Tecniche spettroscopiche basate sulla interazione tra radiazioni elettromagnetiche e materia Quando le radiazioni elettromagnetiche interagiscono con la materia

possono avvenire fenomeni diversi : assorbimento fluorescenza o fosforescenza (assorbimento e riemissione) reazioni fotochimiche (assorbimento e trasformazioni chimiche) riflessione diffusione

Lo spettro elettromagnetico nel vuoto costituito da onde di varia e ,in movimento con la stessa velocit c ( 300.000 Km /sec) pertanto la frequenza e la lunghezza d'onda non sono indipendenti, ma sono legate tra loro attraverso la velocit dell'onda:

c=x

e quindi

=c/

=c/

Lenergia collegata ad unonda

E = h x

ossia la sua frequenza per la costante di Plank (h = 6.6 x10-27 erg /sec) quindi lenergia di una radiazione elettromagnetica inversamente proporzionale alla sua lunghezza donda

E = h x c/

Lassorbimento di una radiazione porta un atomo o una molecola ad un livello energetico superiore. Radiazioni elettromagnetiche di diversa lunghezza donda ed energia interagiscono con la materia provocando transizioni energetiche a livelli diversi di struttura

Struttura che subisce transizione

ELETTRONI DELLE ORBITE INTERNE ELETTRONI DELLORBITA ESTERNA SPIN ELETTRONICO SPIN NUCLEARE

regione dello spettro

Raggi x Radiazioni UV/VIS Microonde ONDE RADIO

Quando un atomo o una molecola assorbono una radiazione UV o visibile gli elettroni esterni passano da uno stato fondamentale (E0) ad uno stato eccitato (E1)
Livelli energetici di un atomo (sodio) Livelli energetici molecolari

questa transizione si verifica quando latomo di sodio assorbe una radiazione di = 589 nm

lo spettro di assorbimento un grafico che definisce il tipo e la quantit delle radiazioni elettromagnetiche assorbite da un atomo o da una molecola: riporta in ascisse le assorbite ed in ordinata una misura dellassorbimento.
Per un atomo SPETTRO A RIGHE Per una molecola SPETTRO A BANDE

LA FOTOMETRIA MISURA LA QUANTIT DI LUCE ASSORBITA DA MOLECOLE IN SOLUZIONE Le sostanze colorate assorbono luce visibile Le sostanze incolori possono assorbire luce ultravioletta

IL TIPO DI RADIAZIONE ASSORBITA DIPENDE DALLA STRUTTURA CHIMICA

La presenza di legami di tipo (insaturazione) e di doppietti elettronici liberi sono responsabili dellassorbimento nel UV/VIS

La della luce assorbita aumenta con laumentare del grado di delocalizzazione elettronica

MONOCROMATORE: dispositivo che permette di isolare fasci di luce monocromatica da luce policromatica
PRISMA RETICOLO DI DIFFRAZIONE

RIFRAZIONE della luce bianca attraverso un prisma

RETICOLO DI DIFFRAZIONE

superficie metallica riflettente sulla quale sono incisi numerosi tratti rettilinei equidistanti la luce incidente sul reticolo subisce il fenomeno della diffrazione e viene quindi deviata in diverse direzioni in funzione della distanza tra le incisioni e della lunghezza donda

CUVETTE

IN VETRO PER IL VISIBILE IN QUARZO PER LUV

USA E GETTA in polistirene per il visibile in metacrilato per il vicino UV

Sistema di rivelazione Cellula fotoelettrica IL fotone colpisce il catodo che ricoperto di una superficie metallica fotosensibile che emette elettroni

M0 + h M+ + e-

LA QUANTIT DI LUCE ASSORBITA [ASSORBANZA, A] DIPENDE DAL NUMERO DELLE MOLECOLE PRESENTI IN SOLUZIONE, e quindi dalla concentrazione della soluzione e dalla lunghezza del cammino ottico LEGGE DI LAMBERT - BEER
I0

A=klc
I

I0 luce incidente I0 I

I luce trasmessa I0

Variazione di c

variazione di l

A=klc

k=A/lc
k=A c = 1 M e l = 1 cm

se c ed l hanno valore unitari a di massimo assorbimento

k = E = COEFFICIENTE DI ESTINZIONE MOLARE

lassorbanza di una soluzione 1M, determinata a 550 nm, in un cuvetta di 1 cm di cammino ottico

In un fotometro non si misura direttamente lassorbanza, ma si ricava dalla misura delle radiazioni trasmesse, non assorbite LA TRASMITTANZA (T) LA FRAZIONE DI RADIAZIONE CHE ATTRAVERSA UN MEZZO ASSORBENTE data dal rapporto tra luce trasmessa (I) e luce incidente (I0)

T = I/I0

0 T 1

T = 0 se la soluzione assorbe tutta la luce incidente (I = 0) T = 1 se la soluzione completamente trasparente (I = I0)

RELAZIONE TRA TRASMITTANZA E ASSORBANZA

A = klc T = 10 -klc T = 10-A A = - log T Per T = 1 Per T = 0 A=0 A=

Variazioni della Assorbanza e della Trasmissione in funzione della concentrazione della sostanza assorbente

Devo azzerare lapparecchio tarando la trasmissione al 100% su un Blank che contenga tutte le molecole diverse dal campione di interesse ma capaci di assorbire

Spettrofotometro a doppio raggio

PERMETTE DI AZZERARE AUTOMATICAMENTE E IN MODO CONTINUO LO STRUMENTO SUL BLANK

S1 ed S2 in posizione a : alla fotocellula arriva il raggio che ha attraversato il Blank (R) S1 ed S2 in posizione b : alla fotocellula arriva il raggio che ha attraversato il campione (C)

Analisi qualitative
Lo spettro di assorbimento diverso da molecola a molecola e ne permette il riconoscimento

Spettro di assorbimento dellemoglobina

Spettri di assorbimento di varie forme dellEMOGLOBINA

Assorbanza

Lunghezza donda (nm)

Spettro del NAD ossidato e ridotto

i nucleotidi e gli acidi nucleici assorbono a 260 nm

Analisi quantitative
La legge di Beer valida per soluzioni diluite. Ad alte concentrazioni si osservano deviazioni positive (2) o negative (3)

CURVA DI TARATURA Stabilisce lambito di linearit della legge di Lambert -Beer

Permette la determinazione della concentrazione di una sostanza in soluzione tramite il confronto della sua assorbanza con lassorbanza di una soluzione della stessa sostanza a concentrazione nota. Posso determinare la concentrazione anche dal valore del coefficiente di estinzione, se lo si conosce

 Analisi quantitatitiva: Misura della concentrazione di molecole che assorbono la luce come le proteine e gli acidi nucleici Misura della concentrazione di molecole che non assorbono la luce, dopo derivatizzazione con un cromoforo o conversione chimica in un composto che assorbe la luce Studio delle cinetiche di reazione (cinetica enzimatica)

i nucleotidi e gli acidi nucleici assorbono a 260 nm La denaturazione del DNA rende le basi pi accessibili e provoca un aumento della assorbanza a 260 nm. Questo effetto ipercromico pu essere utilizzato per seguire la denaturazione, valutando la frazione di DNA denaturato come incremento di assorbanza.

Determinazione colorimetrica di proteine

Misura diretta a 280 nm Aminoacidi aromatici Misura diretta a 205 nm Legame peptidico Metodi indiretti Biureto Folin-Lowry Bradford (blu Coomassie G-250)

Bradford Reattivo Blu Coomassie

Si lega agli aminoacidi basici ed aromatici Max assorbimento a 595 nm Blu