Mtodo cromognico para la identificacin y/o recuento de Aeromonas, Pseudomonas y otras bacterias Gram-negativas con el empleo del medio

CromoCen AGN
BioCen, cdigo 4227

Aplicacin en muestras clnicas

Este mtodo describe el procedimiento para la deteccin y/o enumeracin de Aeromonas, Pseudomonas y otras bacterias Gram negativas en diferentes muestras clnicas con el empleo del medio cultivo cromognico CromoCen AGN. Garantiza los resultados en 18-28 h y la confirmacin de Aeromonas y Pseudomonas se complementa con la prueba de citocromo oxidasa. Tipos de muestras que pueden ser procesadas por este mtodo: muestras destinadas para urocultivo, coprocultivo, hemocultivo, vaginales, uretrales, catteres o cualquier otro tipo de muestra donde se sospeche la presencia de los microorganismos diana. Resumen de la aplicacin El medio combina el sustrato cromognico para la deteccin de actividad -galactosidasa, presente tanto en Aeromonas, E. coli, como en el resto de los coliformes; con un sustrato (de origen proteico) para la deteccin de actividad proteoltica de diferentes especies de Aeromonas y Pseudomonas. La inclusin del sustrato cromognico para la deteccin de actividad -glucuronidasa, posibilita la deteccin de E. coli y de algunas especies de Shigella (Shigella sonnei). La deteccin de especies de Salmonella se facilita en este medio por la inclusin de una fuente de carbono degradable por la mayora de ellas, adicionado como suplemento lquido a excepcin de Salmonella Typhi y Salmonella Paratyphi. La lactosa, contenida en uno de los componentes del medio, constituye otra fuente de carbono que posibilita la diferenciacin de las especies que la degradan, mediante la observacin de la variacin de la coloracin de las colonias y del medio en presencia del indicador rojo neutro. La inclusin de tierra de diatomea en la formulacin, posibilita la mejor observacin de las caractersticas cromticas de las colonias, la deteccin de las reacciones de hidrlisis de la casena, y los elementos qumicos que contiene estimulan la produccin de pigmentos, en especial de Pseudomonas aeruginosa. La combinacin de nutrientes en el medio, conjuntamente con inhibidores para los microorganismos Gram-positivos, permite el adecuado crecimiento y recuperacin de los microorganismos de inters. Procedimiento (Ver los esquemas generales del mtodo). La preparacin de las muestras se ejecuta segn los procedimientos establecidos para la toma, transportacin, recepcin y tratamiento en dependencia del tipo de las mismas. El tamao de la muestra debe ser el adecuado para realizar el examen microscpico y el cultivo. De ser posible, en el caso de las muestras clnicas, stas deben tomarse antes de iniciar la terapia antimicrobiana. Si la muestra no va a ser procesada de inmediato debe almacenarse en refrigeracin a 4 C y trasladarse al laboratorio en un medio de transporte adecuado (ej. Medio Transporte de Stuart) que proporcione condiciones de pH y humedad. Es importante que el laboratorio reciba muestras que no hayan sufrido daos o cambios en su composicin y estado. Se recomienda el enriquecimiento de las muestras sospechosas de Aeromonas en el medio Agua Peptona Alcalina, incubando a 35 2 C por 18-24 h. Se recomienda procesar las muestras para el anlisis de Salmonella, provenientes de coprocultivos y otras, en un medio para su enriquecimiento selectivo, como el Caldo Selenito u otro medio apropiado de enriquecimiento para Salmonella (Rappaport-Vassiliadis o Rappaport-Vassiliadis Modificado). En paralelo, se recomienda sembrar la muestra directamente en el medio CromoCen AGN para obtener respuestas ms rpidas. Cuando se sospecha la presencia de Salmonella Typhi o Paratyphi, se debe acompaar el ensayo inoculando la muestra en otro medio que posibilite la identificacin de estas especies (Agra S.S. Modificado, Agar Sulfito Bismuto). Siembra en placas e identificacin. Los mtodos de siembra en el medio CromoCen AGN dependen del tipo de muestras a ensayar y el propsito (identificacin o recuento). Para la identificacin se recomienda la siembra por agotamiento del inculo en la superficie por estras y el mtodo de inundacin de la superficie. Para el recuento, se recomienda el mtodo de inundacin de la superficie. El mtodo de siembra por agotamiento del inculo en la superficie (por estras) consiste en sembrar un inculo con el objetivo de obtener colonias aisladas para su estudio. Coloque la placa con el medio de cultivo CromoCen AGN sobre una superficie lisa. Se esteriliza a la llama un asa de nicrom, se enfra y se toma el inculo. Se levanta ligeramente la tapa de la placa de Petri y se va
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arrastrando el inculo desde un borde de la placa al otro realizando lneas rectas en zig-zag bien apretadas, avanzando hacia el centro. Se gira la placa en un ngulo de aproximadamente de 70 a 90 y se realiza el estriado entrecruzando los cuadrantes. En el ltimo cuadrante se realiza el zig-zag menos frecuente, es decir, con lneas ms separadas para garantizar el aislamiento de las colonias. Este mtodo puede hacerse flameando el asa al pasar de un cuadrante a otro, sobre todo si el inculo de partida est muy concentrado. El mtodo de siembra por inundacin de la superficie, se ejecuta distribuyendo homogneamente el inculo con ayuda de una esptula de Drigalsky. Coloque la placa sobre una superficie lisa. Levante ligeramente la tapa de la placa de Petri e inocule para muestras de orina 5 L (0,005 mL) de la porcin de ensayo, en el centro de la placa con medio CromoCen AGN. Para otras muestras, inocule lo indicado en los procedimientos de rutina. Distribuya la muestra sobre toda la superficie con una esptula de Drigalsky estril (embeber en alcohol y flamear), girando esta ltima siempre en posicin totalmente horizontal con respecto al plano de la placa. Deje la placa en reposo por 510 min para que la muestra penetre en el lecho del agar. Incube la placa en una incubadora bacteriolgica a 35 2 C por 18-24 h. Para la deteccin y/o recuento de coliformes fecales, as como para diferenciar Pseudomonas aeruginosa de otras especies de Pseudomonas productoras de pigmento pioverdina, se recomienda incubarlo a 42 2 C. En la incubadora, coloque las placas en posicin horizontal, con la tapa hacia abajo, en columnas de no ms de 4 placas. Al finalizar la incubacin, observe el crecimiento y proceda a identificar el microorganismo. Luego de la incubacin, examine las placas para determinar la presencia de colonias tpicas de los microorganismos diana y las atpicas que pudieran considerarse dentro de estos microorganismos. En el presente mtodo, las especies de Aeromonas se identifican directamente en el medio, a excepcin de las colonias violetas sin halo transparente, que deben ser diferenciadas de los coliformes por la prueba adicional de citocromo oxidasa. Las especies de Pseudomonas, y en especial Pseudomonas aerugiosa, se identifican por la coloracin de las colonias, la presencia o no de halo transparente y de fluorescencia azul bajo luz UV (366 nm). E. coli se define como bacterias con actividad -galactosidasa y -glucuronidasa, que producen colonias de color violeta intenso, con halo violeta alrededor de las colonias. Las bacterias del grupo coliformes se definen como aquellas que poseen actividad -galactosidasa, producen colonias de color violeta de diferentes tonalidades. Algunos rganos regulatorios pueden exigir la confirmacin de E. coli por algunas pruebas adicionales a la deteccin de actividad galactosidasa y glucuronidasa, respuestas caractersticas en el medio CromoCen AGN. En este caso, la confirmacin de las colonias sospechosas de E. coli se puede ejecutar con la prueba de glutamato decarboxilasa y/o la prueba rpida de indol (positivas). Las colonias seleccionadas debern ser de un nmero de al menos 5 por placa. Utilice cultivos puros para ejecutar la prueba. Interperetacin En el medio CromoCen AGN, el crecimiento tpico para los microorganismos diana es el siguiente: Aeromonas spp.: colonias de color verde, con o sin halo transparente amplio, o colonias violetas con o sin halo transparente. Las colonias de color violeta sin halo son confirmadas para su reaccin positiva a la prueba de citocromo oxidasa. Pseudomonas spp.: colonias de color rosado a naranja, con o sin halo transparente, fluorescencia azul verdosa en su mayora. E. coli (excepto E. coli O157:H7): colonias de color violeta intenso, con halo violeta alrededor de las colonias. Coliformes: colonias de color violeta de diferentes tonalidades. Dentro de ellas, las cepas de Klebsiella, por lo general son mucoides, las de Citrobacter, por lo general son ms pequeas. Serratia marcescens: colonias violeta rojizas centro ms oscuro, con o sin halo transparente. Salmonella (excepto Typhi y Paratyphi): colonias de color rosado intenso con bordes rosados. Shigella sonnei: colonias violetas rojizas intensas, bordes irregulares. Salmonella Typhi y Paratyphi: colonias de color muy claro en toda la superficie, o incoloras. Otras bacterias Gram-negativas: colonias incoloras o con pigmentacin propia corresponden a otras bacterias Gram-negativas. Candida y otras levaduras: colonias incoloras, si crecen. Microorganismos Gram-positivos: parcial- o totalmente inhibidos.

Ventajas

Identificacin directa. El uso de los medios de cultivo cromognicos y/o fluorognicos en los laboratorios de
microbiologa clnica introduce cambios en los criterios de identificacin de los patgenos (son identificados directamente). Esto debe considerarse en las comparaciones con los estudios previos. Ms rpido. La identificacin y/o recuento confirmado de Aeromonas, Pseudomonas, E. coli, coliformes y otras bacterias Gram-negativas se realiza en un perodo mximo de 28 h. La deteccin directa y simultnea de varias actividades enzimticas en un mismo medio eleva la exactitud del anlisis. Esto permite la identificacin directa (o con un mnimo de pruebas adicionales), cuyos resultados no presentan diferencia con la identificacin realizada por los mtodos bioqumicos tradicionales que consumen ms de 48 h. Posibilidad de realizar los ensayos de susceptibilidad antimicrobiana por el mtodo de difusin a partir de subcultivos de las colonias coloreadas, ya que estas estn constituidas por bacterias que retienen en su interior el cromforo insoluble procedente de sustrato derivado del indoxilo.

Ms fcil de utilizar. No necesita esterilizacin durante su preparacin. Disminucin de la carga de trabajo

asociada al procesamiento de los urocultivos y de otras muestras.

Ms preciso. Sus Sensibilidad y Especificidad diagnsticas son superiores a las de los medios convencionales
destinados al mismo propsito para todos los microorganismos de inters.

Ms confiable. El contraste de colores y la fluorescencia para E. coli no permiten confusin.

Composicin y preparacin de los medios de cultivo y reactivos 1. Base de Medio CromoCen AGN Composicin: Bases nutritivas-13 g/L; Mezcla cromognica-13,2 g/L; Agar-15 g/L; pH 7,0 0,2 Preparacin: De acuerdo a la cantidad deseada, pese el polvo en proporcin de 41,2 g/L de agua destilada o desionizada. Adicione 10 mL del suplemento PLG (propilenglicol) (cd. 4261). Hierva hasta disolucin completa y distribuya. No esterilice en autoclave. 2. Suplemento PLG Reactivo: propilenglicol Determinacin de las caractersticas organolpticas: Se ejecuta por simple evaluacin visual. Criterios de aceptacin: El reactivo debe ser incoloro, transparente, sin presencia de partculas. 3. Prueba de Citocromo oxidasa La prueba debe realizarse con un asa de platino para evitar los resultados falsos positivos. Existen 3 mtodos para su deteccin: en placa directa, indirecto de Kovacs y el mtodo de tiras o discos impregnados con el reactivo tetrametil (o dimetil)pfenilendiamina; este ltimo tiene la ventaja de ser ms rpido, ms econmico, y que el reactivo permanece estable por lo menos hasta 6 meses despus de preparado. Procedimiento: Tomar con un asa de platino, previamente esterilizada a la llama, la colonia de inters y frotarla sobre el papel de filtro impregnado con el reactivo. Interpretacin: La presencia de una coloracin azul o marrn (en dependencia del reactivo que se use) indica una prueba positiva y por consiguiente la presencia de la enzima citocromo oxidasa en el microorganismo. 4. Prueba Rpida de GAD Composicin del reactivo de la prueba rpida de glutamato descarboxilasa (GAD): Acido Lglutmico - 0,1 g; Cloruro de sodio - 9 g; Verde de bromocresol - 0,005 g; Tritn X-100 0,3 mL; Agua destilada - 100 mL. 4.1 Preparacin: El reactivo debe tener el pH 3,5; tener color amarillo y estar transparente. Esterilice el reactivo por filtracin y envselo aspticamente en un frasco de vidrio de color mbar para su posterior almacenamiento en refrigeracin. Se ha comprobado una estabilidad satisfactoria del reactivo en dichas condiciones en un perodo de 5 meses de almacenamiento. 4.2 Procedimiento: Pique una colonia de inters y prepare una suspensin concentrada en 0,5 mL de solucin salina estril. A esta suspensin adale 0,2 mL del reactivo de GAD e incube a 35 C durante 10-13 h, observando cada 30 min. Cualquier cambio de color amarillo a verde o azul considrelo como reaccin positiva. Existen algunas cepas de E. coli que responden de manera ms rpida y por tanto su respuesta se observa en menor tiempo.

5. Prueba Rpida de indol Prueba de Arnold Weaver Medios de cultivo: - Caldo de triptona (Agua de peptona) conteniendo triptfano. Composicin: Hidrolizado enzimtico de casena- 10,0 g; cloruro de sodio- 5,0 g 5.1 Preparacin: Suspender 15 g en 1 L de agua destilada o desionizada, mezclar bien, distribuir y esterilizar a 121 C por 15 min. 5.2 Procedimiento: Inocule con gran abundancia un cultivo puro proveniente en cantidades de 0,4 mL de caldo de triptona (agua de triptona) conteniendo triptfano. Incube a 37 C durante 2 h. Agregue reactivo de Kovac y agite suavemente. Interpretacin: El color rojo en la capa reactiva indica formacin de indol. Almacenamiento de la Base del Medio CromoCen AGN: Mantener el frasco con el medio deshidratado hermticamente cerrado en lugar seco, fresco, protegido de la luz, a temperatura de 15 a 30 C Se podr almacenar las placas listas para el uso por un perodo de 30 das a temperatura de 2 a 8 C, protegidas de la luz. Para mayor informacin dirigirse a: Departamento de ventas: Ing. Carlos Prendes, tel. 8-81-70-24, e-mail: prendes@biocen.cu Asistencia tcnica: DrC Raisa Zhurbenko, tel. 047-68-2441, e-mail: raisa@biocen.cu Esquema A. Deteccin e identificacin de Aeromonas, Pseudomonas, E. coli y coliformes por el mtodo cromognico con el medio CromoCen AGN en muestras de orina

Esquema B. Deteccin e identificacin de Aeromonas por el mtodo cromognico con el medio CromoCen AGN en otras muestras clnicas Muestra en agua peptona alcalina (Homogeneice). Incube a 35 2 C por 24 h. Inocule la placa de CromoCen AGN por agotamiento del inculo en la superficie (estras) o por inundacin de la superficie; 0,2-0,5 mL para muestras lquidas, directamente de la muestra o del cultivo en caldo, o con el tamao de muestra recomendado; o a partir de diluciones. Incube a 35 2 C por 18 - 24 h. Identifique las Aeromonas como colonias de color verde, con o sin halo transparente amplio, o colonias violetas con o sin halo transparente. Las colonias de color violeta sin halo son confirmadas para su reaccin positiva a la prueba de citocromo oxidasa. Procese los resultados. Esquema C. Deteccin, identificacin y/o recuento de Pseudomonas, E. coli y coliformes por el mtodo cromognico con el medio CromoCen AGN Prepare la muestra segn su origen y el mtodo de siembra a emplear. Para muestras slidas, suspenda la muestra en agua peptonada, agua peptonada tamponada, o segn proceda. De ser necesario, prepare diluciones seriadas segn los niveles de contaminacin esperados. Inocule la placa de CromoCen AGN por agotamiento del inculo en la superficie (estras) o por inundacin de la superficie con 0,2-0,5 mL para muestras lquidas, directamente de la muestra, caldos, o a partir de las diluciones seriadas. Incube a 35 2 C por 18 - 24 h. Para coliformes fecales o para diferenciar Pseudomonas aeruginosa de otras Pseudomonas (opcional) incube a 42 2 C por 18-24 h. Identifique y/o cuente las colonias diana segn se describe en el presente mtodo. Confirme si es necesario con las pruebas adicionales que se describen (GAD e Indol rpido para E. coli, o citocromo oxidasa para Pseudomonas). Procese los resultados. Esquema D. Deteccin de Salmonella por el mtodo cromognico con el medio CromoCen AGN Muestra (1-2 mL para muestras fecales) en caldo selenito u otro caldo selectivo de enriquecimiento para Salmonella (Homogeneice). Incube a 35-37 C, durante 16-24 h, en aerobiosis. Inocule la placa de CromoCen AGN por agotamiento del inculo en la superficie (estras), de la muestra sin enriquecer y otra placa con inculo proveniente del cultivo en caldo selenito. (Si se sospecha de la presencia de S. Typhi o S. Paratyphi, inocule en paralelo placas de agar S.S. Modificado, Agar Sulfito Bismuto u otro medio recomendado y proceda segn indicaciones del fabricante). Incube el medio CromoCen AGN a 35 2 C por 18-24 h. Identifique Salmonella (excepto Typhi y Paratyphi) como colonias de color rosado intenso con bordes rosados. . Ejecute las pruebas serolgicas para la clasificacin. Procese los resultados.