La fosforilacin del dominio de unin de ATP TOR por AGC quinasa constituye un nuevo modo de inhibicin de TOR

El objetivo eucariota de rapamicina (TOR ) de protenas quinasas son altamente conservadas y el crecimiento celular y la divisin par con las seales ambientales ( Wullschleger et al, 2006 ; . Loewith y Hall , 2011 ) . TOR quinasas forman al menos dos complejos diferentes : TOR complejo 1 ( TORC1 ) y complejo TOR 2 ( TORC2 ) , que tienen distintas funciones celulares . TORC1 incorpora Raptor , mientras que Raptor se sustituye por Rictor en TORC2 ( Wullschleger et al. , 2006 ) . Los mecanismos moleculares por los cuales se ejerce el control estricto de la sealizacin de TOR en respuesta a seales ambientales no se entienden completamente . En los mamferos, mTORC1 promueve el crecimiento celular , la progresin del ciclo celular y la proliferacin celular . mTORC1 se activa por el Rheb GTPasa , que , a su vez , es inhibida por el TSC1 - TSC2 complejo ( Long et al . , 2005 ; Smith et al , 2005 ) . . actividad mTORC1 tambin puede ser regulado en una variedad de maneras TSC1/2-independent . En respuesta a los cambios en los niveles de aminocidos , la activacin mTORC1 se controla en los lisosomas por GTPasas Rag ( Sancak et al. , 2008 ) . mTORC2 controla el metabolismo , el citoesqueleto , y la supervivencia celular despus de la exposicin al estrs ( Sparks y Guertin , 2010 ) . mTORC2 tambin controla la diferenciacin de las clulas nTreg y clulas pre -T ( Chang et al , 2012 ; . Lee et al , 2012 . ) . El control de la actividad mTORC2 es menos conocida , aunque mTOR autophos - phorylation en serina 2481 se asocia predominantemente con mTORC2 ( Copp et al. , 2009 ) . A diferencia de los mamferos , las levaduras Saccharomyces cere visiae y Schizosaccharomyces pombe tienen dos quinasas TOR . En S. pombe , algo confusamente , Tor2 es el principal componente de TORC1 , mientras que Tor1 es el componente principal de TORC2 ( lvarez y Moreno , 2006 ; Hayashi et al , 2007 ; . . Matsuo et al , 2007 ) . Al igual que su homlogo de mamferos mTORC2 , S. pombe TORC2 es necesario para la organizacin del citoesqueleto , diferenciacin celular y la supervivencia despus de la tensin ( Tatebe y Shiozaki , 2010 ) . Debido a TORC2 la levadura de fisin fosforila la quinasa AGC Gad8 , y Gad8 tambin es necesario para la supervivencia despus de la tensin y para la diferenciacin celular ( Matsuo et al . , 2003 ) , Gad8 ha sido pro-puesto para representar un homlogo de AKT1 mTORC2 - controlada . En resumen, la conservacin de las funciones mTORC1 y mTORC2 junto con la regulacin de TORC1 por Rheb y TSC1 / 2 Para obtener una mayor comprensin de la regulacin de la quinasa TOR activi-dad y la sealizacin , generamos anticuerpos Tor1 especficos con los que podramos caracterizar la molcula de tipo salvaje (Fig. S1 A). Para asignar los sitios de fosforilacin en Tor1 , la quinasa se purific a partir de clulas de tipo salvaje por inmunoprecipitacin seguida de espectrometra de masas -tan dem . Esto identific una nueva y treonina sitio de fosforilacin conservada 1972 dentro del sitio de unin de ATP del dominio quinasa ( fig. 1 A y . Fig. S1 C ) . La estructura de mTOR se ha resuelto recientemente ( Yang et al . , 2013 ) . T2173 , la treonina en mTOR que equivale a T1972 de la levadura de fisin , se encuentra al lado de la L2185 de

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

unin de ATP (Fig. S1 D). Para evaluar la importancia de la fosforilacin en S. pombe Tor1 T1972 , la mutacin de la treonina a alanina ya sea para bloquear la sealizacin o el cido asprtico en un intento de imitar la fosforilacin constitutiva . Se utiliz un intercambio recombinasa Cre mediada casete ( RMCE ; . , 2008 Watson et al) enfoque para reemplazar la quinasa nativa con cada mutante (Fig. 1 B). El TOR1 RMCE + cepa de tipo salvaje , en el que la secuencia de Tor1 se mantiene sin cambios ( tor1.lox ) , tiene niveles y fenotipos que son indistinguibles de los controles de tipo salvaje (Fig. 1 B y . Fig. S2 , A- D ) de protena TOR1 . TOR1 niveles proteicas tambin eran indistinguibles de tipo salvaje en TOR1 . T1972A y tor1.T1972D (Fig. 1 C ) . Para estudiar la dinmica de los Fosforilacin T1972 , generamos anticuerpos que reconocan T1972 - fosforilada Tor1 . Los extractos de protena de tipo salvaje y cepas TOR1 eliminados establecieron que estos anticuerpos reconocen fosforilados quinasa Tor1 . La seal de fosfo - especfico fue abolida en el mutante tor1.T1972A o se elimina tras el tratamiento de los inmunoprecipitados TOR1 con fosfatasa lambda (figura 1 , D y E ) . A continuacin evalu si el bloqueo Tor1 T1972 fosforilacin altera el control TORC2 de la diferenciacin sexual y la supervivencia celular despus de la exposicin al estrs. jugado - DIS clulas tor1.T1972A aumento de la resistencia a ambos oxidativo ( H2O2 ) y la sal ( KCl ) subraya (Fig. 2 A) . El nitrgeno inanicin de la fisin detenciones de levadura progresin del ciclo celular en la fase G1 e induce la diferenciacin sexual , ambos de los cuales se basan en Tor1 ( TORC2 ) actividad (Fig. 2 , B y C ; Weisman y Choder , 2001 ) . mutantes tor1.T1972A no detuvieron de manera eficiente en G1 (Fig. 2 C) y visualizan una capacidad de diferenciacin reduce cuando muertos de hambre de nitrgeno (Fig. 2 B). Actividad de la quinasa Tor1 se reduce por el estrs de nitrgeno ( Petersen y Nurse, 2007 ) , sin embargo , los mutantes de delecin TORC2 fallan completamente para diferenciar . Por lo tanto, es probable que se requiere un nivel basal de sealizacin TORC2 para la diferenciacin , pero que el nivel general de actividad TORC2 que est asociado con clulas pro - liferating tiene que estar deprimido para permitir celular eficiente diferenciacin . La mejora de la resistencia al estrs y reduce la eficiencia de la diferenciacin sexual sugiere que el bloqueo de la fosforilacin T1972 eleva la actividad Tor1 . Para probar esta prediccin , se utiliz in vivo y en ensayos in vitro para monitorear Tor1 quinasa activi-dad . Tor1 ( TORC2 ) media la fosforilacin de Gad8.S546 (Fig. S2 E;. Matsuo et al, 2003) y as representa una precisa lectura en vivo de la actividad Tor1. Este evento de fosforilacin es anlogo a mTORC2 fosforilacin de la serina 473 AKT1 (Ah, y Jacinto, 2011). Gad8.S546 fosforilacin fue ele-vada cuando la fosforilacin de T1972 fue bloqueado (Fig. 3 A). Esta mejora de S546 fosforilacin fue acompaado por un aumento en la proporcin de Gad8 cuya migracin a travs de SDS-PAGE fue retrasado (Fig. 3 A). Gad8 esfosforilacin Lated en el conservada de activacin del bucle T residuo de treonina 387 (T308 AKT1) por la quinasa Ksg1 esencial (PDK1 homlogo;. Matsuo et al, 2003). Por lo tanto, la fosforilacin es Gad8.T387 TORC2 independiente y se puede utilizar como un control para asegurar que la elevacin de la fosforilacin de S546 cuando Tor1.T1972 fosforilacin fue bloqueado no era simplemente la consecuencia de una mejora de Gad8 fosforilacin en general. Nosotros por lo tanto los anticuerpos que reconocen Gad8.T387 fosforilacin-mento (Fig. S2 F) generamos. Gad8.T387 fosforilacin fue abolida cuando el mutante sensible a la temperatura ksg1.208 era inactivacin-vados a la temperatura restringido (37 C;. Fig. S2 F), lo que confirma los datos publicados que muestra Gad8.T387

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

fosforilacin por Ksg1 (Matsuo et al. , 2003). En consonancia, la fosforilacin-cin Gad8.T387 se mantuvo sin cambios en el mutante Tor1.T1972A (Fig. 3 A). El aumento de la actividad de Tor1.1972A en un ensayo de quinasa in vitro apoya los datos in vivo Gad8.S546 e indica que la fosforilacin T1972 debe de hecho deprimir TORC2 quinasa activi-dad (Fig. 3 B). La pequea GTPasa Rab Ryh1 es esencial para actividad TORC2 completo ( Tatebe et al. , 2010 ) . Regulacin TORC2 en Tor1.1972A todava requiere Ryh1 , como la disminucin del nivel de actividad en Tor1 ryh1 . no fue restaurada a los niveles de tipo salvaje por el aumento de la actividad de Tor1.1972A incluso cuando se combina con la supresin de los reguladores Ryh1 sat1 + y sat4 + ( . Fig. S3 A) . Para consolidar el vnculo entre el aumento de la actividad quinasa y tanto la resistencia al estrs y la reduccin de diferenciacin de las clulas tor1.T1972A , buscamos maneras de forma independiente la actividad Tor1 aumen-tar . Esto nos permitir probar por separado el impacto de la actividad elevada Tor1 sobre la resistencia al estrs y la diferenciacin . Previamente se ha establecido que el mutante de S. Cere visiae Tor1.I1954T ha aumentado la actividad de quinasa ( Reinke et al . , 2006 ) . Secuencia alineaciones revelan que I1954 es conservido en la levadura de fisin Tor1 (Fig. 3 C). Lo tanto, gener la mutacin tor1.I1816T anloga y se evalu su actividad quinasa y fenotipos de tensin / de diferenciacin . Tanto in vivo y en ensayos in vitro de la actividad quinasa Tor1 revel que las clulas mutantes tor1.I1816T haban aumentado la actividad . Es importante destacar que esta mutacin tambin se ha mejorado la resistencia al estrs y reduce la eficiencia de la diferenciacin sexual ( fig. 3 , C -F ) . Cuando se combinaron las mutaciones tor1.I1816T y tor1.T1972A en el mismo gen , la actividad de la doble mutante era la de la Tor1.I1816T mu -tante (Fig. S3 , B y C ) , lo que sugiere que la Tor1.I1816T puede mutante ya tienen completamente fosforilados y activados quinasa Gad8 . En resumen , estos dos mutaciones independientes en dos sitios distintos de forma independiente elevan la actividad de quinasa de la resistencia al estrs enHance y reducen la diferenciacin de clulas sexuales . Por consiguiente, concluimos que la fosforilacin de T1972 de Tor1 deprime la actividad quinasa del complejo TORC2 . La secuencia que rodea inmediatamente T1972 es una combinacin perfecta para un sitio de fosforilacin AGC quinasa consenso (Fig. 4 A; Pearson y Kemp, 1991 ) , lo que sugiere que Gad8 podra ser la quinasa responsable de la regulacin de la actividad a travs de TORC2 Tor1.T1972 fosforilacin. Comparacin de fosforilacin - T1972 niveles lacin en extractos celulares preparados a partir de gad8 . , gad8.kd o pSK1 . ( otra quinasa AGC) revel que Tor1.T1972 fosforilacin , efectivamente, requieren actividad Gad8 (Fig. 4 B). Nosotros por lo tanto purificados Gad8 junto con la catalticamente inactiva Gad8.kd mutante de levadura de fisin y utilizado Tor1 recombinante como un sustrato para ensayos in vitro de quinasa en . De tipo salvaje Gad8 pero no el mutante quinasa muertos podra fosforilar T1972 de Tor1 in vitro (Fig. 4 B). Una prediccin del control Gad8 de Tor1.T1972 fosforilacin es que las cepas mutantes en las que se reduce la actividad Gad8 deberan haber aumentado correspondientemente actividad Tor1 . Como ya se ha odo - lier , Gad8.S546 fosforilacin es una lectura directa de TORC2 ( Tor1 ) actividad anloga a mTORC2 fosforilacin de la serina 473 AKT1 . Adems , Gad8 es , de hecho , el nico sustrato TORC2 directa

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

identificado en la levadura de fisin hasta la fecha . Por lo tanto , un poco confusa, en mutantes gad8 deficiente, la actividad in vivo en Tor1 se controla en realidad por la fosforilacin de la propia Gad8 . Por lo tanto , para examinar el impacto de la reduccin de la actividad cataltica Gad8 ( gad8.kd ) tras la activacin Tor1 in vivo , que supervis Gad8.S546 fosforilacin -cin . Sorprendentemente , hubo un claro incremento en la fosforilacin Tor1 dependiente de la serina 546 en el - quinasa muertos mutante Gad8 , lo que indica que la fosforilacin de Gad8 T1972 de hecho - prensa des Tor1 actividad de quinasa (Fig. 4 C ) . Consistentemente , los ensayos in vitro de la actividad quinasa Tor1 tambin revelaron que las clulas mutantes - quinasa muertos gad8.kd haban aumento de la actividad (Fig. 3 E ) . Para determinar si la mejora de la actividad Gad8 aumentara la fosforilacin de Tor1 en T1972 in vivo , hemos explorado la capacidad de la mutacin tor1.I1816T activa ( fig. 3 , C -F ) para aumentar la actividad Gad8 y a su vez Tor1 T1972 fosforilacin . clulas tor1.I1816T muestran ambos niveles ms altos de Gad8.S546 fosforilacin (Fig. 3 D) y elevados Tor1 T1972 fosforilacin (Fig. 4 D) , apoya la opinin de que el aumento de la actividad Gad8 promovido Tor1 . Fosforilacin T1972 . Adems , tambin encontramos que la estimulacin ambiental de la actividad Gad8 en las clulas de tipo salvaje tambin -en hanced Tor1.T1972 fosforilacin (ver "Conclusiones" ) . Para caracterizar mejor el control ambiental de las actividades TOR1 y Gad8 , expusimos las clulas a la inanicin de nitrgeno. Como se seal anteriormente , el ciclo celular arrestos de hambre de nitrgeno progresin en G1 e induce la diferenciacin sexual. Se requieren las actividades tanto de Gad8 y Tor1 para estos procesos ( Figs. 2 B y E 4 ; Weisman y Choder , 2001 ; Matsuo et al , 2003 ) . . Cuando la cepa tor1.T1972A fue privado de nitrgeno , las clulas no pudieron someterse a la diferenciacin eficiente (Fig. 2 B). La fosforilacin de la protena ribosomal S6 ( RPS6 ) es principalmente controlada por Tor2 ( TORC1 ; . Nakashima et al, 2010 ), sin embargo , tambin se requieren las actividades tanto Gad8 y Tor1 por completo la fosforilacin (Du et . al, 2012). Como ya se observ , las clulas de tipo salvaje de hambre de nitrgeno mostraron niveles de RPS6 fosforilacin ( Nakashima et al. , 2010 ) se redujo . Esta reduccin de nitrgeno controlado en RPS6 fosforilacin se retras en el mutante tor1.T1972A activa, y este retraso en RPS6 desfosforilacin fue Gad8 dependiente (Fig. 4 F). En resumen, un retraso en la in- bicin de la actividad quinasa tor1.T1972A conduce a una falta de ejecucin de manera eficiente la diferenciacin. Como se mencion anteriormente , el sitio de fosforilacin principal que activa Gad8 es la conservada treonina T-loop 387 ( AKT1 T308 ) que es fosforilada por Ksg1 . En consecuencia , un gad8 . Mutante T387A es inactiva (Fig. 4 E y . Fig. S3D ) . Para evaluar el impacto de la inanicin de nitrgeno tras la activacin Gad8 , T387 fosforilacin se control como las clulas se mueren de inanicin de nitrgeno. Un rpido aumento en la activacin Ksg1 dependiente de Gad8 (Fig. 4 G) se observ a 5 min de la inanicin. Este aumento de la actividad Gad8 aumento de la fosforilacin Tor1.T1972 ( fig. 4 H ) . Monitoreo Gad8.S546 fosforilacin como una lectura de Tor1 quinasa activi-dad confirm que este aumento en la fosforilacin de Tor1 en T1972 fue acompaado por una disminucin en la actividad Tor1 ( fig. 4 H ) . Es importante destacar que la capacidad de regular Gad8 T387 fosforilacin era esencial para la disminucin inducida por el medio ambiente en la

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

fosforilacin controlada - Tor1 de Gad8 en S546 , porque los altos niveles de fosforilacin de S546 se mantuvieron en un mutante gad8.T387D (Fig. S3 E ) . Una prdida completa de la actividad Gad8 bloqueado diferenciacin (Fig. 4 E). Curiosamente, sin embargo , una disminucin en Gad8 S546 fosforilacin no comprometi por completo la actividad Gad8 , como lo revela la diferenciacin sexual reducida y modestos fenotipos de sensibilidad al calor de los mutantes gad8.S546A (Fig. 4 E y . Figura S3 D ) . Este control de la actividad TORC2 Gad8 es altamente remi - niscent de los estudios en clulas de mamferos , donde el control de la fosforilacin mTORC2 AKT1 aumenta su actividad quinasa , pero no es absoluta-mente esencial para la actividad ( Jacinto et al, 2006 ; . Ah, y Jacinto, 2011 ) . La fosforilacin de T1972 por Gad8 es poco probable que sea el nico mecanismo por el cual Tor1 quinasa se inhibe en respuesta a la inanicin de nitrgeno porque las clulas mutantes tor1.T1972A todava se sometieron a la diferenciacin sexual ( aunque con muy reducida eficiencia ; . Fig. 2 B ) . En conjunto, nuestros resultados sugieren que las clulas responden a la inanicin de nitrgeno por una activacin inicial de Gad8 travs Ksg1 . Adems del control de Ksg1 de Gad8 , esta activacin inicial inducida nitrgeno de Gad8 tambin podra ser regulada a travs de sitios de fosforilacin no caracterizados actualmente , como Gad8 parece ser muy fosforilados (Fig. S3 F ) . Despus de la actividad Gad8 ha sido elevado , inhibe la actividad Tor1 para permitir celular eficiente diferenciacin , tal como se resume en la figura . 5 K. Si cualquier sustratos adicionales se unen Gad8 en la regulacin TORC2 dependiente para promover o facilitar la diferenciacin celular eficiente an est por establecerse .

Tor1 T1972 est conservada evolutivamente (Fig. 1 A). Como primer paso para evaluar si la fosforilacin de este residuo representa un modo universal de control de la quinasa TOR , elevamos fosfato anticuerpos especficos que reconoceran el residuo - homloga Gous S1975 en Tor2 , el otro la levadura de fisin TOR quinasa. Los extractos de protena de tipo salvaje y mutantes TOR2 sensibles a la temperatura establecieron que estos anticuerpos reconocieron de hecho quinasa fosforilada Tor2 (Fig. 5 , A y B ) . En experimentos in vivo con extractos de protenas de mutantes - quinasa muertos Gad8 as como ensayos de quinasa in vitro establecieron que Tor2.S1975 fosforilacin se une en Tor1.T1972 tambin ser controlado por Gad8 ( fig. 5 , C y D ) . El papel de la fosforilacin de Gad8 Tor2 an no se ha determinado . Para extender estas observaciones a travs de la barrera de las especies , que explota el alto grado de homologa en torno a este treonina ( Fig. 1A ) y utilizamos los anticuerpos fosfoespecficos Tor2.S1975 levadura en la mTOR quinasa humana. mTOR T2173 fue fosforilada de manera que se correlaciona con el estado nutricional de las clulas como la fosforilacin se perdi despus de la hambruna y promovi despus de la re-estimulacin de suero (Fig. 5 , E y F). Resulta interesante que , al igual que su homlogo de la levadura de fisin Gad8 , se requiere la actividad de la quinasa de mamfero AKT para esta fosforilacin (Fig. 5 C ) . A continuacin evalu si el bloqueo de la fosforilacin de mTOR T2173 tambin alter la actividad de mTOR . La transfeccin y expresin de mTOR en las clulas HeLa result muy problemtica ( no representada ) , nos impulsa a expresar mTOR y mTOR .

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

T2173A en clulas de melanoma A375 que tolera un nivel modesto de mTOR sobreexpresin (Fig. 5 G). Estos experimentos en clulas de mamferos recapitulan nuestra observacin en la levadura de fisin. En - arrug la fosforilacin del sustrato AKT1 mTORC2 cuando mTOR.T2173A se expres en niveles idnticos a los de tipo silvestre del mTOR se indica que el bloqueo de la fosforilacin en T2173 actividad -en hanced mTOR quinasa (Fig. 5 H).

Conclusiones Llegamos a la conclusin de que la actividad quinasa TOR se puede inhibir a travs de un evento de fosforilacin universalmente conservada dentro del dominio de unin a ATP . Curiosamente , las observaciones de tanto la levadura de fisin y lneas celulares humanas sugieren que este evento de fosforilacin es muy estable . Tor1.T1972 fosforilacin persisti durante varias horas despus de la expresin Gad8 haba apagado (Fig. S3 G). Del mismo modo , no hubo ningn cambio en la fosforilacin - cin mTOR.T2173 durante un perodo de 3 - h despus de la inhibicin de AKT1 en condiciones de suero - rica ( fig. 5 I) . Es importante destacar , 2 h de la inhibicin de AKT1 es suficiente para bloquear la fosforilacin despus de la reestimulacin de suero (Fig. 5 C ) . Esto puede sugerir que, o bien la fosfatasa desfosforila que este residuo de treonina en cada organismo tiene una actividad muy baja o que no hay fosfatasa para este sitio. Debido a AGC quinasas se activan por s mismos trminos de referencia , la estabilidad de esta fosforilacin TOR dentro del dominio de unin de ATP asegura que la regulacin mutua de las dos quinasas no es simplemente anulado ( fig. 5 J ) .

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)