Captulo 3.

Las curvas de calibracin

por Celia E.Coto* Profesora Titular Consulta de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA Investigadora Superior del CONICET.

En el captulo 1 nos hemos referido a la importancia del uso de un blanco o control para darle validez al resultado de un experimento. Hemos explicado tambin que el resultado de una experiencia puede ser de tipo cualitativo o cuantitativo. En el segundo captulo hemos visto que en ciertas situaciones es necesario utilizar cantidades ms pequeas de una determinada sustancia y para lograr preparar esas cantidades se hacen diluciones seriadas de una solucin original, una muestra o una solucin de stock. En este captulo elaboraremos una curva de calibracin o curva patrn. Qu se entiende por curva de calibracin? Se trata de una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo la albmina srica bovina que vimos antes) que se utiliza para determinar la cantidad de esta sustancia (protenas) presente en una muestra incgnita. En muchas determinaciones se cumple una relacin proporcional entre la magnitud o intensidad de color que da una reaccin y lacantidad del reactivo que la provoca. Por ejemplo: si la presencia de 10 ug de protenas en una solucin genera la aparicin de un color azul plido cuando es agregada a una mezcla reactiva, la presencia de 20 ug de protena dar lugar a que la solucin se torne azul ms oscuro y as sucesivamente.

Para realizar la experiencia debemos preparar unas diluciones seriadas de albmina srica bovina como las que hicimos antes (ser nuestro estndar o patrn) y dispondremos as de por lo menos 5 concentraciones, luego realizaremos la reaccin qumica correspondiente para desarrollar color y mediremos la intensidad de color de cada solucin. Por ej., partiendo de una solucin madre de 1mg/ml, tendremos 6 tubos as:

http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.htm

La relacin entre intensidad de color y concentracin de la sustancia (una medida de la cantidad de esa sustancia) es proporcional y as, si se grafica el valor de intensidad de color medido con un aparato adecuado (espectrofotmetro o colormetro) en funcin de las concentraciones crecientes de la sustancia se obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidad de protena, mayor cantidad de producto de reaccin y por lo tanto, mayor intensidad de color.

Curva de Calibracin

Dado que se ha trabajado con datos reales, los grficos que se obtienen no son tan ideales, pero esta situacin no es un obstculo ya que dentro de ciertos valores es posible trazar la recta ms probable que une una serie de puntos, con el uso de los programas de clculo de las computadoras.

Hay que advertir que una respuesta lineal no se obtiene en todo el rango de concentraciones posibles sino dentro de un conjunto de valores que dependen de numerosos factores dependientes del mtodo de medicin. Por otra parte, este tipo de curvas no se limita solamente a la determinacin de un elemento o compuesto qumico sino que tiene mltiples aplicaciones.

Captulo I. El blanco y el control

por Celia E.Coto* Profesora Titular Consulta de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA Investigadora Superior del CONICET.

El conocimiento de las Ciencias experimentales se construye en base a teoras cuya veracidad requiere de pruebas de experimentacin. Pero aunque no tengamos el privilegio de proponer al mundo una teora nueva, seguramente todos aquellos que se asoman al campo experimental deben saber, en primer lugar, que para otorgarle validez a los hallazgos que realicen deben

cumplir obligatoriamente con algunos requisitos. Entre estos requisitos es fundamental incluir en cada experimento, cualquiera sea su naturaleza, un blanco o control, para poder otorgar validez al resultado obtenido. Aunque en el fondo tienen la misma funcin el blanco o el control no son siempre equivalentes, en general la denominacin de blanco se reserva para las reacciones qumicas y el control tiene carcter ms universal y debe ser includo en todo tipo de experimentos. La presencia de los controles es necesaria no slo en los experimentos cualitativos sino tambin en los cuantitativos. Entendemos por cualitativos cuando esperamos una respuesta de todo o nada, hay o no hay, existe o no existe, sin importarnos la cantidad, dicho en otros trminos, la respuesta es negativa o positiva. En cambio, en un experimento cuantitativo queremos medir la cantidad de los que estamos buscando en una muestra, por ejemplo: cuntos gramos de algo, cuntos tubos dan positivos, cantos animales mueren por efecto de una droga, cuntas clulas hay en un cultivo, cuntas partculas de metal hay en una solucin, cuntas bacterias hay en una gota de agua limpia, etc. Los valores cuantitativos se aplican generalmente cuando se quiere comparar entre muestras incgnitas o contra una muestra estndar. Pero este concepto lo estudiaremos en otro captulo de esta serie.

Con los siguientes ejemplos trataremos de aclarar qu significa un blanco o un control:

Caso 1.
Se desea conocer la presencia de un metal en una muestra de agua (puede ser cobre, hierro cadmio u otro). Se sabe que hay un reactivo (se denomina as a un compuesto qumico o mezcla de compuestos qumicos que reaccionan con el metal en cuestin) digamos, por ejemplo, produciendo un color. Elijamos el azul. La intensidad del color depender de la cantidad de metal presente en la muestra, a mayor cantidad ms intensidad tendr el azul. Para medir la intensidad del color que nos dar una medida de la cantidad de metal presente en la muestra utilizaremos un aparato llamado colormetro o uno ms perfeccionado como un espectrofotmetro. En qu consiste la lectura?. Colocando nuestro tubo de ensayo en el aparato conseguiremos que una luz atraviese la solucin y que sea recibida por un "sensor" que la convertir en una medida relacionada con la facilidad conque el rayo de luz pueda atravesar la solucin. La idea es simple: ms oscura la solucin pasar menos luz. Para que la lectura de estos aparatos tenga lugar, primero hay que calibrarlos con una muestra de agua, pero... todo no termina ah Qu pasa cuando nuestro reactivo es ligeramente coloreado?. La medicin final ser igual a la suma de: a) color de reactivo + color de reactivo ms metal, con lo que obtendremos una medicin falsa, porque nuestra incgnita se compar contra agua que es transparente. Lo correcto es preparar un blanco o control que contenga todos los ingredientes de la reaccin

menos el metal. Este blanco medido contra el agua nos dar un cierto valor positivo que tendremos en cuenta en el clculo final. El resultado correcto ser: b) color de la muestra - color del blanco (control) = lectura incgnita. Ahora s, este valor expresa la verdadera cantidad de metal presente en la muesta. En este caso y en casos similares, el uso del control evita obtener mediciones errneas por exceso, al no tener en cuenta el aporte que hacen al sistema, los reactivos.

Caso 2.
Nos proponemos encontrar una droga que impida el crecimiento celular con la esperanza de descubrir un compuesto farmacolgico que eventualmente pudiera usarse contra el cncer. Antes de realizar una prueba en animales debemos probar la droga en un sistema celular en el laboratorio. Es posible mantener clulas vivas en recipientes de plstico o vidrio, en los que las clulas se adhieren a la superficie (cultivo en monocapa), o en suspensin, flotando en el medio de cultivo. Estos medios de cultivo son soluciones complejas que contienen sales apropiadas as como nutrientes necesarios para alimentar a las clulas. En los laboratorios de cultivos celulares se dispone de unas placas de plstico estriles (libres de grmenes) en donde se pueden depositar (sembrar) un nmero apropiado de clulas. Las clulas cuando son incubadas (mantenidas) en ese medio alimenticio y a 37 C se dividen, creciendo su nmero en forma logartmica hasta que se agotan los nutrientes. Existen varios mtodos para contar el nmero de clulas vivas. Por eso si deseo probar una droga puedo agregarla al medio de cultivo y comparando con un control podr determinar su efectividad o no. Veamos el siguiente ejemplo: Se desea probar el efecto de una droga X y de otra Y sobre el crecimiento celular para ello se siembran en un recipiente 3 x105 clulas y se incuba por tres das con medio nutritivo (Serie C). En forma similar otro recipiente se siembra con igual nmero de clulas y se le agrega medio nutritivo conteniendo droga X, se incuba por tres das (serieA). Por ltimo un tercer recipiente se siembra con igual nmero de clulas y luego se incuba con medio nutritivo conteniendo la droga Y, tambin se incuba por tres das (serie B). Pasado ese tiempo se cuenta el nmero de clulas de las series A, B y C y se obtienen los siguientes resultados: Serie C (control) A (droga X) B (droga Y) Nmero de clulas por recipiente 5 x 106 3 x 103 1 x 102

Cmo los interpretamos?. Es evidente la importancia fundamental del control, si comparamos el nmero de clulas sembradas 3 x105 con las existentes al da tercero despus de la siembra

conclumos que se han incrementado aproximadamente 1000 veces. La droga X no les permiti dividirse, ya que al da 3 el nmero de clulas es idntico a las sembradas. Podemos concluir que se trata de un citotstico (detuvo el crecimiento celular), pero la droga Y es an ms promisoria poque no slo es citosttica, sino tambin citotxica, ya que respecto del valor inicial, el nmero de clulas se redujo diez veces. El experimento se puede analizar tambin de otra forma, pero resulta ms que evidente el papel fundamental del control sin el cual no podra arribarse a ninguna conclusin.

Caso 3.
A pesar que por razones de Bioseguridad cada vez ms el uso de istopos radiactivos decrece, a veces es necesario utilizar istopos radiactivos para poder determinar el papel que juegan algunas molculas en los procesos metablicos de las clulas. Los istopos radiactivos de mayor uso en experimentos biolgicos son el fsforo 32 (32P), carbono 14 (14C), tritio (3H) y azufre 35 (35S). Recordemos que estos tomos son variantes inestables del istopo ms comn estable, que para estabilizarse pierden electrones en forma de radiacin electromagntica. Para medir la emisin de las radiaciones (una forma indirecta de conocer la cantidad de sustancia que tengo) se utiliza entre otros aparatos el "espectrofotmetro de centelleo" ms conocido en la jerga del laboratorio como centellador. Este aparato permite alojar frascos de diferente tamao en los que se coloca la muestra radiactiva disuelta en una solucin "centelladora". Esta solucin no es ms que la mezcla de dos solventes orgnicos cuyos tomos al ser bombardeados por los electrones emiten fotones ( partculas o cuantos de luz). Los fotones, a su vez, son convertidos en el espectrofotmetro en impulsos elctricos que activan un contador luminoso que registra el nmero de desintegraciones por minuto. La desintegracin de los tomos no es un fenmeno contnuo sino que el nmero de pulsos por minuto resulta del promedio de desintegraciones que se realizan al azar. Y el control, se preguntarn Uds.? Aqu tambin es necesario un control. Siempre en el medio ambiente se producen radiaciones naturales que son registradas por el aparato y tambin intervienen otros factores como el tamao de la muestra, la cantidad de lquido, el tipo de aparato y otras variables ms complejas de explicar. El hecho es que nuestra muestra debe ir acompaada de otra muestra blanco que contenga, en un envase similar, el lquido de centelleo sin la muestra. Para obtener el resultado se debe proceder as: a la lectura de desintegraciones por minuto conocidas como cpm (cuentas por minuto) hay que restarle las cpm del fondo. Valor que no afecta demasiado los resultados si el nmero de cpm de la muestra que se cuenta es alto, pero igual estar indicando la validez del experimento. Porque no sera raro que, por accidente, se hubiera contaminado el solvente usado con material radiactivo, y si no inclumos el blanco nuestra lectura podra resultar errnea.

Caso 4.
Los experimentos que se realizan con animales son muy frecuentes, aunque hay una tendencia a evitar su uso por razones humanitarias y reemplazarlos por otros sistemas. Sin embargo, muchas veces son paso indispensable antes de realizar ensayos en el hombre. Hay muchos tipos de experimentos que se pueden realizar con animales, en especial, ratones, que por su pequeo tamao son ms manejables que las ratas. Por otro lado, la experiencia acumulada en la Ciencia a travs de tanto aos de experimentacin indica que los resultados obtenidos en ratones son de inmediata aplicacin al hombre. Existen adems ratones endocriados (obtenidos por cruzamiento entre ratones familiares) y libres de grmenes, de modo de evitar que el resultado de un experimento sea complicado por la participacin de microrganismos ajenos a la experimentacin. Vamos a describir el caso de un experimento en el que se desea conocer el efecto de la infeccin con un agente patgeno en el ratn. En primer lugar, debemos trabajar con un nmero relativamente grande de animales, por ejemplo 10, para que los resultados sean significativos. La nocin de significacin la estudiaremos en otro captulo, para el ejemplo que daremos no es necesario conocer su importancia. El protocolo ( as se lo denomina al esquema o diseo del experimento) ser el siguiente: Serie A. 10 ratones (de determinada edad o peso) sern inoculados con una cantidad conocida del agente patgeno y se mantendrn en observacin durante 30 das, alimentndolos diariamente y con toda la cantidad de agua necesaria para beber a su disposicin (ad libitum). Todos los das sern revisados y se registrar el nmero de enfermos o muertos. Como dato final se tendr en cuenta la mortalidad (nmero total de muertos) y la morbilidad (nmero total deenfermos). Serie B. 10 ratones similares sern inoculados con la solucin en la que estaba suspendido el agente patgeno pero sin el agente (placebo). Sern observados del mismo modo que la serie A y constituye el grupo de animales controles. En el siguiente cuadro se analizan los resultados de tres experimentos hipotticos. Nmero de animales enfermos

Serie

Morbilidad %

Nmero de animales muertos 10 0 10 9 0 0

Mortalidad % 100 0 100 90 0 0

Experimento 1 A B (control) Experimento 2 A B (control) Experimento 3 A B (control)

10 2 10 9 2 0

100 20 100 90 20 0

Analicemos los resultados: Experimento 1. Es altamente probable que los ratones sean muy susceptibles al agente patgeno. Como los 2 enfermos del control se recuperaron podra ocurrir que estuvieron enfermos porque no eran completamente sanos al inicio del experimento y las condiciones de estrs producido por la observacin diaria les produjo sntomas. De todos modos la observacin de la enfermedad es muchas veces subjetiva mientras que la muerte es una reaccin incuestionable. Experimento 2. La similitud de comportamiento entre los inoculados con el agente patgeno y el placebo hacen pensar que los animales murieron por causas ajenas al patgeno inoculado. Experimento 3. Aqu podemos concluir que estos animales no son susceptibles al agente patgeno, valen las observaciones sobre la enfermedad efectuadas antes. Qu habra sido de nuestro experimento nmero 2 de no haber includo un grupo control?. Hubiramos arribado a conclusiones falsas y cul es la importancia en los otros, aseverar que la interpretacin de los resultados es correcta.

Conclusin
Hemos presentado aqu varios ejemplos del papel que el blanco o control juega en la interpretacin de resultados experimentales, es la forma de validar que un solo componente presente es el desencadenante de una respuesta. Por lo temprano de estas clases no quisiera polemizar sobre algunos factores que a veces entorpecen esta conclusin.

Captulo 2. Las diluciones seriadas

por Celia E.Coto*

Profesora Titular Consulta de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA Investigadora Superior del CONICET.

Hay muchas situaciones en que las cantidades de sustancia necesarias para ver un efecto son extremadamente pequeas (por ejemplo un frmaco para tratar una enfermedad, una hormona para estudiar su efecto en un animal de experimentacin, etc) y difcilmente se pueden pesar o medir en esas proporciones tan pequeas. En esas situaciones es necesario recurrir a la preparacin de una solucin de alta concentracin (o solucin de stock o solucin madre) y hacer diluciones seriadas a partir de sta. Cmo se preparan las diluciones seriadas? En general se parte de una solucin concentrada y se preparan series de diluciones al dcimo (1:10) o al medio (1:2). De esta manera se obtiene una serie de soluciones relacionadas por ejemplo por un factor de dilucin 10 es decir 1/10; 1/100; 1/1000 y as sucesivamente. O la otra serie es 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32 etc. Por ejemplo: si partimos de una solucin de 50mg/ml de una sustancia (Solucin A) a. Dilucin 1/10: 1ml de la solucin A + 9 ml de agua= una solucin de 5 mg/ml (dilucin 1:10) b. Dilucin 1/2: 5 ml de la solucin A + 5 ml de agua= una solucin de 25 mg /ml (dilucin 1:2) Veremos dos ejemplos: 1) diluciones seriadas de una protena 2) diluciones seriadas de un neurotransmisor 1) El primer ejemplo que veremos es una protena. La albmina srica bovina es la protena que ms usualmente se emplea como patrn para calcular la cantidad de protenas totales en una muestra incgnita. Las unidades que habitualmente se usan para la solucin de stock son mg/ml, y en general una solucin de 1 mg/ml puede resultar adecuada para realizar diluciones seriadas y medir luego la concentracin de protenas en una muestra. Las diluciones se harn al medio en una serie de tubos rotulados 1; 0,5; 0,25; 0,12; 0,06; 0,03; 0,015, a todos se les agrega 2 ml de agua destilada y luego la solucin correspondiente:

tubo

concentracin

ml de H2O

ml solucin x

dilucin

0.5 mg/ml

2 ml

2 ml solucin madre (1 mg/ml)

1/2

0.25 mg/ml

2 ml

2 ml de la solucin 0.5 mg/ml

1/4

0.125 mg/ml

2 ml

2 ml de la solucin 0.25 mg/ml

1/8

2) El otro ejemplo es un neurotransmisor, como por ejemplo la noradrenalina, ya que las concentraciones que se emplean para producir un efecto biolgico suelen ser tan pequeas que es necesario hacer diluciones muy grandes de la sustancia. Por ejemplo, se parte de una solucin madre 0,1 M y se hacen diluciones 1/10 hasta 10 M.
-9

tubo

concentracin

ml de H2O

ml de solucin x

dilucin

0.01M (10 )
-3

-2

9 ml

1 ml solucin 0.1M

1/10

0.001M (10 )
-4

9 ml

1 ml solucin 0.01M

1/100

0.0001M (10 )

9 ml

1 ml solucin 0.001M

1/1000

Estas diluciones las usaremos en los captulos siguientes para realizar una curva de calibracin y una curva dosis-respuesta, experiencia que describiremos en el prximo captulo.

Captulo 1 Captulo 3

Captulo 3. Las curvas de calibracin

por Celia E.Coto*

Profesora Titular Consulta de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA Investigadora Superior del CONICET.

En el captulo 1 nos hemos referido a la importancia del uso de un blanco o control para darle validez al resultado de un experimento. Hemos explicado tambin que el resultado de una experiencia puede ser de tipo cualitativo o cuantitativo. En el segundo captulo hemos visto que en ciertas situaciones es necesario utilizar cantidades ms pequeas de una determinada sustancia y para lograr preparar esas cantidades se hacen diluciones seriadas de una solucin original, una muestra o una solucin de stock. En este captulo elaboraremos una curva de calibracin o curva patrn. Qu se entiende por curva de calibracin? Se trata de una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo la albmina srica bovina que vimos antes) que se utiliza para determinar la cantidad de esta sustancia (protenas) presente en una muestra incgnita. En muchas determinaciones se cumple una relacin proporcional entre la magnitud o intensidad de color que da una reaccin y lacantidad del reactivo que la provoca. Por ejemplo: si la presencia de 10 ug de protenas en una solucin genera la aparicin de un color azul plido cuando es agregada a una mezcla reactiva, la presencia de 20 ug de protena dar lugar a que la solucin se torne azul ms oscuro y as sucesivamente.

Para realizar la experiencia debemos preparar unas diluciones seriadas de albmina srica bovina como las que hicimos antes (ser nuestro estndar o patrn) y dispondremos as de por lo menos 5 concentraciones, luego realizaremos la reaccin qumica correspondiente para desarrollar color y mediremos la intensidad de color de cada solucin. Por ej., partiendo de una solucin madre de 1mg/ml, tendremos 6 tubos as:

La relacin entre intensidad de color y concentracin de la sustancia (una medida de la cantidad de esa sustancia) es proporcional y as, si se grafica el valor de intensidad de color medido con un aparato adecuado (espectrofotmetro o colormetro) en funcin de las concentraciones crecientes de la sustancia se obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidad de protena, mayor cantidad de producto de reaccin y por lo tanto, mayor intensidad de color.

Curva de Calibracin Dado que se ha trabajado con datos reales, los grficos que se obtienen no son tan ideales, pero esta situacin no es un obstculo ya que dentro de ciertos valores es posible trazar la recta ms probable que une una serie de puntos, con el uso de los programas de clculo de las computadoras.

Hay que advertir que una respuesta lineal no se obtiene en todo el rango de concentraciones posibles sino dentro de un conjunto de valores que dependen de numerosos factores dependientes del mtodo de medicin. Por otra parte, este tipo de curvas no se limita solamente a la determinacin de un elemento o compuesto qumico sino que tiene mltiples aplicaciones.

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