Evaluacin de la cultura y la PCR-Mtodos de deteccin basados en Escherichia coli O157:H7 en carne molida inoculados

TERRANCE M. ARTHUR,* JOSEPH M. BOSILEVAC, XIANGWU NOU, AND MOHAMMAD KOOHMARAIE U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Roman L. Hruska U.S. Meat Animal Research Center, Clay Center, Nebraska 68933-0166, USA MS 04-602: Received 29 December 2004/Accepted 26 March 2005

ABSTRACT

Actualmente, varios procesadores de carne de emplear y mantener sistemas para un mayor control de la calidad de la carne molida. En tales Los programas, cada uno de los lotes de producto debe ser probado y negativo para Escherichia coli O157:H7 antes del lanzamiento del producto En el

comercio. Optimizacin de tres pruebas atributos (el tiempo de deteccin, la especificidad y la sensibilidad) es fundamental para el xito de Este tipo de estrategias. Debido a que la carne de vacuno molida es un producto altamente perecedero, la metodologia utilizada deber ser lo ms rpido posible. La prueba tambin debe tener una baja de falsos resultado positivo para que el producto no es innecesariamente descartadas. Resultados falsos negativos no Se puede

tolerar porque permitira que producto contaminado para ser liberado y potencialmente causar la enfermedad. En este estudio, dos Basado en la cultura y tres mtodos basados en PCR para detectar E. coli O157:H7 en carne de res molida se compararon por sus capacidades Para cumplir con los criterios arriba mencionados. Las muestras de carne picada, individualmente con cinco cepas genticamente distintas de E. coli O157: H7 en

concentraciones de 17 y 1.7 UFC/65 g y, a continuacin, objeto de las diversas metodologias de prueba. No haba ninguna diferencia (P >0,05 ) En la

capacidad de los mtodos basados en PCR para detectar E. coli O157:H7 en carne molida a 1,7 UFC/65 g. Basada en la cultura sistemas detectados ms

muestras positivas que el PCR de sistemas, pero los tiempos de deteccin (21 a 48 H) fueron por lo menos 9 h ms de los de los mtodos basados en PCR (7,5 a 12 h). Las muestras de carne picada tambin fueron adicionadas con Posiblemente las cepas de reactividad cruzada. La reaccin en cadena de la polimerasa de los sistemas que emplean una separacin inmunomagntica paso previo a la deteccin Produce menos resultados falsos positivos.

Introduccion

Tradicionalmente, la deteccin de agentes patgenos transmitidos por los alimentos h implicado Recogida de muestras, el enriquecimiento y el aislamiento de la Organismo objectivo de selectiva y/o indicador medios de comunicacin. Tales Basado en la cultura enfoques carecen de sensibilidad y especificidad Y llevan mucho tiempo, tomando de 48 a 96 h de la muestra Recopilacin de los resultados definitivos. La aplicacin de inmunomagn Separacin (IMS) ha aumentado en gran medida la Sensibilidad y

especificidad al mismo tiempo, disminuir el tiempo de deteccin (4, 24, 33). Recientemente, las tcnicas de PCR, tanto convencionales Y en tiempo real de las plataformas, se han aprobado para patgenos transmitidos por los Deteccin sistemtica de agentes alimentos (9, 2022). El

Tiempos de ejecucin rpida PCR habitualmente por reducir tiempos de deteccin 24 H. Escherichia coli O157:H7 es un patgeno que Ha sido

asociado con carne-, producir-, relacionadas con el agua y Los brotes de la enfermedad (15, 17, 28). Este patgeno, que es Conocido por su baja dosis infectiva y de su capacidad de causar Enfermedad grave y la muerte, se ha convertido en una amenaza en los alimentos La dcada de 1980 y principios de 1990 (27, 31). Debido a que las primeras brotes Estaban asociados con la carne molida, el Departamento de La agricultura Servicio de Inspeccin e

Inocuidad de los alimentos producidos Varios reglamentos encaminados a eliminar este patgeno del Carnes rojas (32). Al mismo tiempo, el sector

pblico como en el privado Los sectores de la elaboracin de la carne de vacuno industria estaban trabajando para Disear, validar y aplicar diversas intervenciones antimicrobiana Para su uso en la lucha contra E. coli O157:H7 contaminacin (7, 16, 26.) Por desgracia, no hay una nica intervencin o Combinacin de las intervenciones se han determinado que Va a eliminar E. coli O157:H7 en la carne bovina, y espordicos beefassociated Los brotes se han seguido produciendo. La industria para (6). de la carne ha empleado del producto recientemente que contiene cada prueba-yE. lote coli de

Sistemas O157:H7

evitar En

liberacin dicha

prueba-y-programas,

Producto se ha probado para el caso de E. coli 157:7 y, si los resultados son El producto puede ser puesto en libertad en el comercio. Optimizacin De los mtodos de prueba con respecto al tiempo de deteccin, Especificidad y sensibilidad es de importancia crtica para el xito de esas Las estrategias. Debido a que la carne de vacuno molida es un produto altamente perecedero, La metodologa de las pruebas utilizadas deben ser lo ms rpido posible. La prueba tambin debe tener una baja tasa de falsos positivos Los resultados de modo saludable producto innecesariamente no es descartado. Resultados falsos negativos no se puede tolerar porque Permitira que producto contaminado de ser liberado, potencialmente Causar enfermedad y derrotar a los efectos del programa. En este estudio, basado en la cultura y tres basado en PCR Mtodos para detectar E. coli O157:H7 en carne molida se Con respecto a (i) su capacidade de muestra capacidad y tiempo

Requisitos para el procesamiento de las muestras y la deteccin, (ii) su Especificidad de discriminar entre E. coli O157:H7 y Otros miembros de la flora, y (iii) su sensibilidad Deteccin de E. coli O157:H7 en suelo inoculado La carne en concentraciones bajas.

FIGURE 1. Flowchart outlines the methods by which samples were inoculated, incubated, and processed for detection of E. coli O157:H7. Bold headings indicate the official methods tested. Pathways not ending in a bold heading were used in the data correction process to identify samples that had been inoculated.

Material y metodos Escherichia coli O157:H7 en carne molida. Cinco Mtodos para la deteccin de E. coli O157:H7 en carne molida se Evaluacin de la sensibilidad y la

especificidad (Fig. 1). Muestras de cada lote (600 G de 80% magro de ternera picada) fueron inoculados com cada Las cepas de E. coli O157:H7 y, a

continuacin, dividido en porciones Para su uso con cada uno de los mtodos para minimizar la variacin en las muestras o Las condiciones de Hruska de

procesamiento. Para los mtodos basados en PCR, Roman L.

Investigacin de Animales para Carne (MARC) personal Fueron capacitados para realizar las distintas pruebas de los representantes de La empresa que ha diseado cada kit de prueba. Todas las pruebas se Llevado a cabo en MARC con carne picada comprada a local Los minoristas. Sensibilidad de E. coli 157:7. Carne molida (80% pobre) Se enriquecern con aproximadamente 17 o

1.7 UFC/65 g (equivalente A 100 o 10 UFC/375 g), tanto para PCR y basado en la cultura Los procedimientos. Las cepas. La sensibilidad de los ensayos, cinco cepas de E. coli O157: H7 (55AC1, 114AC1, 131AC1, AC1, 237 y

299AB3) desde el MARC Unidad de Investigacin de Carne (MRU) coleccin de cultivos fueron utilizados Para inoculacin de muestras individuales. Estas cepas son genticamente Diferente uno del otro y representan los principales subtipos dentro Relacin con tres grupos identificados por electroforesis en campo pulsado (PFGE) anlisis de E. coli O157:H7 aislamientos provenientes de Las plantas de procesamiento de carne (1, 3). Material congelado de las cepas fueron Elaborado por inocul caldo trptico de soja (TSB; Difco, Becton Dickinson, Sparks, Maryland ) y cada vez ms las culturas en la noche 37C. Los cultivos fueron en serie diluido en agua de peptona (BPW; Difco, Becton Dickinson), estriles 50% (vol/vol) glicerol (Sigma, St. Louis, Mo. ) fue aadido a una concentracin final de 15% (Vol/vol), y las culturas se congelaron en 70C hasta su uso. Inoculation. Para una concentracin final de 1,7 o 17 E. coli O157:H7 UFC/65 g de carne molida de res, un volumen adecuado era Extrado de un recin descongelado glicerol que contenga aproximadamente 103 UFC/ml de la E. coli O157:H7 y Aadir a 45 ml de BPW. Las acciones fueron, a continuacin, chapado en las culturas (50 Ml) por duplicado en agar trptico de soja (Difco, Becton Dickinson) Para una enumeracin de las placas el inculo. Las muestras (600 g) de refrigeracin Carne de res molida

obtenidos de diversos minoristas locales fueron Coloca en 3.500 ml bolsas Stomacher nonfilter (BA 6042, Seward, Worthington, REINO UNIDO).

Inoculado BPW (45 ml) a continuacin se aadi a Las bolsas, que estaban completamente mano masaje y, a continuacin, estomago A 190 rpm durante 30 s. Despus de los 600 g de carne de res molida se Lotes inoculados, 65- o 375-g se tomaron muestras y se procesa De acuerdo a los distintos protocolos mtodo. Mtodos de deteccin. En el momento de la evaluacin, todos los Mtodos basados en PCR a prueba en ensayos previos fueron su final Las fases de validacin antes de entrar en el mercado minorista. LightCycler E. coli (eae) Kit de deteccin. Las sondas, primers, Y el mtodo de este juego fueron diseados por Marshfield Clinic Laboratorios, Servicios de Seguridad Alimentaria (Marshfield, Wis. ; comercializados por Roche Applied Science, Indianapolis, Indiana). Este mtodo fue Evaluado con 375 g de carne picada

(de acuerdo con loespecificado por el fabricante). Tambin hemos realizado las pruebas con 65-g las muestras a fin de permitir la comparacin Con otros procedimientos que especifican 65-g muestras. Para el 65-g, 70 g de carne picada (65 g de suelo La carne y 5 ml de inculo de BPW) fue retirado de la Lote bolsa inoculacin y se colocan en un 1.650 ml stomacher filtro Bolsa (B01318, Nasco bolsas whirlpack , Fort Atkinson, Wis. ), y 275 ml De BPW (precalentado a 37C) fue agregado a la bolsa. La muestra Era estomago a 230 rpm durante 30 s y se incuba a 37C con Sacudir a 125 rpm durante 4 h. Despus de 4 h, ca. 250 Ml de cada Muestra fue sacada por el filtro en un nuevo filtro 1.650 ml Bolsa stomacher. Las nuevas bolsas de toma de

muestras se colocaron en Matrix/Pathatrix Calentamiento (Matriz microcincia asociado con potes, Golden, Colorado), Que ha sido calentada a una

temperatura de 37C. El aparato fue Pathatrix Inserta en la bolsa en el lado opuesto del filtro de que En caso de que la muestra fue vertida. Cincuenta microlitros de la matriz anti- Perlas inmunomagnticas O157 se ha aadido al tubo conector, Y las muestras fueron reciclados para 1 h de 37C. Las cuentas fueron A continuacin, recogidos, lavados y resuspendidas en 100 ml de BPW. ADN Se extrajo de la 100-ml cordn de suspensin celular utilizando el Magna puro instrumento LC (Roche Applied Science). Tres microlitros Del ADN

extrado fue utilizado en la PCR En el Instrumento LightCycler (Roche Applied Science). Siguiente Coleccin cordn, la muestra se incubaron bolsas en la noche 37C. Al da siguiente por la maana, las bolsas de toma de muestras se procesaron por IMS y el enchapado de acuerdo con los procedimentos estndar IMS MRU. Para el 375-g, 403 g de carne molida (375 g de Carne de res molida y 28 ml de BPW del inculo) se ha eliminado De la bolsa y se coloca en un 3.500 ml filtro bolsa Stomacher (123 010, Bagpage 3500,

Interscience, Weymouth, Massachusetts, y de 1 litro De BPW (precalentado a 378C) fue agregado a la bolsa. La muestra Estmago fue de 190 rpm durante 30 s y se incuba a 378C con Sacudir a 125 rpm durante 4 h. Despus de 4 horas, dos ca. 250ML De cada muestra se echaban a travs del filtro en dos 1.650 Ml stomacher bolsas filtro. La nueva muestra se colocaron bolsas En Matrix/calentamiento Pathatrix pots (precalentado a 378C). El Pathatrix Aparato se inserta en cada bolsa en el lado opuesto El filtro de que en la que la muestra fue derramado. Cincuenta microlitros Matriz de anti-O157 perlas

inmunomagnticas fue aadida, Y las muestras fueron reciclados para 1 h de 378C. Las cuentas fueron Lavado con BPW y, a continuacin, procesa de acuerdo a la luz- Ciclador E. coli (eae) Kit de deteccin. Cuando la evaluacin se realiza el software de automatizacin Determinacin de resultados positivos o negativos no estaba disponible En este juego; por lo tanto, los resultados fueron interpretados por los Operador en funcin de protocolo del ensayo. Muestras positivas amplificacin Las seales y las curvas de fusin con picos de aproximadamente 63C fueron considerados positivos. GDS Garanta para E. coli 157:7, 6.5 - y 8-h mtodos. Para el aseguramiento de GDS (biocontrol Systems, Inc. , Seattle Washington ), 70 g de carne picada (65 g de carne molida y BPW 5 ml de inculo) se ha retirado de la inoculacin por lotes Bolsa y se colocan en un filtro 1.650 ml bolsa Stomacher (B01318, La OCSAN bolsas whirlpack ). EHEC8 media (27,6 g; Biocontrol sistemas) Y 290 ml de agua estril (calentada a una temperatura de 428C) se aade a la Bolsa stomacher, la muestra fue estomago a 230 rpm durante 30 s, Y los restantes 290 ml de agua estril (calentada a una temperatura de 428C) Para un volumen final de 580 ml de medio. La bolsa era parte Un masaje y se incuban a 428C durante 6,5 h y, a continuacin, 1 ml de Cada una de las muestras se retir a una profunda de bloque (cada uno as que contengan 20 Ml de la muestra

preparacin reactivo). Las bolsas de muestreo Fueron devueltos a incubacin a 42C. El profundo de bloque fue Sellada y procesada de acuerdo a la

garanta GDS para E. coli O157: H7 protocolo como escrito. Reactivo de preparacin de muestras (20 ml) se mezcl con cada 1 ml muestra en el bloque de pozo profundo y el bloque era agit a 900 rpm por 5 minutos muestras fueron entonces procesado por IMS usando la partcula magntica de ocho canales de PickPen dispositivo de separacin. Se resuspendi immunobeads recuperados en 25 ml de tampn de resuspensin (BioControl Systems). Veinte microlitros de la mezcla de resuspensin ha sido aadido a 5 ml de la polimerasa (BioControl Systems) solucin tampn y cargan un sistema PCR en tiempo real Rotor-Gene 3000 BAX Sistema prueba de PCR para detectar E. coli 157:7, MP mtodo. Para el BAX E. coli O157:H7 MP mtodo (DuPont Qualicon, Wilmington, Del. ), 70 g de carne picada (65 g Carne de res molida y 5 ml de inculo BPW) fueron eliminados de El lote bolsa inoculacin y se colocan en un 1.650 ml stomacher filtro Bolsa (B01318, Nasco bolsas

whirlpack ), y 580 ml de BAX medio (Precalentado a 428C) fue agregado a la bolsa. La muestra fue estomago A 230 rpm durante 30 s e incubadas a 428C durante 8 h. Despus de 8 H, 5 ml de cada muestra y enriquecimiento lisadas De acuerdo con el binomio bax protocolo. Despus lisis, 50 ml de lisado celular Se ha agregado a la pastilla liofilizada PCR reactivo y cargado en El sistema BAX cycler/detector instrumento. Los resultados se obtuvieron Con el sistema BAX T1,70 paquete de software. MRU mtodo estndar. Despus de las alcuotas para el BAX E. Escherichia coli O157:H7 prueba MP fueron retiradas, el enriquecimiento fueron devueltos A incubacin a 428C durante 4 h (en un total de 12 h A 428C) y, a continuacin, celebr en 48C por una noche. Al da siguiente por la maana, Las bolsas de toma de muestras se procesaron en el IMS y el enchapado de acuerdo con MRU procedimientos estndar IMS. EL IMS se realiza para recuperar E. coli O157:H7 basado en un mtodo descrito previamente (2). Uno Mililitro de enriquecimiento fue aadido a 20 ml de anti O157 inmunomagn Cordones (Dynal, Lake Success, N. Y. ) en 1,5 ml

microtubos Y girarse para 30 min. Las cuentas fueron mantenidos en su lugar por un Imn mientras el sobrenadante fue eliminado. Las cuentas fueron, a continuacin, Lavarse tres veces consecutivas con 1 ml de tampn fosfato Salina ms 0,1 % de Tween 20 (PBS-Tween; Sigma) y resuspendido En 100 ml de PBS-Tween. Despus IMS, E. coli O157:H7 cuentas fueron Difusin directamente en (i) ntRainbow mediano, que es la de Arco Iris Agar (Biolog, Inc. , Hayward, Calif. ) complementado con novobiocina (20 Mg/l; Sigma) y telurito de potasio (0.8 mg/l; Sigma), Y (ii) ctSMAC, sorbitol agar MacConkey (Becton Dickinson) suplementado con cefixima (0,05 mg/litro; Dynal) y Telurito de potasio (2.5 mg/litro; Dynal). Pathatrix. El mtodo de cultivo Pathatrix microcincia asociado con (Matrix) Se puso a prueba en colaboracin con la E. coli LightCycler (eae) Mtodo basado en la PCR y por lo tanto, el protocolo utilizado es diferente de La proporcionada por el fabricante. Cuatrocientos tres gramos de Tacon de carne molida (375 g de carne molida y 28 g de BPW de Inculo) se ha retirado de la inoculacin por lotes y bolsa En el 3.500 ml bolsa Stomacher filtro (123 010; Bagpage 3500, Interscience), Y 1 litro de BPW (calentada a una temperatura de 378C) fue aadido aLa bolsa. La muestra fue de 190 rpm estomago durante 30 s, Se incuba a 378C con agitacin a 125 rpm durante 4 h.

Despus 4 H, ca. 250 Ml fue vertida a travs del filtro en un 1.650 ml Filtro bolsa Stomacher, y de las nuevas bolsas de muestras se colocaron en Matrix/calentamiento Pathatrix pots (precalentado a 378C). El Pathatrix Aparato se inserta en cada bolsa en el lado opuesto de la Filtro de la muestra donde se vierte, y 50 ml de la matriz Anti-O157 perlas inmunomagnticas se aadi en el conector Tubos. Las muestras fueron reciclados para 1 h de 378C, y, a continuacin, Las cuentas fueron lavados y chapado en ctSMAC y directamente a nt- Arco Iris placas de agar. Especificidad para E. coli 157:7. Un subconjunto de la cepa MRU Coleccin fue proyectado en cultivo puro usando slo la deteccin Parte (no IMS) del basado en PCR para identificar sistemas de deteccin Las cepas que se reconoce como E. coli 157:7. Para Este experimento, cultivos puros fueron cultivadas en el TSB y noche A

continuacin, diluido en BPW a 104 UFC/ml . Una parte de la diluida Las muestras se utiliz para la deteccin. Una vez que la reaccin cruzada cepas fueron identificadas, material congelado De las cepas se realizan de la manera descrita para el caso de E. coli 157:7. Experimentos de Deteccin completa la punta y los procesos Las muestras de carne picada se llevaron a cabo para determinar si el Medios de crecimiento o de la separacin inmunomagntica fase Evitar la deteccin de falsos positivos de estas cepas. Los experimentos Se llevaron a cabo utilizando mtodos similares a los descritos Para 157:7. Para estos experimentos, el inculo se agreg en 17 UFC/65 g (100 UFC/375 g).

Las estadsticas. Los diversos resultados de la prueba fueron comparados en dos-cabodos Tablas de contingencia con la prueba de chi-cuadrado de

estadstico SAS Versin de software 6.12 (SAS Institute, Inc. , Cary, N. C. ).

RESULTS

Sensibilidad de E. coli 157:7. Antes de la inoculacin Experimentos, cultivos puros se pusieron a prueba, y todos los Pruebas evaluadas en este proyecto identific correctamente los cinco Genticamente distintas E. coli O157:H7 las cepas utilizadas en este realiza para evaluar Estudio. El primer conjunto de experimentos se

La capacidad de las pruebas para detectar E. coli

O157:H7 que se haban Han sido inoculados en carne molida de 17 UFC/65 g (100 UFC/375 g). Las pruebas evaluadas en estos experimentos fueron El LightCycler E. coli (eae), GDS Garanta 6,5 h, URM, Y Pathatrix. El binmio bax E. coli O157:H7 MP no se Disponible en el momento en que estos

experimentos se llevaron a cabo, de modo que Que no se evalu en esta inoculacin concentracin. Todos De los mtodos evaluados detect el

100% de las muestras Inoculados con E. coli O157:H7 en la 17 UFC/65 g (100 UFC/375 g) concentracin (Tabla 1). evaluaron mediante El lmite inferior de deteccin se

Carne molida inoculadas con 1,7 UFC/65 g (10 UFC/

375g). El LightCycler E. coli (eae) fue el nico que se de Que el tamao de la muestra, 375 g, se ha especificado por el Fabricante. Los otros mtodos se permite al usurio determinar La cantidad de la carne utilizada en una muestra. Secundariamente Gramos fue elegido como el tamao de la muestra a ser evaluado Ya que se trata de un importe comnmente utilizados en la

elaboracin de la carne de vacuno Industria para el anlisis de los productos. Porque 65 g no fue La cantidad especificada para el LightCycler E. coli (eae), Esta prueba se realiz con 65- y 375-g muestras. Este enfoque ha permitido hacer comparaciones directas sobre La sensibilidad de todos los mtodos en idnticas condiciones. realizar De la inoculacin (65-g muestras), aunque tambin

Las pruebas de acuerdo a las instrucciones del fabricante (375-g

Muestras). Tres de PCR se evaluaron las pruebas en esta concentracin baja

De inculo. La seguridad se evalu de GDS Con 6,5 y 8 -h enriquecimento veces. La Garanta GDS 6.5 -h mtodo identificado 56 (41%) de tacon 136 Las muestras positivas para E. coli O157:H7 (Tabla 2). Despus de 8 H de incubacin, el nmero de muestras se determinaron que se Positivo aument a 77 (57%) de 136. El binomio bax E. coli O157: H7 prueba MP fue capaz de detectar E. coli O157:H7 en 76 (57%). De 134 muestras adicionadas. Para el LightCycler E. coli (eae) Evaluado utilizando 65-g las muestras, 82 (65%) de 126 muestras adicionadas Se consideraron positivos para E. coli 157:7. No existe No hubo diferencia significativa (P. 0.05 ) Entre el binomio bax E. coli O157:H7 MP, GDS 8 h, o LightCycler E. coli (eae) las pruebas de la

capacidade de detectar E. coli O157:H7 Inoculadas con 1,7 UFC/65 g con 65-g muestras. Cuando el LightCycler E. coli (eae) prueba se evalu sobre la mayor 375-G muestras inoculadas con la misma concentracin, casi Todas las

muestras (56 de 57, 98%) fueron identificados como positivos Para el caso de E. coli 157:7. Cultura dos pruebas basadas Tambin fueron evaluados en esta inoculacin Concentracin. Con el mtodo Pathatrix, 56 (98%) de tacon 57 375-g las muestras resultaron positivas para E. coli 157:7, Mientras que con el mtodo MRU, E. coli O157: H7 fue aislado de 105 (78%) de 134 pas 65-g muestras. Especificidad para E. coli 157:7. Habida cuenta de que el aislamiento y Confirmacin de la bacteria no es una parte primordial de PCRbased testing, la especificidad de estas pruebas es muy importante. especificidade se evalu en dos partes. En primer lugar, La

Slo la parte de

deteccin de cada mtodo se utiliz para Pantalla de 68 cultivos puros noO157:H7 las cepas de E. coli. Este grupo de cepas contenan tanto no toxica y Shiga E. coli productoras de toxinas (Tabla 3). Dos O55:H7 cepas de la

reaccin de PCR los tres

Las pruebas. Tres cepas O145:NM de reaccionaron con tanto El LightCycler E. coli (eae) y la garanta GDS pruebas. Tres de los cuatro O103:H2 de las cepas reaccionaron en el LightCycler E. coli (eae) prueba. Ninguna de las otras

cepas Probado, incluidos siete E. coli O157 los serotipos distintos de H7, produjo resultados positivos en alguna de las pruebas evaluadas. Para la segunda fase de la evaluacin de la especificidad, un subconjunto cepas que fueron identificadas como de reactores de De las

La primera fase se

inocularon en carne molida y procesada A lo largo de todo el protocolo de pruebas. Este paso fue Para determinar si los medios o IMS Modalidades particulares de un determinado mtodo, impiden a los no- O157:H7 bacterias de generar seales positivas. El O55:H7 muestras no producen seales

positivas en los dos Mtodos que emplean EL IMS, el LightCycler E. coli (eae) y La garanta GDS, pero no producen seales positivas en el BAX E. coli O157:H7 MP (Tabla 4). Tanto el BAX E. coli Garanta pruebas positivas O157:H7 MP y en el GDS

Los resultados de una de las cuatro muestras

adicionadas con O145:N. m. Las dos muestras resultados positivos no eran de El mismo muestra inoculado. Ninguno de los O103:H2-con pas Muestras produjeron resultados positivos en ninguna de las pruebas. Ocho

Nonspiked muestras tambin fueron procesados. Una de estas muestras Genera una seal positiva en el BAX E. coli O157: H7 MP ensayo. Tiempo de deteccin. Deteccin mnimo aproximado Tiempos de los mtodos basados en PCR fueron 7,5 , 9 y 12 h de El LightCycler E. coli (eae), GDS Garanta (8-h), BAX y E. coli O157:H7 MP, respectivamente. Estos tiempos son mnimas

porque slo cuenta para Los tiempos de los mecanizados individuales y no muestra Manejo entre los pasos. La garanta GDS y BAX E. Escherichia coli O157:H7 MP mtodos implican una mnima manipulacin de la muestra, Mientras que el LightCycler E. coli (eae) mtodo requiere Mucho ms. Durante el perodo de prueba Anterior a esta evaluacin, una segunda filtracin fue encontrado De ser necesario antes de la IMS procedimiento tanto para el Recuperacin En las

LightCycler E. coli (eae) y mtodos para asegurar Pathatrix

adecuada de los cordones siguientes IMS. Esta desviacin instrucciones del fabricante fue incorporado Durante esta evaluacin.

Tiempo de deteccin es tambin una funcin de la muestra. El LightCycler E. coli (eae) mtodo est limitado a cinco muestras Por instrumento durante el IMS paso y 32 muestras Por instrumento para la extraccin de ADN y pasos de deteccin. El mtodo GDS Garanta puede manejar fcilmente 96 muestras En el IMS y la extraccin de ADN, con la deteccin Instrumento aceptando ya sea 36 o 72 muestras en funcin de Modelo de instrumento. El binomio bax E. coli O157:H7 mtodo MP No tiene un IMS paso y puede alojar hasta 96 Agregar al

Muestras por instrumento de deteccin. La cultura de mtodos menos 9 h. a la hora de deteccin. El Pathatrix muestras por instrumento al IMS Paso.

Mtodo se limita a cinco

DISCUSSION

Pruebas patgeno se ha utilizado durante mucho tiempo en la produccin de alimentos Entornos como un medio de proceso y control de calidad, El

Seguimiento de fuentes de contaminacin, regulacin y supervisin

cumplimiento. Los mtodos utilizados han evolucionado como Ms sensible y rpida tcnicas disponibles. Actualmente, vrios procesadores de carne estn empleando test-andhold Estrategias como medida adicional para asegurar que la contaminacin Producto no est disponible en el comercio (6). Tal Sistema requiere pruebas rigurosas para el cumplimiento de sus objetivos. El Mtodos de ensayo (i) debe ser rpida, debido a que la carne de vacuno molida es Un producto muy perecedero, (ii) debe tener un bajo nmero de Resultados falsos positivos para asegurar sana no es producto Innecesariamente descartadas, y (iii) no debe tener falsos negativos Los resultados, lo que ira en contra de la finalidad de ese sistema. La ms importante de estas cuestiones es la de falsos negativos Los resultados Los falsos negativos pueden ser de dos formas. En primer lugar, una prueba no puede detectar un determinado subtipo de E. coli 157:7. Una amplia gama de variabilidad gentica ha sido En E. coli

O157:H7 cepas (1, 12, 18, 19). Por lo tanto, la gentica de las pruebas puede centrarse en un objetivo que No est presente en todas O157:H7. Cinco E. coli O157:H7 Las cepas fueron utilizadas en la sensibilidad experimentos en el presente Estudio. Estas cepas anteriormente estaban decididos a ser Genticamente diferentes una de otra en funcin de los resultados obtenido de PFGE (1). Las cepas fueron aisladas de las muestras recogidas Comercial de ganado vacuno en varias plantas de procesamiento y representan Principales subtipos dentro de los tres grupos derivado relacin De la PFGE escribiendo de un total de 343 E. coli O157:H7 Cepas (1, 10). Las cinco cepas fueron detectados correctamente por Cada una de las pruebas evaluadas en este estudio. El segundo tipo de resultado falso negativo no es as Define y

proviene de mtodos de ensayo en el que la sensibilidad Es simplemente insuficiente para la aplicacin en la que O157:H7 tiene una baja infecciosas El mtodo que se utilice. E. coli

Dosis; una dosis tan baja como 100

organismos ha sido considerado Suficiente para causar la enfermedad (30,

31). Por lo tanto, los diversos

Mtodos de ensayo deber ser capaz de

detectar menos de 100 organismos Por muestra. En este estudio, se evaluaron las pruebas de Su capacidad para detectar E. coli O157:H7 en

concentraciones de 17 Y 1,7 UFC/65 g, donde una tpica dosis ingerida Ser inferior a las 100 UFC dosis infecciosa. Estas concentraciones De inculo son equivalentes a 30 3 UFC y UFC, Respectivamente, de 0,25 libras (0,11 kg) de carne molida. Los resultados Indicar que a los 17 UFC/65 g todos los mtodos ensayados fueron Capaz de detectar E. coli O157:H7 100% del tiempo. La sensibilidad los experimentos que se describen aqu se realizaron Com

muestras adicionadas. Al evaluar los mtodos de corta Veces enriquecimiento, la naturaleza del inculo se vuelve muy Importante. Las muestras deben ser adicionadas con un inculo que Reproduzca exactamente las caractersticas de crecimiento bacteriano, especialmente La fase lag, que se encuentra en la naturaleza Muestras contaminadas. Suponemos que con un inculo Que fue congelada en 2708C de una fase estacionaria cultura Es un buen

representante; sin embargo, incluso el mejor representante Pueden diferir de un contaminante natural en algunos aspectos. Las pruebas tambin fueron evaluados en una concentracin ms baja De inculo, 1,7 UFC/65 g. Con la ayuda de 65 g de muestra, el PCRbased Mtodos fueron similarmente

sensibles. La Garanta GDS 8 h y la BAX E. coli O157:H7 MP las pruebas correctamente Detectado O157:H7 en el 57% de las muestras, mientras que el porcentaje LightCycler correcto de E. coli (eae) resultados de la prueba fue Ligeramente superior al 65 %. La eficacia de estas pruebas podran Ser el resultado de el volumen efectivo que se utiliza en la deteccin Parte del

mtodo. Para el BAX E. coli O157: H7 MP mtodo, que no utiliza un IMS paso, slo 1,25 Ml del enriquecimiento es en realidad coloca en el tubo PCR. La garanta LightCycler GDS y E. coli (eae) IMS mtodos emplean un paso que concentra el objetivo Las clulas y presenta un mayor volumen efectivo de enriquecimiento Muestra para la deteccin. La garanta GDS sistema realiza IMS 1 ml de muestra de enriquecimiento, mientras que el LightCycler E. coli (eae) mtodo utiliza 250 ml, lo que conduce a Volmenes de muestra efectiva de 0,8 y 83 ml, respectivamente. De los tres de deteccin basado en el PCR, la LightCycler E. coli (eae) fue el nico mtodo que no

Tener un sistema automatizado para la determinacin de positivo o

Resultados negativos; la determinacin se deja al arbitrio del operador. Este Enfoque no puede ser totalmente objetivo y puede haber introducido Sesgo, ya sea positivo o negativo, en los resultados. Por lo tanto, los resultados que aqui se reportan para esta prueba podra ser Mayor o menor de lo que habran sido con automatizado Determinacin. La MRU mtodo tambin se evalu con un inculo De 1,7 UFC/65 g con 65-g muestras. E. coli O157:H7 Fue detectado en el 78% de las muestras. La mayor deteccin Para este mtodo se pueden atribuir a la Largo tiempo de enriquecimiento. Cuando se analizaron muestras de 375-g, ambos el LightCycler E. coli (eae) y los mtodos de Pathatrix identificados correctamente 98% de las muestras como algo positivo. La muestra ms grande tiene ms clulas del patgeno en una concentracin del inculo dado, llevando con una mejor oportunidad ser detectado ese O157: H7 Para los inculos a bajas concentraciones (1,7 UFC/65 g), es Dificultades para asegurar que todas las muestras han sido inoculadas. Por lo tanto, hemos incluido un factor de correccin de datos, teniendo En cuenta slo las muestras que podra ser confirmado como

Inoculados. Para cada tipo de mtodo, un segundo mtodo de deteccin Fue empleado en la misma muestra para determinar enriquecimiento Cuntas de las muestras que no fueron positivos por El original mtodo de deteccin fueron inoculadas y se No por una razn u otra. Por ejemplo, 82 (65%) de los 126 LightCycler E. coli (eae) 65-g muestras Fueron positivos mediante la prueba de PCR. Las 44 muestras negativas fueron Adems

incubados durante toda la noche y, a continuacin, procesado por IMS y plateado (Fig. 1). De las 44 muestras, 25 fueron positivos por deteccin de cultura. Por lo tanto, 107 de las muestras fueron positivas por anlisis de PCR o cultura, lo que indica que por lo menos 107 las muestras fueron inoculadas y dando 82 de 107 o 77% (tabla 2) para el correccin porcentaje de muestras positivas. El Enriquecimientos Assurance GDS se manejaron en un similar moda. Para el BAX E. coli enriquecimientos MP O157: H7, las muestras fueron quitadas para ensayo PCR a las 8 h y el enriquecimento las culturas se incubaron otro 4 h a 428C y celebrada en 48 C durante la noche. Estas culturas enriquecimiento eran entonces utilizado para el procedimiento MRU. Mediante el anlisis de cada muestra por dos mtodos diferentes, fue posible determinar una absoluta nmero mnimo de muestras que recibi clulas en el

procedimiento de inoculacin. Aunque debera haber ninguna diferencia en la distribucin de muestras verdaderamente inoculadas entre los mtodos individuales, este enfoque proporciona un mnimo (datos corregidos) y mximo (total) nmero de muestras inoculadas para evaluacin. Podra ser slo 105 de las 136 muestras Assurance GDS confirmado como inoculados, corregida conduce a resultados positivos de 53 y 73% para las incubaciones de 6,5 y 8 h, respectivamente. No todas las muestras podran ser confirmadas como Inoculados Para el BAX E. coli O157:H7 MP y enriquecimientos, MRU A

corregir los resultados positivos de 66 y 91 %, respectivamente. Porque slo el LightCycler 107 de E. coli (EAE) 65-g de muestra enriquecimientos se

confirmaron como inoculados, El porcentaje de resultados positivos se corrigi al 77 %. Inoculacin de todas las 375-g muestra enriquecimientos Se

confirma, por lo que no es preciso corregir. Estos datos deben interpretarse con cierta Precaucin, porque el resultado final est muy influida por la El test del

Capacidad de la secundaria para detectar E. coli 157:7. Si

secundario es considerablemente menos sensibles para detectar 157:7, La correspondiente prueba principal tendr una mayor Corregida sensibilidad de lo que sera si todos los secundarios Las pruebas tienen la misma sensibilidad. Especificidad para E. coli 157:7. Varios basado en PCR Mtodos de deteccin de E. coli O157:H7 han sido desarrollados Previamente, en el sentido de que los genes de la toxinas Shiga o El antgeno O157 (8, 13, 14, 23, 25). Sin embargo, estos objetivos No son especficos de E. coli 157:7 y pruebas con tal Los objetivos tienen altas tasas de falsos positivos (5, 11). En Esta evaluacin, las tres pruebas determinaron las secuencias diana En el E. coli O55:H7. Este resultado no es sorprendente Porque el serotipo O55:H7 se cree que es el precursor Gentica y la ms cercana relacin con el serotipo O157:H7 (11, 29). El Secuencia de ADN objetivos para el aseguramiento y GDS LightCycler E. coli (eae) las pruebas se encuentran en uno y dos Otros serotipos,

respectivamente. Ambos de estos serotipos E. coli Producen toxina Shiga y sus genomas puede ser gran homologa Con la de serotipo 157:7. Slo porque una cepa posee el objetivo del ADN para el Aseguramiento de GDS o no hace pruebas LightCycler E. coli (eae) es decir que estas pruebas producir resultados falsos positivos. Prior para la deteccin, estos dos mtodos de emplean a un paso IMS, que dirige el antgeno O157. En teora, este paso

sera evitar todas las cepas excepto aquellos expresan el antgeno O157 de estar presente en la reaccin final de deteccin. En realidad, puede haber algn enlace inespecfico que permite no Cepas O157 para pasar a travs, como ocurri en 1 de 12 corridas para los GDS de aseguramiento de la prueba pero no ocurri nada para el Pruebas de LightCycler Escherichia coli (eae). Porque el BAX E. coli Mtodo O157: H7 MP no emplea a un paso IMS, all no es un proceso para evitar que Cruz-reaccionando cepas productoras resultados falsos positivos. El MP BAX E. coli O157: H7 prueba tambin fue el nico de los cinco mtodos que dio un resultado positivo para un control negativo nonspiked. Ocho tales las muestras fueron incluidas para cada prueba. La causa de este falsopositivos resultado es desconocido. El ltimo factor del anlisis es el tiempo de deteccin, es decir, El tiempo que le toma a una

muestra que se va a ejecutar y el nmero de Las muestras que se pueden procesar en un momento dado. Tanto de la Basado en la cultura, mtodos y MRU Pathatrix, son considerados Largo por el largo perodo de incubacin necesario para Las placas de agar. La reaccin en cadena de la polimerasa mtodos basados en tiempos similares, Especialmente si la muestra de tiempo de manipulacin. La Garanta GDS y BAX E. coli O157:H7 MP muy Muestra poca entrega, pero que no es el caso de la LightCycler E. coli (eae) mtodo, lo que supone una importante Manipulacin de la muestra antes y despus de la IMS. Rendimiento de la muestra es un motivo de preocupacin para los procesadores de carne que Han multilot protocolos de muestreo. El LightCycler E. coli (EAE) y Pathatrix mtodos estn limitados a cinco muestras por La mquina en el IMS, as varias unidades son necesarios para Rendimiento apreciable. El LightCycler E. coli (eae) Mtodo tambin est limitada a 32

muestras por mquina para el ADN prep y pasos de deteccin. La muestra de la capacidad Assurance GDS y BAX E. coli O157:H7 MP mtodos Slo estn limitadas por el paso de deteccin. La garanta GDS Sistema puede manejar 36 o 72 muestras, dependiendo de la muestra Rotor utilizado y la BAX E. coli O157:H7 sistema acepta 96 Muestras. En la ponderacin de los tres factores, el PCR based systems Todos tenan rendimiento comparable. Hay ventajas para Cada uno de los sistemas, pero nada de lo que est firmemente colocado un sistema de Los dems. Basada en la cultura sistemas eran ms sensibles,

Pero los tiempos de deteccin (de 21 a 48 h) fueron por lo menos 9 h. ms Que los de los mtodos basados en PCR (7,5 a 12 h).

ACKNOWLEDGMENTS The authors thank Julie Dyer, Ann Goding, Bruce Jasch, Frank Reno, Greg Smith, and Shanda Watts for technical support and Carol Grummert for secretarial assistance. REFERENCES 1. Barkocy-Gallagher, G. A., T. M. Arthur, G. R. Siragusa, J. E. Keen, R. O. Elder, W. W. Laegreid, and M. Koohmaraie. 2001. Genotypic analyses of Escherichia coli O157:H7 and O157 nonmotile isolates recovered from beef cattle and carcasses at processing plants in the Midwestern states of the United States. Appl. Environ. Microbiol. 67:38103818. 2. Barkocy-Gallagher, G. A., E. D. Berry, M. Rivera-Betancourt, T. M. Arthur, X. Nou, and M. Koohmaraie. 2002. Development of methods for the recovery of Escherichia coli O157:H7 and Salmonella from beef carcass sponge samples and bovine fecal and hide samples. J. Food Prot. 65:15271534. 3. Barkocy-Gallagher, G. A., K. K. Edwards, X. Nou, J. M. Bosilevac, T. M. Arthur, S. D. Shackelford, and M. Koohmaraie. Methods for recovering Escherichia coli O157:H7 from cattle fecal, hide, and

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