum D. acidovorans Scenedesmus sp. S. hominis B. sphaericus A. actinomycetemcomitans P. stomatis Oocystis sp. P. aerogenes S. hominis S. maltophilia B. diminuta C-12 Blanca Geitlerinema sp. C-12 Naranja C-42 Delftia sp. Chlorococcum sp. C-13 + + + + + + + + + + casena (U/mL) 0,404 0,699 0,404 0,659 0,535 0,699 0,166 0,203 0,329 0,535 0,389 0,490 0,758 0,836 0,149 0,659 0,490 Rango 31115 U/mL 2 5 2 0 1 5 0 0 0 0 1 0 1 1 8 5 2 + + + + + + + + FOSFATASA CELULOSA UREASA Urea 0,1% + + -

4.2.1.5. Actividad de celulasa: Todas las microalgas evidenciaron actividad celuloltica (Figura 23). En cuanto a las diversas cepas, fueron las cepas de Chlorella que presentaron una hidrlisis parcial obtenindose halos entre 0,4-0,5 cm de dimetro. En cambio, para el resto de las microalgas, los valores de los halos oscilaron de 0,1-0,4 cm (Tabla 23).

En las bacterias asociadas como Corynebacterium durum, Bacillus sphaericus, asociado a Chlorella sp., Corynebacterium durum, Delftia acidovorans y Staphylococcus hominis asociadas a las microalga Scenedesmus sp., y Staphylococcus hominis, C-12 Naranja, asociadas a la microalga Geitlerinema sp. fueron positivas para la actividad de celulosa, a diferencia de los dems gneros que fueron negativos (Tabla 24). De tal manera que, tanto Chlorella sp. y Scenedesmus sp., continan acaparando las capacidades de produccin de exoenzimas, conjuntamente con su flora bacteriana asociada, en algunos casos, como para sugerir, las cepas correspondientes a estos dos gneros, como las de mayor factibilidad para la remocin de materia orgnica.

94

Las cianobacterias Anabaena flos-aquae, Aphanizomen-non flos-aquae y microcystis aeuginosa y ciertas cepas bacterianas heterotrficas han sido reportadas en un lago estuarino, con capacidad celuloltica. Una de las razones por la baja poblacin de microorganismos celulolticos es el hecho de que la celulosa es relativamente resistente a los procesos de degradacin de bacterias y su transformacin en glucosa requiere una cantidad considerable de energa. De tal manera que, para una despolimerizacin microbiolgica de la celulosa se requiere una actividad sinrgica de muchas enzimas hidrliticas sintetizadas por bacterias, actinomicetales, hongos y protozoos (Mudryk y Skrczewski, 2006).

La presencia de celulasa es de suma importancia para los sistemas de estabilizacin de aguas residuales, procedentes de actividades de procesamiento de madera, extraccin de grasas, aceites, pectinas y otros compuestos de plantas de inters comercial. El hecho de que las microalgas, aisladas de aguas residuales de una planta extractora de aceite de palma, supone un valor agregado, a este consorcio de microalgas, puesto que contribuiran a remover, los excedentes de celulosas presentes en los efluentes del proceso de extraccin del aceite.

Figura 23. Celulasa en las microalgas a. Chlorella sp.1, b. Scenedesmus sp. c. Euglena sp.

4.2.1.6. Actividad de ureasa: De acuerdo a las condiciones de cultivo, todas las microalgas fueron positivas, la prueba para ureasa (Figura 24); indicando que las microalgas Chlorella sp. 1, 2 y 3, Scenedesmus, Oocystis, Euglena, Geitlerinema y

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Chlorococcum fueron las microalgas que evidenciaron la reaccin de ureasa a los 5 das, las otras especies (Synechocystis, S. ecornis, Chlamydomonas) evidenciaron al 7 y 8 da. Infiriendo, que las cepas de Chlorella sp., Scenedesmus sp., Oocystis sp., Euglena sp., Geitlerinema sp. y Chlorococcum sp. tuvieron una mayor velocidad de la expresin de urea que las dems microalgas evaluadas para esta exoenzima.

Figura 24. Presencia de ureasa en las microalgas Synechocystis sp. S. ecornis, Chlamydomonas sp. Geitlerinema sp. Chlorellasp.2Scenedesmus sp. Oocystis sp. Euglena sp. Chlorococcum sp. y el Control.

En cuanto a las bacterias asociadas, solo Delftia acidovorans y Delftia sp. resultaron con actividad de ureasa, estando las mismas, asociadas con Scenedesmus sp. y Chlorococcum sp.

La actividad de las exoenzimas es principalmente confinada a las enzimas hidrolasas, las ms notables las Lipasas, Fosfatasas, Glucosidasas y Proteasas; indicando que el contacto de estas enzimas con los sustratos son importantes en la digestin anaerobia del proceso biolgico del tratamiento de aguas residuales; y declinan su actividad durante la digestin aerbica y anaerbica (Jain y col. 1992; Novak y col. 2003; Burgess y Pletschke, 2008). Whiteley y col. (2002) muestran que las enzimas proteasas y fosfatasas estn predominantemente asociadas con la materia orgnica particulada del lodo del agua residual municipal.

96

En Lagunas de estabilizacin de una planta extractora de aceite de acuerdo a los resultados podemos decir, Chlorella sp. 1, 2 y 3, Scenedesmus sp. y S. ecornis muestran la mayor produccin de exoenzimas como amilasa, proteasa, lipasa, ureasa, celulasa y fosfatasa; y Oocystis sp. estando tambin como una de las especies con mayor cantidad de produccin como amilasa, lipasa, ureasa y celulasa; mientras que con menor produccin las especies de Chlorococcum sp. (amilasa y proteasa), Euglena sp. (ureasa) y Geitlerinema sp. (fosfatasa).

97

Remocin de DQO, Nitrgeno, Fsforo y grasas en agua residual de una Planta extractora de aceite de palma en presencia de microalgas y sus bacterias asociadas

98

4.3.1. Cultivos mixtos de microalgas productoras de exoenzimas con agua residual de la planta extractora de aceite de palma En este estudio se seleccionaron las microalgas Chlorella sp., Chlorococcum sp., Chlamydomonas sp., Oocystis sp., Scenedesmus sp. y Geitlerinema sp.; previamente aisladas de aguas residuales de la Planta extractora de aceite de palma y las cuales demostraron ser fuentes de las exoenzimas: amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa y ureasa. Es por ello, que en el presente estudio se reportan los resultados sobre niveles de remocin de DQO, nitrgeno, fsforo y grasas de muestras de aguas residuales de una Planta extractora de aceite de palma, a fin de relacionar el posible efecto de estas microalgas como co-participantes en los procesos de remocin. Los experimentos fueron iniciados con un inculo mixto de estas microalgas y la concentracin de estos parmetros qumicos y biolgicos, al inicio y final del ensayo.

Estos resultados derivan de dos diseos experimentales, cuyo Primer Ensayo se relacion con la evaluacin de un control sin agua residual (cultivo autotrfico de microalgas), un control AR (con agua residual sin ningn aditivo qumico o biolgico), y un cultivo con agua residual complementada con un fertilizante comercial (Nitrofoska) e inoculado con el consorcio de microalgas (ARN). En cambio, para la ejecucin del Segundo Ensayo se incluyeron los siguientes tratamientos: agua residual suplementada con una mezcla orgnica (O), compuesta por lecitina (0,1%), urea (0,1%) y almidn (0,1%), como materia orgnica referencial aadida al agua residual (ARO); agua residual enriquecida con fertilizante (ARN), agua residual con el fertilizante y la mezcla orgnica (ARNO), otro tipo de control integrado por el fertilizante y la mezcla orgnica (NO). Para ambos experimentos se analiz el crecimiento y contenido de pigmentos, pH, remocin de DQO, nitrgeno, fsforo, slidos totales, grasas y aceites. Adems de, monitorear la presencia de exoenzimas y de bacterias al inicio y final de cada experimento.

4.3.1.1. Crecimiento y contenido de pigmentos en el primer ensayo: Este experimento realizado con agua residual de la extractora de aceite de palma africana, colectada antes de entrar al sistema de lagunas de estabilizacin (AR) (Figura 25), se

99

obtuvo el mximo crecimiento (p<0,05) en agua residual con Nitrofoska (ARN) con 12,342,32 x106 cel.mL-1. Mientras que, en el control (agua destilada + fertilizante) y AR fue de 11,142,17 y 5,531,31 x106 cel.mL-1 (Figura 26). Tambin se observ que, con la adicin del fertilizante al agua residual (ARN), se increment el crecimiento en un 45%. Es posible, que el bajo crecimiento producido en AR, sea debido a que los nutrientes contenidos en el agua residual no estn del todo disponibles para las microalgas. De tal manera que, acusa deficiencia para el crecimiento, y que la misma es superada con la adicin del fertilizante, el cual elev dicho crecimiento a 2,2 veces.

L A G U N A S D E E S T A B I L I Z A C I N

L-1

L-2

L-3

Agua Residual antes de su ingreso a las Lagunas de Estabilizacin (AR)

L-4

Muestra Agua Residual

L-5

Recoleccin de Efluentes Tratados (Agua para Riego de Cultivos)

Figura 25. Sistema de tratamiento aguas residuales (Extractora de Aceite de Palma).

En cuanto al contenido de clorofila y carotenoides (Figura 27 y 28), se alcanzaron valores significativamente mayores (p<0,05) con valores similares de 19,130,42 y 17.940,32g.mL-1 clorofila en ARN y control, respectivamente.

100
14 12

DC (x 10 6 cel.mL -1 )

10 8 6 4 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Edad del Cultivo (das)

Control AR ARN

Figura 26. Crecimiento de microalgas en funcin de la edad del cultivo con agua residual.
Control: AR: agua residual, ARN: agua residual enriquecida con Nitrofoska.

En cambio la clorofila, con el agua residual sin adicin de fertilizante (AR) se produjo un valor de 10,221,29g.mL-1 (Figura 27), lo que solo representa un 50,4% del obtenido cuando era adicionado el fertilizante.

25 20

Clorofila a (g.mL -1)

15 10 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Edad de Cultivos (das)

AR ARN Control Control (AR)

Figura 27. Variacin del contenido de clorofila (g.ml-1) con la edad del cultivo.

101

El seguimiento de la concentracin de los carotenoides en funcin de la edad del cultivo, tambin contribuy a ratificar que en ARN, seguido del control y luego de AR, se reflej el crecimiento en este orden descendente, y que apenas el bajo contenido de carotenoides detectado en el control (AR), sea debido al poco crecimiento de las microalgas presentes en las muestras colectadas del agua residual.

Caroretoniodes (g.mL -1)

2,5 2 1,5 1 0,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Edad del Cultivo (das)

AR ARN Control Control (AR)

Figura 28. Variacin del contenido de carotenoides (g.ml-1) con la edad del cultivo.

Estudios anteriores han demostrado la posibilidad de utilizar las aguas residuales urbanas como medio de cultivo para el crecimiento de microalgas. Chacn y col. (2002) realizaron cultivos a nivel de laboratorio utilizando las microalgas Chlorella sp. y Scenedesmus sp. en aguas residuales urbanas de la serie A del sistema de lagunas de estabilizacin del CIA-LUZ, obteniendo un crecimiento satisfactorio de las mismas en el agua residual y superando significativamente el crecimiento presentado por el tratamiento de control, con lo que se demuestra el potencial estimulador del crecimiento y de la produccin de pigmentos esta agua residual.

102

25

DC (x10 6 cel.mL -1 ); Pigmentos (g.mL -1 )

20 15
11,14

17,94

19,13

12,34 9,64

10
5,53

5
1,29 1,15 1,68

0 Control Crecimiento AR Clorof ila ARN Carotenoides

Figura 29. Densidad celular (x106 cel.mL-1), clorofila y carotenoides (g.mL-1) del cultivo mixto de microalgas en control, AR y ARN.

El seguimiento de la concentracin de la clorofila y carotenoides con la edad del cultivo, tambin es una medida del crecimiento de las microalgas, y permite complementar el comportamiento de las mismas ante medios de cultivos experimentales, como lo fueron las aguas residuales. Es por ello que, la produccin de clorofila se selecciona como parmetro de crecimiento; puesto que se correlaciona con la densidad celular o peso seco de las microalgas, conforme van transcurriendo los das del cultivo (Jonte, 2003). En este estudio se aprecia (Figura 29) que el mximo crecimiento (p<0,05) fue en agua residual con nitrofoska (ARN) con 12,342,32 x106 cel.mL-1. Mientras que, en el control (agua destilada + fertilizante) y AR fue de 11,142,17 y 5,533,00 x106 cel.mL-1.

4.3.1.2. Crecimiento y contenido de pigmentos en el segundo ensayo: La mayor densidad celular se produjo en el control (solo fertilizante) con 28,993,23 x106 cel.mL-1 (p>0,05); a pesar de que present un comportamiento similar con el control NO

103

(fertilizante con la mezcla orgnica), hasta el da 16. los tratamientos (Figura 30).

De acuerdo a la curva de

crecimiento, ambos cultivos, parecen formar un subconjunto, muy diferente al resto de Por otro lado, en los cultivos mixotrficos (AR complementados o no con NO y/o Nitrofoska), se encontr el mejor crecimiento en NO, con lo cual, refleja el siguiente orden descendente: NO> ARO> AR > ARN> ARNO. Adems, se evidenci que NO, super a ARO, AR, ARN y ARNO en 1.5, 2.10, 2.32 y 4.3 veces respectivamente, con diferencia significativa (p0,05), en los subconjuntos homogneos homogneos.
a,b,c

sin

diferencia

significativa

(p>0,05)

entre

subconjuntos

30 25

DC (x 10 6 cel. mL -1)

20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Edad del Cutivo (das)

Control NO AR ARN ARO ARNO

Figura 30. Cultivo de microalgas en funcin de la edad del cultivo con diferentes tratamientos. NO: Nitrofoska + O, AR: Agua residual, ARN: Agua residual con Nitrofoska, ARO: Agua residual + O, ARNO: Agua residual Nitrofoska + O.

Es de indicar, adems que, los cultivos ARN y ARNO presentaron una inhibicin del crecimiento ms acentuada, que los cultivos ARO y AR, quizs como resultado de la excesiva carga orgnica y falta de disponibilidad de nutrientes del agua residual. Dicho

104

efecto, fue observado hasta el da 16 de iniciado el experimento. A partir del cual, se observ un crecimiento real de estos cultivos, probablemente debido, a alguna actividad de biodegradacin de los componentes del agua residual, que hizo luego disponibles los nutrientes necesarios para el incremento de la densidad celular. No obstante, en el cultivo control, tampoco hubo un crecimiento adecuado hasta el da 16, presentando un bajo crecimiento, para luego elevar su densidad celular drsticamente en el da 18. En tal sentido, se sugiere algn efecto ambiental a los cultivos, que durante el perodo del experimento, produjo bajo crecimiento hasta el da 16 en todos los cultivos (Figura 30).

El control autotrfico tambin super al resto de los tratamientos (p0,05), en cuanto al contenido de clorofila y carotenoides y ligeramente en cuanto a los valores de densidad celular (Figura 31). Esto sugiere que las condiciones mixotrficas de los cultivos: AR, ARN, ARO, ARNO y NO, parecen no favorecer la sntesis de pigmentos. Tal efecto, se refleja en mayor grado, para ARNO, al cual se le ha adicionado al agua residual, el fertilizante y la mezcla orgnica. carotenoides. De tal manera, que pudo haberse producido compuestos que inhibieron tanto su crecimiento, como la acumulacin de clorofila y de

Es decir, si se compara el contenido de clorofila entre los cultivos con agua residual y el control, se detecta que hubo una inhibicin del 70,3; 68,1; 56,2 y 54,64 en ARNO, AR, ARO, ARN, respectivamente. Mientras que en el cultivo control con fertilizante y la mezcla orgnica (NO) tambin lo hubo, pero en un y 45,4%. Lo que permite, deducir que, las condiciones mixotrficas en presencia de alto contenido de compuestos orgnicos, influyeron en la baja acumulacin de clorofila. El valor ms alto del control fue de 28,993,23 x106 cel.ml-1 y el de ARNO apenas alcanzo los 6 millones, tal como se ve en la figura 31.

105
35

DC (x 10 6 cel.mL -1 ); Pigmentos (g.mL -1 )

30 25 20 15 10 5 0

28,99

21,86 18,92 13,79 11,07 6,49 6,75 3,19 1,62 2,18 1,74

11,96

12,50 9,05 6,98

12,29

5,04 3,32

Control

NO Crecimiento

AR

ARN Clorof ila

ARO Carotenoides

ARNO

Figura 31. Densidad celular (x106 cel.mL-1), clorofila y carotenoides totales (g.mL-1) del cultivo mixto de microalgas con los diferentes tratamientos.

4.3.2. Efecto del pH en los cultivos mixtos de las microalgas

El pH del agua residual colectada (antes de entrar al sistema de lagunas de estabilizacin) vari entre 3,75 y 4,28 a 3,75, el cual era ajustado hasta la neutralidad, al momento de ser utilizada como medio de cultivo. Al realizar el Primer ensayo, el agua residual cruda tuvo un pH de 6,5 despus de realizar los diferentes tratamientos, el pH vario. Para el control (AR) fue de 8,07, con AR fue de 7,67 y con ARN de 7,69. Para el segundo ensayo, el agua residual tuvo un pH de 3,35 y ajustado luego a 7,00. Mientras que, los valores iniciales de pH para el control, control (AR), AR, NO, ARN y ARNO fueron de 7,68; 7,10; 8,24; 7,11; 7,23 y 7,20 respectivamente.

El monitoreo del pH con la edad del cultivo (Fig. 32a) en el primer ensayo y en el segundo ensayo (Fig. 32b) a lo largo del periodo experimental, indican un ascenso del pH entre 9 y 10 en los tratamientos con agua residual, en comparacin con los del control y NO, que solo se mantenan entre 8,5 y 8,0 y entre 7,8 y 8,2, respectivamente.

106
a

12 10 8

pH

6 4 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Edad del Culltivo (das)

Control Control (AR) AR ARN

12 10 8

pH

6 4 2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Edad del Cultivo (das)

Control Control (AR) NO AR ARN ARO ARNO

Figura 32. Variacin del pH durante el periodo experimental. a. Ensayo 1 b. Ensayo 2.

Es posible que, el elevado pH en los cultivos con agua residual, ejerzan influencia en la precipitacin de nutrientes, y en consecuencia disminuyan la disponibilidad de los mismos para las microalgas, si se compara con el control, cuyo pH permaneci en el rango optimo para el crecimiento de microalgas (Abalde y col. 1995). El incremento del pH en cultivos con microalgas utilizadas en el tratamiento de aguas residuales tambin se ha descrito un incremento del pH desde 7 a valores superiores a 9 (Lau y col. 1995).

107

4.3.3. Anlisis de Remocin de materia orgnica y nutrientes

4.3.3.1. Demanda Qumica de Oxigeno (DQO): La remocin de DQO fue observada en el primer ensayo en los tratamientos y el control con diferencias significativas (p<0,05). De acuerdo a los resultados obtenidos, se produjo una remocin de 23,464,42mg.L-1, 9123,02331,84mg.L-1, 5411,93536,72mg.L-1 y de 11859,06379,33mg.L-1 en el control, control (AR), AR y ARN respectivamente; lo cual represent el 52,93; 97,66; 95,51 y 96,77% en el control, control (AR), AR y ARN (Figura 33).

La demanda qumica de oxgeno presente al inicio del control autotrfico, de 23,464,42mg.L-1, obedece a la carga orgnica que aportan el inculo mixto de microalgas a inicio del experimento, y luego esta misma es removida en un 52,93% al final del primer ensayo (Figura 33). Asimismo, el incremento de la DQO a 2.924,1957,04 mg.L-1 para el control utilizado en el segundo ensayo, se debe a que el inculo proceda del mismo cultivo mixto utilizado en el primer ensayo, con lo cual era ms envejecido y en consecuencia, tendra un mayor aporte de materia orgnica, producto del metabolismo de las microalgas y de las bacterias asociadas.

En el segundo ensayo, la remocin de DQO fue tambin elevada con un 90,60% en NO, 95,09% en ARN, 96,13% en el Control, 97,50 en ARO, 97,80% en ARNO, 98,14 en AR y 98,39% en el Control (AR), sin diferencia significativa entre los tratamientos y Controles (p>0,05). En referencia a las concentraciones removidas se encontr el valor ms bajo de 2281,0733,01mg.L-1 en NO y el ms alto, de 14700,73564,97mg.L-1 en AR (Figura 34).

El elevado porcentaje de remocin obtenido en el control (AR), deduce una alta eficiencia por parte del consorcio bacteriano asociado al agua residual, adems del efecto de volatilizacin, que tambin contribuira a la reduccin de la materia orgnica existente. Para el primer ensayo se obtuvo un valor inicial de DQO de 9341,67329,34 mg.L-1; mientras que para el segundo ensayo fue de 14.166665,97 mg.L-1 (Tabla 25 y

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26).

Esta diferencia se debe a que para cada ensayo se utilizaron muestras de

residuales de diferentes muestreos. Adems, la muestra de residual para el segundo ensayo fue sometida a agitacin constante durante una semana y luego se seleccion el 25% y el resto completado con agua potable; lo cual significa, que aun as, el residual del segundo ensayo, fue superior en DQO en 1,5 veces respecto a la utilizada en el primer ensayo. Sin embargo, las remociones de un 97,66% y 98,39% en el primer y segundo ensayo, ratifica la elevada eficiencia de los microorganismos hetertrofos en reducir la DQO, y a la presencia adicional de microalgas propias del agua residual, que se mantuvieron hasta el final del experimento; las cuales en conjunto contribuyeron a la elevada remocin de la materia orgnica en el segundo ensayo.

Figura 33. Remocin de DQO [(mg.L-1) (%)] en el primer Ensayo. Control (AR): agua residual no inoculada con microalgas, AR: agua residual, ARN: agua residual + Nitrofoska.

En relacin a la reduccin de DQO en los tratamientos con agua residual (AR, ARN, ARNO) y en el control NO inoculados con las microalgas, tambin hubo altos porcentajes de remocin, en orden descendente: control (AR)> AR> ARNO> ARO>control >ARN >NO (Figura 34).

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Figura 34. Remocin de DQO [(mg.L-1) (%)] en el segundo ensayo. O: mezcla con lecitina, urea y almidn, NO: Nitrofoska + O, Control (AR), ARN: agua residual+ Nitrofoska, ARO: agua residual + O, ARNO: agua residual + Nitrofoska + O.

Por otra parte, se encontr tambin que, no hubo diferencia entre el control (AR) y AR; ya que se removi 14.700,73 y 13.938,63mg.L-1, respectivamente. Lo que parece deducirse que, aparentemente no es necesario adicionar el inculo mixto de microalgas, porque con tan solo la presencia del consorcio microbiano nativo (bacterias, hongos, microalgas) en el agua residual, se logra la reduccin de la DQO con resultados similares (Figura 34 y Tabla 26). En cambio, cuando se le adicion al agua residual la mezcla orgnica (ARO), el fertilizante (ARN) y tanto la mezcla orgnica como el fertilizante (ARNO), la remocin de la materia orgnica fue menor; aun cuando los porcentajes de remocin fueron similares entre los tratamientos y el control (AR). Al respecto, se ha encontrado al menos en este trabajo, una mayor remocin de DQO, que en trabajos realizado con aguas residuales en Samara (Rusia), en el cual se produjo una remocin del 51%, correspondiente a una reduccin a 59048,9mg.L-1 a partir de 120066,5mg.L-1 (Safonova y col. 2004).

4.3.3.2. Slidos Suspendidos Totales (SST) y Slidos Suspendidos Voltiles (SSV): Durante el desarrollo de los cultivos, en el primer y segundo ensayo,

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observamos una produccin de microalgas en las paredes de las unidades de cultivos, que se supone una cantidad adicionar de slidos suspendidos. Es de considerar, que una parte de los slidos en suspensin estn formados por detritus, restos de las microalgas y bacterias; por lo que los procesos de colmatacin en los diferentes ensayos fue evidente. La remocin de SST en el primer ensayo (Figura 35), fue ms efectiva en AR (p<0,05), con una remocin de 148,00mg.L-1; equivalente al 87,06%; seguido por el control con 42,00mg.L-1 y un 47,73%; luego ARN con 18,00mg.L-1 y 25,71% y por ltimo, se produjo la menor remocin en el control (AR) con 30, 00mg.L-1 y con tan solo un 14,29%. Sin embargo, en slidos voltiles, tanto AR como en el control (AR), se obtuvo la misma remocin con un 70% (Figura 36). En relacin a la remocin de SST y SSV, en el segundo ensayo, aunque fue por lo general baja, se encontr que en el control (AR), se redujo la mayor concentracin, de 110 mg.L-1 (p<0,05), equivalente al 37,93%. En ARNO fue de un 12,00% y en NO, de un 50,00% con 40,00 mg.L-1 (Figura 37 y 38). Roman y col. 2006. Reporto en lodo primario de la digestin anaerobia de agua residuales disminucin de SST en un 80% (20% en el control) y de 25g/L a 5g/L, lo cual indica que solo las enzimas como celulasa y pronasa tienen poco o no impacto sobre la solubilizacin de los slidos.

Figura 35. Remocin de slidos totales [SST-(mg.L-1) y SST-(%)] en el primer ensayo.

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Figura 36. Remocin de slidos voltiles [SSV-(mg.L-1) y SSV-(%)] en el primer ensayo.

Figura 37. Remocin de slidos totales [SST-(mg.L-1) y (SST-(%)] en el segundo ensayo.

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Figura 38. Remocin de slidos voltiles [SSV-(mg.L-1) y (SSV-(%)] en el Segundo ensayo.

En general cuando la remocin de slidos totales de aguas residuales en condiciones de laboratorio, tiende a no ser eficiente, en el sentido de que a pesar de una participacin importante de las bacterias del residual, tambin se acumulan productos de su metabolismo y el de las microalgas, con lo cual, puede existir remocin, pero a la vez tambin hay produccin de materia orgnica, que pasa a caracterizarse como slidos totales. En cambio, a cielo abierto, el efecto de la irradiacin solar, lluvias y mayor poblacin bacteriana, puede contribuir a una remocin ms efectiva de los slidos totales. No obstante, la biota presente en las lagunas de estabilizacin incrementa, la produccin de slidos totales. As se ha relacionada a las microalgas, como influyentes en el mantenimiento de elevada carga de SST y al respecto, se ha descrito un estudio realizado con aguas residuales industriales de la ciudad de Hamadan en Iran, en el cual se demostr una correlacin entre la concentracin de slidos totales y microalgas. Adems, de lograr una remocin del 100% de microalgas y del 99.5% de SST, despus de aplicar el mtodo de electro-coagulacin a las aguas residuales del sistema (Azarian y col. 2007).

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4.3.3.3. Nitrgeno (Nitrgeno Total Kjeldahl): La remocin de Nitrgeno en el primer ensayo fue superior en los cultivos con agua residual inoculados con microalgas (AR), respecto al control autotrfico y al control de agua residual no inoculado con microalgas. Es decir, la remocin se presento en el siguiente orden descendente: AR (99,98%) > ARN (98,36%) >Control-AR (65,56%) >Control (22,37%) (Figura 39), con diferencia significativa (p<0,05), en relacin a los dos controles. Entre los resultados ms sorprendentes, se reflejan los obtenidos en la remocin de nitrgeno en AR, ya que a partir de 291.200,001.400,00mg.mL-1 hubo una reduccin hasta 70,936,47mg.mL-1 (Tabla 25) de nitrgeno; lo cual represent un 99,98% de remocin.

En el segundo ensayo (figura 40), se produjo una remocin del 67,35% para el control y del 89,60% en el control (AR), siendo estos los valores ms bajos (p<0,05) respecto a los dems tratamientos. El valor ms alto fue en ARNO con 99,58%, pero sin diferencia significativa (p<0,05) en cuanto a NO, AR, ARN, ARO y ARNO, siendo estos subconjuntos homogneos.

En el tratamiento que hubo la menor remocin de nitrgeno fue en NO, con 872,111,83mg.L-1; mientras que, la ms elevada de 9.328,85562,24mg.L-1 se produjo en ARNO (Tabla 26). Es posible que, la adicin del fertilizante y de la mezcla orgnica al agua residual, contribuyo al crecimiento de la poblacin de bacterias inherentes al residual, y al de las microalgas y sus bacterias asociadas, como para que de manera sinergstica asimilaran las diferentes formas de nitrgeno para su crecimiento; adems del que pudo haber sido volatilizado, como para haberse consumido casi el total del nitrgeno (99,58%) presente al inicio del experimento.

A pesar de que la remocin de la DQO en el control con solo agua residual (AR) fue ms eficiente que cuando el agua residual fue inoculada con el cultivo mixto de microalgas, para el caso de la remocin del nitrgeno fue lo contrario. Es decir, en el control (AR) se inici con una concentracin de nitrgeno de 4.200,00280,00mg.L-1 se finaliz con un contenido de 429,33140,93mg.L-1; lo cual represent un 89,60%. Sin embargo, en el cultivo ARNO, con la mayor concentracin de nitrgeno de todos los

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tratamientos, la remocin de nitrgeno supero todas las expectativas, se revela como uno de los resultados ms interesantes de este estudio.

Figura 39. Remocin de Nitrgeno Kjeldahl [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo.

Figura 40. Remocin de Nitrgeno Kjeldahl [(mg.L-1), (%)] en el segundo ensayo.

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Nutriente mg.mL-1 Control Control (AR) AR ARN

Tabla 25. Concentracin inicial y final de DQO, nitrgeno, fsforo, grasas y aceites (mg.mL-1) en el Primer ensayo. A. y G. DQO Inicial DQO Final Nitrgeno inicial Nitrgeno Final Fsforo Inicial Fosforo final Inicial 20,662,22 44,133,74 1418,678,08 1101,3321,39 277,5920,13 158,6525,13 0,00 9341,67329,34 5661,67486,93 218,655,67 249,7354,43 168,0056,00 291200,001400,00 6626,67168,00 58,402,58 70,936,47 108,276,47 56,0011,20 258,134,08 995,4343,57 17,570,60 14,861,55 51,600,20 580,00 63,89 85,00

A. y G. Final 0,00 180,00 20,86 10,86

12267,96377,91 408,91100,47

Control: agua destilada con Nitrofoska, control (AR): agua residual sin microalgas, (AR): agua residual+microalgas, (ARN): agua residual con Nitrofoska.

Nutriente mg.mL-1 Control Control (AR) NO AR ARN ARO ARNO

Tabla 26. Concentracin inicial y final de DQO, nitrgeno, fsforo, grasas y aceites (mg.mL-1) en el Segundo ensayo. A. y G. DQO Inicial DQO Final Nitrgeno inicial Nitrgeno Final Fsforo Inicial Fosforo final Inicial 2924,1957,04 113,194,44 992,5114,00 324,052,59 760,436,01 386,1731,59 0,00 14166665,97 2517,5930,21 10690,53285,97 9591,17394,06 227,5331,64 236,522,83 525,201,77 239,6031,16 4200,00280,00 893,0121,39 5600,00280,00 5169,18161,66 5878,50427,71 9367,68560,00 429,33140,93 20,912,59 34,352,59 40,320,00 34,352,59 38,832,59 52,962,36 309,314,29 140,382,58 355,860,43 220,650,86 551,311,08 24,591,37 133,9013,22 94,643,09 154,396,18 71,0614,25 138,943,78 212,00 530,00 110,00 206,00 432,00 460,00

A. y G. Final 00,00 180,00 28,00 18,00 20,50 12,00 4,00

14978,83570,32 278,1026,20

11073,03155,01 243,9725,78

Control: agua destilada con Nitrofoska, control (AR): agua residual no inoculada con microalgas , (AR): agua residual+microalgas, NO: Nitrofoska y O (mezcla orgnica), (ARN): agua residual +Nitrofoska, (ARO): agua residual y O (mezcla orgnica), ARNO: agua residual + Nitrofoska + mezcla orgnica, (G y A): grasas y aceites. Concentracin inicial: al inicio del experimento. Concentracin final: al finalizar el experimento.

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En diversos estudios ya se ha demostrado, altas eficiencias en la remocin de nitrgeno de aguas residuales. As, efluentes de granjas de cerdos con alta carga de nutrientes e inoculadas con las microalgas Microspora willeana, Ulothrix ozonada, Rhizoclonium hieroglyphicum y Oedogonium sp. han reportado una remocin del 90%, equivalente a una cantidad mayor a 1000mg.l-1 de nitrgeno total (Kebede y col. 2006). Por otro lado, Chacn y col. (2006); encontraron remociones de nitrgeno amoniacal (100%) en aguas residuales urbanas cultivadas con Chlorella sp. y Scenedesmus sp.

Entre otros trabajos, Andrade, (2007) tambin reporto remociones de 95,49% y de 99,78% nitrgeno amoniacal y de nitratos de aguas residuales con Scenedesmus sp. En cuanto a las diferentes fuentes de nitrgeno existentes en los medios de cultivo, se ha descrito una asimilacin preferencial en el siguiente orden (N-NH4+)>(N-NO2-)>(NNO3-)>Nitrgeno orgnico simple (como urea y aminocidos). Es decir, la microalga consumir en primer lugar el NH4+ en funcin del grado de reduccin de las diferentes fuentes de nitrgeno, debido al gasto energtico requerido para asimilar las fuentes ms oxidadas (Lau y col. 1995; Morales, 1996).

Voltolina y col. (2005) obtuvieron una remocin de Nitrgeno 43,7% utilizando una dilucin del 30% de agua residual artificial y luego a una dilucin del 40%, la remocin disminuyo a 26,4% con cultivo semicontinuo de Scenedesmus obliquus. No obstante, en el presente estudio se utiliz una dilucin del 25% del residual, producindose una remocin de nitrgeno de 99,17% (AR).

4.3.3.4. Fsforo Total: La remocin de fosfatos en el primer ensayo (Figura 41) alcanz un 98,50% y 94,24% en ARN y AR respectivamente y ambos con diferencia significativa (p>0,05) respecto a los controles. La mayor cantidad fue removida en ARN y presento una relacin directa con el mayor crecimiento microalgal presentado en este tratamiento. Sin embargo, no se encontr relacin directa entre la remocin de fosfato y los tratamientos restantes. porcentaje. El control present el valor ms bajo con 118,945,10mg.L-1 y 43,09% de remocin tanto en concentracin como en el

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Figura 41. Remocin de Fosfatos [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo.

En el segundo ensayo (Figura 42) observamos que los valores mayores de remocin de fsforo fueron alcanzados en ARNO, con 412,382,71mg.L-1 y 74,80%, ARO con 149,6015,11mg.L-1 y 67,78%, y NO con 175,4156,74mg.L-1 y 56,74% y ARN con 201,485,75mg.L-1 y 56,62% respectivamente, sin diferencia significativa (p>0,05) entre los mismos. En cambio, los controles presentaron los valores ms bajos con una remocin de 374,2649,20; 45,745,67 y 28,373,74mg.L-1, equivalentes a un 53,43, 49,20 y 32,54% y para el control (AR), control autotrfico y AR.

En estos dos ensayos observamos que la remocin de fosforo se evidencio mejor en los tratamientos en donde el agua residual fue enriquecida con Nitrofoska y la mezcla orgnica, indicndonos que las bacterias en estas agua residuales tienen un papel importante en la remocin de este parmetro. No obstante; al observar el tratamiento en donde estn las microalgas y bacterias con un medio enriquecido hay mayores remociones de este parmetro, como es el caso de ARN en el primer ensayo y ARNO en el segundo ensayo.

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Figura 42. Remocin de Fosfatos [(mg.L-1), (%)] en el segundo ensayo.

Es conocido que, la eliminacin de los fosfatos del agua residual tratada mediante sistemas biolgicos, como en el caso de las microalgas tiene lugar por asimilacin de las mismas. As mismo, la actividad fotosinttica diurna tambin contribuye a la eliminacin de este nutriente, ya que al elevar el pH del lquido de mezcla, produce la precipitacin del mismo (El Halouani y col. 1993). Estudios anteriores realizados con aguas residuales urbanas colectadas del sistema A de lagunas de estabilizacin de la Universidad del Zulia, Venezuela, las microalgas Chlorella sp. y Scenedesmus sp. registraron remociones de fosfato en el orden de 2,40mg.L-1 (44,0%) y 2,65mg.L-1 (48,7%), respectivamente, en un periodo de 27 das (Chacn y col. 2004). De igual forma en el tratamiento aplicado a aguas residuales del sistema B del mismo Sistema de lagunas utilizando la microalga Chlorella sp. se logr una remocin mxima de 12,6mg.L-1 representado el 73,5% de la concentracin inicial (Andrade y col. 2002). Andrade, (2007) en los tratamientos a aguas residuales del sistema B de las lagunas (CIA-LUZ) B3 y las Lagunas Pisccolas enriquecidas con medio de cultivo comercial alcanzaron las mayores remociones de este parmetro con 1,83mg.L-1 (91,04%) y 1,65mg.L-1 (86,39%).

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El tratamiento de aguas residuales de cerdo con alta carga de nutrientes tambin ha sido reportado, mediante la utilizacin de microalgas filamentosas (Microspora willeana, Ulothrix ozonada, Rhizoclonium hieroglyphicum y Oedogonium sp.), y para lo cual se obtuvieron eficiencias de remocin de fsforo entre 68 y 76%; lo que equivale a cantidades entre los 231,2 y 258,4mg.L-1. Estos resultados, permitieron sugerir que el tratamiento con microalgas es eficiente para la depuracin de efluentes con alta carga de nutrientes (Kebede y col. 2006).

Por otra parte, Lau y col. (1995), demostraron que la capacidad de asimilacin de fosfato por Chlorella vulgaris no se redujo por la presencia de bacterias nativas; sino que, por el contrario, ambas, bacterias y microalgas fueron capaces de captar y asimilar fosfatos del agua residual y que adems de este mecanismo, el fosfato pudo haber sido eliminado del medio a travs de la precipitacin del mismo. De igual manera, tratamientos con agua residual domestica (en tandem, con pre-muerte y microalga coinmovilizada (Chlorella sorokiniana y Chlorella vulgaris) contribuyeron a incrementar a una remocin del 72% de fosforo en el agua residual (Hernndez y col. 2006).

4.3.3.5. Aceites y Grasas: El anlisis de aguas residuales derivadas de actividades industriales de extraccin o de procesamiento de materia prima rica en grasas, es de suma importancia al momento de determinar, los niveles de remocin de DQO y de grasas, en funcin del tiempo de residencia de los residuales, y de la comunidad microbiana existente en las lagunas de estabilizacin respectiva. Es por ello que, tambin se someti a evaluacin el grado de reduccin de grasas y aceites en los cultivos con los diferentes tratamientos. As, observamos en el primer ensayo, que la mayor remocin se produjo en el control (AR) con 400mg.L-1; lo que equivale a un 68,97%. Para el caso de AR y ARN hubo una remocin de 43,03mg.L-1 y 74,14mg.L-1, equivalentes a 67,35% y 87,23% respectivamente con diferencia significativa (p<0,05) y de igual forma en los diferentes tratamientos con diferencia significativa (p<0,05) con respecto al control (Figura 43).

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En la figura 44, observamos que para el segundo ensayo, este parmetro obtuvo la mayor remocin en los tratamientos de NO y ARNO con 502mg.L-1, 456,00mg.L-1 y 94,72% y 99,13% respectivamente, con respecto al control (AR) y AR en donde se obtuvo los valores ms bajos de remocin con 32,00mg.L-1 y 15,09% y 92,00mg.L-1 y 83,64%, observndose diferencia significativa (p<0,05) entre todos los tratamientos.

La remocin significativa de residuales de aceite de oliva se ha reportado en sistemas de tratamiento de residuales industriales y realizado por filtros de arena, con una concentracin de 7,51,03mg.L-1 a la entrada y de 0.30,07mg.L-1, a la salida, obtenindose una reduccin del 96%. En este estudio se demostr la participacin de Lyngbia, Microcoleus chthonoplastes, Phormidium corium, Phormidium sp., Oscillatoria salina, Plectonema terebrans y Aphanocapsa sp., en asociacin con bacterias heterotrficas (Safonova y col. 2004).

Figura 43. Remocin de aceites y grasas [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo.

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Figura 44. Remocin de aceites y grasas [(mg.L-1), (%)] en el segundo ensayo.

Bhumibhamon y col. (2002), estudiaron dos grupos de bacterias (cultivos individuales cultivos mixtos) productores de lipasas, habiendo mayor remocin de DQO y Aceites y grasas (81-99% y 73-88% respectivamente) con cultivos simples (cepas KUL8 Acinetobacter sp., KUL39 Bacillus sp. y KLB1 Pseudomonas sp.) durante 7 das de tratamiento; las aguas residuales de palma de aceite y aguas residuales de panadera utilizadas, demostraron que las cepas KUL8 y KUL39 remueven grasas y aceite en una proporcin de 87,7% y 80,6% en aguas residuales de palma de aceite, mientras que solo el 70% y 64% en aguas residuales de panadera dentro de 48 horas de tratamiento.

4.3.4. Presencia de exoenzimas

La presencia de exoenzimas en los diferentes cultivos con el agua residual inoculada con microalgas y en el control, fue confirmada para amilasa, lipasa, celulasa y ureasa (Tabla27). En cambio, en el control (AR), no inoculado con microalgas, solo se apreci halos de actividad para amilasa y lipasa.

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Tabla 27. Exoenzimas (halo-cm) presentes en los diferentes tratamientos del primer ensayo. TRATAMIENTO AMILASA LIPASA* CELULASA UREASA Control Control (AR) AR ARN 0,8 0,4 0,5 0,9 0,5 0,3 0,6 0,2 0,4 0,4 0,1 +++ ++ +

LIPASA*: yema de huevo, Ureasa: intensidad del color rojo-naranja.

En el segundo ensayo, se ratific que el control (AR), solo registra una ligera actividad de amilasa y celulasa; lo cual evidencia que la presencia de las microalgas inoculadas al residual, favorece la produccin significativa de las enzimas analizadas (Tabla 28). Para el caso de la prueba de la ureasa, dicha actividad fue positiva despus del tercer da de incubacin con muestras procedentes de los cultivos ARO y ARNO y AR; mientras que en los otros tratamientos se detect al quinto da.

Tabla 28. Exoenzimas (halo-cm) presentes en los diferentes tratamientos del segundo ensayo. TRATAMIENTO AMILASA LIPASA* LIPASA** CELULASA UREASA Control Control (AR) NO AR ARN ARO ARNO 1,6 0,3 0,4 1,8 1,8 1,3 1,5 1,2 1,1 1,3 1,2 0,7 1,6 0,7 0,4 0,5 0,3 0,5 0,5 0,3 0,9 1,2 0,1 0,1 0,1 ++ ++ +++ ++ ++++ ++++

Lipasa*: medio slido con yema de huevo, Lipasa**: medio slido con lecitina comercial (Val natural), Ureasa: intensidad del color rojo-naranja.

Hosetti y Patil (1988, 1992), han determinado la presencia de catalasa, proteasa, fosfatasa y amilasa en lagunas de estabilizacin de aguas residuales domsticas en tres lagunas y comparadas durante los primeros 9 das y 60 das. Entre otros resultados, reconocieron que las mayores actividades se encontraron en la laguna 3, durante el periodo de pre-estabilizacin y de estabilizacin. Adems, indicaron que las actividades de catalasa, proteasa y amilasa fueron las ms elevadas durante el perodo de pre-estabilizacin, en relacin a las actividades detectadas en el periodo de estabilizacin.

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Es de destacar que, el tratamiento biolgico de aguas residuales est relacionado con los microorganismos existentes y sus enzimas asociadas, tanto en condiciones aerbicas como en anaerbicas. Por ejemplo, las proteasas y glicosidasas desempean un papel esencial en la degradacin de lodos residuales; pero sus actividades estn condicionadas a los niveles de oxgeno, fuentes de azufre y de otros sustratos. Por ejemplo, la adicin de almidn hidrolizado estimul la actividad de las glicosidasas en los lodos activados (Nybroe y col. 1992). En los exopolisacridos asociados a los flculos producidos durante los procesos de biodegradacin de aguas residuales, se han detectado un 17% de aminopeptidasas, 5% de -glucosidasas, 23% de proteasas y un 44% de -amilasas (Cadoret y col. 2002); lo que corrobora la importancia de los microorganismos productores de estas exoenzimas para incrementar la velocidad de remocin de protenas, grasas, cidos nucleicos, exopolisacridos y almidones presentes en aguas residuales. Actualmente, se continua investigando sobre el efecto de los procesos de transferencia de masa, intermediarios metablicos, exopolisacridos, aceptores de electrones, pH y temperatura en las diferentes enzimas hidrolticas que incrementan la remocin de los componentes en aguas residuales (Burgess y Pletschke, 2008). De acuerdo a los resultados obtenidos en nuestra experiencia, las exoenzimas asociadas a microorganismos fotosintticos y hetertrofos de aguas residuales, deben de ser ms estudiadas y lograr, su mayor expresin para incrementar la velocidad de remocin de residuales.

4.3.5. Poblacin de bacterias asociadas a los cultivos

Con la finalidad de complementar los factores involucrados en los procesos de remocin de N, P, DQO y de grasas, se determin la poblacin de bacterias heterotrficas en cada uno de los tratamientos, tanto al inicio como al final del segundo experimento. Los resultados indican que en ARN se alcanz la mayor nmero de colonias de bacterias, con 25x105 UFC/mL (Tabla 29); mientras que en el resto de los cultivos la poblacin bacteriana estuvo en el siguiente en orden descendente: ARN>control=ARNO>ARO>NO>AR> Control (AR).

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Se observa, igualmente que, en todos los tratamientos hubo un ascenso del nmero de bacterias, desde el inicio hasta el final del ensayo. Posiblemente, debido al aumento de la disponibilidad de nutrientes que se fueron liberando, como producto de la biodegradacin de los compuestos en dichos medios de cultivos. Efecto observado tambin en el control autotrfico, que con tan solo el fertilizante aadido y el inculo mixto de microalgas, se estimul el crecimiento bacteriano asociado a estas microalgas (Tabla 29). En cambio, tanto en ARNO como en ARO, se esperaba una mayor poblacin bacteriana, debido a la carga bacteriana asociada al agua residual (25%); a la adicin del fertilizante y a la mezcla orgnica (ARNO), los cuales estimularan aun ms el crecimiento bacteriano, conforme se fuese desarrollando el cultivo. No obstante, el exceso de sustrato o de carga orgnica existente, pudiese haber inhibido el incremento de bacterias a niveles ms elevados que en el control.

Tabla 29. Poblacin de bacterias (UFC/mLx105) al inicio y final del segundo ensayo. TRATAMIENTOS Control Control (AR) NO AR ARN ARO ARNO INICIO 0,03 0,05 0,04 2,99 2,84 3,00 2,91 FINAL 19,4 2,70 10,9 6,40 25,0 17,3 19,3

Tal es el caso del control (AR) y AR, con las ms bajas densidades de bacterias, que coinciden con las ms elevadas concentraciones iniciales de DQO de 14.166665,97 y 14.978,83570,32mg.mL-1 respectivamente (Tabla 26). Esto parece deducir, que la alta carga orgnica inhibi desde un inicio la proliferacin de la poblacin bacteriana; mientras que al adicionrsele al agua residual el fertilizante y la mezcla orgnica, se le suministr nutrientes mas disponibles para el crecimiento bacteriano, o que ambos ingredientes contribuyeron a incrementar la biodegradacin de la materia orgnica, como para hacer mas disponibles los nutrientes liberados, para las bacterias e incluso para el crecimiento microalgal. Razn por la cual, se incrementara la poblacin de bacterias, tanto de las asociadas, como las inherentes al agua residual. Y de esta

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manera, es como se puede explicar que, en NO, ARO, ARNO y ARN fue incrementando la poblacin bacteriana. Pero, con una mayor estimulacin cuando se adicionaba el fertilizante.

Los resultados obtenidos en el primer y segundo ensayo, reflejan que todos los factores involucrados en el proceso de remocin de DQO, nitrgeno, fsforo, slidos totales, grasas y aceites contenidos en el agua residual derivada de la extraccin del aceite de palma, ejercen influencia sobre el crecimiento, produccin de pigmentos y exoenzimas en las microalgas; as como en el crecimiento bacteriano. Por otra parte, la remocin de DQO pareci no depender de la adicin de microalgas; ya que en su ausencia y presencia hubo remociones de 14700,73564,97 y 13.938,63mg.L-1 en el control (AR) y A, lo cual represent un 98,14 y 98,39% respectivamente.

En cuanto al fsforo, se logr con el agua residual enriquecida con fertilizante y la mezcla orgnica, la mayor remocin con el 74,80% (ARNO), un 67,78% en ARO y un 56,62% en ARN, cuando fue comparada a los controles (AR), autotrfico y AR. Las grasas y aceites, tambin fueron removidas en mayor medida en ARNO con un 99,13% (p<0,05), y con la eficiencias ms baja en el control (AR). El tratamiento preliminar al agua residual; as como su enriquecimiento con nutrientes orgnicos e inorgnicos, tambin condicionan la eficiencia de remocin en cuanto a slidos totales; ya que las condiciones del segundo ensayo permitieron una mejor remocin que en el segundo experimento. Por otra parte, la presencia de exoenzimas y de las bacterias asociadas en los diferentes tratamientos, contribuyeron en menor o mayor grado a promover la remocin de la DQO, Nitrgeno y fsforo; as como a interpretar el crecimiento y desempeo de las microalgas en los diferentes tratamientos.

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Conclusiones

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En el Sistema de Estabilizacin de la planta extractora de aceite de palma se identificaron 27 especies de microorganismos fotosintticos; de las cuales el gnero Chlorella sp., fue la ms abundante. Asimismo, fueron aisladas y cultivadas 9 cepas de microalgas (Chlorella sp. 1, sp. 2 y sp. 3., Scenedesmus sp. 1 y S. ecornis, Chlamydomonas sp., Chlorococcum sp., Oocystis sp. y Euglena sp.) y 2 de cianobacterias (Geitlerinema sp. y Synechocystis sp.).

De estos cultivos unialgales, se identificaron y aislaron 13 cepas de bacterias, asociadas a los cultivos de Chlorella sp. 1 y sp. 2 (Corynebacterium durum y Bacillus sphaericus), Staphylococcus Scenedesmus sp. (Corynebacterium durum, Delftia acidovorans y hominis) Oocystis sp. (Bacillus sphaericus, Actinobacillus

actinomycetemcomitans, Pasteurella stomatis y Pasteurella aerogenes), Chlorococcum sp. (Delftia sp. C-13 y C-42) y Geitlerinema sp. (Staphylococcus hominis, Stenotrophomonas maltophilia, Brevundimononas diminuta, cepa C-12 Blanca, C-12 Naranja).

Los elevados valores de nutrientes, materia orgnica, aceites y grasas del sistema de estabilizacin, reflejan un efecto sobre la adaptacin, diversidad y abundancia de los microorganismos fotosintticos. cianobacterias. La influencia del pH, nitrgeno, fsforo y DQO parecen determinar en mayor grado, el crecimiento de las microalgas y

Chlorella sp. 1, Chlorella sp. 2, Chlorella sp. 3, Synechocystis sp., Oocystis sp. y Geitlerinema sp. demostraron actividad de amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa y ureasa; sugiriendo estos resultados que las cepas de Chlorella sp., Oocystis sp., Scenedesmus sp., Chlorococcum sp. y Geitlerinema sp. pueden ser utilizadas para el tratamiento de residuales enriquecidos con almidones, protenas y grasas.

Los diferentes tratamientos involucrados en los experimentos, para el caso de los controles (autotrfico, AR y NO), y de los cultivos con aguas residuales (AR, ARN, ARO y ARNO), permitieron deducir que, la remocin de DQO, parece no depender, al menos

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de las microalgas. En cambio, fue ms efectiva la remocin del fsforo y de las grasas cuando dicho residual era ms enriquecido con nutrientes orgnicos e inorgnicos (ARNO). De igual manera, con el agua residual enriquecida (AR, ARN, ARO y ARNO) se remueve hasta un 99,58%, en relacin a los controles.

El tratamiento preliminar al agua residual as como su enriquecimiento con nutrientes orgnicos e inorgnicos, tambin condicionan la eficiencia de remocin en cuanto a slidos totales; ya que las condiciones del segundo ensayo permitieron una mejor remocin que en el primer ensayo.

Los resultados obtenidos en condiciones de laboratorio reflejan que, todos los parmetros fisicoqumicos analizados ejercen influencia sobre la poblacin de bacterias y sobre el crecimiento, produccin de pigmentos y exoenzimas en las microalgas; las cuales contribuyeron a promover la remocin de la DQO, Nitrgeno, fsforo, grasas y aceites con alta eficiencia.

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Recomendaciones

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Monitorear el funcionamiento de las Lagunas de estabilizacin de la planta extractora de aceite exhaustivamente, a fin de determinar la dinmica poblacional y distribucin de microorganismos fotosintticos y heterotrficos para valorar su contribucin en los procesos de remocin de los residuales en funcin de los parmetros fisicoqumicos.

Disear sistemas de cultivos de microalgas a diferentes proporciones de agua residual de plantas extractoras de aceite a fin de establecer cual estimula un mayor crecimiento que permita mejorar la calidad del agua a la salida del sistema.

Proponer a la empresa un estudio para utilizar la biomasa microalgal como biofertilizante en los centros de propagacin de la palma africana o de otros rubros agrcolas.

Realizar estudios conducentes a la sobreproduccin de exoenzimas de microalgas y sus bacterias asociadas, a fin de aplicar inculos altamente productores para catalizar la velocidad de remocin en aguas residuales y para expandir su uso en la industria.

Proponer a la empresa extractora de aceite de palma un estudio definitivo para validar consorcios microbianos mixtos que aceleren la remocin de DQO, N, P y el exceso de grasas y aceites en funcin del tiempo.

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ndice de Referencias

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ndice de Figuras

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Pg. Figura 1. Ciclo de oxigenacin fotosinttica de aguas residuales. Salazar, (2005). Figura 2. Mecanismo de accin de las enzimas hidrolticas sobre la materia orgnica. (1) Limitacin de la transferencia de masa, (2) EPS, (3) Intermediarios metablicos, (4) Condiciones del aceptor de electrones, (5) pH y Temperatura. Todos tienen un efecto sobre la actividad de las enzimas involucradas en el tratamiento de aguas residuales. Burgess y Pletschke, (2008). Figura 3. Sistema de Tratamiento de aguas residuales de las Lagunas de Estabilizacin de Palmas Oleaginosas de Casacar Ltda-Colombia. Figura 4. Cultivos en condiciones de laboratorio. Figura 5. Agua residual antes de ser vertidas a las Lagunas de Estabilizacin. Figura 6. Primer Ensayo (Tratamientos). Figura 7. Segundo Ensayo (Tratamientos). Figura 8. Micrografias (400x). (1) Primer Muestreo. a. Scenedesmus sp. b. Oscillatoria sp. c. Oocystis sp. d. Pandorina sp. e. Lyngbya sp. f. Chroococcus sp. (2) Segundo muestreo. g. Thiopedia sp. h. Pseudoanabaena sp. i. Euglena sp. j. Monoraphidium sp. k. Synechococcus sp. l. Ankistrodesmus sp. (3) Tercer muestreo. m. Haematococcus sp. n. Geitlerinema sp. o. Kirchineriella lunaris. Figura 9. Micrografias (400x). (4) Cuarto Muestreo. a. Navicula sp. b. 56 59 68 68 73 74 75 Synechocystis sp. c. Phacus sp. d. Nitzschia sp. e. Merismopedia sp. Figura 10. a. Crecimiento comparativo de microalgas Chlorophyta. b. Crecimiento de la cianobacteria Geitlerinema sp., seguido mediante turbidez. Figura 11. Corynebacterium durum. Figura 12. Bacillus sphaericus. Figura 13. B. diminuta bacilo gramnegativo. Figura 14. Colonias de Stenotrophomonas maltophilia. Figura 15. Poblacin de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintticas en Lagunas de estabilizacin de una Planta extractora de aceite de palma, 40 41 42 43 54 27 22 18

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orden cronolgico de los muestreos. Muestreo 1: junio-2008, muestreo 2: Septiembre 2008, muestreo 3: diciembre 2008, muestreo 4: mayo 2009. Figura 16. Abundancia de microalgas, cianobacterias y bacterias 76 fotosintticas segn los sitios de muestreos en lagunas de estabilizacin de una Planta extractora de aceite de palma, de acuerdo al orden de los muestreos. a. Muestreo 1. b. Muestreo 2. c. Muestreo 3 y d. Muestreo 4. Figura 17. Grasas y aceites (mg.L-1) en las lagunas de estabilizacin de acuerdo a los muestreos. Figura 18. Presencia de amilasa en medio slido (almidn al 0,2%) en microalgas y bacterias asociadas. a. Oocystis, b. Chlorella, c. Scenedesmus, d. cepa bacteriana C-12 Naranja, e. A. actinomycetemcomitans, f. S. maltophilia. Figura 19. Variacin de la actividad amilasa (U/g) en microalgas Figura 20. Lipasa en microalgas. Medio Yema de Huevo: a. Chlorella sp.1, b. Chlorococcum, Chlorella sp. 3. Figura 21. Presencia de lipasa en bacterias asociadas. Medio Yema de Huevo: a. Stenotrophomonas maltophilia, b. Staphylococcus hominis, c. Actinobacillus actinomycetemcomitans, Medio Tween 80: d. cepa C-12 Naranja, e. cepa C-42 Bacillus sphaericus, e. Staphylococcus hominis. Figura 22. Licuefacin de la gelatina en microalgas. Figura 23. Celulasa en las microalgas a. Chlorella sp.1, b. Scenedesmus sp. c. Euglena sp. Figura 24. Presencia de ureasa en las microalgas Synechocystis sp. S. ecornis, Chlamydomonas sp. Geitlerinema sp. Chlorella sp.2 Scenedesmus sp. Oocystis sp. Euglena sp. Chlorococcum sp. y el Control. Figura 25. Sistema de tratamiento aguas residuales (Extractora de Aceite de Palma). Figura 26. Crecimiento de microalgas en funcin de la edad del cultivo con agua residual. Control: AR: agua residual, ARN: agua residual enriquecida con Nitrofoska. Figura 27. Variacin del contenido de clorofila (g.ml-1) con la edad del 100 100 99 93 88 89 88 c. Oocystis. Medio Tween 80: d. Euglena, e. Oocystis, f. 79 83 77 76

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cultivo. Figura 28. Variacin del contenido de carotenoides (g.ml-1) con la edad del cultivo. Figura 29. Densidad celular (x106 cel.mL-1), clorofila y carotenoides (g.mL-1) del cultivo mixto de microalgas en control, AR y ARN. Figura 30. Cultivo de microalgas en funcin de la edad del cultivo con diferentes tratamientos. NO: Nitrofoska + O, AR: Agua residual, ARN: Agua residual con Nitrofoska, ARO: Agua residual + O, ARNO: Agua residual Nitrofoska + O. Figura 31. Densidad celular (x106 cel.mL-1), clorofila y carotenoides totales (g.mL-1) del cultivo mixto de microalgas con los diferentes tratamientos. Figura 32. Variacin del pH durante el periodo experimental. a. Ensayo 1 b. Ensayo 2 Figura 33. Remocin de DQO [(mg.L-1) (%)] en el primer Ensayo. Control (AR): agua residual no inoculada con microalgas, AR: agua residual, ARN: agua residual + Nitrofoska. Figura 34. Remocin de DQO [(mg.L-1) (%)] en el segundo ensayo. O: mezcla con lecitina, urea y almidn, NO: Nitrofoska + O, Control (AR), ARN: agua residual+ Nitrofoska, ARO: agua residual + O, ARNO: agua residual + Nitrofoska + O. Figura 35. Remocin de slidos totales [SST-(mg.L-1) y (SST-(%)] en el primer ensayo. Figura 36. Remocin de slidos voltiles [SSV-(mg.L-1) y (SSV-(%)] en el primer ensayo. Figura 37. Remocin de slidos totales [SST-(mg.L-1) y (SST-(%)] en el segundo ensayo. Figura 38. Remocin de slidos voltiles [SSV-(mg.L-1) y (SSV-(%)] en el Segundo ensayo. Figura 39. Remocin de Nitrgeno Kjeldahl [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo. Figura 40. Remocin de Nitrgeno Kjeldahl [(mg.L-1), (%)] en el segundo ensayo. 114 114 112 111 111 110 109 108 106 105 103 102 101

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Figura 41. Remocin de Fosfatos [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo. Figura 42. Remocin de Fosfatos [(mg.L-1), (%)] en el segundo ensayo. Figura 43. Remocin de aceites y grasas [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo. Figura 44. Remocin de aceites y grasas [(mg.L-1), (%)] en el segundo ensayo.

117 118 120 121

152

ndice de Tablas

153

Pg. Tabla 1. Microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintticas ms comunes en Lagunas de Estabilizacin. Tabla 2. Uso de microalgas para el tratamiento de aguas residuales en lagunas de alta tasa de oxidacin en diversos pases. Tabla 3. Uso de biomasa de microalgas cultivadas en aguas residuales. Tabla 4. Composicin qumica del medio de cultivo ALGAL. Tabla 5. Composicin qumica del fertilizante NITROFOSKA FOLIAR (Insecticidas Internacionales, CA). Tabla 6. Composicin del medio BG11 (Rippka, 1988). Tabla 7. Composicin del medio organotrfico complejo. Tabla 8. Microorganismos observados en los muestreos de las lagunas de Estabilizacin. Tabla 9. Microalgas y cianobacterias observados durante el periodo de estudio en las Lagunas de Estabilizacin de una Planta extractora de aceite de palma. Tabla 10. Diversidad de microorganismos fotosintticos en Lagunas de estabilizacin. Tabla 11. Caractersticas bioqumicas y diferenciales de Bacterias Grampositivas asociadas a las Microalgas. Tabla 12. Caracterizacin bioqumica y de proliferacin de las Bacterias Gram-negativas asociadas a los cultivos de microalgas. Tabla 13. DQO (mg.L-1) en las lagunas estabilizacin de acuerdo a cada muestreo. Tabla 14. SST (mg.L-1) en las lagunas estabilizacin de acuerdo a cada muestreo. Tabla 15. SSV (mg.L-1) en las lagunas estabilizacin de acuerdo a cada muestreo. Tabla 16. Nitrgeno Total (mg.L-1) en las lagunas estabilizacin de acuerdo a cada muestreo. Tabla 17. Fsforo Total (mg.L-1) en las lagunas estabilizacin de acuerdo a 78 72 69 65 65 64 63 62 61 30 33 57 20 29 29 19 19

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cada muestreo. Tabla 18. Grasas y aceites (mg.L-1) en las lagunas de estabilizacin de acuerdo a cada muestreo. Tabla 19. Monitoreo del pH en las Lagunas de Estabilizacin. Tabla 20. Amilasa en microalgas y bacterias asociadas. Tabla 21. Lipasa en Microalgas. Tabla 22. Lipasa en bacterias asociadas a microalgas, mtodo en placa y espectrofotomtrico (p-NPP). Tabla 23. Exoenzimas (proteasa, ureasa, celulasa y fosfatasa) en microalgas. Tabla 24. Exoenzimas (Proteasa, Ureasa, Celulosa y Fosfatasa) en bacterias asociadas a las microalgas. Tabla 25. Concentracin inicial y final de DQO, nitrgeno, fsforo, grasas y aceites (mg.mL-1) en el Primer ensayo. Tabla 26. Concentracin inicial y final de DQO, nitrgeno, fsforo, grasas y aceites (mg.mL-1) en el Segundo ensayo. Tabla 27. Exoenzimas (halo-cm) presentes en los diferentes tratamientos del primer ensayo. Tabla 28. Exoenzimas (halo-cm) presentes en los diferentes tratamientos del segundo ensayo. Tabla 29. Poblacin de bacterias (UFC/mLx105) al inicio y final del segundo ensayo. 124 122 122 115 115 94 95 83 85 87 90 82