Prctica 2

EXTRACCIN DE ADN GENMICO DE DIFERENTES FUENTES

Dra. Yenizey M. Alvarez

26.08.13

Introduccin
La extraccin y purificacin de los cidos nucleicos es el primer paso en la mayora de los estudios de Biologa Molecular. Para manipular o amplificar el ADN es necesario eliminar otros componentes celulares que pueden interferir con los experimentos como: protenas, ARN y lpidos.

Actualmente existen varios mtodos para la extraccin y purificacin de los cidos nucleicos, los cuales son seleccionados segn: El tipo de cido nucleico El organismo de donde se extraer El material de extraccin Los resultados deseados La posterior aplicacin 1.Amplificacin 2.Clonacin 3.Expresin

Es Importante Diferenciar dos Conceptos

Extraccin: sacar los componentes desde un compartimento celular. Involucra:
Lisis de las clulas que contienen a los AN Inactivacin de nucleasas Clarificacin: separacin de los AN de los restos celulares (debris).

Purificacin: Separacin de AN:

De protenas solubles De otros AN no deseados De Lpidos, carbohidratos De sales y otros compuestos orgnicos

Para muchas aplicaciones que involucran manipulacin de AN es necesario disponer de stos en estado puro.

Por qu purificar?
Nucleasas que se liberan al lisar las clulas degradan
los cidos nuclicos. Interferentes que inhiben a las enzimas que se usan en ingeniera gentica.
El desafo es separar los cidos nucleicos deseados desde una mezcla compleja, manteniendo la integridad de los AN
Contaminantes:

Protenas, lpidos y carbohidratos, sales del medio, iones, etc.

Etapas bsicas de un procedimiento general para Extraccin y Purificacin de AN

Disgregacin o fragmentacin del tejido

Lisis celular Estas etapas deben ir acompaadas de medidas o agentes que inactiven nucleasas celulares Durante todo el Clarificacin procedimiento se debe usar Purificacin soluciones y material estril, ademas Precipitacin de guantes

Cualitativo electroforesis

Anlisis

Cuantitativo espectrofotometra UV

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los AN purificados

Cantidad de material de partida
Nmero de copias de las molculas de AN Cantidad de tejido

Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado) Contaminantes en el material biolgico Hay un compromiso entre rendimiento/calidad/pureza

1. Mtodos de fragmentacin y lisis celular para la extraccin de AN

El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio (clulas o tejido) y la delicadeza requerida para preservar las molculas de inters (ADN o ARN).
Mtodos fsicos Homogenizacin mecnica, Homogenizacin en solucin Molienda manual en mortero Bolitas de vidrio Sonicacin Mtodos enzimticos
Lysozima: rompe enlaces -1.4- entre N-acetil murmico y Nacetil glucosamina de peptidoglucano de la pared celular de bacterias Lyticasa: rompe enlaces -1.3 de glucano de levaduras Proteasas: rompe enlaces peptdicos de pared y membrana plasmtica e interacciones clula-clula.

Mtodos qumicos Detergentes

2. Clarificacin. Eliminacin de restos celulares (debris)

Centifugacin Filtracin

Mtodo mixto: enzimas + centrifugacin

3. Purificacin
Desproteinizacin con fenol (denaturaliza protenas) Precipitacin de protenas con sales (salting out)
Cromatografa
De intercambio inico De adsorcin a slica De filtracin

Extraccin de DNA a partir de un gel de agarosa

Extraccin Fenlica de protenas

fenol

ADN total = ADN cromosmico = ADN plasmdico

Extraccin de ADN plasmdico

Los plsmidos utilizados en Ingeniera gentica se denominan vehculos o vectores y pueden ser utilizados para la clonacin y la expresin de genes, entre otras aplicaciones.
Protocolos de extraccin: La desnaturalizacin alcalina con SDS (dodecilsulfato de sodio), La precipitacin sal-SDS La ebullicin rpida.

Solucin I

(almacenadas a 4C)

Solucin II

(preparar antes de ser utilizada)

Solucin III

(almacenadas a 4C)

Purificacin

Cuantificacin de ADN por espectrofotometra

Concentracin de ADN puede ser determinada midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotmetro utilizando una cubeta de cuarzo.
Medidas tomadas a una A260 deben estar entre 0.1 y 1.0. Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a 50 g de ADN/mL
A260nm de DNA de cadena doble = 50 g / mL A260nm de DNA de cadena sencilla = 33 g / mL A260nm de RNA de cadena sencilla = 40 g / mL

Pureza de ADN:
Proporcin A260/A280

Proporcin indica pureza/presencia de contaminantes que pueden absorber luz UV (protenas, etc.)
ADN puro tiene una proporcin de 1.7-2.0 --en buffer ligeramente alcalino, pH 7.5 Proporcin A260/A230

A230 nm= Indica la presencia de sales caotrpicas o compuestos rganicos. Se desean proporciones mayores a 2.

Lecturas a 320 nm podran indicar si hay turbidez en la solucin posible contaminacin

A260/A280 =1.7-2.0 A260/A230 2 A230 nm= 0

Determinar el % de protena y ADN en la muestra

NanoDrop

Qu es la electroforesis?
La electroforesis en gel es una tcnica sencilla empleada de forma rutinaria en laboratorios para separar molculas biolgicas especialmente ADN, ARN y protenas.
Tipos: De frente mvil (en solucin) De zona (sobre un soporte)

En papel

Slice

Geles (a travs de una matrz porosa)

Agarosa

Poliacrilamida (DNA y protenas)

(DNA)

La movilidad del DNA depende de: Factores extrnsecos a la partcula [agarosa] o [poliacrilamida] Voltaje Buffer Tiempo Temperatura pH Factores intrnsecos a la partcula Relacin carga/masa

Conformacin
Tamao

[ ] Agarosa
Log(PM o Kbs)
% de agarosa 0,5% 0,7%

1%
a b

m
1,2%

mb>ma

A > % de agarosa la movilidad de la partcula disminuye

A > % de agarosa la resolucin de partculas de PM similar aumenta

Los fragmentos ms pequeos se mueven ms rpido y progresan ms lejos que los fragmentos ms grandes.

% agarosa poliacrilamida 0,5

Rango separacin 1-5 pb a 500 pb 700 pb a 25 Kpb

0,8 1 1,2 1,5

500 pb a 15 Kpb 250 pb a 12 kpb 150 pb a 6 kpb 80 pb a 4 kpb

Fragmentos grandes de DNA se corren en geles de agarosa de campo pulsante

Poliacrilamida
Alta resolucin NO para fragmentos grandes Difcil de armar

Agarosa
Baja resolucin (poros grandes) SI fragmentos grandes Fcil de armar Si el % es muy bajo el gel es frgil

Voltaje aplicado
Voltaje tpico = 10 V / cm de gel

Mejor resolucin

Voltajes menores (70 V)

(mxima resolucin fragm. > 2kb, se corre a 5 V / cm de gel)

Buffer de corrida

Composicin

TAE

Ms usado. No puede reciclarse mucho. Mayor capacidad buffer

TBE

Glicerol o ficol o sacarosa

Densidad a la muestra

Loading Buffer
Colorantes de corrida (ubicar frente de corrida) Azul de bromofenol (corre como DNA 300 pb)

Xylene Cyanol (corre como DNA 4000 pb) Orange G (corre como DNA 50 pb)

Equipo de Electroforesis de Agarosa

Bio-Rad
Cubetas de Electroforesis

Fuentes de Electricidad
Geles de agarosa preparados

PowerPac Junior

PowerPac Basic

PowerPac HC

PowerPac Universal

PowerPac 3000

Mini-Sub Cell GT

Wide Mini-Sub Cell GT

Electroforesis

Corriente
O O P O O Base

CH2

Azcar

O
O P O O CH2 Base
Bfer

Tinta Gel de agarosa

Azcar

OH

Fuente de Poder

Conformacin del DNA plasmdico

DNA circulares: 3 conformaciones posibles CA Circular abierto

Lineal

CCC + 0,6 a 1% agarosa

Circular covalentemente cerrado (superenrrollado)