Fabin Camilo Salgado Roa 070100052011

TALLER N 4 BIOINFORMATICA USOS DE DIFERENTES BASES DE DATOS PARA ESTUDIAR SECUENCIAS DE UNA ENZIMA

FABIN CAMILO SALGADO ROA 070100052011

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULDAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE BIOLOGIA BIOINFORMATICA IBAGUE

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1. DISEO DE UNA PRUEBA DE PCR-RFLPS PARA EVALUAR LA VARIABILIDAD DEL CITOCROMO OXIDASA I (COI) EN DOS ESPECIES DE DELFINES CON DISTRIBUCIN EN COLOMBIA PERO CON HBITATS TOTALMENTE DIFERENTES El fin del siguiente trabajo es mediante herramientas bioinformticas disear un PCR-RFLPs que permite encontrar diferencias moleculares entre la especie Inia geoffrensis de hbitat de agua dulce y Sotalia fluviatilis de hbitat marino. Para ello de utilizaron las siguientes entradas en Nucleotide: Entrada 1: EU496374 Titulo: Evaluating the utility of cox1 for cetacean species identification Definicion: Sotalia fluviatilis voucher SEFSC:MMMGL:Igeo084 cytochrome oxidase Organismo: Sotalia fluviatilis Referencia: 1 (bases 1 a 686) Revista: Mar. Mamm. Sci. 28 (1), 37-62 (2012) Autores: Viricel,A. and Rosel,P.E.

Entrada 2: EU496359 Titulo: Evaluating the utility of cox1 for cetacean species Definicion: Sotalia fluviatilis voucher SEFSC:MMMGL:Igeo084 cytochrome oxidase Organismo: Inia geoffrensis Referencia: 1 (bases 1 a 686) Revista: Mar. Mamm. Sci. 28 (1), 37-62 (2012) Autores: Viricel,A. and Rosel,P.E.

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Software 1: Sequence Manipulation Suite Enzima de restriccin: RSA I * Inia geoffrensis (entrada EU496359)

Se obtuvieron 4 fragmentos de las siguientes longitudes (bases): 533, 76, 45, 32.

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* Sotalia fluviatilis (entrada EU496374)

Se obtuvieron 3 fragmentos de las siguientes longitudes (bases): 331, 314, 41

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*Cuadro comparativo

Resultados tras el corte con la enzima de restriccion Rsa I Inia geoffrensis (entrada EU496359) Sotalia fluviatilis (entrada EU496374) [4] [3] 533 bases 331 bases 76 bases 314 bases 45 bases 41 bases 32 bases
Al nivel de laboratorio no son tiles las secuencias con longitud de 76, 45, 32, y 41 bases debido a que no son resultados que puedan diferenciarse claramente en un gel de agarosa durante una electroforesis. Por lo tanto para Inia goffrensis obtendra en realidad un solo fragmento y para Sotalia fluviatilis obtendra 2

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Enzima de restriccin Hinf I * Inia geoffrensis (entrada EU496359)

No hubo corte con la enzima de restriccin debido a que se mantuvo el mismo tamao.

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* Sotalia fluviatilis (entrada EU496374)

Se obtiene dos fragmentos luego del corte con la enzima de restriccin Hinf I, de los cuales solo uno tiene significancia para el anlisis de laboratorio

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*Cuadro comparativo

Resultados tras el corte con la enzima de restriccion Rsa I Inia geoffrensis (entrada EU496359) Sotalia fluviatilis (entrada EU496374) [1] [2] 686 bases 592 bases 44 bases
De este cuadro la secuencia de 44 bases no es til para el anlisis de laboratorio

Enzima de restriccin Hae III * Inia geoffrensis (entrada EU496359)

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Se obtuvieron dos fragmentos, 383 bases y otro de 303 bases, los cuales tienes significancia para el anlisis de laboratorio con electroforesis en gel de agarosa. * Sotalia fluviatilis (entrada EU496374)

La enzima no realiz corte, ya que el fragmento mantiene su longitud inicial

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*Cuadro Comparativo

Resultados tras el corte con la enzima de restriccion Rsa I Inia geoffrensis (entrada EU496359) Sotalia fluviatilis (entrada EU496374) [2] [1] 383 bases 686 bases 303 bases
Todos los fragmentos son tiles para el anlisis en laboratorio utilizando electroforesis en gel de agarosa.

Anlisis Luego de observar lo sucedido en las tres enzimas de restriccin (resultados diferentes para cada individuo) se concluye que la secuencia de la enzima COI para los individuos evaluados son diferentes y por lo tanto los individuos pertenecen a especies diferentes, lo que concuerda con los datos tanto morfolgicos como ecolgicos de estos organismos en la red.

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Web cutter 2.0 Los resultados con este software son bastante completos ya que arroja la informacin de todas las enzimas de restriccin que realizan cortes en la secuencia o secuencias seleccionadas para estudiarInia geoffrensis

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Sotalia fluviatilis

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Sotalia fluviatilis

Inia geoffrensis

Los resultados con este software se relacionan con el del software anterior ya que indica que diferentes enzimas de restriccin actan sobre cada secuencia y las enzimas de restriccin que tienen en comn arrojan diferentes nmeros de fragmentos.

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2. ALINEAMIENTO DE DOS SECUENCIA UTILIZANDO EL PROGRAMA LALING Para la primera parte de este ejercicio se seleccionaron dos secuencias de dos protenas diferentes que corresponden a especies diferentes, con el fin de observar el funcionamiento del software laling para protenas

Entrada 1: CAA79652 Definicin: lipasa (Serratia proteamaculans) Organismo: Serratia proteamaculans Autores: Smigielski,A.J. Titulo: submision directa Revista: JOURNAL Submitted (15-JAN-1993) ADAM J SMIGIELSKI Dr, Molecular Biology, CSIRO Division of, Entomology, GPO BOX 1700, CANBERRA, ACT, 2601, AUSTRALIA Entrada 2: AAA41250 Definicin: Lipasa (Rattus norvegicus) Organismo: Rattus norvegicus Autores: Wishart,M.J., Andrews,P.C., Nichols,R., Blevins,G.T. Jr., Logsdon,C.D. and Williams,J.A. Titulo: Identification and cloning of GP-3 from rat pancreatic acinar Revista: J. Biol. Chem. 268 (14), 10303-10311 (1993)

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Alineamiento formato local

En este formato solo aparecen los aminocidos que tiene en comn las dos secuencias, donde un punto simboliza aminocidos de la misma clase o tipo, dos puntos mismo aminocido y espacio diferencia en aminocidos.

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Without end point

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Este formato incluye tanto los gaps, como los aminocidos en comn, da una percepcin mayor acerca de la similaridad entre de las dos secuencias incluyendo la comparacin de sus tamaos.

Diferencias entre los dos formatos Local aligment indica solamente os aminocidos o la seccin del alineamiento donde se evidencia la similaridad entre las dos secuencias, por el contrario el otro formato incluye todos los gaps, que el software arroja para realizar un mejor alineamiento, permitiendo tener una perspectiva de la verdadera similaridad de las secuencias a comparar.

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Anlisis de DNA con el software LALING, comparando las entradas L28038 y L28039. Entrada 1: L28038 Definicion: Trypanosoma rangeli kinetoplast DNA sequence with conserved Organismo: Trypanosoma rangeli Autores: Ntambi,J.M. and Englund,P.T, Ray,D.S. Vallejo,G.A., Macedo,A.M., Chiari,E. and Pena,S.D. Titulo: A gap at a unique location in newly replicated Revista: J. Biol. Chem. 260 (9), 5574-5579 (1985)

Entrada 2: L28039 Organismo: Trypanosoma rangeli Autores: Ntambi,J.M. and Englund,P.T., Ray,D.S., Vallejo,G.A., Macedo,A.M., Chiari,E. and Pena,S.D. Titulo: A gap at a unique location in newly replicated kinetoplast DNA, Conserved sequence blocks in kinetoplast minicircles from diverse, Kinetoplast DNA from Trypanosoma rangeli contains two distinct classes of minicircles with different size and molecular. Revista: Mol. Cell. Biol. 9 (3), 1365-1367 (1989), Mol. Biochem. Parasitol. 67 (2), 245-253 (1994)

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Local

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Without end gaps En este formato es software arroja un porcentaje de similaridad del 48% incluyendo en la vista, las terminaciones gap

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3. ALINEAMIENTO PROGRAMA CLUSTAL W 2

MLTIPLE

DE

SECUENCIAS,

UTILIZANDO

EL

Para este ejercicio se utilizaron 10 entradas correspondientes al individuo Daphnia cf. Pulicaria , el cual es un hibrido muy estudiado en el campo de la biologa molecular. Para ello se utiliz como marcador el gen COI, de donde se obtuvieron 10 entradas diferentes las cuales son: EU152327.1, EU152326.1, EU152325.1, EU152324.1, EU152323.1, EU152322.1, AF489525.1, AF489524.1, AF489523.1, EU152328.1

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este es resultado de un alineamiento mltiple donde los asteriscos del final de cada base hace referencia a una base consenso, es decir en ese lugar hay ausencia de polimorfismo (SNPs)

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Esta imagen hace referencia al jalview, el cual identifica a cada nucletido con un color facilitando la identificacin de SNPs y STRs, adems de esto posee en la parte inferior una secuencia consenso luego del alineamiento que es la siguiente:

Este formato ayuda a comprender mucho ms el alineamiento, para un posterior anlisis.

Para qu se podra utilizar las regiones variables y las regiones constantes? Los SNPs y los STRs (no presente en el alineamiento) son regiones variables que facilitan la identificacin de organismos diferentes y as mismo observar la variabilidad de numerosos organismos al mismo tiempo facilitando el estudio del linaje evolutivo de un grupo de individuos en base a las diferencias gnicas en un marcador (en este caso COI). Las regiones conservadas tiene una gran importancia evolutiva ya que permite identificar similaridad entre individuos, para poderlos identificar en la lnea evolutiva como organismos cercanos o lejanos a la hora de la diversificacin.

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A partir de las regiones variables y conservadas se puede construir un rbol gua que relacione de forma evolutiva las secuencias escogidas para trabajar.

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CONCLUSIONES

* Las enzimas de restriccin permiten identificar polimorfismos entre individuos de diversas especies, la bioinformtica facilita el desarrollo de tcnicas moleculares mediante modelos simulados que facilitan ahorrar dinero en experimentos

*PCR-RFLP permite diferenciar especies usando enzimas de restriccin.

*Existen alineamientos binarios y mltiples que permiten localizar polimorfismos entre especies con ayuda de marcadores moleculares

*A partir de regiones variables y conservadas se pueden realizar arboles gua que reflejen una hiptesis evolutiva de un grupo especfico de estudio

*La bioinformtica es una herramienta clave en el desarrollo de las ciencias biolgicas