APUNTESME

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE TECNOLOGA MDICA MORFOFISIOPATOLOGA Y CITODIAGNSTICO
Microscopa Electrnica
Apuntes de Clases IV Ao PROF. ENCARGADO: T. M. Nancy Olea Rosson PROF. COORDINADOR: T. M. Nancy Olea Rosson AYUDANTE T. PRCTICOS: T. M. Marta Gacita
2003
Microscopa Electrnica Gabriel Rodrguez 1
Del Microcosmos al Macrocosmos: Una Visin de la Microscopa Electrnica y su Contribucin al Conocimiento del Universo.
Prof. Gabriel Rodrguez IDIEM Martes 30 de Septiembre de 2003
La sed de conocimiento del ser humano le ha llevado a indagar la composicin de su entorno y de s mismo, para as descubrir de qu forma lo existente se interrelaciona. Esta infinita necesidad de aprender lo ha llevado a observar desde su medio ms inmediato hasta el plano de lo nfimo o ms bien pequeo (el subuniverso microscpico) y de lo abismantemente enorme y/o lejano (el subuniverso macroscpico), comenzando a entender con ello la gran variedad de estructuras, formas, diseos y entidades existentes en el Universo. Al iniciar este curso de Microscopa Electrnica, haremos una breve pero didctica revisin de cmo el ser humano ve y los medios de apoyo que ha desarrollado para la visin y observacin de su mundo. Nuestro entorno lo vemos con nuestros sentidos, y particularmente con el sentido de la vista. El ser humano puede ver medidas limitadas en torno a l; de hecho el metro fue creado como medida de referencia considerando la estatura del ser humano, y sobre esta base se crearon subunidades y amplificaciones de la unidad referencial (micrometros, milmetros, centmetros, decmetros, kilmetros, etc.). El ser humano puede ver, en trminos inferiores a la unidad, objetos de milmetros de dimetro, y por debajo de 0.2 mm le es difcil ver a simple vista, en tanto que en dimensiones grandes, a distancias mayores de 1 km le resulta poco claro distinguir objetos grandes. Cuando los objetos son muy grandes, debemos alejarnos para poder contemplarlos. Por ejemplo, hasta el siglo XV el ser humano no se percat de la redondez de la Tierra, pues se pensaba que era plana y si bien existan hiptesis sobre la posibilidad de su redondez, no exista la certeza fehaciente de ello, pues no existan medios de transporte y observacin que permitieran verla desde lejos. Entonces se deba rehacer poco a poco la geografa para entender cmo era su forma. Afortunadamente hay objetos ms lejanos que podemos visualizar, pero que por su distancia debemos acercarlos a la vista, lo mismo que cuando queremos ver objetos muy pequeos. Dada la capacidad de la vista de ver slo puntos distantes entre s a un mximo de 0.2 mm (lmite de resolucin, mnima distancia a la que 2 objetos separados entre s pueden ser distinguidos como 2 entidades diferentes). Este lmite de resolucin se da porque uno ve realmente el ngulo bajo el cual esos 2 puntos se observan (lo que est dado por la distancia a la que los fotorreceptores estn separados entre s).
Las Dimensiones del Universo- Gabriel Rodrguez 1
Del Microcosmos al Macrocosmos: Una Visin de la Microscopa Electrnica y su Contribucin al Conocimiento del Universo.
Prof. Gabriel Rodrguez IDIEM Martes 30 de Septiembre de 2003
La sed de conocimiento del ser humano le ha llevado a indagar la composicin de

su entorno y de s mismo, para as descubrir de qu forma lo existente se interrelaciona. Esta infinita necesidad de aprender lo ha llevado a observar desde su medio ms inmediato hasta el plano de lo nfimo o ms bien pequeo (el subuniverso microscpico) y de lo abismantemente enorme y/o lejano (el subuniverso macroscpico), comenzando a entender con ello la gran variedad de estructuras, formas, diseos y entidades existentes en el Universo. Al iniciar este curso de Microscopa Electrnica, haremos una breve pero didctica revisin de cmo el ser humano ve y los medios de apoyo que ha desarrollado para la visin y observacin de su mundo. Nuestro entorno lo vemos con nuestros sentidos, y particularmente con el sentido de la vista. El ser humano puede ver medidas limitadas en torno a l; de hecho el metro fue creado como medida de referencia considerando la estatura del ser humano, y sobre esta base se crearon subunidades y amplificaciones de la unidad referencial (micrometros, milmetros, centmetros, decmetros, kilmetros, etc.). El ser humano puede ver, en trminos inferiores a la unidad, objetos de milmetros de dimetro, y por debajo de 0.2 mm le es difcil ver a simple vista, en tanto que en dimensiones grandes, a distancias mayores de 1 km le resulta poco claro distinguir objetos grandes. Cuando los objetos son muy grandes, debemos alejarnos para poder contemplarlos. Por ejemplo, hasta el siglo XV el ser humano no se percat de la redondez de la Tierra, pues se pensaba que era plana y si bien existan hiptesis sobre la posibilidad de su redondez, no exista la certeza fehaciente de ello, pues no existan medios de transporte y observacin que permitieran verla desde lejos. Entonces se deba rehacer poco a poco la geografa para entender cmo era su forma. Afortunadamente hay objetos ms lejanos que podemos visualizar, pero que por su distancia debemos acercarlos a la vista, lo mismo que cuando queremos ver objetos muy pequeos. Dada la capacidad de la vista de ver slo puntos distantes entre s a un mximo de 0.2 mm (lmite de resolucin, mnima distancia a la que 2 objetos separados entre s pueden ser distinguidos como 2 entidades diferentes). Este lmite de resolucin se da porque uno ve realmente el ngulo bajo el cual esos 2 puntos se observan (lo que est dado por la distancia a la que los fotorreceptores estn separados entre s).
2003. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
LAS DIMENSIONES DEL UNIVERSO Gabriel Rodrguez J. (socio 41) El Universo, desde el micro al macrocosmo, tiene dimensiones que la mente humana difcilmente llega a comprender. Por un lado estn las partculas subatmicas, infinitamente chicas, que rayan en la nada misma. Por otro lado estn los espacios intergalcticos que son tan grandes que cuesta entender que la luz, que viaja a la pasmosa velocidad de 300 mil kilmetros por segundo, demore miles de millones de aos en recorrerle. Pero as es. El problema de imaginar ms o menos correctamente esas dimensiones pasa por nuestra limitacin mental de comprender cabalmente los grandes nmeros. Estamos familiarizados con las unidades comunes, milmetros, metros y kilmetros, tiles en el diario vivir, los que comprendemos correctamente porque los usamos a menudo, pero raras veces nos codeamos con dimensiones de millones de millones de kilmetros o, en el otro extremo, millonsimas de millonsimas de milmetro. Entonces, cuando nos enfrentamos a tales cantidades, perdemos la nocin de lo que ellas representan verdaderamente. Muchas veces manejamos grandes cantidades con demasiada liviandad, hablamos por ejemplo de una riqueza de mil millones de pesos o de un trabajo que demand un milln de horashombre o de un vehculo que tiene un milln de kilmetros recorridos o que la poblacin mundial llega a 6 mil millones de habitantes, etc. Se ha detenido Ud a pensar realmente lo qu significan esas cifras? Sabe Ud. que si contramos a razn de un nmero por segundo sin descansar da y noche, demoraramos once das y medio en contar un milln? Otro ejemplo, si todos los habitantes del mundo actual se pusieran en fila india y pasaran frente a alguien que los contabilizara a razn de una persona por segundo, ese alguien demorara 190 aos en contarlos! En el intertanto la poblacin mundial crecera y, como lo hace duplicndose cada 30 aos aproximadamente, significa que ese alguien estara eternamente contando, sin poder nunca acabar su tarea. Otro caso: cuntos segundos cree Ud. que han transcurrido desde que Cristbal Coln descubri Amrica, hace algo ms de 500 aos? A primera vista se creera que es un nmero gigantesco, casi inexpresable. No es tanto. La respuesta es aproximadamente 15 mil millones de segundos(producto de multiplicar 500 aos por 365 das por 24 hora por 60 minutos y por 60 segundos). Curiosamente esta cifra es la edad del Universo desde su nacimiento hasta ahora, si cada segundo equivaliese a un ao! Cun lejos est la Luna? Si consideramos nuestra conocida unidad de distancia llamada kilmetro (equivalente a 1000 metros) entonces la distancia Tierra-Luna es algo menos de medio milln de kilmetros (exactamente 384.500 km). Esta es una enorme distancia que en nuestro diario vivir casi no se usa. Pero todo es relativo porque si en vez de usar el kilmetro como unidad usamos la distancia de la Tierra al Sol (llamada por los astrnomos unidad astronmica, que equivale a 150 millones de kilmetros!), entonces la distancia Tierra-Luna resulta ridculamente chica, algo as como 3 milsimas partes de esa
distancia. Es decir que si el Sol y la Tierra fuesen dos puntos que estuviesen a 100 metros de distancia la Luna estara a menos de 30 cm de la Tierra. Cun cerca est la Luna y qu lejos est el Sol! Sin embargo, en nuestra vida comn, consideramos que la Luna est muy lejos, tan lejos que los astronautas que viajaron a ella, demoraron ms de tres das en llegar a su destino aun cuando se desplazaban a velocidades de unos 30.000 kilmetros por hora aunque haciendo un recorrido en espiral. Estas comparaciones muestran que a nuestra mente le cuesta bastante darse cuenta lo que significan los grandes nmeros que, por decirlo crudamente, usamos tan sueltos de cuerpo. En otras palabras, las unidades corrientes, por ejemplo metros, resultan ridculamente chicas si las usamos para medir la distancia a las galaxias y ridculamente grandes si la usamos para medir cosas pequeas, tales como microbios o partculas atmicas. Veamos algo ms del macrocosmos. La estrella ms cercana a nosotros se llama Prxima Centauro y est a 4,3 ao-luz1, vale decir que se encuentra a unas 270.000 veces la distancia Tierra-Sol, repito 270.000 veces la distancia de la Tierra al Sol que, a su vez, es de 150 millones de kilmetros! Es algo casi inimaginable verdad?y esto es slo el principio de las distancias astronmicas pues se han podido fotografiar galaxias que estn a ms de 10 mil millones de aos luz de nosotros. Una manera didctica de representar estas cantidades es hacer saltos de 10 en 10, es decir crecer (o decrecer) en factores de diez. Me explico, es posible hacer una escala (similar a una regla graduada en centmetros) en que cada mdulo sea 10 veces superior al anterior (los matemticos la llaman escala logartmica). Para ejemplarizar hagamos en un papel una escala logartmica. Tracemos una recta y hagamos una marca cada centmetro de modo que cada una valga 10 veces la anterior, del siguiente modo: primera marca representa 1 metro, segunda marca representa 10 m, tercera marca 100 m, cuarta marca 1000 m, quinta marca 10.000 m, sexta marca 100.000 m y as sucesivamente. (Para evitar tener que escribir tantos ceros, puede emplearse el mtodo que usan los matemticos, es decir colocar un exponente junto al nmero 10 que represente el nmero de ceros que tendra la cantidad que se quiere representar, por ejemplo, el valor cien, que tiene dos ceros, se representa como 102 ; mil, que tiene tres ceros, se escribe 103 ; un milln, que tiene seis ceros, como 106 , y as sucesivamente. Como la distancia Tierra-Sol es de 150 millones de km, se representa abreviadamente como 150 x 106 kilmetros o bien en nuestra escala logartmica en metros sera 150 x 109 metros. Pues bien, para representar el tamao del Universo2 en metros es necesario hacer 26 marcas en la regla en que cada una valdra 10 veces la anterior. En una tal regla podramos
Un ao-luz es la distancia que la luz recorre en un ao a la velocidad de 300.000 km/seg. Equivale a multiplicar los 365 das por 24 horas por 60 minutos por 60 segundos y por 300.000 = 9.5000.000.000.000 km, lo que se puede escribir abreviadamente 9,5 x 1012 km (se lee 9,5 billones de kilmetros). Para expresar esta cantidad en metros hay que multiplicar por mil, vale decir que se llega a 9,5 x 1015 metros. 2 El tamao del Universo puede calcularse multiplicando su edad por los metros que la luz recorre en un ao . Como la actual estimacin de la edad del Universo desde que ocurri el Big Bang o gran explosin primogenia es del orden de 15 mil millones de aos y, puesto que la luz inicial viene viajando desde
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representar cualquier distancia aproximada, por ejemplo, la altura de una casa de 10 metros (101 ) o la altura de una torre de 100 metros ( 102 ), o la distancia Tierra-Sol que como se dijo es de 150 mil millones de metros (150 x 109 ), etc. En la Tabla final se muestran estas y otras distancias hasta llegar a cubrir el tamao total del Universo. Similarmente se pueden representar cantidades pequeas. Por ejemplo, un dcimo de metro puede escribirse en forma decimal 0,1 m. Un milsimo de metro (llamado milmetro, mm) se escribe 0,001 m. Para llevarlo a nuestra escala se escribe en forma exponencial similar a como se hizo anteriormente con los grandes nmeros, colocando como exponente de 10 el nmero de ceros que contiene el decimal y anteponiendo un signo menos (-) para sealar que es fraccionario. As los nmeros decimales sealados anteriormente como ejemplo, se escriben del siguiente modo: 0,1 m se escribe 10 1 m, y 1 mm que equivalente a 0,001 m se escribe 10 3 m y as sucesivamente. En este mbito, una hormiga de 2 mm puede escribirse como 2 x 10 3 m ; un microbio de un milsimo de mm se puede escribir 10 6 m ; el tomo de hidrgeno tiene un tamao de 10 12 m y un protn 10 18 m. Como se dijo el radio del Universo mide 10 26 m y un protn mide 10 18 m lo que significa que desde el microcosmos al macrocosmos hay una relacin de 10 18 hasta 10 +26 = 10 44 . Es decir el Universo es 10 44 veces ms grande que un protn, cifra que de no disponerse de una escritura abreviada habra que escribirla del siguiente modo: 100000000000000000000000000000000000000000000 En la pgina siguiente se muestra una tabla en escala logartmica donde se sealan los tamaos del macrocosmos.
entonces, el radio total del Universo ser de 9,5 x 1015 metros multiplicado por la edad 15.000.000.000 de aos lo que da muy aproximadamente la bonita cifra de 1,4 x 10 26 m.
ESCALA (LOGARTMICA) PARA REPRESENTAR EL TAMAO DE OBJETOS Objeto Tamao metros Altura de un nio 1 m 10 0 Altura de una casa de 3 pisos 10 m 10 1 Altura Torre Entel 100 m 10 2 Longitud de 1 kilmetro 1.000 m 10 3 Distancia Santiago-Lo Espejo 10 km 10 4 Distancia Santiago-Valparaso 100 km 10 5 Distancia Santiago-Puerto Montt 1.000 km 10 6 Distancia Polo-Ecuador 10 mil km 10 7 2,5 vueltas a la Tierra 100 mil km 10 8 2/3 del dimetro del Sol 1 milln km 10 9 26 veces la distancia a la Luna 10 millones km 10 10 2/3 distancia Tierra-Sol 100 10 11 Distancia Sol-Saturno (1 hora-luz)1 mil 10 12 10 h-l dimetro Sistema Solar 10 10 13 100 h-l, espacio vaco 100 10 14 1000 h-l 1 billn km 10 15 1 ao-luz (a-l), zona de cometas 10 10 16 10 a-l , zona con algunas estrellas 100 10 17 100 a-l estrellas, nebulosas, etc. V.Lctea 1000 10 18 1000 10000 10 19 10.000 100000 10 20 100.000 dimetro Va Lctea 1 milln de billones km 10 21 1.000.000 espacio vaco, Andrmeda 10 milln de billones km 10 22 10.000.000 galaxias, Grupo Local 100 10 23 100.000.000 galaxias 1000 10 24 1.000.000.000 10000 10 25 15.000.000.000 radio del Universo 100000 10 26 En resumen, el macrocosmo est compuesto en su tamao por 6 niveles: Primer nivel. Nuestro mundo cotidiano, mensurable en metros o kilmetros. Segundo nivel. Nuestro Sistema Solar mensurable en millones de km. Tercer nivel. Grupo de estrellas cercanas al Sol mensurable en aos-luz. Cuarto nivel. Nuestra Va Lctea mensurable en miles de aos-luz. Quinto nivel. Grupos de galaxias mensurable en millones de aos-luz. Sexto nivel. Universo mensurable en miles de millones de aos luz
MET Juan Carlos Olavarra 6
Microscopio Electrnico de Transmisin (MET)

Prof. Juan Carlos Olavarra IDIEM Martes 30 de Septiembre de 2003
se ha instituido desde su creacin en los aos 30 en una herramienta de apoyo fundamental para el entendimiento de la ultraestructura de entidades biolgicas y no biolgicas. En esta presentacin haremos una revisin prctica orientada a aspectos tcnicos del funcionamiento del microscopio electrnico. Aquellos que hemos trabajado con microscopios pticos hemos logrado obtener aumentos prcticos de 1000 veces, pero sabemos que cambiando la fuente de luz o radiacin (por ejemplo empleando radiaciones UV), puede variarse el aumento de un microscopio. Esto se basa en la limitacin que pone la longitud de onda utilizada en el poder o lmite de resolucin de un microscopio. En la medida que la longitud de onda empleada es menor, la resolucin (distancia mnima a la que 2 cuerpos cercanos deben estar separados para ser distinguibles como entidades distintas) aumenta. Si consideramos que el ojo humano tiene una limitada capacidad de visin, que slo comprende las radiaciones ubicadas entre los 350 y 700 nm (violeta a rojo, rango visible del espectro de longitudes de onda), y que no percibe ni las longitudes de onda inferiores a 350 nm (UV, radiacin X, , , , rayos csmicos) ni aquellas superiores a 700 nm (IR, microondas, ondas de radio, TV), nos encontramos con la sorpresa de tener una pobre percepcin de nuestro entorno (Figura 1). Nuestro lmite inferior llega a niveles de longitudes de onda que cumplen con las condiciones exigidas a la luz, es decir, reflejadas, focalizadas y colimadas (concentradas), pero no deflectadas, salvo que sufran efecto de masas tal como lo explica la teora de la relatividad de Einstein.
El microscopio electrnico de transmisin
Figura 1: Longitudes de Onda de los diferentes tipos de radiacin existentes.
El manejo de las longitudes de onda nos permite determinar los lmites de ampliacin de las imgenes. En la microscopa de luz empleamos fotones, en tanto que en microscopa electrnica la muestra es iluminada por electrones. stos son de un manejo relativamente fcil. Se ilumina puntualmente, con un menor lmite de resolucin. Puede tomarse una seal y trasladarla al espectro visible. Sin embargo, tienen una baja penetracin pese a la alta aceleracin que se les puede imprimir, por lo que es necesario que las muestras sean muy finas. Dependiendo del espesor y el peso atmico (P.A.) de la masa en observacin, ser la penetracin que tengamos. A mayor peso atmico, menor penetracin. Generalmente, el material observado en biologa es de PA bajo. El MET empleado en biologa se caracteriza por tener bajas aceleraciones de electrones, entre 40 y 100 kV. Al aumentar la energa de los electrones por mayor kV aplicados, se les imprime mayor velocidad, pudiendo pasar desde el estado esttico a la velocidad de la luz.
Componentes del Microscopio Electrnico de Transmisin: En el esquema que sigue, se presentan de manera simplificada los diferentes componentes del MET:
(i). Sistema de iluminacin: Constituido por un can de electrones, encargado de emitir el haz electrnico que incidir sobre la muestra, y por un sistema de lentes condensadoras que coliman o pulen el haz, mantenindolo recto.
(ii). Sistema ptico o de magnificacin: Constituido por una lente objetivo, lentes intermedias y una lente de proyeccin, que amplifican la imagen del espcimen. (iii). Pantalla: Encargada de convertir la seal del haz de electrones que traspas la muestra, en luz visible, permitiendo que se vea el espcimen. (iv). Sistema de grabacin: Consistente en placas fotogrficas, sistema de video o sistema de captura digital, que permite el almacenamiento de la informacin ptica de la muestra, lo que es necesario para el anlisis de las muestras.
a. Can: El can es la fuente de electrones que incidirn en la muestra. Se comporta como una fuente electromagntica (FEM), aportando aceleracin a los electrones. El can est constituido por un sistema de transmisin termoinica, que se comporta como un conductor (que tiene electrones libres; diferente es el caso de los aislante, cuya cantidad de electrones libres es nfima o nula) en que al calentar el conductor aumenta la cantidad de electrones libres en el material conductor, por fuerzas que producen una nube electrnica en torno a este material. Estos electrones libres, al ser estimulados con una energa mayor a aquella que los mantiene unidos al tomo del que forman parte, son expulsados del orbital en que se encuentran y pueden viajar por el vaco hasta que encuentren un objeto en su camino.
Cuando se pone una placa positiva (+) respecto del elemento, sta atrae los electrones libres que se mueven por el espacio; debemos recordar que esta libertad de movimiento est condicionada a que no exista algn elemento que interfiera en el trayecto de estos electrones. Para que los electrones se desplacen libremente el camino a seguir por ellos debe estar completamente libre, por lo que es necesario proporcionar vaco extrayendo gases de la columna.
El aire que respiramos tiene una densidad de 1kg por m3; cuando lo calentamos se aumenta el volumen por aumento de la energa cintica de los tomos que lo componen. Por cada kg de aire, cuando es calentado, aumenta en la carga que ste puede elevar. Por ejemplo, para elevar a una persona de 100 kg se requieren 200 m3. Los electrones que se encuentran en el aire tienen poca masa comparados con los de algunos metales, principalmente aquellos empleados en microscopa electrnica. Uno de ellos es el oro, cuya densidad es 20 kg/l; el aire por contrapartida tiene una densidad y peso equivalente a 20000 veces menos. Cuando existe una perforacin en la pantalla, la mayora de los electrones quedan detenidos en el nodo, pero aquellos que pasan a travs de la perforacin viajan por el vaco en direccin al infinito con una baja eficiencia. El nodo mide de 4 a 5 mm2, en tanto la perforacin mide 3 mm de dimetro. El filamento generador de electrones tiene forma de punta en V y est conectado a la FEM. Cuando alcanza la temperatura de 1000 C este filamento incandesce, generando trabajo y potencia.
El filamento es un pequeo alambre de 1 cm por lado; no importa la polaridad pues la FEM se encarga de calentar el filamento aumentando con ello la energa cintica de los electrones de la punta del filamento. En el otro extremo del circuito hay un nodo, que es un elemento circular con una perforacin central, cuyo potencial es (+). Dado que los electrones se repelen entre s por similitud de cargas, estos se dirigen hacia el nodo.
Protegiendo al filamento se encuentra un componente denominado Cilindro de Wehnelt, que focaliza el haz de electrones. A travs de la apertura central de este cilindro se produce el cruce de electrones, formndose un embudo de electrones, de los que la gran mayora pasan a travs de la perforacin. La fuente del filamento genera una tensin de 6 a 12 V, en el cilindro de Wehnelt se produce una tensin de 100 V, y en la FEM de 400 a 250 kV. Algunos microscopios, particularmente los de alta aceleracin, emplean FEM de 2 MV. Los kV aplicados al filamento dan energa a los electrones para acelerar y ser liberados desde el filamento al vaco. En la fuente del filamento, la intensidad o corriente final define la cantidad de electrones que fluyen en el haz. Al aumentar la cantidad de energa, se incrementa el kV, y al elevarse la cantidad de electrones, tambin la Vf. Un concepto importante es la corriente de saturacin, que corresponde al mximo contraste o brillo a obtener. Para que todos los electrones tengan la misma energa el voltaje debe ser estable. En caso de haber fluctuaciones en el voltaje, las diferencias de energa de los electrones se traducir en la alteracin de las imgenes obtenidas. Lo mismo ocurre con el flujo o corriente de electrones. La medicin de la estabilidad del sistema se hace en ppm.
b. Lentes: El haz de electrones tiene un comportamiento similar a la luz con los lentes pticos, es decir, iluminan el sector a observar. La iluminacin debe ser uniforme. c. Portamuestra: Permite mover la muestra en los planos X e Y, as como en direccin oblicua (ngulo Till). Cuando se estudia material cristalino, se produce una imagen de difraccin de electrones al mover el portamuestra. Las imgenes obtenidas pueden ser transparentes (por transparencia del objeto), u opacas (obtenidas por reflexin de la imagen del objeto). En el MET las imgenes se obtienen por transmisin. Cuando se estudia material cristalino, por difraccin de electrones se configuran puntos que permiten al especialista en cristales analizar las estructuras. Retomando el anlisis del sistema de lentes, mencionaremos las componentes y posteriormente cmo se forman las imgenes. (i). Lente Objetivo: Es el que realiza el aumento, focalizando la imagen en la pantalla. Aumenta en aproximadamente 20 veces (20x) el objeto. (ii). Lentes Intermedia y Proyectiva: Aportan la potencia ptica al microscopio, contribuyendo a un aumento ms alto. La lente proyectiva, que da una alta magnificacin, es una pieza polar intercambiable (anloga a los objetivos de los microscopios), dando un aumento de unas 5000 veces (5000x). por su parte, la lente intermedia da un aumento de 100x. (iii). Pantalla: Compuesta por una lmina metlica cubierta por un polvo de Fsforo, Carbono o Cadmio, convierte la energa elctrica en luz. Los elementos antes mencionados emiten fotones siguen una onda dentro del espectro visible, al ser bombardeados por electrones. Se emplea tambin cristales que convierten electrones en fotones.
En la pantalla, las imgenes se forman con tonos de grises, presentando una gran resolucin de elementos pequeos. Habitualmente, se asocia a la pantalla un sistema de grabacin o almacenamiento de imgenes, como cmaras fotogrficas convencionales o digitales, fotomultiplicadores, sensores, u otros que puedan conectarse a computadores, que capturan las imgenes a una resolucin que es deseable para su interpretacin. Forma y funcin de los lentes: En un conductor, la velocidad de los electrones que fluyen por l depende de la cantidad de electrones excitados. El valor de la velocidad puede alcanzar la velocidad de la luz. La formacin de las imgenes se relaciona con el tiempo de demora de la ampolleta en encenderse. La velocidad de los electrones, comparada con la de la luz, es lenta. Considerando que cada lente tiene una distancia focal fija (distancia entre el lente y la muestra), uno tiende a pensar que slo cambiando la forma de ste puede obtenerse una distancia focal (Df) diferente. Al pasar los electrones por los condensadores y los lentes (que en el esquema de la figura 2 son representados con forma de cajn), son focalizados en un punto. La distancia focal es ajustable. En el caso de la luz, sta puede ser focalizada y reflejada, pero no reflectada con campos visuales. En el caso del LASER este se basa en un sistema de reflexin resistente a espejos. Los electrones, por su parte, pueden ser generados (por el can de electrones), focalizados, colimados (condensados y enfocados, en ambos casos por las lentes electromagnticas y el sistema de apertura) y deflectados (por campos elctricos E, y electromagnticos B). En el universo, la luz es reflectada por efecto de la masa, tal como ocurre con la luz de los astros al pasar cerca de algn planeta.
El flujo de electrones sucede a travs de material magntico, formando un campo en el aire. Cuando el electrn se mueve en el sentido del campo magntico no existe fuerza sobre l. F=B x vsen En la frmula, el valor de la fuerza ejercida sobre el electrn aparece cuando el ngulo formado entre su direccin y el campo magntico es mayor que 0.
Las lneas de fuerza, como vemos en la figura, forman un ngulo igual a 0. El electrn, al moverse en forma espiralada, genera una vuelta. Todos los electrones pasan por un punto. El electrn puede salir en cierto ngulo con un giro. Ahora bien, el punto de focalizacin depender de la geometra y de la corriente que pasa por el lente. La capacidad de focalizacin desde el infinito por el punto focal mximo, cuando con 0 se produce en infinito. La variacin del poder cambiando. La calidad del MET est en ntima relacin con la perfeccin de la pieza polar, aumentando el umbral de calidad al microscopio. La mecnica debe ser muy precisa. Todos estos factores cambian las funciones de cada lente. Algunas lentes proyectivas tienen piezas intercambiables, por lo que la pieza polar de la lente le otorga la capacidad de cambio. Como puede deducirse de lo antes dicho, el volumen y la forma de la lente cambian entre las diferentes lentes, pero la constante transferi no. J= Ri2 La frmula anterior es la sntesis de la ley de Joule. La generacin de calor ocurre por un cambio en la geometra de los cuerpos. Las lentes, dentro de la columna del microscopio electrnico se calientan siguiendo esta ley; debido a ello, es necesario un sistema de enfriamiento formado por una camisa fra por la que circule agua u otro lquido fro, que ayude a mantener la temperatura de la columna interior estable, y que adems evite un sobrecalentamiento.
Sistema de formacin de imgenes: La columna del microscopio requiere vaco en su interior para la obtencin de imgenes debido a ciertos inconvenientes intrnsecos: los electrones, por la longitud de onda que tienen, presentan un bajo poder de penetracin, siendo necesario vaco para que transiten libremente; cuando existe aire, puede formarse un arco voltaico entre el nodo y el ctodo (en este caso el filamento), que pudiera causar perjuicio al microscopio al producirse la oxidacin del filamento que se quemara, y adems en el aire que pudiera haber, se encuentra agua, que puede tambin deteriorar el funcionamiento del microscopio. Siempre debe considerarse la presin atmosfrica del lugar geogrfico donde se encuentre el microscopio electrnico de transmisin. Por convencin, se considera que la presin
atmosfrica normal es de 760 mm de Hg a 25 C a 0 metros sobre el nivel del mar (msnm). La presin interna en el ME va desde un mnimo de 10-4 mm de Hg hasta el nivel ptimo de 10-6 mm de Hg. El vaco se hace de forma anloga al secado de un balde lleno de agua: 1. 2. Se saca la mayor parte del aire con una bomba Se extrae el aire residual con bombas de alta presin de vaco, para extraer al mximo.
Habitualmente, queda una presin de aire inferior a 1 mm de Hg, en forma de humedad. Con una bomba mecnica o rotatoria se logra un vaco de 10-1 a 10-2 mm de Hg, en tanto que con una bomba de alto vaco se extraen diferenciad de presin de 10-2 a 10-4 mm de Hg. Con la bomba gruesa, se saca la fraccin mayor de aire (10-1 a10-2 mm de Hg), mientras la diferencia menor es succionada con una bomba de alto vaco, como se muestra en el esquema.
La bomba de alto vaco puede ser de tipo difusora de aceite, una de las ms econmicas y de fcil mantencin; puede tambin ser turbo molecular, o bien inica. En el caso de la bomba rotatoria, la pared se sella con aceite.
El aceite de la bomba de vaco pasa del estado slido a gaseoso saturando el medio; para que exista un flujo debe existir una diferencia de presin (P) que en este caso es de 10-3 a 10-4 mm de Hg. Como condicin de preoperacin, debe existir un prevaco producido por saturacin de gas, optimizando la bomba con faldas. En la prctica, se intercalan vlvulas para ayudar a vaciar gradualmente la columna. La bomba difusora requiere de un precalentamiento de aproximadamente hora. Cuando se abren por ejemplo V1 y V3, se saca aire con la bomba rotatoria, se hace andar el sistema de calefaccin de la bomba difusora, y luego se cierran estas vlvulas. Entonces se hace el prevaco abriendo V2, que luego se cierra para abrir V1 y V3. Para inyectar aire, se cierran V1 y V2, abrindose V4 (que no aparece en la figura). Las llaves del sistema se abren. Algunos cambios en la configuracin bsica se relacionan especialmente con la medicin de vaco. Por ejemplo, se emplean sistemas de prdida de calor o de ionizacin de gas. Si se entrega calor a un cuerpo, ste eleva su temperatura hasta que se estabiliza, dependiendo de la cantidad de electrones y de aire en contacto. En el vaco puede aumentar la temperatura de un cuerpo. Este aumento de temperatura puede medirse con una termocupla, que consiste de un filamento de cobre y fierro conectado a un circuito alimentado por una fuente electromagntica; este sistema est conectado a un medidor de voltaje que muestra una variacin de voltaje, manifestacin de un cambio de tensin en funcin de la temperatura. Habitualmente la termocupla est conectada a un sistema de prevaco por prdida de calor.
A travs de la termocupla circula corriente, que calienta un cuerpo, generando mV. En el caso de un sistema de vaco cambia la temperatura al vaco. La termocupla, como cualquier otro instrumento, puede ser calibrado para obtener mejores mediciones.
Otro sistema empleado para generar vaco es el de autovaco, que consiste en un sistema de ionizacin en que un fusible o botella con 2 electrodos conectados a un sistema de alto vaco y a un microampermetro alimentados por una FEM. En condiciones normales de presin atmosfrica el gas no se ioniza (es decir, no es conductor) y la temperatura es igual a 0. al extraer el aire, la presin disminuye ionizndose el gas (circula corriente). No existen elementos de ionizacin en forma normal, pero al hacer vaco se ionizan. Los componentes fundamentales a considerar para la ionizacin o paso de corriente son la existencia de iones, electrones y bloques de masa.
Deben considerarse condiciones de doble ionizacin, electrones. Al sacar aire hasta lmites cercanos a 0, se produce un vaco mximo, dando una parbola que muestra una condicin similar a la de un sistema lleno de aire.
Dado el calentamiento del microscopio electrnico de transmisin, debe contar con un sistema de enfriamiento, idealmente cerrado. Uno de estos es el de pared fra, que capta el calor del microscopio, enfra el aire y elimina el calor por un radiador. Este tipo de refrigerador emplea un circuito de caera cerrada en que circula agua por un serpentn que mejora el enfriamiento. Este enfriador debe ser tratado para extraer las sales calcreas que se acumulan en las caeras. A su vez, debe controlarse la temperatura, y usarse controles de calidad de oxidacin y de pH adecuado (que no sea destructivo). El sistema de enfriamiento debe mantener baja la temperatura de las lentes. Estas lentes se caracterizan por tener bobinas de bronce y piezas magnticas. Existen cmaras que sirven para enfriamiento. El aumento de temperatura por volumen se mide en caloras. 1 caloras equivale a la elevacin de 1 cc de agua en 1 C de temperatura. Para el caso del aceite, la elevacin de la temperatura en 1 C requiere de 4 caloras. Como ancdota, debemos tener en cuenta que 1 gota de aceite caliente causa menos dao que una de agua. Sin embargo, dado que el agua tiene una capacidad de transporte de calor equivalente a 1.6 veces la del aceite, la posibilidad de enfriar el sistema por parte del agua (la reduccin de la temperatura interna), es mejor respecto del aceite.
Los sistemas de refrigeracin emplean compresin y enfriamiento. habitual de uso es 15 C. Debido a esto, es necesario un enfriamiento forzado.
La temperatura
Para redondear lo antes expresado, veremos a continuacin los criterios de eleccin de un microscopio electrnico. Primero, debemos considerar el propsito de utilizacin; debe reunirse al personal que lo emplear; cotizar con antecedentes y utilidades proporcionadas por los diferentes fabricantes. La disponibilidad del servicio tcnico. Analizar el costo, el buen funcionamiento del campo, la informacin tcnica de repuestos e insumos, el compromiso de aporte del representante, la informacin disponible, la capacitacin del personal a cargo. Establecer un protocolo de entrega: montaje del microscopio, supervisin de cada etapa y de la forma de montaje, verificar las condiciones. Revisar las especificaciones, las condiciones de iluminacin, verificar si cuenta con proteccin contra ruido y antissmica. Para evitar vibraciones, debe ser puesto en un lugar que tenga suelo firme y adems lejos de reas de vibracin (en un zcalo o patio, alejado de la calle). Crear fundaciones slidas assmicas de concreto armado, aislado de la tierra. Las vibraciones de menos de 1 ciclo son perjudiciales para el microscopio; lo mismo ocurre con los movimientos ssmicos, que son vibraciones de ms de un ciclo. Las vibraciones entre 0.1 y 1 ciclo, son de baja audibilidad. El equipo de microscopa electrnica debe traer aislamiento de tierra y vibraciones. Deben evitarse tambin los cambios electromagnticos de baja frecuencia que son nocivos. Debe prevenirse la presencia de ductos y lneas de potencia, que han de aislarse. Ha de protegerse adems el espacio fsico. En Chile, la frecuencia de la corriente es de 50 Hz. Para proteger al microscopio de las diferencias de frecuencias se emplea una celda Fahrenheit para radiofrecuencias. Debe comprobarse adems la calidad de la lnea elegida (en relacin con la calidad de la imagen).
Hay que revisar la alta tensin diferente de la lnea, que debe regularse sin conexin a motores (debe ser estable, no conectarla a generadores o grupos electrgenos). No deben haber alfombras (generan esttica y pelusas que contaminan el microscopio), el piso debe ser antiesttico, de ser posible el cuarto de microscopa debe tener diferencia de presin y doble puerta, el piso debe ser totalmente pulido, sin rayaduras posibles.
ADOLFO ROS-ALCORTA
Fijacin en M E- Julieta Gonzlez 19
Fijacin en Microscopa Electrnica

Prof. Julieta Gonzlez Mircoles, 15 de Octubre de 2003
Las muestras biolgicas, para ser observadas a la microscopa electrnica de transmisin,

deben ser fijadas. El proceso de fijacin tiene como finalidad ltima conservar la estructura celular de forma similar a aquella que tena en vida. Para los estudios ultraestructurales se emplean principalmente 2 tipos de fijadores: glutaraldehdo y tetrxido de osmio, que son utilizados en forma secuencial. Para la eleccin del fijador ms apropiado siempre debe tenerse claro el objetivo y el propsito del estudio. Es as, por ejemplo, que el uso de enzimas, el estudio con anticuerpos, o de la morfologa influyen de manera similar al tiempo, pH y temperatura. Siempre deben emplearse soluciones tamponadas de fijador al pH del sistema biolgico en estudio, procurando mantener un equilibrio entre la solucin en uso y los elementos intracelulares. Es fundamental para ello considerar la osmolaridad, o cantidad de partculas presentes, determinando la densidad del tejido. Para este fin debe primero homogeneizarse el tejido y luego con un osmmetro se mide la osmolaridad. Los tampones utilizados contienen una sal y su base o cido, segn sea el caso. La concentracin aproximada de los tampones es 0.1 M. Para mantener la osmolaridad se usan otras sustancias neutras que no modifican por carga los dominios celulares. Por ejemplo la sacarosa aumenta el nmero de partculas. Al preparar un fijador debe calcularse la contribucin de la sacarosa, medir el pH y la concentracin, y agregar luego sacarosa. Las propiedades del fijador se estandarizan de acuerdo al tipo de tejido. Las modificaciones de concentracin, pH, temperatura, pueden producir artefactos. Analicemos ahora los 2 fijadores empleados en MET. 1. Glutaraldehdo: Es un dialdehdo, con 5 carbonos, lineal, con 1 enlace y 1 . Los electrones del grupo aldehdo de esta molcula se deslocalizan hacia el O. El carbono electropositivo causa que los H cidos salgan. Una molcula con centro positivo se forma y da interacciones entre 2 molculas de glutaraldehdo generando grupos - no saturados. Estos grupos generan compuestos heterocclicos que luego polimerizan. Todos estos grupos se encuentran en las soluciones comerciales de glutaraldehdo y son contaminantes. Se puede evitar con atmsferas inertes, sellando con atmsfera de N gaseoso, midiendo por densidad ptica de la solucin (Absorbancia). En atmsfera rica en oxgeno se genera cido glutrico, que no sirve como fijador. Este inconveniente es superado usando filtros de carbono activado que captura productos cclicos permitiendo el paso de los - no saturados y del cido glutrico. Tambin se emplean columnas de sephadex (poros muy pequeos para capturar partculas). El producto se mantiene en
ampollas de 1 ml, que una vez abiertas pueden ser reselladas en ampollas con atmsfera de N; se usa en poca cantidad o bien se resella con parafilm a -20 C. Al pasar el tiempo el contenido de las ampollas se modifica. A pH 4.5 el glutaraldehdo es ms estable por existir ms cantidad de H+. El carbanin se estabiliza saliendo H+ al medio para compensar la formacin de carbonio. La forma lineal del glutaraldehdo es la requerida para la fijacin. Las propiedades de uso del glutaraldehdo se basan en el entrecruzamiento. Es as que 2 grupos vecinos dentro de una misma protena o entre 2 protenas, o bien lejos entre protenas o en una misma protena, pueden formar puentes metilnicos con el glutaraldehdo. La forma de interaccin vara la estabilidad molecular, y modifica la conformacin proteica. Estas interacciones permiten conservar grupos reactivos para ser identificados con diferentes metodologas.
Por ejemplo, para inmunocitoqumica, el glutaraldehdo se usa muy diluido en conjunto con otros aldehdos como el paraformaldehdo. La fijacin se hace por un tiempo mnimo con el fin de mantener reactivos la mayora de los grupos. Como mecanismos propuestos, se sugiere la adicin nucleoflica, en que grupos con afinidad por cargas positivas interactan. Un ejemplo de ello son los grupos amino, que tienen 2 electrones libre, sin compartir, que pueden ser cedidos a grupos deficientes en electrones o electrfilos. En las protenas existen grupos sulfhidrilo (cistena), amino, hidroxilo (tirosina). Los grupos ms importanten son los amino, que abundan ms que los otros y tienen mejor capacidad nucleoflica. Los grupos amino forman enlaces metilnicos con el glutaraldehdo. Los aldehdos modifican la estructura terciaria, en tanto las estructuras primaria y secundaria son poco modificadas, lo que explicara que algunas enzimas conserven su actividad; adems permiten medir las caractersticas osmticas pues la mantienen en las clulas (por ejemplo el transporte de membrana). Conserva adems los dominios intramembrana por mantener la -hlice.
2. Tetrxido de Osmio (OsO4): Este fijador estabiliza los lpidos. El osmio tiene nmeros de oxidacin 2, 4, 6 y 8. fue introducido como fijador aproximadamente en 1936 por Criege. El tetrxido de osmio es un fijador de tipo oxidante, de larga data (antigedad) de uso, lo mismo que el permanganato de potasio (oxidante ms enrgico).
Un ejemplo de utilizacin de tetrxido de osmio es el de fijacin de bacterias, que presentan entre sus estructuras un mesosoma, que corresponde a una invaginacin de la membrana plasmtica con presuntas funciones REDOX. Este organelo se ha observado adems en hongos como Neurospora crassa. Cuando las bacterias son fijadas con permanganato de potasio, esta estructura se observa estirada, en tanto que con tetrxido de osmio se ven espiralazas, enrolladas. A partir de esto sera interesante determinar mediante criofractura cul es la real forma del mesosoma in vivo, pues no se usa fijacin qumica.
Los lpidos, compuestos de glicerol, cidos grasos y aminoalcoholes, pueden formar interacciones con estos fijadores oxidantes, y particularmente con tetrxido de osmio, el que acta a nivel de los dobles enlaces de las molculas de lpidos. Los oxgenos con carga negativa de la molcula de tetrxido de osmio van a reaccionar deslocalizando electrones en el doble enlace, esto lleva a la formacin de un intermediario 1,2-glicol (grupos OH vecinos) o 1,2-diol. Esto hace que OsO4 se reduzca a OsO2, que se observa como un precipitado negro y en caso de continuar la oxidacin forma nuevos grupos 1,2-glicol. Los monosteres de osmio, al reaccionar con 1,2-glicol forman alcoholes. Esta reaccin se traduce en entrecruzamientos entre 2 fosfolpidos, que corresponde a un punto de transicin. Por esta razn no es conveniente utilizarlo en ICQ. Los cidos grasos puros extraen todos los tipos de disteres de osmio formados. La forma de presentacin del osmio es lquida, transparente, ligeramente amarillento cuando est concentrado (+8) y negro profundo cuando su estado de oxidacin es (+2). Este fijador se prepara en solucin acuosa; el osmio es voltil, tiene una presin de vapor muy alta, por lo que produce una rpida fijacin. Los trozos a fijar, sin embargo, deben ser muy pequeos por su baja velocidad de penetracin, pues de ser grande la muestra slo fija las caras de contacto y el centro de la muestra quedara crudo, sin fijar. La velocidad de difusin del osmio depende de la densidad de trama del tejido, la periferia se fija antes que el interior y esto da una mayor rigidez. El tetrxido de osmio es empleado por 1 hora a temperatura ambiente para fijar, tiene una penetracin homognea. Slo se fija con la cantidad necesaria, pues el tejido podra fragilizarse y quebrarse.
Adolfo Ros-Alcorta
Inclusin en ME- Cecilia Leyton 22
Medios de Inclusin
Prof. Cecilia Leyton Mircoles 8 de Octubre de 2003
La mayora de los preparados que se ven en ME son artefactos. Cada preparado pasa por un proceso
que se inicia con la fijacin, para M.E. se fija con dos fijadores, primero con glutaraldehdo y luego una postfijacin con tetrxido de osmio. Cada fijador tiene un efecto sobre las estructuras celulares, por tanto no se ven las clulas tal cul son, sino que se ve un artefacto de tcnica repetitivo consecuencia del uso de esos fijadores o consecuencia del uso de los deshidratantes si es que se utiliza un medio hidrfobo. Posteriormente, a las protenas, que estn constituyendo las estructuras celulares, se les da un contraste con colorantes electrnicos que son metales pesados que se van a adherir a las protenas de una manera ms o menos selectiva. Entonces, cuando se obtienen preparados, las estructuras celulares que se ven representan artefactos de tcnica, pero cuando los artefactos de tcnica son repetitivos, en cuanto a las condiciones en que se trata un determinado tipo celular, pasa a constituir la normalidad para ese determinado tejido. El procesamiento de los tejidos para ME es similar al que se realiza para M ptica con la diferencia del uso de algunos reactivos y que se va a tratar el tejido de una manera distinta especialmente porque el tamao de las muestras es muy pequeo (2 mm), importando sobre todo el grosor de las muestras. Entonces, en el procesamiento de las muestras hay que tratar de minimizar al mximo los artefactos de tcnica. Cuando se comienza a tratar un tejido nuevo se debe estandarizar la tcnica para ese tejido hasta conseguir lo que se pretende en las mejores condiciones de morfologa que se requiere. Los tipos de medios de inclusin son: - resinas acrlicas: hidrfobas: metacrilatos hidroflicas. - resinas epoxy: hidrfobas: epn 812, araldita, spurr (baja viscosidad) hidroflicas: LR white, LR gold, lowicryl. - resinas polister. Dependiendo del objetivo del estudio, las resinas incluso se pueden mezclar. Supongamos que interesa preservar estructuras celulares que son solubles en el deshidratante y por las cualidades de corte, se desea incluir en una buena resina epoxy hidrfoba (epn 812),resistente al haz de electrones y permeable a los colorantes electrnicos. En este caso, lo que se puede hacer es despus de pasar por los lavados del fijador, pasar por una resina hidroflica en concentraciones crecientes, como el durcupan, que adems es miscible con epn, lo que permite realizar despus una impregnacin con epn en concentraciones crecientes para finalmente incluir la muestra manteniendo la estructura soluble porque se elimina la deshidratacin. La mayora de las resinas epoxy son mezclas de resina, acelerados, plastificante y endurecedor. Las resinas de ltima generacin tienen la ventaja que se usan tal como vienen, no es necesario prepararlas. Pero, cuando se prepara la resina de impregnacin se enriquece el preparado porque cada uno maneja cuan dura es la mezcla final, cuan blanda, cuan plastificada porque se pueden variar los componentes de acuerdo a los objetivos del estudio. Si consideramos una resina hidrfoba como el epn, los pasos que se deben seguir son: - fijacin: glutaraldehdo. - lavado: en el mismo buffer en que se prepar el fijador. - postfijacin: tetrxido de osmio. - lavado: en el mismo buffer en que se prepar el fijador o en agua.
- deshidratacin: etanol, acetona, alcohol isoproplico, cloroformo. El ms usado es el etanol en escala ascendente para extraer el agua del tejido. - lquido intermediario: Como el etanol no es miscible con las resinas (epn, araldita, spurr), luego de la deshidratacin hay que pasar por un lquido orgnico que se llama aclarante, que tiene la ventaja de ser miscible con el etanol y con el medio de impregnacin. - impregnacin: con el mismo medio en que se va a realizar la inclusin, se hacen baos en concentracin creciente para reemplazar el aclarante por la resina hasta llegar a resina pura en la que se incluye el tejido. lquido aclarante 3 1 1 0 resina 1 1 3 resina pura
La proporcin y tiempo de la impregnacin depende del protocolo establecido, pero siempre el ltimo bao es de resina sola. La resina de inclusin debe ser recin preparada y sin agitacin para evitar la formacin de burbujas. Esto es en trminos generales, lo que se hace siempre que se utiliza un medio de inclusin hidrfobo. Todo este proceso puede ser a temperatura ambiente o a 4C, dependiendo del trabajo que se realice. Una vez realizada la inclusin con su nmero de identificacin correspondiente, se lleva el molde a una estufa con una temperatura entre 70-80C para que polimerice. Esta estufa debe estar destinada exclusivamente para este fin, no puede ser en la que se seca el material de vidrio porque no pueden haber vapores de agua. Otras resinas para que polimericen hay que exponerlas a luz UV o a luz de cuarzo. Se dejan polimerizando entre 2-5 das. El procesamiento de una muestra para ME es largo, razn por la cual es necesario cuidar los detalles para obtener un buen preparado, porque slo se va a evidenciar un mal procesamiento al momento de realizar el corte. Si el bloque est blando quiere decir que no polimeriz bien porque le qued lquido aclarante, entonces se va a romper. Si el bloque est muy duro va a ser difcil cortarlo. Otras veces no va a costar cortar el bloque y se va a poder teir los cortes, pero una vez en el microscopio, si se prepar mal la mezcla de epn las cualidades de resistencia del plstico, que va a ser expuesto al bombardeo del haz de electrones, no se va a mantener y se va a disgregar junto con el tejido. Entonces es necesario tener una buena mezcla de inclusin y una buena impregnacin de la resina en el tejido. Deshidratantes Como deshidratantes se utilizan lquidos anhdros como alcohol etlico, metlico, butlico, isoproplico, cloroformo y acetona. Cuando se usa acetona se puede eliminar el paso por el lquido intermediario porque es miscible con algunas resinas, por ejemplo con el vestopal. Pero, al comparar la acetona con el alcohol etlico, la acetona es un deshidratante mucho ms fuerte, provocando mayor retraccin al tejido. Entonces hay que equilibrar el costo-beneficio. Puede ser muy bueno eliminar el paso por el aclarante, que es el xido de propileno, pero por evitarlo se produce una gran alteracin al tejido. Igual que para la MO, la deshidratacin se hace en una escala ascendente de alcoholes, pero para la ME es conveniente, por lo delicado del trabajo y porque cualquier salida brusca de agua va a provocar distorsin de las membranas, va a arrastrar componentes celulares, etc, comenzar con una graduacin de alcoholes mucho ms baja que para la MO. El tiempo de deshidratacin va a depender del tipo de tejido, del grosor de la muestra y del medio deshidratante a emplear, si se usa acetona los tiempos son ms cortos que con etanol, en general no son
tiempos largos, pero en el caso de tejidos ms densos aumentan al igual que en el caso de tejidos que cuesta sacarles el agua como los tejidos vegetales. La mayora de los deshidratantes son solventes orgnicos enrgicos, que provocan retraccin de los tejidos y extraccin de constituyentes celulares. Hay que tener cuidado con el tiempo de deshidratacin porque si se deja mucho tiempo se puede extraer los lpidos, especialmente los de membrana aun cuando se haya realizado una postfijacin en tetrxido de osmio. Algunos investigadores como Milloning (1996), aconsejan para evitar los artefactos de retraccin en la salida brusca de agua, agregar a los baos de deshidratacin cuando se usa etanol, NaCl 0.5%. Otro autor afirma que se obtienen mejores resultados al usar metanol en comparacin al uso de etanol. En el caso de la acetona, aconsejan usarla a 4C; otros dicen que provoca menos retraccin que el etanol cuando se usa por poco tiempo; no reacciona con el tetrxido de osmio, mientras que el etanol s lo hace, precipita, si no se lava bien el tejido luego de la postfijacin y se ve al microscopio como un fino precipitado negro; no reacciona qumicamente con algunos monmeros epoxy, lo que permite evitar el paso por el aclarante; extrae menos los fosfolpidos que el etanol; algunos autores prefieren comenzar la deshidratacin a temperatura ambiente y luego seguirla en fro, con lo cual se minimizara la extraccin de lpidos. En el caso que se tenga que dejar la muestra por fuerza en etanol, se recomienda dejar en etanol de 70 a 4C. Lquidos Intermediarios Los lquidos intermediarios o aclarantes ms usados son la acetona y el xido de propileno, que es un epoxipropano, introducido en MET por Left (1961). El xido de propileno se caracteriza por tener una viscosidad relativamente baja, infiltra rpidamente el tejido y reduce la viscosidad de las resinas, que mientras menos viscosas sean van a infiltrar ms rpidamente el tejido, entonces es una buena caracterstica el hecho que reduzca la viscosidad de las resinas, especialmente de algunas que son muy viscosas. Es un compuesto muy reactivo que puede combinarse con algunos grupos reactivos de las clulas y afectar algunas reaccin histoqumicas e inmunohistoqumicas. Cuando se va a hacer un estudio ICQ para MET hay que tener mucho cuidado con el uso del xido de propileno, probablemente se va a tener que evitar. Esto se puede evitar usando acetona o un medio de inclusin hidrfobo. El ltimo bao de impregnacin, que es el ms largo, dura 1 da para tratar de extraer del tejido todo el xido de propileno que pudiera quedar porque va a influir en la calidad del bloque de inclusin. Si quedan trazas de xido de propileno en los tejidos, este va a reaccionar con los grupos epoxy de algunas resinas inhibiendo o alterando la polimerizacin, lo que se va a reflejar en la dureza del bloque de inclusin, se va a obtener un bloque muy blando. Se recomienda usar en tiempos muy cortos, 5-10 min, como mximo.
RESINAS
Caractersticas generales de los medios de inclusin: - poca extraccin de los componentes celulares. - en su forma monomrica, que es la forma comercial, deben ser de fcil solubilidad en los solventes usados. - penetrar los tejidos en forma fcil y rpida. - termoestabilidad alta durante el bombardeo electrnico. - baja viscosidad, los que son muy viscosos demoran ms en infiltrar el tejido. - buenas cualidades de bloque de inclusin: que sea homogneo en cuanto a su dureza. - que tenga una dureza suficiente para hacer cortes ultrafinos (nm). - que tenga una plasticidad y una elasticidad suficientes, no se necesitan bloques duros y rgidos, tienen que tener cierta plasticidad y para eso se les agrega ciertos monmeros que dan esa caracterstica, los llamados plastificantes. - polimerizacin uniforme.
- que preserve las estructuras, es decir, que no extraiga los constituyentes celulares. - que permitan la penetracin de los medios contrastantes que son metales pesados. - que sean miscibles con otros medios de inclusin, lo que permite hacer mezclas. Los mayores inconvenientes que se pueden presentar para lograr un buen bloque de inclusin para ME son: - no conseguir una buena infiltracin del medio de inclusin porque el tejido no qued bien deshidratado ni bien aclarado. - no conseguir un bloque de inclusin con la dureza apropiada para poder hacer cortes ultrafinos, debe ser ni muy duro ni muy blando. Generalidades de los medios de inclusin: - se venden como compuestos semifluidos, de una viscosidad diferencial entre unos y otros, y de composicin qumica monomrica. - tienen un tamao molecular, viscosidad y un ndice de polimerizacin variable para cada resina. - por accin de reactivos activadores, endurecedores, plastificantes, aceleradores, luz UV o del calor pasan de monmeros lquidos a polmeros slidos. - los polmeros se clasifican en polmeros inestables o reversibles o en polmeros irreversibles. Para MET interesa obtener los irreversibles, porque los reversibles bajo ciertas condiciones recuperan su estado lquido, lo que no servira porque entre los componentes de las mezclas se establecen enlaces dbiles, en cambio en los polmeros irreversibles, al asociarse los monmeros de las mezclas se forman nuevos grupos qumicos que forman uniones covalentes o electroestticas, lo que va a permitir mayor estabilidad de los componentes al momento de recibir el haz de electrones. - de acuerdo a la forma de asociacin de los monmeros en estos polmeros, se van a clasificar en polmeros de distinta estructura, por ejemplo los metacrilatos, que fueron las primeras resinas que se usaron en la MET se dejaron de usar porque formaban polmeros lineales. Los metacrilatos estn formados por N-metil metacrilato y N-butil metacrilato y a eso se le agrega un acelerador, cuando comienzan a polimerizar, las molculas se asocian en forma lineal, lo que no es estable por no ser termoestable. Entonces al colocar los cortes en metacrilatos con polimerizacin lineal, con el bombardeo del haz de electrones la resina se rompe y adems al romperse se subliman contaminando la columna del microscopio. Otro tipo de polmeros son los polmeros cclicos, formados por la adicin de monmeros que presentan anillos de cuatro o ms tomos de carbono, no son muy usados. Los mejores para MET son los polmeros cruzados, se forman polmeros lineales o cclicos que presentan grupos reactivos que interaccionan formando redes tridimensionales muy estables, los grupos reactivos presentes en los monmeros de las mezclas de resinas establecen puentes que pueden ser teres y eso le da estabilidad a la molcula, porque este tipo de puentes son resistentes al calor y a los solventes orgnicos. Los grupos epoxy, caractersticos de las resinas epoxy, pueden interaccionar con otros grupos epoxy presentes en otros monmeros de la mezcla o pueden interaccionar con grupos hidroxilos presentes tambin en la molcula de la resina epoxy, o bien pueden interaccionar con anhdridos cidos que estn presentes en los agentes endurecedores, que tambin estn como monmeros. Entonces, si hay interaccin entre dos o ms grupos epoxy, entre grupos epoxy-hidroxilo y entre grupos epoxy-anhdridos cidos, obviamente que la red de interacciones que se constituye en el polmero es mucho ms estable y da cualidades de inclusin mejores que otras resinas. Caractersticas generales de algunas resinas: resina vestopal araldita viscosidad densidad 900 2500 1170 1081
epn 812 maraglas
1400 565
1158 1121
La viscosidad de las resinas tambin tiene que ver con el tamao de cada molcula, hay monmeros que son mucho ms grandes, la araldita, por ejemplo, al compararla con el epn es mucho ms grande, siendo las dos resinas epoxy y eso se refleja en su viscosidad. Si se trabaja con araldita se obtiene una solucin de impregnacin y de inclusin mucho ms densa y por lo tanto, los tiempos van a tener que ser mayores que los que en el caso del epn o cuando se trabaje con otra resina de menor viscosidad. Otra cualidad importante en trminos generales es la cantidad de retraccin que se obtengan con estas resinas. El spurr es un monoepxido y presenta la menor viscosidad entre las resinas epoxy y tiene adems muy buenas cualidades de inclusin. Resinas Epoxy Hidrfobas: Hidrfilas: epn, spurr, araldita, maraglas. durcupn, acun.
- Son resinas sintticas, caracterizadas por la presencia de uno o ms grupos epxidos terminales y grupos hidrxilos esparcidos a lo largo de la molcula. De color amarillo claro o miel, viscosos y termoestables. - Son los medios de inclusin ms utilizados en los laboratorios, aun cuando son ms difciles de cortar y menos elsticos que las resinas acrlicas. - Polimerizan uniformemente. - Los cortes que se obtienen de los bloques de inclusin son estables al haz de electrones y pueden ser montados sobre grillas descubiertas o desnudas. En algunos casos se opta por poner una membrana sobre las grillas, que puede ser formvar, parlodin o colodin, para dar ms estabilidad a los cortes, a este tipo de grillas se les llama cubiertas. - El medio de inclusin es una mezcla cuidadosamente balanceada, constituida por: resina epoxy uno o dos tipos de endurecedor o curador acelerador o catalizador plastificante o modificador Los componentes de la mezcla se guardan separados para evitar que polimericen y a 4C porque al ser monmeros, a temperatura ambiente son inestables y menos fluidos. La mezcla se prepara en un mismo vaso plstico midiendo los componentes o en un vaso plstico pesando los componentes, para esto hay que calcular cuanto pesa cada cantidad de componente a una temperatura determinada. Lo ltimo que se hace es agregar el acelerador porque activa la polimerizacin. Los restos de resina que sobran se dejan polimerizar y una vez slidos se eliminan. - Cada uno de los componentes de la mezcla tiene diferentes viscosidades, por lo tanto penetran en el tejido a diferentes velocidades (si no se ha tenido l precaucin de realizar una mezcla homognea). - La velocidad a la que la mezcla de trabajo infiltra el tejido depende no slo de la densidad del tejido, tambin del tamao de la molcula infiltrante, la viscosidad de la mezcla, etc. Esta ltima se puede modificar variando las cantidades de los endurecedores. Ej. araldita, por el tamao de su molcula infiltra lentamente; el epn tiene una viscosidad menor e infiltra ms rpido y el spurr (ciclohexeno-dixido) presenta una muy baja viscosidad e infiltra muy rpido. - La mezcla de trabajo polimeriza formando enlaces cruzados muy estables, por efecto del calor y/o de la luz UV.
Desventajas del uso de resinas epoxy: - Los grupos epxido y anhdridos pueden reaccionar con las protenas. - Lo anterior puede reducir la antigenicidad y provocar sensibilizacin en los operadores que trabajan en los laboratorios, quienes absorben estos compuestos por la piel o los inhalan (se recomienda el uso de campanas y guantes). - Los componentes de las resinas epoxy son txicos y el VCD (vinilciclohexano) es un conocido carcingeno. Endurecedores o curadores Participan directamente en la reaccin de polimerizacin. La mayora son cidos dicarboxlicos o anhdridos cidos que reaccionan con los grupos hidroxilos y epoxy formando enlaces esteres. Ejemplos: DDSA: anhdrido dodecil succinico NSA: anhdrido monenil succinico NMA: anhdrido metil ndico Aceleradores o catalizadores Aumentan la reactividad del proceso de polimerizacin, promoviendo las reacciones entre los grupos epoxyepoxy y epoxy- hidroxilo. Ejemplos: BDMA: bencildimetil amino DMAB: dimetilaminoetanol DMP-30: amina terciaria: 2,4,6- tridimetil amino metilfenol La mayora de ellos son aminas .Es el componente que va en menor proporcin en la mezcla.
Plastificantes
Son opcionales, pero mejoran las cualidades de la mezcla porque aumentan la extensibilidad de los bloques de inclusin. Confieren suavidad y flexibilidad a la mezcla de resina epoxy-endurecedor ( que suelen ser extremadamente rgidas). Ejemplos: Dibutilftalato DER736: diglicil ter de propilen glicol ( recomendada spurr por su baja viscosidad ) Proceso de infiltracin o impregnacin en el medio de inclusin Previo a la infiltracin, el operador deber preocuparse de preparar adecuadamente la mezcla de resina con la que infiltrar los tejidos. - Componentes a temperatura ambiente ( si la infiltracin se realizara a esta temperatura ) - Obtener una mezcla con las proporciones exactas de componentes, mezclados en forma homognea y completa. - Recordar que los reactivos que componen la mezcla de impregnacin son molculas de distintos tamaos, con diferente viscosidad y diferentes ndices de polimerizacin. Ejemplo: DDSA (endurecedor) es ms rgido y menos viscoso que la araldita, de tal manera que si no se mezclan bien, el DDSA penetrara primero el tejido y desplazara a la araldita.
- El proceso de infiltracin depende de la resina utilizada para incluir la muestra. - Si los tejidos no son adecuadamente infiltrados se obtendrn bloques de inclusin con una polimerizacin de muy baja calidad. - Los parmetros que hay que cuidar para tener una buena impregnacin son: Viscosidad: va a constituir un ndice de penetracin del medio de inclusin, varia inversamente con el tamao de la molcula y con su viscosidad. Un aumento de la temperatura disminuye la viscosidad ( la mayora de las infiltraciones se realizan a temperatura ambiente) Vaco: se recomienda durante todo el tiempo de infiltracin del tejido en las resinas. La presin recomendada es de 0.5 atmsferas, presiones mas altas tienden a provocar desagregacin de las clulas. El vaco remueve y elimina las burbujas de aire que pudieran producirse durante la infiltracin. Se recomienda especialmente para la infiltracin de tejidos vegetales. Agitacin: se recomienda para hacer mas rpidas y homogneas las infiltraciones. Los movimientos deben ser suaves para no daar los tejidos (circulares-rotacionales son mas recomendados que los de sacudidas) Tiempo de infiltracin: el tiempo de infiltracin para cada tejido debe ser determinado por mtodo de ensayo y error. El tiempo a utilizar depende directamente del tipo de tejido, de la densidad del tejido, del tamao de la muestra (grosor) y del medio del inclusin que se utilice. No debe prolongarse innecesariamente la infiltracin para evitar la extraccin de los constituyentes celulares. Lo mismo que en la deshidratacin y en el paso por el lquido intermediario. Los polmeros cruzados se forman entre grupos presentes en la resina epoxy, hidroxilos de alcohol secundario ms el anhdrido presente en el endurecedor, formando puentes monosteres que pueden interaccionar con los grupos epoxy de las resinas formando puentes diesteres que son parte de los polmeros cruzados. Esa es parte de la reaccin. Tambin podran establecerse interacciones directamente entre los grupos hidrxilos presentes en la resina epoxy ms los grupos epoxy de la propia resina y generarse estos puentes esteres. Los dos tipos de reacciones pueden ocurrir. La inclusin final se hace en pequeos moldes que se llenan con resina sola y en los que se ponen la muestra y el nmero de identificacin. Una vez que est listo, se pueden hacer dos cosas: llevar el molde a una estufa a 45C por 2 horas o llevarlo directamente a una estufa a 70-80C para la polimerizacin. La ventaja de llevar los moldes primero a una estufa a 45C es que por la polimerizacin lenta se puede reorientar la muestra en caso de que se haya movido y eliminar burbujas que pueden haber quedado. Caractersticas fsicas de un buen bloque de inclusin: - suficiente dureza. - adecuada elasticidad. - adecuada plasticidad. - suficiente resistencia al bombardeo al haz de electrones. - homogeneidad. Para realizar los cortes se utilizan ultramicrtomos que son micrtomos similares a los rotatorios tipo Minot, los cuales tienen adicionados un par de lupas para observar los cortes, un carro portamuestras, una lmpara que ilumina los cortes y la navaja, que va en una carro porta navajas y una manivela. Estos micrtomos pueden ser de avance mecnico o de avance trmico (se han dejado de usar). Los primeros cortes que se hacen son cortes gruesos (para ME) de 1m, que se tien con azul de toluidina a pH alto, pero el problema es que las resinas son difcilmente penetradas por los colorantes comunes (hematoxilina, eosina, azul de toluidina, etc), pero esto se resuelve utilizando pH altos, a los que las resinas son penetradas rpidamente. Este corte grueso sirve para hacer un anlisis general del tejido y en que zonas estn las estructuras que interesan para sacar en los cortes ultrafinos y as saber que parte del bloque hay que retallar.
Cuchillos Los cuchillos que se utilizan en ME son de dos tipos: vidrio o diamante. En el caso de los cuchillos de vidrio, se deben confeccionar en el mismo laboratorio y para eso nosotros compramos el material a la LKB que es material de importacin. Se compran barras de vidrio de una cierta dimensin, es ms bien un cristal de muy buena calidad, y de esas barras que se lavan y secan muy bien para que no tengan pelusas se cortan cuadraditos que tienen una cierta dimensin. Una vez que tengo los cuadraditos con un diamante hago una lnea diagonal y posteriormente hago presin con unas tenazas en esa lnea y el cuadrado de vidrio se va a escindir en dos y de cada cuadrado voy a obtener dos cuchillos de vidrio. Esto se hace con una mquina que permite que la presin que se ejerce sea ms homognea de modo que el rendimiento en la obtencin de cuchillos sea mejor. Los cuchillos de vidrio fueron introducidos en el ao 1950 y los de diamante en el ao 1953. Tienen una gran ventaja los cuchillos de diamante que es su gran duracin, pero su gran desventaja es su alto costo, pero para la gente que trabaja en forma rutinaria en microscopa electrnica son necesarios y no hay laboratorio que no tenga uno o dos cuchillos de diamante. Los cuchillos de vidrio son fabricados por el operador, se utilizan barras de vidrio destensado? y se obtienen cuadrados de vidrios de 2 a 2,5 cm de lado. Estos cuadrados se pueden obtener por un sistema artesanal o con mquinas y de cada uno de los cuadrados se obtiene dos cuchillos. La arista de uno de los ngulos del cuadrado es la que se utiliza como borde cortante y la longitud del borde cortante va a depender del grosor del vidrio que utilicen para fabricar el cuchillo. Los sistemas de fabricacin son por fractura trmica o por fractura mecnica, esta ltima puede ser utilizando una mquina que se llama Messer Sunkay. Es importante evaluar el filo del cuchillo y adems hay que agregarles un bao a los cuchillos que es donde van a ir cayendo los cortes. Este bao se puede hacer de cinta adhesiva plstica, cinta adhesiva de aluminio o de cinta aisladora y deben ser sellados con barniz para uas, cera dental lquida o parafina. Una vez que los cuchillos han sido seleccionados deben ser guardados en una caja protegidas del polvo y la humedad, porque cualquier cosa que tenga el filo del cuchillo va a ir en desmedro de la calidad de su corte. La evaluacin de los cuchillos se hace bajo un microscopio de luz. El filo del cuchillo posee un ngulo muy agudo que se llama pico de destruccin? y bajo esa zona una serie de rayas, toda esta zona no es til para utilizarla como filo. Tambin podemos ver una arruga que se llama arruga de fractura. La zona ms til que puede usarse como filo es la que est un poco ms all de la arruga de fractura y antes del pico de deflexin. Una vez que tenemos hecho nuestro segundo tallado tenemos que cambiar el cuchillo. En el bao es posible poner un poco de acetona par que los cortes se estiren al caer. Si se utiliza slo agua yo puedo con un palito de naranjo al que el he puesto un algo don con cloroformo, acercarlo a los cortes sin tocarlos y de ese modo se estiran. Una vez que estn estirado tengo que evaluar si los cortes son del grosor que yo necesito a pesar de que yo he puesto un grosor en el micrtomo. Luego con una pinza que en su extremo tiene una grilla yo me acerco con la pinza a los cortes que estn estirados y son del tamao adecuado y puede pasar dos cosas, o que los cortes se adhieran a la grilla al ponerla encima, o bien podemos sumergir la pinza y que los cortes se atrapen por debajo. Pueden ser grillas desnudas o cubiertas dependiendo de lo que hayamos decidido. Cuando son cortes seriados no podemos perder ningn corte y en ese caso se utilizan grillas con un hoyo que pueden estar cubiertas o no. Para evaluar el grosor del corte utilizamos los colores de interferencia. Cuando los cortes estn flotando sobre la superficie del agua del bao los vamos a ver coloreados y los colores van entre gris claro que es lo mejor, a color violeta que para los efectos de nuestro trabajo es lo peor en cuanto al grosor porque son los ms gruesos. Los colores de interferencia reflejan el grosor del corte.
Color
grosor ()
gris claro 150-200 Gris 200-250 plata mate 250-400 plata brillante 500-700 oro plido 700-900 oro mate 900-1100 Violeta 1100-1500 Lo ms comn es plata brillante. Mientras ms delgada sea la muestra ms dbil va a ser al bombardeo electrnico, y tambin hay que considerar que si usamos grillas cubiertas el corte no puede ser muy grueso porque la cobertura de la grilla va a influir. Todo esto hay que tenerlo en cuenta porque va a influir en la observacin que vamos a hacer. Las grillas son de varios modelos. Se llaman grillas o rejillas y son el medio soportante de los tejidos ultrafinos, o de las suspensiones que sern observadas al microscopio electrnico de transmisin, tienen la caracterstica de disipar el calor y las cargas elctricas producidas por el haz de electrones. En general, son discos de metal de 2,3 a 3,05nm de dimetro y 0,10 a 0,20mm de espesor, con un rea central que presenta perforaciones de distinta forma y dimetro y un borde que es perifrico, slido y liso. Estn hechas de cobre, nquel, oro, platino, oro-paladio, acero inoxidable, etc., y va a depender de la metodologa que vamos a aplicar que se elige el material de la grilla. Las ms comunes son las de cobre, pero a veces las de cobre no sirven; las de platino sirven cuando sobre los cortes se hacen tratamientos con cidos. Tambin pueden ocuparse grillas de nylon, tefln o slice cuando es necesario contar con un aislante electrnico. La trama se refiere al nmero de barras por pulgada, y a eso se le llama unidades MESH. A mayor nmero de barras, menor es el rea descubierta de la grilla. Hay grillas de 70 mesh, 100 mesh, 200 mesh, etc. hay grillas con agujeros de diferentes formas, con un agujero o con varios, descubiertas o cubiertas con un film o membrana soportante (que puede ser fabricada por el operador). Si necesitramos incluir una suspensin de clulas que necesitamos cortar lo podemos hacer utilizando un medio soportante como la agarosa 4% despus de haberlas fijado, y despus esto puede ser tratado como si fuera un tejido cualquiera. Las membranas soportantes son delgadas films, fabricados por el operador, que se colocan sobre las grillas con el fin de sostener los cortes ultrafinos o suspensiones que van a ser puestos en las grillas para ser observados al M.E., son fabricadas de diferentes materiales y la eleccin del material con que se fabrican va a depender del tipo de trabajo a realizar y el tipo de grilla a emplear. Las caractersticas que pretendemos de las membranas soportantes son: ser de lata resistencia mecnica; ser de baja absorcin electrnica especfica; y que no cambien de dimensin al ser bombardeadas por el haz electrnico. Comnmente se usa para fabricarlas soluciones diluidas de diferentes plsticos como fomvar (polivinilformol), colodin o parlodin (nitrocelulosa), etc. las concentraciones son de 0,5 a 1,0 %. Se puede utilizar materiales evaporados al vaco como carbn, berilio, monxido de silicn, berilio+aluminio, xido de aluminio. las ms utilizadas son las de carbn y de fomvar. Las de formvar y colodin son las ms utilizadas porque se obtienen grosores de 20 a 200nm. Las de colodin son menos resistente que las de formvar, pero son ms fciles de fabricar. Con las de carbn tambin se obtienen membranas de bajo grosor pero son utilizadas para trabajos muy especializados. Los plsticos y sus solventes son: Formvar dicloruro de etileno, cloroformo o dioxan
Colodin acetona, acetato de etilo o acetato de amilo Perspex cloroformo. Poliestireno bencina Polivinilalcohol agua destilada Una forma de preparar las membranas es por evaporacin del solvente de una solucin diluida (ej, formvar 0,2 0,5 o 1,0%). Se hecha una gotita de la solucin en un recipiente con agua y se deja evaporar el solvente y debera quedar una pelcula. Otra forma es sumergir rpidamente un portaobjeto muy limpio en la solucin de plstico, rpidamente para que la membrana quede homognea, delgada y sin arrugas. Luego este portaobjeto se deja secar en una campana de modo que se evapore el solvente. Cuando est seco se corta con una navaja de afeitar y se sumerge en una fuente con agua y se va levantando la pelcula, hasta que toda queda flotando en el agua. Ahora sobre esta superficie voy colocando con una pinza las grillas sobre la lmina hasta que quede llena de grillas. Para recoger la pelcula ocupo papel filtro o parafilm y se deja en una placa petri para posteriormente utilizarlo. Esto hay que hacerlo antes de ponerse a cortar.
Un tejido que fue incluido en parafina se puede reincluir para obtener una muestra para ME, y una muestra que ha quedado mal incluida tambin se puede reincluir.
Daniela Araya Caldern
Medios de Inclusin- Cecilia Leyton 22
Medios de Inclusin
Prof. Cecilia Leyton Mircoles, 8 de Octubre de 2003
La mayora de los preparados que se ven en ME son artefactos. Cada preparado pasa por un proceso
que se inicia con la fijacin, para M.E. se fija con dos fijadores, primero con glutaraldehdo y luego una postfijacin con tetrxido de osmio. Cada fijador tiene un efecto sobre las estructuras celulares, por tanto no se ven las clulas tal cul son, sino que se ve un artefacto de tcnica repetitivo consecuencia del uso de esos fijadores o consecuencia del uso de los deshidratantes si es que se utiliza un medio hidrfobo. Posteriormente, a las protenas, que estn constituyendo las estructuras celulares, se les da un contraste con colorantes electrnicos que son metales pesados que se van a adherir a las protenas de una manera ms o menos selectiva. Entonces, cuando se obtienen preparados, las estructuras celulares que se ven representan artefactos de tcnica, pero cuando los artefacto de tcnica son repetitivos, en cuanto a las condiciones en que se trata un determinado tipo celular, pasa a constituir la normalidad para ese determinado tejido. El procesamiento de los tejidos para ME es similar al que se realiza para M ptica con la diferencia del uso de algunos reactivos y que se va a tratar el tejido de una manera distinta especialmente porque el tamao de las muestras es muy pequeo (2 mm), importando sobre todo el grosor de las muestras. Entonces, en el procesamiento de las muestras hay que tratar de minimizar al mximo los artefactos de tcnica. Cuando se comienza a tratar un tejido nuevo se debe estandarizar la tcnica para ese tejido hasta conseguir lo que se pretende en las mejores condiciones de morfologa que se requiere. Los tipos de medios de inclusin son: - resinas acrlicas: hidrfobas: metacrilatos hidroflicas. - resinas epoxy: hidrfobas: epn 812, araldita, spurr (baja viscosidad) hidroflicas: LR white, LR gold, lowicryl. - resinas polister. Dependiendo del objetivo del estudio, las resinas incluso se pueden mezclar. Supongamos que interesa preservar estructuras celulares que son solubles en el deshidratante y por las cualidades de corte, se desea incluir en una buena resina epoxy hidrfoba (epn 812),resistente al haz de electrones y permeable a los colorantes electrnicos. En este caso, lo que se puede hacer es despus de pasar por los lavados del fijador, pasar por una resina hidroflica en concentraciones crecientes, como el durcupan, que adems es miscible con epn, lo que permite realizar despus una impregnacin con epn en concentraciones crecientes para finalmente incluir la muestra manteniendo la estructura soluble porque se elimina la deshidratacin. La mayora de las resinas epoxy son mezclas de resina, acelerados, plastificante y endurecedor. Las resinas de ltima generacin tienen la ventaja que se usan tal como vienen, no es necesario prepararlas. Pero, cuando se prepara la resina de impregnacin se enriquece el preparado porque cada uno maneja cuan dura es la mezcla final, cuan blanda, cuan plastificada porque se pueden variar los componentes de acuerdo a los objetivos del estudio. Si consideramos una resina hidrfoba como el epn, los pasos que se deben seguir son: - fijacin: glutaraldehdo. - lavado: en el mismo buffer en que se prepar el fijador. - postfijacin: tetrxido de osmio. - lavado: en el mismo buffer en que se prepar el fijador o en agua.
- deshidratacin: etanol, acetona, alcohol isoproplico, cloroformo. El ms usado es el etanol en escala ascendente para extraer el agua del tejido. - lquido intermediario: Como el etanol no es miscible con las resinas (epn, araldita, spurr), luego de la deshidratacin hay que pasar por un lquido orgnico que se llama aclarante, que tiene la ventaja de ser miscible con el etanol y con el medio de impregnacin. - impregnacin: con el mismo medio en que se va a realizar la inclusin, se hacen baos en concentracin creciente para reemplazar el aclarante por la resina hasta llegar a resina pura en la que se incluye el tejido. lquido aclarante 3 1 1 0 resina 1 1 3 resina pura
La proporcin y tiempo de la impregnacin depende del protocolo establecido, pero siempre el ltimo bao es de resina sola. La resina de inclusin debe ser recin preparada y sin agitacin para evitar la formacin de burbujas. Esto es en trminos generales, lo que se hace siempre que se utiliza un medio de inclusin hidrfobo. Todo este proceso puede ser a temperatura ambiente o a 4C, dependiendo del trabajo que se realice. Una vez realizada la inclusin con su nmero de identificacin correspondiente, se lleva el molde a una estufa con una temperatura entre 70-80C para que polimerice. Esta estufa debe estar destinada exclusivamente para este fin, no puede ser en la que se seca el material de vidrio porque no pueden haber vapores de agua. Otras resinas para que polimericen hay que exponerlas a luz UV o a luz de cuarzo. Se dejan polimerizando entre 2-5 das. El procesamiento de una muestra para ME es largo, razn por la cual es necesario cuidar los detalles para obtener un buen preparado, porque slo se va a evidenciar un mal procesamiento al momento de realizar el corte. Si el bloque est blando quiere decir que no polimeriz bien porque le qued lquido aclarante, entonces se va a romper. Si el bloque est muy duro va a ser difcil cortarlo. Otras veces no va a costar cortar el bloque y se va a poder teir los cortes, pero una vez en el microscopio, si se prepar mal la mezcla de epn las cualidades de resistencia del plstico, que va a ser expuesto al bombardeo del haz de electrones, no se va a mantener y se va a disgregar junto con el tejido. Entonces es necesario tener una buena mezcla de inclusin y una buena impregnacin de la resina en el tejido. Deshidratantes Como deshidratantes se utilizan lquidos anhdros como alcohol etlico, metlico, butlico, isoproplico, cloroformo y acetona. Cuando se usa acetona se puede eliminar el paso por el lquido intermediario porque es miscible con algunas resinas, por ejemplo con el vestopal. Pero, al comparar la acetona con el alcohol etlico, la acetona es un deshidratante mucho ms fuerte, provocando mayor retraccin al tejido. Entonces hay que equilibrar el costo-beneficio. Puede ser muy bueno eliminar el paso por el aclarante, que es el xido de propileno, pero por evitarlo se produce una gran alteracin al tejido. Igual que para la MO, la deshidratacin se hace en una escala ascendente de alcoholes, pero para la ME es conveniente, por lo delicado del trabajo y porque cualquier salida brusca de agua va a provocar distorsin de las membranas, va a arrastrar componentes celulares, etc, comenzar con una graduacin de alcoholes mucho ms baja que para la MO. El tiempo de deshidratacin va a depender del tipo de tejido, del grosor de la muestra y del medio deshidratante a emplear, si se usa acetona los tiempos son ms cortos que con etanol, en general no son
tiempos largos, pero en el caso de tejidos ms densos aumentan al igual que en el caso de tejidos que cuesta sacarles el agua como los tejidos vegetales. La mayora de los deshidratantes son solventes orgnicos enrgicos, que provocan retraccin de los tejidos y extraccin de constituyentes celulares. Hay que tener cuidado con el tiempo de deshidratacin porque si se deja mucho tiempo se puede extraer los lpidos, especialmente los de membrana aun cuando se haya realizado una postfijacin en tetrxido de osmio. Algunos investigadores como Milloning (1996), aconsejan para evitar los artefactos de retraccin en la salida brusca de agua, agregar a los baos de deshidratacin cuando se usa etanol, NaCl 0.5%. Otro autor afirma que se obtienen mejores resultados al usar metanol en comparacin al uso de etanol. En el caso de la acetona, aconsejan usarla a 4C; otros dicen que provoca menos retraccin que el etanol cuando se usa por poco tiempo; no reacciona con el tetrxido de osmio, mientras que el etanol s lo hace, precipita, si no se lava bien el tejido luego de la postfijacin y se ve al microscopio como un fino precipitado negro; no reacciona qumicamente con algunos monmeros epoxy, lo que permite evitar el paso por el aclarante; extrae menos los fosfolpidos que el etanol; algunos autores prefieren comenzar la deshidratacin a temperatura ambiente y luego seguirla en fro, con lo cual se minimizara la extraccin de lpidos. En el caso que se tenga que dejar la muestra por fuerza en etanol, se recomienda dejar en etanol de 70 a 4C. Lquidos Intermediarios Los lquidos intermediarios o aclarantes ms usados son la acetona y el xido de propileno, que es un epoxipropano, introducido en MET por Left (1961). El xido de propileno se caracteriza por tener una viscosidad relativamente baja, infiltra rpidamente el tejido y reduce la viscosidad de las resinas, que mientras menos viscosas sean van a infiltrar ms rpidamente el tejido, entonces es una buena caracterstica el hecho que reduzca la viscosidad de las resinas, especialmente de algunas que son muy viscosas. Es un compuesto muy reactivo que puede combinarse con algunos grupos reactivos de las clulas y afectar algunas reaccin histoqumicas e inmunohistoqumicas. Cuando se va a hacer un estudio ICQ para MET hay que tener mucho cuidado con el uso del xido de propileno, probablemente se va a tener que evitar. Esto se puede evitar usando acetona o un medio de inclusin hidrfobo. El ltimo bao de impregnacin, que es el ms largo, dura 1 da para tratar de extraer del tejido todo el xido de propileno que pudiera quedar porque va a influir en la calidad del bloque de inclusin. Si quedan trazas de xido de propileno en los tejidos, este va a reaccionar con los grupos epoxy de algunas resinas inhibiendo o alterando la polimerizacin, lo que se va a reflejar en la dureza del bloque de inclusin, se va a obtener un bloque muy blando. Se recomienda usar en tiempos muy cortos, 5-10 min, como mximo.
RESINAS
Caractersticas generales de los medios de inclusin: - poca extraccin de los componentes celulares. - en su forma monomrica, que es la forma comercial, deben ser de fcil solubilidad en los solventes usados. - penetrar los tejidos en forma fcil y rpida. - termoestabilidad alta durante el bombardeo electrnico. - baja viscosidad, los que son muy viscosos demoran ms en infiltrar el tejido. - buenas cualidades de bloque de inclusin: que sea homogneo en cuanto a su dureza. - que tenga una dureza suficiente para hacer cortes ultrafinos (nm). - que tenga una plasticidad y una elasticidad suficientes, no se necesitan bloques duros y rgidos, tienen que tener cierta plasticidad y para eso se les agrega ciertos monmeros que dan esa caracterstica, los llamados plastificantes. - polimerizacin uniforme.
- que preserve las estructuras, es decir, que no extraiga los constituyentes celulares. - que permitan la penetracin de los medios contrastantes que son metales pesados. - que sean miscibles con otros medios de inclusin, lo que permite hacer mezclas. Los mayores inconvenientes que se pueden presentar para lograr un buen bloque de inclusin para ME son: - no conseguir una buena infiltracin del medio de inclusin porque el tejido no qued bien deshidratado ni bien aclarado. - no conseguir un bloque de inclusin con la dureza apropiada para poder hacer cortes ultrafinos, debe ser ni muy duro ni muy blando. Generalidades de los medios de inclusin: - se venden como compuestos semifluidos, de una viscosidad diferencial entre unos y otros, y de composicin qumica monomrica. - tienen un tamao molecular, viscosidad y un ndice de polimerizacin variable para cada resina. - por accin de reactivos activadores, endurecedores, plastificantes, aceleradores, luz UV o del calor pasan de monmeros lquidos a polmeros slidos. - los polmeros se clasifican en polmeros inestables o reversibles o en polmeros irreversibles. Para MET interesa obtener los irreversibles, porque los reversibles bajo ciertas condiciones recuperan su estado lquido, lo que no servira porque entre los componentes de las mezclas se establecen enlaces dbiles, en cambio en los polmeros irreversibles, al asociarse los monmeros de las mezclas se forman nuevos grupos qumicos que forman uniones covalentes o electroestticas, lo que va a permitir mayor estabilidad de los componentes al momento de recibir el haz de electrones. - de acuerdo a la forma de asociacin de los monmeros en estos polmeros, se van a clasificar en polmeros de distinta estructura, por ejemplo los metacrilatos, que fueron las primeras resinas que se usaron en la MET se dejaron de usar porque formaban polmeros lineales. Los metacrilatos estn formados por N-metil metacrilato y N-butil metacrilato y a eso se le agrega un acelerador, cuando comienzan a polimerizar, las molculas se asocian en forma lineal, lo que no es estable por no ser termoestable. Entonces al colocar los cortes en metacrilatos con polimerizacin lineal, con el bombardeo del haz de electrones la resina se rompe y adems al romperse se subliman contaminando la columna del microscopio. Otro tipo de polmeros son los polmeros cclicos, formados por la adicin de monmeros que presentan anillos de cuatro o ms tomos de carbono, no son muy usados. Los mejores para MET son los polmeros cruzados, se forman polmeros lineales o cclicos que presentan grupos reactivos que interaccionan formando redes tridimensionales muy estables, los grupos reactivos presentes en los monmeros de las mezclas de resinas establecen puentes que pueden ser teres y eso le da estabilidad a la molcula, porque este tipo de puentes son resistentes al calor y a los solventes orgnicos. Los grupos epoxy, caractersticos de las resinas epoxy, pueden interaccionar con otros grupos epoxy presentes en otros monmeros de la mezcla o pueden interaccionar con grupos hidroxilos presentes tambin en la molcula de la resina epoxy, o bien pueden interaccionar con anhdridos cidos que estn presentes en los agentes endurecedores, que tambin estn como monmeros. Entonces, si hay interaccin entre dos o ms grupos epoxy, entre grupos epoxy-hidroxilo y entre grupos epoxy-anhdridos cidos, obviamente que la red de interacciones que se constituye en el polmero es mucho ms estable y da cualidades de inclusin mejores que otras resinas. Caractersticas generales de algunas resinas: resina vestopal araldita viscosidad densidad 900 2500 1170 1081
epn 812 maraglas
1400 565
1158 1121
La viscosidad de las resinas tambin tiene que ver con el tamao de cada molcula, hay monmeros que son mucho ms grandes, la araldita, por ejemplo, al compararla con el epn es mucho ms grande, siendo las dos resinas epoxy y eso se refleja en su viscosidad. Si se trabaja con araldita se obtiene una solucin de impregnacin y de inclusin mucho ms densa y por lo tanto, los tiempos van a tener que ser mayores que los que en el caso del epn o cuando se trabaje con otra resina de menor viscosidad. Otra cualidad importante en trminos generales es la cantidad de retraccin que se obtengan con estas resinas. El spurr es un monoepxido y presenta la menor viscosidad entre las resinas epoxy y tiene adems muy buenas cualidades de inclusin. Resinas Epoxy Hidrfobas: Hidrfilas: epn, spurr, araldita, maraglas. durcupn, acun.
- Son resinas sintticas, caracterizadas por la presencia de uno o ms grupos epxidos terminales y grupos hidrxilos esparcidos a lo largo de la molcula. De color amarillo claro o miel, viscosos y termoestables. - Son los medios de inclusin ms utilizados en los laboratorios, aun cuando son ms difciles de cortar y menos elsticos que las resinas acrlicas. - Polimerizan uniformemente. - Los cortes que se obtienen de los bloques de inclusin son estables al haz de electrones y pueden ser montados sobre grillas descubiertas o desnudas. En algunos casos se opta por poner una membrana sobre las grillas, que puede ser formvar, parlodin o colodin, para dar ms estabilidad a los cortes, a este tipo de grillas se les llama cubiertas. - El medio de inclusin es una mezcla cuidadosamente balanceada, constituida por: resina epoxy uno o dos tipos de endurecedor o curador acelerador o catalizador plastificante o modificador Los componentes de la mezcla se guardan separados para evitar que polimericen y a 4C porque al ser monmeros, a temperatura ambiente son inestables y menos fluidos. La mezcla se prepara en un mismo vaso plstico midiendo los componentes o en un vaso plstico pesando los componentes, para esto hay que calcular cuanto pesa cada cantidad de componente a una temperatura determinada. Lo ltimo que se hace es agregar el acelerador porque activa la polimerizacin. Los restos de resina que sobran se dejan polimerizar y una vez slidos se eliminan. - Cada uno de los componentes de la mezcla tiene diferentes viscosidades, por lo tanto penetran en el tejido a diferentes velocidades (si no se ha tenido l precaucin de realizar una mezcla homognea). - La velocidad a la que la mezcla de trabajo infiltra el tejido depende no slo de la densidad del tejido, tambin del tamao de la molcula infiltrante, la viscosidad de la mezcla, etc. Esta ltima se puede modificar variando las cantidades de los endurecedores. Ej. araldita, por el tamao de su molcula infiltra lentamente; el epn tiene una viscosidad menor e infiltra ms rpido y el spurr (ciclohexeno-dixido) presenta una muy baja viscosidad e infiltra muy rpido. - La mezcla de trabajo polimeriza formando enlaces cruzados muy estables, por efecto del calor y/o de la luz UV.
Desventajas del uso de resinas epoxy: - Los grupos epxido y anhdridos pueden reaccionar con las protenas. - Lo anterior puede reducir la antigenicidad y provocar sensibilizacin en los operadores que trabajan en los laboratorios, quienes absorben estos compuestos por la piel o los inhalan (se recomienda el uso de campanas y guantes). - Los componentes de las resinas epoxy son txicos y el VCD (vinilciclohexano) es un conocido carcingeno. Endurecedores o curadores Participan directamente en la reaccin de polimerizacin. La mayora son cidos dicarboxlicos o anhdridos cidos que reaccionan con los grupos hidroxilos y epoxy formando enlaces esteres. Ejemplos: DDSA: anhdrido dodecil succinico NSA: anhdrido monenil succinico NMA: anhdrido metil ndico Aceleradores o catalizadores Aumentan la reactividad del proceso de polimerizacin, promoviendo las reacciones entre los grupos epoxyepoxy y epoxy- hidroxilo. Ejemplos: BDMA: bencildimetil amino DMAB: dimetilaminoetanol DMP-30: amina terciaria: 2,4,6- tridimetil amino metilfenol La mayora de ellos son aminas .Es el componente que va en menor proporcin en la mezcla. Plastificantes Son opcionales, pero mejoran las cualidades de la mezcla porque aumentan la extensibilidad de los bloques de inclusin. Confieren suavidad y flexibilidad a la mezcla de resina epoxy-endurecedor ( que suelen ser extremadamente rgidas). Ejemplos: Dibutilftalato DER736: diglicil ter de propilen glicol ( recomendada spurr por su baja viscosidad )
Resinas acrlicas - Son productos de condensacin de cidos dicarboxlicos con dihidroxialcoholes. - Polimerizan formando polmeros lineales, fcilmente atacados por los solventes orgnicos y por el calor. Los bloques de inclusin presentan excelentes condiciones de corte. - Se han usado el butil metacrilato, metil metacrilato (polimetilmetacrilato) y el glicol metacrilato (poli 2hidroxietilmetacrilato). - El butil y etil metacrilato, provocan alteraciones del tejido durante la polimerizacin. Se producen grandes retracciones, lo que da al tejido una caracterstica apariencia vacuolada y se subliman fcilmente con el
bombardeo del haz de electrones (se despolimerizan a altas temperaturas), provocando contaminacin en el microscopio. - En los inicios de la MET se utilizaron mezclas de metil metacrilato (confera dureza) y butil metacrilato que proporcionaba la plasticidad de los bloques de inclusin. Variando las proporciones de los componentes se variaba la dureza de los bloques de inclusin. - Como catalizador se usa Luperco CDB (perxido de 2,4-diclorobenzoilo con 50% de butilftalato). - Por accin del catalizador, el calor o la radiacin UV se logra la polimerizacin del bloque de inclusin. - El glicol metacrilato es soluble en agua y se ha empleado para estudios citoqumicos. Se recomienda con mejores resultados el uso de mezclas: glicol, n-butil y metil metacrilato, las que son ms estables que los metacrilatos tradicionales, pero los cortes deben montarse sobre grillas cubiertas con un film de soporte. - Butil, metil y glicol metacrilato se usan con xito en microscopa de luz de alta resolucin (cortes de 1 a 2 m). Son fciles de cortar y se pueden obtener bloques de inclusin de diferente dureza. - Metil metacrilato, por su dureza, es muy utilizado para incluir hueso no descalcificado u otros tejidos duros, para cortes en microscopa de luz.
Cmo evitar la polimerizacin prematura de los metacrilatos? - Evitar el calor y la luz directa sobre los envases. - Ambos factores producen espontneamente radicales libres que interaccionan con los dobles enlaces presentes en la resina y se forman, prematuramente, largas cadenas alifticas. - Como prevencin a la polimerizacin prematura las resinas acrlicas comerciales se expenden en frascos color ambar y contienen un cierto porcentaje (unas pocas partes por milln) de quinona (hidroquinona) que inhibe la polimerizacin espontnea. Por esta razn, previo a su uso en los laboratorios, es necesario purificarlos. Se elimina la hidroquinona mediante un tratamiento de destilacin. Cmo obtener polimerizaciones lentas? - Infiltrar a baja temperatura (ej: -20C). - Controlar la adicin de acelerador (perxido de benzoilo). Nueva generacin de resinas acrlicas hidroflicas (1980): - Polimerizan por puentes cruzados, lo que previene la sublimacin al ser expuestas al haz de electrones y se observa una disminucin del grado de retraccin de los tejidos durante la infiltracin. - Se clasifican en dos grupos: 1.- Resinas LR, dimetacrlicas-polihidroxiaromticas (son monmeros aromticos). Ejemplos: LR- White y LR-Gold. 2.- Resinas Lowicryl (son monmeros alifticos) Ejemplos: Lowicryl K4M y HM20 (son steres de acrilato y metacrilato). K4M: resina hidroflica polar (se usa a 35C) HM20: resina hidrofbica apolar (se usa a 35C) K11M: resina hidroflica apolar (se usa a 60C) HM23: resina hidroflica apolar (se usa a 70C) Ambos tipos de resinas (LR y Lowicryl) se han usado con xito para estudios citoqumicos e inmunohistoqumicos (el uso de baja temperatura inhibe la denaturacin de protenas). Ventajas del empleo de estas resinas:
- Son solubles en agua (resinas hidroflicas, puede realizarse la impregnacin de los tejidos desde el agua o despus de etanol de 70). - Son estables al haz de electrones. - Son usados para microscopa de luz de alta resolucin y para MET. - Son de baja viscosidad, por lo que requieren tiempos de impregnacin cortos. - Son de baja toxicidad. - No requieren mezclas. Cmo se logra el endurecimiento (polimerizacin) de los bloques de inclusin? - LR-White: 24 hrs a 60C uso de temperatura ambiente (agregando, opcionalmente, un acelerador) - LR-Gold: polimerizacin fotoqumica a 25C se usa luz azul proveniente de una lmpara de cuarzo - Cmo mtodo de rutina cuando se usa LR-Gold la infiltracin se realiza a 25C. - Los Lowicryl polimerizan fotoqumicamente usando radiacin UV. Proceso de infiltracin o impregnacin en el medio de inclusin Previo a la infiltracin, el operador deber preocuparse de preparar adecuadamente la mezcla de resina con la que infiltrar los tejidos. - Componentes a temperatura ambiente ( si la infiltracin se realizara a esta temperatura ) - Obtener una mezcla con las proporciones exactas de componentes, mezclados en forma homognea y completa. - Recordar que los reactivos que componen la mezcla de impregnacin son molculas de distintos tamaos, con diferente viscosidad y diferentes ndices de polimerizacin. Ejemplo: DDSA (endurecedor) es ms rgido y menos viscoso que la araldita, de tal manera que si no se mezclan bien, el DDSA penetrara primero el tejido y desplazara a la araldita. - El proceso de infiltracin depende de la resina utilizada para incluir la muestra. - Si los tejidos no son adecuadamente infiltrados se obtendrn bloques de inclusin con una polimerizacin de muy baja calidad. - Los parmetros que hay que cuidar para tener una buena impregnacin son: Viscosidad: va a constituir un ndice de penetracin del medio de inclusin, varia inversamente con el tamao de la molcula y con su viscosidad. Un aumento de la temperatura disminuye la viscosidad ( la mayora de las infiltraciones se realizan a temperatura ambiente) Vaco: se recomienda durante todo el tiempo de infiltracin del tejido en las resinas. La presin recomendada es de 0.5 atmsferas, presiones mas altas tienden a provocar desagregacin de las clulas. El vaco remueve y elimina las burbujas de aire que pudieran producirse durante la infiltracin. Se recomienda especialmente para la infiltracin de tejidos vegetales. Agitacin: se recomienda para hacer mas rpidas y homogneas las infiltraciones. Los movimientos deben ser suaves para no daar los tejidos (circulares-rotacionales son mas recomendados que los de sacudidas) Tiempo de infiltracin: el tiempo de infiltracin para cada tejido debe ser determinado por mtodo de ensayo y error. El tiempo a utilizar depende directamente del tipo de tejido, de la densidad del tejido, del tamao de la muestra (grosor) y del medio del inclusin que se utilice. No debe prolongarse innecesariamente la infiltracin para evitar la extraccin de los constituyentes celulares. Lo mismo que en la deshidratacin y en el paso por el lquido intermediario. Los polmeros cruzados se forman entre grupos presentes en la resina epoxy, hidroxilos de alcohol secundario ms el anhdrido presente en el endurecedor, formando puentes monosteres que pueden interaccionar con los grupos epoxy de las resinas formando puentes diesteres que son parte de los polmeros
cruzados. Esa es parte de la reaccin. Tambin podran establecerse interacciones directamente entre los grupos hidrxilos presentes en la resina epoxy ms los grupos epoxy de la propia resina y generarse estos puentes esteres. Los dos tipos de reacciones pueden ocurrir. La inclusin final se hace en pequeos moldes que se llenan con resina sola y en los que se ponen la muestra y el nmero de identificacin. Una vez que est listo, se pueden hacer dos cosas: llevar el molde a una estufa a 45C por 2 horas o llevarlo directamente a una estufa a 70-80C para la polimerizacin. La ventaja de llevar los moldes primero a una estufa a 45C es que por la polimerizacin lenta se puede reorientar la muestra en caso de que se haya movido y eliminar burbujas que pueden haber quedado. Caractersticas fsicas de un buen bloque de inclusin: - suficiente dureza. - adecuada elasticidad. - adecuada plasticidad. - suficiente resistencia al bombardeo al haz de electrones. - homogeneidad. Para realizar los cortes se utilizan ultramicrtomos que son micrtomos similares a los rotatorios tipo Minot, los cuales tienen adicionados un par de lupas para observar los cortes, un carro portamuestras, una lmpara que ilumina los cortes y la navaja, que va en una carro porta navajas y una manivela. Estos micrtomos pueden ser de avance mecnico o de avance trmico (se han dejado de usar). Los primeros cortes que se hacen son cortes gruesos (para ME) de 1m, que se tien con azul de toluidina a pH alto, pero el problema es que las resinas son difcilmente penetradas por los colorantes comunes (hematoxilina, eosina, azul de toluidina, etc), pero esto se resuelve utilizando pH altos, a los que las resinas son penetradas rpidamente. Este corte grueso sirve para hacer un anlisis general del tejido y en que zonas estn las estructuras que interesan para sacar en los cortes ultrafinos y as saber que parte del bloque hay que retallar. Cuchillos Los cuchillos que se utilizan en ME son de dos tipos: vidrio o diamante. En el caso de los cuchillos de vidrio, se deben confeccionar en el mismo laboratorio y para eso nosotros compramos el material a la LKB que es material de importacin. Se compran barras de vidrio de una cierta dimensin, es ms bien un cristal de muy buena calidad, y de esas barras que se lavan y secan muy bien para que no tengan pelusas se cortan cuadraditos que tienen una cierta dimensin. Una vez que tengo los cuadraditos con un diamante hago una lnea diagonal y posteriormente hago presin con unas tenazas en esa lnea y el cuadrado de vidrio se va a escindir en dos y de cada cuadrado voy a obtener dos cuchillos de vidrio. Esto se hace con una mquina que permite que la presin que se ejerce sea ms homognea de modo que el rendimiento en la obtencin de cuchillos sea mejor. Los cuchillos de vidrio fueron introducidos en el ao 1950 y los de diamante en el ao 1953. Tienen una gran ventaja los cuchillos de diamante que es su gran duracin, pero su gran desventaja es su alto costo, pero para la gente que trabaja en forma rutinaria en microscopa electrnica son necesarios y no hay laboratorio que no tenga uno o dos cuchillos de diamante. Los cuchillos de vidrio son fabricados por el operador, se utilizan barras de vidrio destensado? y se obtienen cuadrados de vidrios de 2 a 2,5 cm de lado. Estos cuadrados se pueden obtener por un sistema artesanal o con mquinas y de cada uno de los cuadrados se obtiene dos cuchillos. La arista de uno de los ngulos del cuadrado es la que se utiliza como borde cortante y la longitud del borde cortante va a depender del grosor del vidrio que utilicen para fabricar el cuchillo.
Los sistemas de fabricacin son por fractura trmica o por fractura mecnica, esta ltima puede ser utilizando una mquina que se llama Messer Sunkay. Es importante evaluar el filo del cuchillo y adems hay que agregarles un bao a los cuchillos que es donde van a ir cayendo los cortes. Este bao se puede hacer de cinta adhesiva plstica, cinta adhesiva de aluminio o de cinta aisladora y deben ser sellados con barniz para uas, cera dental lquida o parafina. Una vez que los cuchillos han sido seleccionados deben ser guardados en una caja protegidas del polvo y la humedad, porque cualquier cosa que tenga el filo del cuchillo va a ir en desmedro de la calidad de su corte. La evaluacin de los cuchillos se hace bajo un microscopio de luz. El filo del cuchillo posee un ngulo muy agudo que se llama pico de destruccin? y bajo esa zona una serie de rayas, toda esta zona no es til para utilizarla como filo. Tambin podemos ver una arruga que se llama arruga de fractura. La zona ms til que puede usarse como filo es la que est un poco ms all de la arruga de fractura y antes del pico de deflexin. Una vez que tenemos hecho nuestro segundo tallado tenemos que cambiar el cuchillo. En el bao es posible poner un poco de acetona par que los cortes se estiren al caer. Si se utiliza slo agua yo puedo con un palito de naranjo al que el he puesto un algo don con cloroformo, acercarlo a los cortes sin tocarlos y de ese modo se estiran. Una vez que estn estirado tengo que evaluar si los cortes son del grosor que yo necesito a pesar de que yo he puesto un grosor en el micrtomo. Luego con una pinza que en su extremo tiene una grilla yo me acerco con la pinza a los cortes que estn estirados y son del tamao adecuado y puede pasar dos cosas, o que los cortes se adhieran a la grilla al ponerla encima, o bien podemos sumergir la pinza y que los cortes se atrapen por debajo. Pueden ser grillas desnudas o cubiertas dependiendo de lo que hayamos decidido. Cuando son cortes seriados no podemos perder ningn corte y en ese caso se utilizan grillas con un hoyo que pueden estar cubiertas o no. Para evaluar el grosor del corte utilizamos los colores de interferencia. Cuando los cortes estn flotando sobre la superficie del agua del bao los vamos a ver coloreados y los colores van entre gris claro que es lo mejor, a color violeta que para los efectos de nuestro trabajo es lo peor en cuanto al grosor porque son los ms gruesos. Los colores de interferencia reflejan el grosor del corte. color grosor ()
gris claro 150-200 gris 200-250 plata mate 250-400 plata brillante 500-700 oro plido 700-900 oro mate 900-1100 violeta 1100-1500 Lo ms comn es plata brillante. Mientras ms delgada sea la muestra ms dbil va a ser al bombardeo electrnico, y tambin hay que considerar que si usamos grillas cubiertas el corte no puede ser muy grueso porque la cobertura de la grilla va a influir. Todo esto hay que tenerlo en cuenta porque va a influir en la observacin que vamos a hacer. Las grillas son de varios modelos. Se llaman grillas o rejillas y son el medio soportante de los tejidos ultrafinos, o de las suspensiones que sern observadas al microscopio electrnico de transmisin, tienen la caracterstica de disipar el calor y las cargas elctricas producidas por el haz de electrones. En general, son discos de metal de 2,3 a 3,05nm de dimetro y 0,10 a 0,20mm de espesor, con un rea central que presenta perforaciones de distinta forma y dimetro y un borde que es perifrico, slido y liso. Estn hechas de cobre,
nquel, oro, platino, oro-paladio, acero inoxidable, etc., y va a depender de la metodologa que vamos a aplicar que se elige el material de la grilla. Las ms comunes son las de cobre, pero a veces las de cobre no sirven; las de platino sirven cuando sobre los cortes se hacen tratamientos con cidos. Tambin pueden ocuparse grillas de nylon, tefln o slice cuando es necesario contar con un aislante electrnico. La trama se refiere al nmero de barras por pulgada, y a eso se le llama unidades MESH. A mayor nmero de barras, menor es el rea descubierta de la grilla. Hay grillas de 70 mesh, 100 mesh, 200 mesh, etc. hay grillas con agujeros de diferentes formas, con un agujero o con varios, descubiertas o cubiertas con un film o membrana soportante (que puede ser fabricada por el operador). Si necesitramos incluir una suspensin de clulas que necesitamos cortar lo podemos hacer utilizando un medio soportante como la agarosa 4% despus de haberlas fijado, y despus esto puede ser tratado como si fuera un tejido cualquiera. Las membranas soportantes son delgadas films, fabricados por el operador, que se colocan sobre las grillas con el fin de sostener los cortes ultrafinos o suspensiones que van a ser puestos en las grillas para ser observados al M.E., son fabricadas de diferentes materiales y la eleccin del material con que se fabrican va a depender del tipo de trabajo a realizar y el tipo de grilla a emplear. Las caractersticas que pretendemos de las membranas soportantes son: ser de lata resistencia mecnica; ser de baja absorcin electrnica especfica; y que no cambien de dimensin al ser bombardeadas por el haz electrnico. Comnmente se usa para fabricarlas soluciones diluidas de diferentes plsticos como fomvar (polivinilformol), colodin o parlodin (nitrocelulosa), etc. las concentraciones son de 0,5 a 1,0 %. Se puede utilizar materiales evaporados al vaco como carbn, berilio, monxido de silicn, berilio+aluminio, xido de aluminio. las ms utilizadas son las de carbn y de fomvar. Las de formvar y colodin son las ms utilizadas porque se obtienen grosores de 20 a 200nm. Las de colodin son menos resistente que las de formvar, pero son ms fciles de fabricar. Con las de carbn tambin se obtienen membranas de bajo grosor pero son utilizadas para trabajos muy especializados. Los plsticos y sus solventes son: Formvar dicloruro de etileno, cloroformo o dioxan Colodin acetona, acetato de etilo o acetato de amilo Perspex cloroformo. Poliestireno bencina Polivinilalcohol agua destilada Una forma de preparar las membranas es por evaporacin del solvente de una solucin diluida (ej, formvar 0,2 0,5 o 1,0%). Se hecha una gotita de la solucin en un recipiente con agua y se deja evaporar el solvente y debera quedar una pelcula. Otra forma es sumergir rpidamente un portaobjeto muy limpio en la solucin de plstico, rpidamente para que la membrana quede homognea, delgada y sin arrugas. Luego este portaobjeto se deja secar en una campana de modo que se evapore el solvente. Cuando est seco se corta con una navaja de afeitar y se sumerge en una fuente con agua y se va levantando la pelcula, hasta que toda queda flotando en el agua. Ahora sobre esta superficie voy colocando con una pinza las grillas sobre la lmina hasta que quede llena de grillas. Para recoger la pelcula ocupo papel filtro o parafilm y se deja en una placa petri para posteriormente utilizarlo. Esto hay que hacerlo antes de ponerse a cortar. Un tejido que fue incluido en parafina se puede reincluir para obtener una muestra para ME, y una muestra que ha quedado mal incluida tambin se puede reincluir. Daniela Araya Caldern
Contraste en MET- Nancy Olea 33
Contraste En MET
Nancy Olea 14 de octubre de 2003
Los materiales biolgicos no tienen contraste, entonces es necesario drselo usando

elementos pesados, agregndolos en forma especfica. Hay una suerte de organizacin molecular en los tejidos que nos permite ver las estructuras, por ejemplo, la organizacin de la cromatina. Los detalles en ME estn sujetos a las limitaciones que tiene la muestra (poco contraste) ms que a limitaciones del instrumento. La nica manera de ver estructuras era agregndoles metales pesados, pero primero era necesario perfeccionar el aparato en s, despus fue necesario inventar una mquina para cortar las muestras. En el ao 1951 Halls fue el primero en considerar cuantitativamente la relevancia de la dispersin de electrones en la formacin de la imagen, concluy que si los electrones no se dispersan, no hay imagen. El quera medir la cantidad de contraste que daba una estructura particular, para ello consider la intensidad incidente (intensidad del haz: kilovoltaje) necesario para acelerar un electrn. Tambin consider la masa/unidad de rea del espcimen en la que vio que cosas demasiado delgadas no captan el colorante y no se ven. La unidad de rea del espcimen, y el contraste, que se refiere a la naturaleza misma de la muestra, de acuerdo a esto se sugiere una ley: I=Io e-sw con I: Intensidad incidente, Io: Intensidad transmitida, w: masa/unidad de rea del espcimen, s: contraste referido a la naturaleza de la muestra K= (Io-I)/Io K(contraste) = (intensidad transmitida intensidad incidente) / intensidad transmitida Segn Valentine (1962), el 100% del contraste sera el exceso de cantidad de grosor por m2 del espcimen y esto multiplicado por el espesor del espcimen expresado en . Si el contraste es menor al 5%, no vemos nada. Dentro de las variables en la generacin de contraste, se considera el espesor del espcimen, masa, rea y cantidad de granos. Despus de todos los procesos a los cuales se someten las muestras (fijacin, osmicacin, deshidratacin, inclusin), uds. Creen que se puede cuantificar???? Es imposible, es muy difcil poder hacer una medicin cuantitativa, adems porque los medios de contraste aaden colorantes que van a ser tomados por los sitios activos dependiendo de muchas variables: la resina que se usa (algunas pueden inhabilitar sitios activos); la fijacin realizada; solventes usados (el xido de propileno es un agente deshidratante extremadamente enrgico provocando cambios en la configuracin). Cuando un haz incidente desprendimiento de varios tipos de primarios, los cuales pasan a travs experimentan dispersin inelstica: incide sobre el corte, entonces se produce el formas de energa: fotnica, radiacin X, electrones del tejido sin ser dispersos; hay otros electrones que vienen electrones que interactan con orbitales de
elementos de peso atmico alto, este electrn es enviado en ngulo tan grande que sale del campo de formacin de la imagen, generando una mancha oscura. Esto se llama contraste de amplitud, y es la base fsica del contraste. Hay electrones que interactan con los orbitales de los tomos pesados pero pierden un mnimo de energa, mantenindose aun en la imagen. Estos electrones sirven para hacer focalizacin en contraste de fase, el resto solamente molesta, porque en los cortes delgados crean un halo alrededor de las estructuras y en los cortes gruesos se produce la aberracin esfrica (electrones que experimentan dispersin inelstica). Los electrones secundarios son de muy baja energa, sirven para estudiar topografa. En MEB, los electrones retrodifundidos dan imgenes de contraste de acuerdo a la composicin del material y los electrones Auger nos dan informacin de elementos de muy bajo peso atmico. El hecho de que produzcan aberracin esfrica los electrones dispersados inelsticamente se debe a que, como perdieron un poco de energa, esta prdida de energa se manifiesta como una prdida de velocidad, por lo tanto la focalizacin es diferente a la del haz de electrones, forman distintos focos. Los electrones secundarios los capta un detector que los atrae, porque son de muy baja energa (10-50 Ev) y despus son transformados en seales de luz, que con un tubo fotomultiplicador forma en una pantalla la imagen topogrfica del espcimen. El contraste, adems de los factores que ya mencionamos, depende de factores propios del instrumento que utilizamos: el kilovoltaje (Kv, aceleracin del elctrn) la aberracin esfrica, el uso de diafragma que elimina los electrones que no estn colimados. El uso de cortes ms gruesos requiere de aberturas de menor tamao. Lo ideal es trabajar con una preparacin biolgica de 600 A de espesor bien contrastada y con un Kv de 100 y una abertura de tamao regular. Dentro de un mismo corte puede haber zonas de distinto espesor, adems las estructuras pueden variar segn el plano de corte. Por ejemplo, para ver un microtbulo como realmente es hay que cortarlo transversalmente. El ME tiene un sistema llamado.. que permite orientar la grilla de tal manera que las estructuras se vean tal cual son. Otra variable es la longitud de onda de los electrones para distintos Kv; al aumentar el potencial de los electrones, aumenta la velocidad de estos, y como consecuencia la longitud de onda va a disminuir (mientras mas chica la longitud de onda, mejor la resolucin). Nosotros trabajamos cerca de los 80 Kv con una longitud de onda de 0.042 nm. Para cada microscopio electrnico hay un lmite terico de resolucin que lo da el fabricante. Actualmente se ha llegado a un poder de resolucin de 2-3 A. Tambien existen los microscopios de alto voltaje, que usan 3 MegaV (3000 Kv), con el cual los electrones pueden atravesar una lmina de aluminio de 10 um. Si metemos una clula en este tipo de microscopio, simplemente no la vemos, los electrones pasan de largo. Clasificacin de los medios de contraste 1. Medio directo 2. Medios indirectos
3. Mtodos especiales
a) Medios directos: Plomo y uranilo. Es un contraste general e inespecfico. Funcionan con una unin directa del ligando al metal pesado. b) Medios indirectos. Son contrastes localizados especficamente, semicuantificables, pueden ser particulados o no particulados. Por ejemplo en la deteccin de enzimas, hay que acoplar al producto de reaccin un metal pesado, por ejemplo el formazan, que es electrondenso. Lo mismo ocurre con el cerio. El plomo se acopla al producto de reaccin. El mtodo ICQ, donde partculas de oro coloidal estn conjugadas con el anticuerpo; el mtodo autorradiogrfico, donde el filamento de plata reducido que se va a depositar justo en el sitio emisor de la radioactividad que nosotros dimos al tejido previamente; el mtodo de hibridizacin in situ donde fabricamos una sonda con un antisentido marcado con digoxigenina y luego a esta le acoplamos bolitas de oro coloidal y asi luego el reconocimiento en la clula. - Mtodos especiales: - tinciones negativas: hay depsitos de material denso (medio de contraste) y las estructuras destacan plidas - sombreo metlico de material in toto: cmo ver una estructura electrnlcida?, bombardeando el material en un aparato que rota. Ejemplo: hebras de DNA - criofracturas o criograbados (revisin de rplicas). Aqu no estamos mirando el material, lo que estamos viendo es una rplica, una copia del material Mtodos directos: El acetato de uranilo es uno de los colorantes ms usados. Cmo funciona?, simplemente por diferencias de cargas (unin electrosttica; el mecanismo exacto no se conoce, pero se sabe que reacciona con los grupos sulfatos, con los amino de las cidos nucleicos (tie protenas) y forma compuestos quelados, los que se caracterizan por ser estables. El uranilo es muy reactivo, puede compartir fcilmente sus electrones. Se puede teir antes de incluir, hacer los cortes, tomar el taco y tirarlo dentro de un vaso con uranilo y lo dejan 1 da. Otra manera es sacar el corte, poner una gota de uranilo encima (esta es la forma ms habitual). Viene en solucin acuosa, en metanol, en alcohol. La que nosotros usamos es al 4% en metanol durante 1 minuto. Precipita, hay que cuidarlo mucho, es muy inestable a la luz (fotolbil), es txico, viene con un cierto grado de radioactividad pero atenuada, si la solucin se pone turbia o le sube el Ph hay que botarla (en una botella destinada para esto, despus se manda a Bioseguridad). Si se tie por tiempos muy prolongados, aumentan los precipitados. Conviene siempre centrifugar el colorante a 5000 g ms de 5 minutos y luego se filtra para teir. Hay metales que coordinan mejor con el oxgeno o con el nitrgeno, por ejemplo el lantano, torio, fierro, plomo, berilio, bismuto, tienen una tendencia a coordinar mejor con el oxgeno y por lo tanto se usan para teir
cidos nucleicos. El niquel, cadmio, oro, plata, zinc, cobre tienen tendencia a coordinar mejor con el nitrgeno, se usan para teir protenas. Plomo: tie las membranas que estn tratadas con tetrxido de osmio, tie el glicgeno ( se ve como en rosetas). Tambin forma compuestos quelados (compuestos polibutanos). se usa despus del uranilo, porque ambos conjugan bien, intensificando la tincin. Reynolds estudi la combinacin del CO2 del aire con el plomo, se forman carbonatos de plomo que precipitan. Estos carbonatos no se disuelven con nada y se depositan sobre el tejido en forma polibutanos o en granitos como pimienta. Reynolds pens en una solucin estequiomtrica entre el nitrato de plomo y el citrato de sodio, de manera que todo el plomo reaccionara con el citrato y as no quedara plomo libre que se combinara con el CO2, a Ph 2 (favorece el estado catinico bivalente del plomo). Para preparar el plomo hay que hervir el agua, porque con el burbujeo sale el CO2 del agua, o bien, autoclavarla. A veces funciona tratar los precipitados con cido oxlico. Cmo se tie?, hay que hacer una cmara de tincin con una placa de petri con parafilm y las gotas de uranilo sobre el parafilm. Sobre la gota se pone la grilla con el corte hacia abajo, se tapa durante 1 minuto, se lava la grilla en tres vasos de metanol 25-30 veces sumergiendo la grilla en cada vaso, secar la pinza y despus teir con el plomo. El plomo que nosotros usamos es ms fcil de preparar que el de Reynolds: 0,04 g de plomo y luego NaOH 10N (un par de gotas). Se tie 5 minutos con el plomo en la cmara que adems debe tener unas lentejitas de NaOH, porque capta el CO2 del ambiente. Despus se lava con agua o con una solucin de KOH 0,01 N. El lantano se usa para delinear espacios intercelulares. Cmo incrementar una tincin?, usando concentraciones relativamente bajas, controlando el tiempo de tincin, controlando la fijacin (por ejemplo en las reacciones de inmuno no se usa el osmio, tampoco para las reacciones enzimticas), modificando el Ph del colorante, empleando controles (por ejemplo, para teir cidos nucleicos se utilan las muestras y con eso se van las protenas). En el caso de querer contrastar slo DNA, se hace una hidrlisis alcalina que saca el RNA y luego se trabaja con el corte. Mtodo de Bernard: tratamiento con EDTA, compite con las sales de uranio, permite detectar solo RNA. Una solucin colorante ideal rene todas estas condiciones: - estable al haz de electrones - alto peso atmico - densidad electrnica ms alta que el medio de inclusin - no reacciona con el metal de la grilla - estable en solucin - no produce artefacto - fcil de preparar Los medios de contraste adems de contrastar, deben estabilizar el material de manera que no se rompa la muestra con el haz de electrones.
Mtodos especiales: Las tinciones negativas sirven para estudios de virus principalmente, permiten hacer un examen rpido del material. Est basado en el principio de la no reaccin. Ventajas: es un mtodo simple, rpido, resultados inmediatos. Desventajas: muestras requieren una purificacin y concentracin adecuada, porque el material en estudio (p. Ej. Virus) es muy pequeo. Las variaciones morfolgicas que produce el haz por desecacin a veces puede hacer que los resultados varen. Mtodo de sombreado: se gotea en una grilla con un film de carbn y despus uno puede medir el tamao de las partculas. Con esta frmula () se puede calcular la altura de la partcula que produce el metalizado, a partir de la tangente del ngulo de sombreo, por el largo de la sombra que proyecta (rea que queda desprovista de metal). Esta sirve para calcular tamao. en qu se sombrea? En un sistema que tiene una bandeja rotatoria, un vaporizador, etc. Generalmente, el metal usado es el platino, estn en un ngulo de 45. Con un filamento de tungsteno que se calienta mucho, los metales pueden evaporarse y sombrear el espcimen. Tambin se `puede evaporar carbn para preparar una membrana para una grilla. cmo calcular cunto carbn debe caerle a la muestra?, se pone una plaquita de porcelana con una gota de aceite, entonces se ve la diferencia de colores entre ambas. El carbn se bombardea en un ngulo de 90, y el metal, en 45. Despus se trata con cido toda la parte orgnica, se lava y las rplicas quedan flotando, se toman con una grilla. Mtodo del esparcido de DNA/RNA: sirve para purificar DNA o RNA, se suspenden en una solucin que contiene acetato de amoniaco y EDTA, entre otros. Esta solucin se deja caer con un portaobjetos super limpio, entonces cae el DNA; ahora se usa una solucin super bsica, entonces el DNA se expande. Cmo verificar antes?, uno usa talco: si se expande el DNA va a quedar un rea clara.
Cuantificacin del contraste: Los estudios de los microscopistas electrnicos interesados en cuantificar el contraste producido por sales de metales pesados en los tejidos biolgicos se ven obstaculizados por la consideracin de muchas variables:
Empleo de fijadores y medios de inclusin que introducen cambios conformacionales capaces de alterar los sitios de unin al colorante, aumentando o disminuyendo la tincin
Bloqueo de los sitios activos por el medio de inclusin
Disminucin de la coloracin por falta de penetracin debido a la resina de inclusin. La tincin observada se debera slo a grupos activos superficiales
Variaciones en el espesor de las secciones comparadas
Alejandra Salas Seplveda
Lectinas- Julieta Gonzlez 39
Deteccin Citoqumica de Polisacridos: Lectinas y su utilizacin en Citoqumica Ultraestructural

Prof. Julieta Gonzlez Martes 21 de Octubre de 2003
En tejidos como los epitelios, las clulas que los componen es posible que a travs de molculas
expresadas en la superficie celular, puedan reconocer otras molculas que forman parte de la matriz extracelular; es importante entonces recordar la organizacin de sta para comprender el modo de trabajo en microscopa electrnica. La superficie celular (cualquiera sea el tipo de clula de entre todas las que nos constituyen), incluso en tejidos constituidos por un mismo tipo celular; este es el caso del hgado, que a microscopa ptica nos parece similar. Sin embargo, los anlisis bioqumicos y ultraestructurales demuestran que hay una gradiente de composicin caracterstica dentro del lobulillo heptico. Adems, la composicin y funcin cambia entre cada hepatocito. Las superficies del hepatocito tienen diferentes receptores, azcares y otros componentes, que lo hacen ser particular. Si bien podemos observar clulas que parecen equivalentes en forma y funcin, cuando indagamos en forma ms profunda comprobamos que no es as. Esto es fundamental tenerlo presente para los propsitos de investigacin, pues incluso en cultivos celulares ninguna clula es igual a otra, pese a que tengan un mismo patrn. Adicionalmente, debe considerarse el nivel de complejidad existente, relacionado con la diversidad de tipos de molcula de membrana, o de los dominios. Por ejemplo, una clula plasmtica no equivale a una clula epitelial, pues esta ltima se relaciona con clulas vecinas, un lumen y una matriz extracelular, mostrando una complejidad diferencial en su superficie dependiendo de las relaciones establecidas. La membrana plasmtica se observar como una estructura de 2 zonas densas separadas por una zona clara formando una unidad de membrana (segn Robertson). Sin embargo, al comparar las unidades de membrana de diferentes clulas observadas al microscopio electrnico de transmisin, no es posible sealar que sus funciones y composicin son equivalentes. Ms an cuando se estudian procesos de transporte, se esquematizan procesos como el transporte, los dibujos muestran un grado de confusin, pues da una visin simplista de la funcin de las molculas. El caso tpico es el de los canales de potasio, que en modelos 3D, con sus diferentes dominios, estn formados por 2 subunidades que en parte miran al extra y al intracelular, y que son complejas. El modelo de membrana de mosaico fluido de Robertson, planteado en 1962 y que sigue emplendose hasta hoy, ha tenido pocas modificaciones. Este modelo propone que las membranas estn formadas por una bicapa altamente fluida y lquida a la temperatura fisiolgica de los organismos, y que las protenas se insertaban en toda ella, hacia un lado u otro de la bicapa, y que la bicapa era mvil, con cierto grado de libertad de movimiento de lpidos transversalmente en el plano de la membrana. Por 40 aos se ha trabajado con este modelo. Haba bicapas ms ricas en c. grasos saturados, insaturados, y dependiendo del punto de fusin de stos iba a estar en estado ms o menos lquido, pero se supona que las membranas tenan un mismo grado de fluidez en ambos lados. Por otra parte, se pensaba que una misma molcula (fosfolpidos) tena 2 centros diferenciales: las colas hidrofbicas de cidos grasos, y un extremo amino alcohol. Una membrana puede tener una cantidad de fosfolpidos no equivalente a la otra. En M.E. puede observarse esta unidad de membrana de bolsa equivalente, pero no mirndola como si tuviese los mismos constituyentes. A qu nos lleva esto? Dependiendo de las alternativas de tener un mismo tipo de cido graso pero con diferente rotacin y que cambie solamente el amino alcohol, tendremos un enorme nmero de posibilidades de fosfolpidos diferentes que dan asimetra a la membrana, ubicndose algunos hacia la cara extracelular y otros hacia el citosol. Aquellos fosfolpidos de la cara extracelular no podrn estar hacia el citosol, y viceversa, salvo que medien procesos como la
apoptosis, que tendrn un flip-flop de algunos de ellos, que puede usarse como marcador de dao celular temprano.
En la ltima dcada ha surgido nueva informacin que aporta elementos nuevos de conocimiento sobre las membranas. Las membranas no solamente son una interfase formada por fosfolpidos y otros lpidos como el colesterol, libremente desplazables, sino adems existen unidades con composicin diferencial respecto de las dems, que estn constituidas por esfingolpidos y colesterol en altas concentraciones, presentes en la cara exoplsmica de la bicapa. Estos sectores denominados dominios raft o balsa , se caracterizan por ser resistentes a la solubilizacin en detergente, mostrando un cambio en el concepto del modelo clsico de mosaico fluido de membrana, en que todos los componentes eran solubles en detergentes inicos y no inicos, y que a 4 C hay una baja densidad de flotacin en una gradiente de sacarosa. Operacionalmente, desde el punto de vista fsico, la membrana dej de ser una entidad contnua, concepcin inicial, hasta hace unos 5 aos atrs. Los esfingolpidos ms participativos son los ganglisidos (sustituidos por monosacridos o subunidades mayores) y cerebrsidos. Existen familias de ganglisidos, que aportan a los dominios diversidad y especificidad de funcin para cada membrana que tenga este tipo de molculas. Tambin debemos considerar el colesterol, especfico de todas las membranas, pero concentrado en la monocapa externa de los dominios raft. Una clula, tiene una difusin alternada entre los dominios Raft y no Raft, sin separacin fsica. Al microscopio electrnico se ven iguales, slo si esos dominios Raft, adems de su composicin lipdica forman cavolas, se puede discriminar morfolgicamente entre dominios Raft y postcavola; y la cavola tendr la composicin de lpidos Raft y protenas como caveolinas, que le permiten quebrarse e invaginarse. Es decir, requerir la presencia de una maquinaria mecnica que le haga perder su continuidad e invaginarse. Estos dominios no se forman en la propia membrana, sino que se forman en Golgi. Es la ltima cisterna del trans Golgi que destina vesculas, sea de composicin Raft o no, pues la destinacin viene del intracelular. En la hoja exoplsmica hay protenas unidas por tallos de lpidos GPI (glicosil fosfatidil inositol), asociados a transporte, transcitosis, adems se han estudiado en su relacin con la transduccin de seales. Los dominios Raft al verlos en 2 tipos de clulas epiteliales, como el epitelio intestinal y en hepatocitos veremos lo siguiente: en hepatocitos estn discretamente distribuidos en forman ms o menos homognea en todas su superficies (canalicular, sinusoidal, intermembrana). Cada una de sus caras forma interacciones diferentes. En el caso del intestino, existe una superficie luminal, una basolateral, y una cara que da hacia la matriz extracelular. Las clulas se contactan entre ellas por interacciones o uniones estrechas, por el lado basal interacta a travs de receptores de adhesin con componentes de la matriz extracelular. Comparando la distribucin con los dominios de estas clulas, los dominios Raft estn distribuidos mayoritariamente en la superficie apical. Cada tipo celular tendr una distribucin asimtrica, pero no en el plano de la bicapa, sino en el de los dominios de membrana (apical y basolateral); esto no solo es vlido para lpidos, sino tambin para protenas. En la membrana hay protenas integrales de membrana, de transmembrana que atraviesan una o varias veces sta, protenas asociadas con cidos grasos, perifricas asociadas a protenas integrales. Cmo se distribuyen las protenas dentro de una clula con un gradiente de polaridad, como las que forman epitelios (presentan un dominio apical, uno basal y uno lateral, generalmente la regin apical mirando hacia un lumen y la basal hacia la matriz extracelular). Cmo se distribuyen las protenas en una misma superficie? En una clula epitelial, un nutriente como la glucosa no ingresa si no est acoplada funcionalmente a 4 tipos de receptores o canales; por ejemplo ingresa por la cara luminal a travs de un transportador de tipo bomba sodio potasio ATPasa, otro que corresponde a un canal de potasio; para que la glucosa llegue a la sangre deben funcionar 4 tipos de protenas que medien el transporte de la glucosa, ubicadas en diferentes dominios. El citoplasma servir de reservorio, que dependiendo de la concentracin de glucosa o sodio activar otras molculas para que el proceso ocurra. Hay un acoplamiento qumico funcional y un dominio separado fsicamente por barreras de tipo uniones estrechas que impiden la deslocalizacin de
los componentes proteicos sea de la cara basal o la apical. Es importante al identificar molculas a nivel de superficie, saber que an sin conocer la ubicacin de estos sistemas, debe mantenerse la integridad fsica que impida el reordenamiento de componentes de una superficie a otra.
Por ejemplo al desconocer la ubicacin de un transportador, se disocian las clulas para hacer un cultivo de clulas primarias, es probable que se distribuya en toda la clula; por ende, es fundamental mantener las uniones estrechas entre las clulas, para dar as polaridad de dominios que permitan identificar mejor la ubicacin del transportador en estudio, en caso de no poder hacer la identificacin en tejido. Existen anticuerpos que no pueden ser utilizados en tejido ni en material fijado incluido posteriormente en resinas. Entonces debe hacerse la inmunodeteccin en tejido sin fijar, permeabilizando los extendidos, porque sera necesario tener los dominios mirando hacia el extracelular. Es muy importante entonces tener presente que las molculas deben ubicarse en el extracelular, adoptar precauciones, y tener claro la ubicacin del epitelio. Las cavolas, analizadas en la dcada del 50 por Palade, han sido retomadas para el estudio. Se defina antes como una unidad invaginada de membrana plasmtica de 50 a 100 nm; Disanti, en la actualidad, agrega que adems de invaginaciones pueden haber estructuraciones en vesculas, estructuras aplanadas, racimos; todas estas formas pueden ser momentos o estados de la invaginacin. Estas invaginaciones tienen distribucin diferencial en las diferentes superficies celulares. Cuando se da un tratamiento a las clulas para extraer las bicapas y dejar el componente proteico, se observan ovillos que son diferentes entre s. Todas estas protenas forman cubiertas a estas estructuras. Existen isoformas de una protena denominada caveolina, que forman una cubierta a la cavola, y podran ayudar a explicar las diferencias en las formas de stas. Cuando la cavola adopta una forma hexagonal o pentagonal, su cubierta est formada por clatrina. Dependiendo del tipo celular las cavolas pueden ser transitorias y cumplir funciones de endocitosis y fusionarse con la membrana plasmtica basal celular y transitar compuestos a travs de la clula. En un corte de MET de un capilar sanguneo, cuya principal funcin es la de transporte, en que se ven clulas endoteliales cortadas a diferente plano, se ven una serie de vesculas hacia basal. A mayor aumento, las vesculas corresponden a cavolas (segn Disanti seran con forma de racimo, interconectadas, y que llegaran a la superficie basal), se ven vesculas abiertas que han vaciado su contenido a la matriz extracelular, otras prontas a fusionarse, surge la pregunta: si realmente en estos sistemas, y dada la alta eficiencia operativa del transporte en los vasos sanguneos, es necesario esto? En otros tejidos como el intestino, rin, hepatocito u otras clulas, esta organizacin no se encuentra. Entonces la organizacin es particular del tipo celular estudiado. No esperaremos que las cavolas de un tipo celular se presenten de la misma forma en otro tipo. Se ha postulado un modelo contnuo que conecta el extra e intracelular a travs de este racimo de estructuras que van a fusionarse con el intracelular; otro punto que no puede desconocerse al hacer estudio de membranas es el movimiento de protenas y lpidos en la membrana celular. La temperatura del organismo est sobre el punto de fusin de los cidos grasos; con mayor razn a 37 C. En los 70 Singer y Nicholson se basaron en el experimento de Frye y Edwin para postular el modelo de mosaico fluido. Con linfocitos y Ac contra una protena de membrana unido a un fluorocromo, se incub y al tiempo cero se vi que la protena estaba localizada en forma localizada, y a los 30 minutos se observ una redistribucin de la marca. Si bien inicialmente se ubicaba en un polo de la clula; cuando se mira con otros marcadores, puede determinarse la polaridad de stos. Las clulas, pese a ser libres, tiene una distribucin de sus componentes de superficie no equivalentes en su longitud, porque de alguna forma fueron destinados para producir la endocitosis y la degradacin de los componentes. En el caso de componentes como el glicoclix, formado por azcares unidos covalentemente unidos a protenas y lpidos, no debe perderse de vista su procedencia; la glicosilacin de protenas y
lpidos de membrana ocurre en el Golgi. En el caso de las protenas empieza en retculo y se modifica en Golgi, en tanto en el caso de los lpidos se inicia en el Golgi; despus, con seales apropiadas, y por un proceso de secrecin constitutiva (recambio de componentes de membrana) cambian en forma particular el componente degradado y se ubica as en la superficie extracelular. Es un proceso complejo. Como sealamos las protenas inician su modificacin en retculo, y una vez que se sintetiza el pptido se le agregan oligosacridos caracterizados por tener 2 grupos de N-acetilglucosaminas, 9 manosas y 3 glucosas, que corresponden a los precursores de los oligosacridos de las glicoprotenas.
Algunos grupos se procesan en retculo y otros en Golgi. En un ejemplo se muestra un residuo de asparragina que es glicosilado y el resto corresponde a los azcares ya mencionados. En el Golgi la protena sigue su procesamiento, por lo que en los distintos compartimientos deben haber enzimas que agreguen, saquen y transfieran azcares: glicosidasas y transferasas. El trmino de la glicosilacin ocurre a este nivel. Pueden originarse 3 tipos de producto, 3 grandes grupos de azcares: un tipo rico en manosas (6 tipos de manosa), otro que pierde manosa y se agregan otros azcares en Golgi (Nacetilglucosamina, galactosa en posicin subterminal y cido silico (NANA) en posicin terminal. A partir de estas enzimas pueden generarse 3 tipos diferentes de azcares: rico en manosa, hbrido (contiene menos manosa que el rico en manosa pero ms que el que las ha sustituido totalmente por otros 2 oligosacridos agragados en el Golgi), y un tipo complejo. Cuando hay mutaciones gnicas en clulas de Sacaromycces cerevisiae que carecen de la enzima GlcNac no puede agregar galactosa y cido silico, y por ende las glicoprotenas no son funcionales pese a tener una destinacin correcta. Mediante tcnicas metodolgicas se ha podido estudiar los azcares y su participacin en el metabolismo. Debe definirse previamente la molcula a identificar. Por ejemplo, en el caso del cido silico, que tiene cargas negativas, se ocupan diversas tcnicas, que identifican las caractersticas aninicas del cido silico, o bien permiten reconocer el residuo de cido silico como tal. En este caso est en juego el grado de especificidad. Por ejemplo, empleando rojo rutenio, colorante de baja especificidad que permite teir la superficie celular, se hace un control negativo tratando con enzimas otros tejidos para determinar cunto disminuye y cunto aporta el grupo COOH a identificar los sitios aninicos. Para la identificacin de residuos completos, por ejemplo de cido silico, se emplean unas protenas que antiguamente se pensaba que slo estaban en vegetales, pero que hoy se conoce su participacin en animales tambin, las lectinas. stas se caracterizan por tener un sitio de unin especficos para ciertos residuos, por ejemplo algunas lectinas como la LPA slo reconocen cido silico; la WGA (aglutinina de germen de trigo) reconoce N-acetilglucosamina y tambin cido silico, pero la constante de afinidad favorece el reconocimiento de cido silico. Otra lectina, la concanavalina A (Con A), que induce la proliferacin celular, reconoce residuos de manosa, fucosa y glucosa. Pero los azcares de superficie no tienen glucosa, pues se encuentra en retculo. Entonces no habr problema en la identificacin de los residuos glucosa. Debe discriminarse entre fucosa y manosa, para lo que se usa manosidasa o fucosidasa que la extraigan para as determinar cual es el residuo que est siendo reconocido. Estas tcnicas se complementan con el control de unin de tratamiento con enzima. Luego se emplean anticuerpos para determinar un tipo o grupo de azcares, con un nivel mayor de especificidad. Por ejemplo con anticuerpos policlonales se reconocen por ejemplo otros epitopos. Todos estos sistemas de reconocimiento, con excepcin del rojo rutenio que da un color electrondenso a la microscopa electrnica, son protenas, por lo que no pueden ser observadas directamente al microscopio, y requieren entonces de un marcador, que pueden ser enzimas (unidas covalentemente a lectina o anticuerpo) como la peroxidasa y las fosfatasas, o bien marcadores particulados, como la ferritina (protena que tiene un sitio o ncleo con una alta cantidad de Fe+3
electrondenso al haz de electrones), la hemocianina (de tamao muy grande, presenta problemas de identificacin), y la ms empleada actualmente que es el oro coloidal. ste permite una mejor resolucin y pueden fabricarse diferentes tamaos de partculas desde 5 nm hacia arriba, lo que permite hacer colocalizacin de ms de una molcula de azcar o eptopo de una protena, en forma simultnea.
Hace 20 aos se usaba ferritina principalmente, ahora se emplea ms oro coloidal. En un podocito de glomrulo renal se hizo identificacin utilizando una lectina unida a enzima, lo que se hace despus que la lectina se ha unido, es incubar con un sustrato que sea electrondenso, adems insoluble para que no sea extrable con los lavados. Dependiendo del tiempo de incubacin (si tengo una enzima activa y con suficiente cantidad de sustrato), tanto sustrato se convierte a producto como sustrato exista. Si se desea hacer una localizacin exacta y no se sabe cunto de lo que se est identificando hay, se parte con una determinacin de este tipo; si bien no es cuantitativa dar por el manejo experimental hecho o por lo grosera de la reaccin, en caso de dar negativa la reaccin, se comprueba que no existe la molcula que se busca. Dando diferentes tiempos de incubacin, si se obtiene una cantidad de precipitado, se seala que hay una cantidad determinada. Para hacer ms cuantitativo el anlisis, si los mismos podocitos estudiados con la misma lectina, unida a ferritina, se ven unos pequeos grnulos correspondientes a la lectina unida al residuo, en este caso a cido silico, al extraer las glicoprotenas de membrana por fraccionamiento subcelular, se obtiene una nica protena rica en silico. Existe una patologa en que cuando hay alteraciones de la glicosilacin no se produce transformacin proteica en los podocitos y da alteraciones a nivel proteico. Es importante tener la visin de una misma estructura observada con 2 metodologas diferentes para discernir cul conviene ms emplear y la cantidad de sustrato a utilizar. En otro caso, en endotelio se observan partculas de oro que se depositan sobre la superficie, que se endocitan, hay reaccin. Este caso muestra una albmina glicosilada de diabtico. Cuando se identifica en estas tcnicas de estudio de ligandos a nivel de membrana y superficie, se necesita una molcula que reconozca al ligando y un marcador, que puede ser particulada o difusa, y controles. En una reaccin de verificacin de azcares se puede usar enzimas (control ms especfico), y uso de inhibidores competitivos. Se incuba en este caso las lectinas con haptenos, azcares similares a las estudiadas y modificadas qumicamente para tener mayor afinidad por la lectina, el hapteno se une a lectina en incubacin previa de 30 minutos. Luego la clula es incubada con las lectinas y luego se desarrolla la reaccin, debiendo en teora haber escasa o nula marca. Existen problemas de cncer asociados a glicosilacin, que pueden ser pesquisados por seguimiento de enzimas y glicoprotenas para determinar cul producto est aumentado o disminuido. Debe tenerse cuidado con el anlisis de estas molculas. Existen, como en todo tipo de estudio, limitantes, que al igual que las ventajas que tenga, deben ser conocidas, pues ellas pueden incidir en resultados negativos o en falsos positivos. Hay limitaciones en la identificacin, en la localizacin y la cuantificacin. 1. Identificacin: uniones altamente especficas, no encontrar marcador si existe endocitosis o difusin del componente en estudio (se sugiere para evitar esto bajar las temperaturas, el movimiento de membranas haciendo la incubacin a 4 C), cambios de exposicin del receptor (enmascaramiento). 2. Localizacin: adems de los anteriores problemas, existencia de movimiento inducido, activo de la molcula en identificacin, movimiento pasivo, uso de marcadores no particulados en la
localizacin (la distribucin pudiera ser homognea en toda la superficie o bien en parches, o localizada puntualmente en un dominio de la membrana); es importante definir el tipo de marcador a utilizar.
3. Cuantificacin: a los anteriores se suman la afinidad y avidez (interaccin apropiada del ligando con el marcador) de unin, la razn entre ligando y marcador (estequiometra de los elementos que participan), tamao de la molcula ligando, del marcador, del nmero de valencia del ligando (ms de un sitio de unin), la exposicin de los sitios de unin, pptidos y azcares.
El ideal es que una glicoprotena en superficie tenga expuestos todos sus sitios con residuos azcares y pptidos. Por ejemplo la identificacin de cido silico, todos los sitios estn expuestos, pero teniendo un ligando muy grande que ocupa el sitio de un residuo vecino, pudiera impedir ver ambos como entidades separadas, no estando disponibles estas azcares para la unin ligando-receptor. Un problema de discriminacin de vecindad se presenta frecuentemente con el uso de concanavalina A que tiene 4 sitios de reaccin. Otra posibilidad es que haya reaccin en una zona de convergencia lo que impide tambin el reconocimiento de residuos diferentes. Lo mismo cuando se usan partculas o molculas grandes como la hemocianina, que no permiten saber a cuntos residuos se unen. Pueden haber reordenamientos inducidos por ligando, de tipo activo o pasivo. En caso de contabilizarse las partculas no se puede discriminar cunto realmente est marcndose. Pudiera haber incluso enmascaramiento de partculas, que altera claramente los resultados.
No puse los ejemplos que dio en clase de los acinos glandulares, porque lo esencial de la materia ya fue expuesto. Adolfo Ros-Alcorta
Deteccin Citoqumica de Polisacridos: Lectinas y su utilizacin en Citoqumica Ultraestructural

En tejidos como los epitelios, las clulas que los componen es posible que a travs de molculas
expresadas en la superficie celular, puedan reconocer otras molculas que forman parte de la matriz extracelular; es importante entonces recordar la organizacin de sta para comprender el modo de trabajo en microscopa electrnica. La superficie celular (cualquiera sea el tipo de clula de entre todas las que nos constituyen), incluso en tejidos constituidos por un mismo tipo celular; este es el caso del hgado, que a microscopa ptica nos parece similar. Sin embargo, los anlisis bioqumicos y ultraestructurales demuestran que hay una gradiente de composicin caracterstica dentro del lobulillo heptico. Adems, la composicin y funcin cambia entre cada hepatocito. Las superficies del hepatocito tienen diferentes receptores, azcares y otros componentes, que lo hacen ser particular. Si bien podemos observar clulas que parecen equivalentes en forma y funcin, cuando indagamos en forma ms profunda comprobamos que no es as. Esto es fundamental tenerlo presente para los propsitos de investigacin, pues incluso en cultivos celulares ninguna clula es igual a otra, pese a que tengan un mismo patrn. Adicionalmente, debe considerarse el nivel de complejidad existente, relacionado con la diversidad de tipos de molcula de membrana, o de los dominios. Por ejemplo, una clula plasmtica no equivale a una clula epitelial, pues esta ltima se relaciona con clulas vecinas, un lumen y una matriz extracelular, mostrando una complejidad diferencial en su superficie dependiendo de las relaciones establecidas. La membrana plasmtica se observar como una estructura de 2 zonas densas separadas por una zona clara formando una unidad de membrana (segn Robertson). Sin embargo, al comparar las unidades de membrana de diferentes clulas observadas al microscopio electrnico de transmisin, no es posible sealar que sus funciones y composicin son equivalentes. Ms an cuando se estudian procesos de transporte, se esquematizan procesos como el transporte, los dibujos muestran un grado de confusin, pues da una visin simplista de la funcin de las molculas. El caso tpico es el de los canales de potasio, que en modelos 3D, con sus diferentes dominios, estn formados por 2 subunidades que en parte miran al extra y al intracelular, y que son complejas. El modelo de membrana de mosaico fluido de Robertson, planteado en 1962 y que sigue emplendose hasta hoy, ha tenido pocas modificaciones. Este modelo propone que las membranas estn formadas por una bicapa altamente fluida y lquida a la temperatura fisiolgica de los organismos, y que las protenas se insertaban en toda ella, hacia un lado u otro de la bicapa, y que la bicapa era mvil, con cierto grado de libertad de movimiento de lpidos transversalmente en el plano de la membrana. Por 40 aos se ha trabajado con este modelo. Haba bicapas ms ricas en c. grasos saturados, insaturados, y dependiendo del punto de fusin de stos iba a estar en estado ms o menos lquido, pero se supona que las membranas tenan un mismo grado de fluidez en ambos lados. Por otra parte, se pensaba que una misma molcula (fosfolpidos) tena 2 centros diferenciales: las colas hidrofbicas de cidos grasos, y un extremo amino alcohol. Una membrana puede tener una cantidad de fosfolpidos no equivalente a la otra. En M.E. puede observarse esta unidad de membrana de bolsa equivalente, pero no mirndola como si tuviese los mismos constituyentes. A qu nos lleva esto? Dependiendo de las alternativas de tener un mismo tipo de cido graso pero con diferente rotacin y que cambie solamente el amino alcohol, tendremos un enorme nmero de posibilidades de fosfolpidos diferentes que dan asimetra a la membrana, ubicndose algunos hacia la cara extracelular y otros hacia el citosol. Aquellos fosfolpidos de la cara extracelular no podrn estar hacia el citosol, y viceversa, salvo que medien procesos como la
apoptosis, que tendrn un flip-flop de algunos de ellos, que puede usarse como marcador de dao celular temprano.
En la ltima dcada ha surgido nueva informacin que aporta elementos nuevos de conocimiento sobre las membranas. Las membranas no solamente son una interfase formada por fosfolpidos y otros lpidos como el colesterol, libremente desplazables, sino adems existen unidades con composicin diferencial respecto de las dems, que estn constituidas por esfingolpidos y colesterol en altas concentraciones, presentes en la cara exoplsmica de la bicapa. Estos sectores denominados dominios raft o balsa , se caracterizan por ser resistentes a la solubilizacin en detergente, mostrando un cambio en el concepto del modelo clsico de mosaico fluido de membrana, en que todos los componentes eran solubles en detergentes inicos y no inicos, y que a 4 C hay una baja densidad de flotacin en una gradiente de sacarosa. Operacionalmente, desde el punto de vista fsico, la membrana dej de ser una entidad contnua, concepcin inicial, hasta hace unos 5 aos atrs. Los esfingolpidos ms participativos son los ganglisidos (sustituidos por monosacridos o subunidades mayores) y cerebrsidos. Existen familias de ganglisidos, que aportan a los dominios diversidad y especificidad de funcin para cada membrana que tenga este tipo de molculas. Tambin debemos considerar el colesterol, especfico de todas las membranas, pero concentrado en la monocapa externa de los dominios raft. Una clula, tiene una difusin alternada entre los dominios Raft y no Raft, sin separacin fsica. Al microscopio electrnico se ven iguales, slo si esos dominios Raft, adems de su composicin lipdica forman cavolas, se puede discriminar morfolgicamente entre dominios Raft y postcavola; y la cavola tendr la composicin de lpidos Raft y protenas como caveolinas, que le permiten quebrarse e invaginarse. Es decir, requerir la presencia de una maquinaria mecnica que le haga perder su continuidad e invaginarse. Estos dominios no se forman en la propia membrana, sino que se forman en Golgi. Es la ltima cisterna del trans Golgi que destina vesculas, sea de composicin Raft o no, pues la destinacin viene del intracelular. En la hoja exoplsmica hay protenas unidas por tallos de lpidos GPI (glicosil fosfatidil inositol), asociados a transporte, transcitosis, adems se han estudiado en su relacin con la transduccin de seales. Los dominios Raft al verlos en 2 tipos de clulas epiteliales, como el epitelio intestinal y en hepatocitos veremos lo siguiente: en hepatocitos estn discretamente distribuidos en forman ms o menos homognea en todas su superficies (canalicular, sinusoidal, intermembrana). Cada una de sus caras forma interacciones diferentes. En el caso del intestino, existe una superficie luminal, una basolateral, y una cara que da hacia la matriz extracelular. Las clulas se contactan entre ellas por interacciones o uniones estrechas, por el lado basal interacta a travs de receptores de adhesin con componentes de la matriz extracelular. Comparando la distribucin con los dominios de estas clulas, los dominios Raft estn distribuidos mayoritariamente en la superficie apical. Cada tipo celular tendr una distribucin asimtrica, pero no en el plano de la bicapa, sino en el de los dominios de membrana (apical y basolateral); esto no solo es vlido para lpidos, sino tambin para protenas. En la membrana hay protenas integrales de membrana, de transmembrana que atraviesan una o varias veces sta, protenas asociadas con cidos grasos, perifricas asociadas a protenas integrales. Cmo se distribuyen las protenas dentro de una clula con un gradiente de polaridad, como las que forman epitelios (presentan un dominio apical, uno basal y uno lateral, generalmente la regin apical mirando hacia un lumen y la basal hacia la matriz extracelular). Cmo se distribuyen las protenas en una misma superficie? En una clula epitelial, un nutriente como la glucosa no ingresa si no est acoplada funcionalmente a 4 tipos de receptores o canales; por ejemplo ingresa por la cara luminal a travs de un transportador de tipo bomba sodio potasio ATPasa, otro que corresponde a un canal de potasio; para que la glucosa llegue a la sangre deben funcionar 4 tipos de protenas que medien el transporte de la glucosa, ubicadas en diferentes dominios. El citoplasma servir de reservorio, que dependiendo de la concentracin de glucosa o sodio activar otras molculas para que el proceso ocurra. Hay un acoplamiento qumico funcional y un dominio separado fsicamente por barreras de tipo uniones estrechas que impiden la deslocalizacin de
los componentes proteicos sea de la cara basal o la apical. Es importante al identificar molculas a nivel de superficie, saber que an sin conocer la ubicacin de estos sistemas, debe mantenerse la integridad fsica que impida el reordenamiento de componentes de una superficie a otra.
Por ejemplo al desconocer la ubicacin de un transportador, se disocian las clulas para hacer un cultivo de clulas primarias, es probable que se distribuya en toda la clula; por ende, es fundamental mantener las uniones estrechas entre las clulas, para dar as polaridad de dominios que permitan identificar mejor la ubicacin del transportador en estudio, en caso de no poder hacer la identificacin en tejido. Existen anticuerpos que no pueden ser utilizados en tejido ni en material fijado incluido posteriormente en resinas. Entonces debe hacerse la inmunodeteccin en tejido sin fijar, permeabilizando los extendidos, porque sera necesario tener los dominios mirando hacia el extracelular. Es muy importante entonces tener presente que las molculas deben ubicarse en el extracelular, adoptar precauciones, y tener claro la ubicacin del epitelio. Las cavolas, analizadas en la dcada del 50 por Palade, han sido retomadas para el estudio. Se defina antes como una unidad invaginada de membrana plasmtica de 50 a 100 nm; Disanti, en la actualidad, agrega que adems de invaginaciones pueden haber estructuraciones en vesculas, estructuras aplanadas, racimos; todas estas formas pueden ser momentos o estados de la invaginacin. Estas invaginaciones tienen distribucin diferencial en las diferentes superficies celulares. Cuando se da un tratamiento a las clulas para extraer las bicapas y dejar el componente proteico, se observan ovillos que son diferentes entre s. Todas estas protenas forman cubiertas a estas estructuras. Existen isoformas de una protena denominada caveolina, que forman una cubierta a la cavola, y podran ayudar a explicar las diferencias en las formas de stas. Cuando la cavola adopta una forma hexagonal o pentagonal, su cubierta est formada por clatrina. Dependiendo del tipo celular las cavolas pueden ser transitorias y cumplir funciones de endocitosis y fusionarse con la membrana plasmtica basal celular y transitar compuestos a travs de la clula. En un corte de MET de un capilar sanguneo, cuya principal funcin es la de transporte, en que se ven clulas endoteliales cortadas a diferente plano, se ven una serie de vesculas hacia basal. A mayor aumento, las vesculas corresponden a cavolas (segn Disanti seran con forma de racimo, interconectadas, y que llegaran a la superficie basal), se ven vesculas abiertas que han vaciado su contenido a la matriz extracelular, otras prontas a fusionarse, surge la pregunta: si realmente en estos sistemas, y dada la alta eficiencia operativa del transporte en los vasos sanguneos, es necesario esto? En otros tejidos como el intestino, rin, hepatocito u otras clulas, esta organizacin no se encuentra. Entonces la organizacin es particular del tipo celular estudiado. No esperaremos que las cavolas de un tipo celular se presenten de la misma forma en otro tipo. Se ha postulado un modelo contnuo que conecta el extra e intracelular a travs de este racimo de estructuras que van a fusionarse con el intracelular; otro punto que no puede desconocerse al hacer estudio de membranas es el movimiento de protenas y lpidos en la membrana celular. La temperatura del organismo est sobre el punto de fusin de los cidos grasos; con mayor razn a 37 C. En los 70 Singer y Nicholson se basaron en el experimento de Frye y Edwin para postular el modelo de mosaico fluido. Con linfocitos y Ac contra una protena de membrana unido a un fluorocromo, se incub y al tiempo cero se vi que la protena estaba localizada en forma localizada, y a los 30 minutos se observ una redistribucin de la marca. Si bien inicialmente se ubicaba en un polo de la clula; cuando se mira con otros marcadores, puede determinarse la polaridad de stos. Las clulas, pese a ser libres, tiene una distribucin de sus componentes de superficie no equivalentes en su longitud, porque de alguna forma fueron destinados para producir la endocitosis y la degradacin de los componentes. En el caso de componentes como el glicoclix, formado por azcares unidos covalentemente unidos a protenas y lpidos, no debe perderse de vista su procedencia; la glicosilacin de protenas y
lpidos de membrana ocurre en el Golgi. En el caso de las protenas empieza en retculo y se modifica en Golgi, en tanto en el caso de los lpidos se inicia en el Golgi; despus, con seales apropiadas, y por un proceso de secrecin constitutiva (recambio de componentes de membrana) cambian en forma particular el componente degradado y se ubica as en la superficie extracelular. Es un proceso complejo. Como sealamos las protenas inician su modificacin en retculo, y una vez que se sintetiza el pptido se le agregan oligosacridos caracterizados por tener 2 grupos de N-acetilglucosaminas, 9 manosas y 3 glucosas, que corresponden a los precursores de los oligosacridos de las glicoprotenas.
Algunos grupos se procesan en retculo y otros en Golgi. En un ejemplo se muestra un residuo de asparragina que es glicosilado y el resto corresponde a los azcares ya mencionados. En el Golgi la protena sigue su procesamiento, por lo que en los distintos compartimientos deben haber enzimas que agreguen, saquen y transfieran azcares: glicosidasas y transferasas. El trmino de la glicosilacin ocurre a este nivel. Pueden originarse 3 tipos de producto, 3 grandes grupos de azcares: un tipo rico en manosas (6 tipos de manosa), otro que pierde manosa y se agregan otros azcares en Golgi (Nacetilglucosamina, galactosa en posicin subterminal y cido silico (NANA) en posicin terminal. A partir de estas enzimas pueden generarse 3 tipos diferentes de azcares: rico en manosa, hbrido (contiene menos manosa que el rico en manosa pero ms que el que las ha sustituido totalmente por otros 2 oligosacridos agragados en el Golgi), y un tipo complejo. Cuando hay mutaciones gnicas en clulas de Sacaromycces cerevisiae que carecen de la enzima GlcNac no puede agregar galactosa y cido silico, y por ende las glicoprotenas no son funcionales pese a tener una destinacin correcta. Mediante tcnicas metodolgicas se ha podido estudiar los azcares y su participacin en el metabolismo. Debe definirse previamente la molcula a identificar. Por ejemplo, en el caso del cido silico, que tiene cargas negativas, se ocupan diversas tcnicas, que identifican las caractersticas aninicas del cido silico, o bien permiten reconocer el residuo de cido silico como tal. En este caso est en juego el grado de especificidad. Por ejemplo, empleando rojo rutenio, colorante de baja especificidad que permite teir la superficie celular, se hace un control negativo tratando con enzimas otros tejidos para determinar cunto disminuye y cunto aporta el grupo COOH a identificar los sitios aninicos. Para la identificacin de residuos completos, por ejemplo de cido silico, se emplean unas protenas que antiguamente se pensaba que slo estaban en vegetales, pero que hoy se conoce su participacin en animales tambin, las lectinas. stas se caracterizan por tener un sitio de unin especficos para ciertos residuos, por ejemplo algunas lectinas como la LPA slo reconocen cido silico; la WGA (aglutinina de germen de trigo) reconoce N-acetilglucosamina y tambin cido silico, pero la constante de afinidad favorece el reconocimiento de cido silico. Otra lectina, la concanavalina A (Con A), que induce la proliferacin celular, reconoce residuos de manosa, fucosa y glucosa. Pero los azcares de superficie no tienen glucosa, pues se encuentra en retculo. Entonces no habr problema en la identificacin de los residuos glucosa. Debe discriminarse entre fucosa y manosa, para lo que se usa manosidasa o fucosidasa que la extraigan para as determinar cual es el residuo que est siendo reconocido. Estas tcnicas se complementan con el control de unin de tratamiento con enzima. Luego se emplean anticuerpos para determinar un tipo o grupo de azcares, con un nivel mayor de especificidad. Por ejemplo con anticuerpos policlonales se reconocen por ejemplo otros epitopos. Todos estos sistemas de reconocimiento, con excepcin del rojo rutenio que da un color electrondenso a la microscopa electrnica, son protenas, por lo que no pueden ser observadas directamente al microscopio, y requieren entonces de un marcador, que pueden ser enzimas (unidas covalentemente a lectina o anticuerpo) como la peroxidasa y las fosfatasas, o bien marcadores particulados, como la ferritina (protena que tiene un sitio o ncleo con una alta cantidad de Fe+3
electrondenso al haz de electrones), la hemocianina (de tamao muy grande, presenta problemas de identificacin), y la ms empleada actualmente que es el oro coloidal. ste permite una mejor resolucin y pueden fabricarse diferentes tamaos de partculas desde 5 nm hacia arriba, lo que permite hacer colocalizacin de ms de una molcula de azcar o eptopo de una protena, en forma simultnea.
Hace 20 aos se usaba ferritina principalmente, ahora se emplea ms oro coloidal. En un podocito de glomrulo renal se hizo identificacin utilizando una lectina unida a enzima, lo que se hace despus que la lectina se ha unido, es incubar con un sustrato que sea electrondenso, adems insoluble para que no sea extrable con los lavados. Dependiendo del tiempo de incubacin (si tengo una enzima activa y con suficiente cantidad de sustrato), tanto sustrato se convierte a producto como sustrato exista. Si se desea hacer una localizacin exacta y no se sabe cunto de lo que se est identificando hay, se parte con una determinacin de este tipo; si bien no es cuantitativa dar por el manejo experimental hecho o por lo grosera de la reaccin, en caso de dar negativa la reaccin, se comprueba que no existe la molcula que se busca. Dando diferentes tiempos de incubacin, si se obtiene una cantidad de precipitado, se seala que hay una cantidad determinada. Para hacer ms cuantitativo el anlisis, si los mismos podocitos estudiados con la misma lectina, unida a ferritina, se ven unos pequeos grnulos correspondientes a la lectina unida al residuo, en este caso a cido silico, al extraer las glicoprotenas de membrana por fraccionamiento subcelular, se obtiene una nica protena rica en silico. Existe una patologa en que cuando hay alteraciones de la glicosilacin no se produce transformacin proteica en los podocitos y da alteraciones a nivel proteico. Es importante tener la visin de una misma estructura observada con 2 metodologas diferentes para discernir cul conviene ms emplear y la cantidad de sustrato a utilizar. En otro caso, en endotelio se observan partculas de oro que se depositan sobre la superficie, que se endocitan, hay reaccin. Este caso muestra una albmina glicosilada de diabtico. Cuando se identifica en estas tcnicas de estudio de ligandos a nivel de membrana y superficie, se necesita una molcula que reconozca al ligando y un marcador, que puede ser particulada o difusa, y controles. En una reaccin de verificacin de azcares se puede usar enzimas (control ms especfico), y uso de inhibidores competitivos. Se incuba en este caso las lectinas con haptenos, azcares similares a las estudiadas y modificadas qumicamente para tener mayor afinidad por la lectina, el hapteno se une a lectina en incubacin previa de 30 minutos. Luego la clula es incubada con las lectinas y luego se desarrolla la reaccin, debiendo en teora haber escasa o nula marca. Existen problemas de cncer asociados a glicosilacin, que pueden ser pesquisados por seguimiento de enzimas y glicoprotenas para determinar cul producto est aumentado o disminuido. Debe tenerse cuidado con el anlisis de estas molculas. Existen, como en todo tipo de estudio, limitantes, que al igual que las ventajas que tenga, deben ser conocidas, pues ellas pueden incidir en resultados negativos o en falsos positivos. Hay limitaciones en la identificacin, en la localizacin y la cuantificacin. 1. Identificacin: Uniones altamente especficas, no encontrar marcador si existe endocitosis o difusin del componente en estudio (se sugiere para evitar esto bajar las temperaturas, el movimiento de membranas haciendo la incubacin a 4 C), cambios de exposicin del receptor (enmascaramiento).
2. Localizacin: Adems de los anteriores problemas, existencia de movimiento la molcula en identificacin, movimiento pasivo, uso de marcadores no localizacin (la distribucin pudiera ser homognea en toda la superficie o localizada puntualmente en un dominio de la membrana); es importante marcador a utilizar.
inducido, activo de particulados en la bien en parches, o definir el tipo de
3. Cuantificacin: A los anteriores se suman la afinidad y avidez (interaccin apropiada del ligando con el marcador) de unin, la razn entre ligando y marcador (estequiometra de los elementos que participan), tamao de la molcula ligando, del marcador, del nmero de valencia del ligando (ms de un sitio de unin), la exposicin de los sitios de unin, pptidos y azcares.
Adolfo Ros-Alcorta
Histoqumica Enzimtica en ME- Esteban rdenes45
DEMOSTRACIN CITOQUMICA DE ACTIVIDAD ENZIMTICA A NIVEL DE MICROSCOPA ELECTRNICA DE TRANSMISIN

Prof. Esteban rdenes Mircoles 22 de Octubre de 2003
Demostracin de enzimas a nivel de ME Dos formas:

Demostracin de la actividad enzimtica (citoqumica enzimtica) Demostracin de la protena (inmunocitoqumica)
Objetivos de la citoqumica enzimtica:

Preservar la actividad de la enzima Conservar localizacin
Reaccin tipo para demostracin de enzimas en MET: Sustrato

enzima
producto de reaccin primario (PRP) producto final de reaccin (PFR) electrnicamente denso
PRP + agente capturante
Se deja actuar la enzima sobre su sustrato, obtenindose un producto de reaccin primario, que no tiene color ni contraste, que es lo que nos interesa en ME, pero este producto puede reaccionar con un agente capturante; esta reaccin, entre PRP y agente capturante da un producto electrn denso, que constituye el producto final de reaccin. Interesa tambin que el PFR sea, adems de electrn denso, insoluble, que no difunda, para no perder la localizacin de la actividad enzimtica. Mezcla incubadora Componentes: Sustrato: a concentracin saturante Agente capturante: Es el que aporta el elemento electrn denso. - Sales metlicas: Pb, Al, Ce. - Sales de diazonio, sales de tetrazolio. Cofactores requeridos por la enzima Temperatura: generalmente subptima si la enzima es abundante pH : apropiado para la enzima Osmolaridad: fisiolgica Agente capturante:
Debe estar en concentracin adecuada: si es menor, la reaccin no podr ser visualizada y si se excede, la reaccin pudiera ser inhibida. Debe poder ser agregado cerca del sitio de reaccin de la enzima. Flujo: agente capturante tejido remocin por combinacin con PRP (en la medida que el AC reacciona con el PRP, su concentracin va disminuyendo) Influye: Grosor del trozo de tejido Grado de compactacin del tejido Fijacin, que permeabiliza el tejido. Suele tenerse problemas con el AC, dado que frecuentemente son poco penetrantes.
Caractersticas del producto final de reaccin: Debe formarse inmediatamente, para que el PRP soluble o difunda. Debe ser muy insoluble, para que precipite en el mismo lugar en que se forma. Ambos elementos apuntan a conseguir una reaccin cuya localizacin se conserve. Debe ser electrn denso.
Dos tipos principales de producto final de reaccin: Precipitado estable que no presenta contraste adecuado. Se debe tratar con osmio (sales de diazonio, tetrazolio, DAB, que son osmioflicos). Precipitado estable, no reactivo, con alto contraste electrnico, que resiste tratamientos posteriores (Pb, fosfato AL, Ce, Ferrocianuro cprico). La eleccin del mtodo depender del objetivo del estudio. Preparacin del tejido antes de la incubacin con el sustrato

Fijacin: algunas enzimas pueden ser fijadas y otras no. Las que no soportan fijacin constituyen un gran problema para la ME, slo a nivel de MO se puede tolerar de manera ms aceptable la observacin de la reaccin en tejido sin fijar. sta es una limitante de la enzimocitoqumica a nivel ultraestructural: que no todas las enzimas resisten fijacin. Lavado. Corte grueso.
Objetivos de la fijacin en citoqumica enzimtica

Preservar morfologa y proteger los tejidos de los procesos posteriores. (mantener el conocido artefacto de tcnica producido al procesar un tejido segn un protocolo dado y al cual estamos acostumbrados). Conservar la actividad enzimtica. Insolubilizar o inmobilizar a la enzima.
Efectos de la fijacin en citoqumica enzimtica

Disminuye o inhibe actividad enzimtica por denaturacin, lo cual depende tanto de la naturaleza de la enzima como del tipo de fijador, por ejemplo, ciertas enzimas no admiten fijacin con aldehdos, pero si con etanol (aunque para ME la fijacin con etanol es un desastre). Facilita la penetracin de los reactivos. En ME los estudios enzimticos se usan para precisar localizacin. Si se requiere medir actividad, se debe utilizar mtodos a nivel de MO. Se sugiere realizar primero la identificacin de la actividad enzimtica con MO y luego precisar localizacin de dicha actividad con ME.
Fijadores en citoqumica enzimtica Formaldehdo: fijador monoaldehdo, aditivo, es decir, reacciona qumicamente con el tejido y permanece all formando enlaces con grupos reactivos de las protenas. Por ello altera las estructuras terciaria y secundaria de las protenas y alterar la actividad enzimtica. Su compuesto activo es el metilenglicol. Debe ser preparado a partir de p-formaldehdo (forma slida, polimerizada del formaldehdo), ya que de esta forma se encuentra puro, no contiene metanol como la solucin acuosa, que puede actuar como inhibidor de algunas enzimas. Suele usarse al 4% a 4C y el tiempo de fijacin vara segn la enzima. Glutaraldehdo: es un dialdehdo, por lo que es an ms reactivo. Muchas veces no se puede emplear en estudios enzimticos o se lo emplea en baja concentracin (0,2 a 0,5%) a 4C. Es ms frecuente su uso en mezclas fijadoras que solo. Mezclas de ambos Solvente usado: buffer cacodilato pH 7,2 0,1M
Prctica de la fijacin Trocitos de tejido de 20 a 250um. Vibratomo: similar a un microtomo, para tejido includo en agar. Tissue choppers: includo en agar Cristato: Congelacin en isopentano en N2 lquido (congelacin rpida para evitar formacin de cristales de agua, que daan el tejido) Almacenamiento en N2 lquido. Corte en cristato, 10 a 20C. Tratamientos posteriores a la incubacin

Si el tejido no ha sido fijado, se puede fijar despus de la reaccin con glutaraldehdo. Si el PFR no presenta contraste adecuado, tratar de aumentarlo: osmicacin. Generalmente se usa post fijacin con osmio.
Controles en citoqumica enzimtica Negativos: control de la especificidad de la reaccin. Supresin de sustrato. Calor para inhibir la enzima. Inhibidores especficos. Positivo: Tejido que posea la actividad enzimtica investigada. Considerar patrn de reaccin: enzima mitocondrial debe dar reaccin en mitocondria y no en otro sitio. Demostracin de Fosfatasas Reaccin general:
Las fosfatasas catalizan la hidrlisis de steres y amidas de cido fosfrico, dando como producto un alcohol y un fosfato. Las tcnicas de identificacin pueden utilizar tanto el fosfato (tcnicas que utilizan sales metlicas) como el alcohol (tcnicas con sales de diazonio y tetrazolio). Fosfatasas:

Alcalinas cidas
Fijacin: permiten fijacin con glutaraldehdo 2% + sucrosa (osmolaridad), 2h, 4 C, trozos pequeos. Ejemplos sustrato: Beta-glicerofosfato, Citidin-5-monofosfato, naftol fosfato. Agentes capturantes: sales metlicas como Pb, Al, Ce; sales de diazonio; sales de tetrazolio. Agentes capturantes en fosfatasas Sales de Pb Puede dar reacciones inespecficas por afinidad con estructuras celulares. Inhibe fosfatasas. Da precipitados gruesos con la consiguiente mala localizacin. Penetracin lenta (Se utiliza la tcnica de Gomori, 1942, 1952.)
Sales de Al Ms especfico. Precipitados ms finos, que no enmascaran estructura de lisosomas. (Introducido por Beny en 1982). Cerio Buen capturante de fosfato Reacciones ms uniformes y reproducibles Ms especfico Precipitados finos Es poco penetrante: se debe usar cortes delgados de 4 a 7u. Clulas en cultivo deben ser permeabilizadas con detergentes, con la desventaja de la alteracin morfolgica. (Introducido por Robinson, 1983).
Demostracin de fosfatasa cida con sales metlicas:
Se utiliza el fosfato, para hacerlo reaccionar con una sal metlica, en el ejemplo: un fosfato de plomo, que corresponde a un precipitado incoloro. Este producto se hace reaccionar con una sal que contenga azufre, para formar un sulfuro de plomo insoluble, negro y electrondenso.
Demostracin de fosfatasa alcalina con sales de diazonio:
Como sustrato se usa naftol fosfato. La tcnica usa el naftol (no el fosfato), que tiene una reaccin de copulacin con una sal de diazonio, obtenindose un colorante azoico (grupo azo como cromgeno). ste no da un buen contraste pero es osmioflico, por lo que se trata con osmio para obtener la electrn densidad.
Demostracin de Oxido-reductasas Reaccin general: SH2 + A

enzima
S + AH2
Actan sobre un sustrato reducido en presencia de un aceptor, oxidando al sustrato con la consiguiente reduccin del aceptor. xido-reductasas: Oxidasas Deshidrogenasas Peroxidasa Oxigenasas
Oxidasas Reaccin general: SH2 + O2

enzima
2S + H2O
Tiene aceptor especfico: O2. Ejemplo: citocromo oxidasa. El sustrato es ms inespecfico. Deshidrogenasas Reaccin general: SH2 + A
enzima
S + AH2, (NADH, FADH, NADPH)
Aceptores: NAD FAD NADP Cada deshidrogenasa tiene un sustrato especfico. Ejemplos: deshidrogenasa lctica: cido lctico; deshidrogenasa succnica: cido succnico. La peroxidasa usa agua oxigenada como oxidante. Tiene sustratos inespecficos, ejemplo: DAB. Las oxigenasas introducen oxgenos en lugares de doble enlace en el sustrato. Ej: triptofano oxigenasa.
Identificacin de deshidrogenasas: Mtodo con sales de tetrazolio: Sustrato + Sales tetrazolio

enzima
Formazn + Sustrato oxidado
Sustrato oxidado coloreado Dbilmente electron denso
Osmioflico
Se sustituye el aceptor natural por uno artificial a una concentracin adecuada. Se usa como aceptor artificial una sal de tetrazolio, que es reducida al oxidarse el sustrato por accin enzimtica. La sal de tetrazolio reducida corresponde a formazn, compuesto insoluble, coloreado (til en MO), dbilmente electrn denso, pero osmioflico, por lo que el contraste se logra con tratamiento posterior con osmio.
Identificacin de deshidrogenasas: Mtodo con sales metlicas: Sustrato + Ferricianuro de K + Cu

enzima
Ferrocianuro cprico + Sustrato oxidado El tejido se trata con ferricianuro de potasio ms una sal de cobre. Por accin de la enzima, el sustrato es oxidado y el ferricianuro reducido a ferrocianuro, que a su vez reacciona con la sal de cobre, para dar ferrocianuro cprico, producto electrnicamente denso e insoluble.
Sofa Seplveda Contreras
Inmunocitoqumica Ultraestructural- Esteban rdenes 53
Inmunocitoqumica Ultraestructural
Prof. Esteban rdenes Martes 28 de Octubre de 2003
Inmunocitoqumica: Tcnica que permite la deteccin de antgenos celulares o tisulares, mediante anticuerpos especficos, y visualizacin posterior de la unin antgeno-anticuerpo con un sistema marcador Los anticuerpos son las sustancias ms especficas que se conocen, por lo tanto van a unirse especficamente a la sustancia que nosotros andamos buscando. Las tcnicas en general de inmunocitoqumica utilizan estos tres elementos:
La diferencia est en el tipo de marcador que utilicemos, algunos sirven para microscopa de luz, otros para microscopa electrnica. Para microscopa de luz necesitaremos colores, y para ME densidad electrnica. Sistemas marcadores: * Fluorocromos * Enzimas Peroxidasa Fosfatasa Alcalina * Partculas Metlicas Inmunofluorescencia (microscopio de fluorescencia) Inmunoperoxidasa Inmunofosfatasa Inmunometlicas (microscopio electrnico y de luz)
Para ME nos sirven enzimas y partculas metlicas.
Las tcnicas se dividen en cuanto a si son directas o indirectas. Directas son las que en el sistema marcador est unido directamente al anticuerpo primario, y son indirectas cuando el sistema marcador no est unido al anticuerpo primario sino a una segunda molcula, ya sea anticuerpo u otra sustancia. Esto tiene ventajas y desventajas, la desventaja de las tcnicas directas es que tendramos que tener cada anticuerpo marcado con un sistema lo que sale ms caro y engorroso. Por otra parte esta marcacin podra alterar la estructura del anticuerpo, podra daar la conformacin del anticuerpo y por lo tanto perder la reactividad. Adems son menos sensibles. De los sistemas indirectos tenemos segundo anticuerpo marcado, PAP (peroxidasa anti peroxidasa) y ABC (complejo avidina-biotina, generalmente usa peroxidasa). Estos sistemas pueden ser usados para distintos anticuerpos lo que es ms barato y menos complicado, es decir yo puedo tener un sistema de deteccin y muchos anticuerpos primarios distintos lo que puedo revelar con el mismo sistema. Con la tcnica de PAP se pudo por primera vez realizar inmunohistoqumica en tejidos incluidos en parafina por su alta sensibilidad. Esto fue importante porque se pudo diagnosticar ms correctamente distintas neoplasias que hasta el momento eran indiferenciados. Sensibilidad de ABC es mucho mejor, y ltimamente un sistema de deteccin conocido como polmero marcado da mucho ms sensibilidad.
Sistemas de deteccin electrondensos

Inmunoperoxidasa (PAP y ABC) con cromgeno DAB + osmio (da un cromgeno coloreado, precipitado y que es electrn denso y osmioflico, pero no tan definidos como el oro coloidal) Conjugados con ferritina (no se usan tanto ahora) Conjugados con oro coloidal Anticuerpos-oro Protena A-oro Sistemas avidina-biotina-oro
INMUNOCITOQUMICA ULTRAESTRUCTURAL Aspectos histricos

Ferritina

Anticuerpos conjugados con ferritina (Singer 1959) Anti ferritina-anti IgG (Hammerling et al, 1968) Ferritina-anti ferritina (Marucci et al, 1974) Avidina-Ferritina (Heitzman and Richards, 1974)
Peroxidasa

Peroxidasa-anticuerpos (Nakane and Pierce, 1966; Avrameas and Uriel, 1966) PAP (Masson et al, 1969 and Sternberg and Cuculis, 1969) Avidina-biotina-fluorocromos (Heggenes and Ash, 1977) Avidina-biotina-enzimas (Guesdon et al, 1977) Complejo avidina-biotina (ABC, Hsu et al, 1981)
Oro coloidal

Oro coloidal en ME (Feldherr and Marshal, 1962) Anticuerpos-oro coloidal (Faulk and Taylor, 1971)
Hay dos formas de hacer las tinciones en microscopa electrnica, a diferencia de microscopa de luz, una tcnica pre inclusin y una tcnica post inclusin.
PRE INCLUSIN Fijacin Corte grueso (si corresponde) Inmunotincin Osmicacin Inclusin en resina epxica Corte ultrafino Examen en TEM POST INCLUSIN Fijacin Osmicacin Inclusin (hidrfila o hidrfoba) Corte ultrafino Inmunotincin Examen en TEM
Se ha intentado realizar en tejidos incluidos pero es muy complejo porque la resina es muy impermeable y solo se puede reconocer los antgenos que queden expuestos en la cara de corte. Se ha probado poniendo los cortes en ambientes ricos en xilol para ablandar la resina pero aun as es difcil. En general la osmicacin antes de la incubacin se omite. Algunas resinas tienen problemas para polimerizar con el osmio porque este atrapa la luz UV y no les permite polimerizar.
ICQ pre inclusin o post inclusin?

Retencin de los antgenos en el tejido y preservacin de su reactividad Adecuada preservacin de la ultraestructura Ausencia de barreras que impidan la penetracin de los anticuerpos en el tejido o impidan su interaccin con los antgenos Hay algunos antgenos que no permiten fijacin.
ELECCIN DEL MTODO DE DETECCIN
Post inclusin Oro coloidal Pre inclusin PAP o ABC
Oro coloidal
Se obtiene por condensacin de partculas metlicas micromoleculares en partculas ms grandes de tipo coloidal (Zsigmondi y Thiesen 1925; Weisser 1933; Jirgenson y Traumanis 1962) Se procede a reducir cido clorourico con un agente adecuado Dependiendo del agente reductor se obtendrn partculas que varan en tamao y color. Ejemplos: Con fsforo: 1 - 3 nm o 5 - 12 nm segn la tcnica empleada Con citrato trisdico: 15-150 nm Son partculas esfricas de tamao y formas muy definidos, que a ME resultan ms definidas que cualquier cosa La existencia de distintos tamaos de esferas permite realizar tinciones dobles (partcula chica y grande).
Sistema de marcado con inmunogold para TEM
Para estudios con TEM los tamaos de partcula ms recomendados son: 5nm, 10nm, y 15nm. Duracin del complejo: Complejos duran aproximadamente 12 meses a 4C. Para mantener la estabilidad de los coloides se puede agregar soluciones proteicas.
Propiedades del oro coloidal

Hidrofbico con carga negativa en su superficie La estabilidad del coloide es mantenida por repulsin electrosttica Electrolitos en concentraciones sobre 7mM provocan floculacin y precipitacin. Este efecto se evita agregando protenas a los coloides (sustancias hidroflicas cargadas elctricamente). Las protenas son adsorbidas a las partculas de oro formando complejos estables
Conjugados con oro coloidal
Protena A-Oro: Se produce por ultracentrifugacin (60.000 a 105.000 x g por 1 a 1,5 h a 4C) de oro coloidal y protena A purificada de estafilococos (tiene afinidad por el fragmento Fc de las inmunoglobulinas). Conjugados de anticuerpo-oro coloidal, es la mejor opcin, se conjugan los secundarios.
APLICACIONES ICQ POST INCLUSIN Oro coloidal

De eleccin en la mayora de los estudios de ICQ Tcnica rpida y relativamente fcil Se puede utilizar en material incluido y osmicado Alta resolucin Permite estudios de doble marcacin No apropiada para antgenos que pierden fcilmente su reactividad
Ventajas del oro coloidal en ICQ post inclusin

Forma definida y alta densidad electrnica Pueden ser producidas en diferentes tamaos. Se puede hacer marcaciones dobles Son fciles de preparar y se pueden almacenar por largos perodos de tiempo
Caractersticas de los sistemas de marcado con inmunogold para TEM

Alta especificidad Baja aglomeracin (85% de las partculas permanecen separadas) Baja reactividad cruzada Tamao de partcula uniforme Alta concentracin
CONSIDERACIONES CON INMUNOGOLD

La eficiencia del marcaje es inversamente proporcional al tamao de partcula (mientras ms grande es la partcula el marcaje es menos eficiente) Las partculas ms grandes son ms fciles de detectar En experimentos de doble marcaje utilizar partculas de tamao bien distinto: 5 / 10; 10/ 20 En una solucin de oro coloidal siempre hay partculas de diverso tamao. Estudiar histogramas de hoja de especificaciones para ver si hay superposicin de tamaos (se puede estar marcando cosas distintas con partculas de igual tamao). Las suspensiones de oro coloidal deben refrigerarse pero no congelarse. En buenas condiciones, las soluciones duran 6 meses a 1 ao.
FIJACIN EN ICQ ULTRAESTRUCTURAL

Es un compromiso entre mantencin de la reactividad de los antgenos y la mantencin de la ultraestructura del tejido. Post fijacin con osmio: pocos antgenos se conservan a menos que se realice pre tratamiento.
Eleccin del fijador para ICQ ultraestructural

Paraformaldehido 1 4% en general no afecta la reactividad de la mayora de los antgenos Antgenos muy pequeos pueden ser fijados con concentraciones altas de Glutaraldehdo (5%) Pptidos y pequeas protenas pueden ser fijadas con glutaraldehdo 0,5 2% Antgenos proteicos grandes (enzimas, filamentos intermedios, glicoprotenas), habitualmente pierden su reactividad con glutaraldehdo sobre 0,5%
PRETRATAMIENTOS PARA RECUPERACIN DE REACTIVIDAD

Metaperiodato de sodio. Es un oxidante fuerte, cuyo mecanismo de accin parece ser la extraccin del OsO4 que no reaccion con el tejido ( Bendayan and Zollinger, 1983). Aumenta la hidrofilia de la resina por oxidacin de los residuos alkanos a alcoholes, aldehdos y cidos. Inconvenientes: Daa morfologa y remueve carbohidratos de las glicoprotenas.
PRETRATAMIENTOS PARA RECUPERACIN DE REACTIVIDAD CON METAPERIODATO DE SODIO Procedimiento:

Se debe realizar pruebas: Para araldita: 5, 10 y 15 min Para Epn: 10, 20, 30 min Finalmente, lavado con buffer + 1% de Tritn X-100 Metaperiodato ayuda a sacar el Epon.

RESINAS EN ICQ POST INCLUSIN

A.- Araldita o Epn. (ocultan antgenos) B.- Resinas hidroflicas acrlicas como Lowicryl K4M o LR Gold (es el recomendado para ICQ, no el LR White) Estas resinas (Lowicryl)pueden polimerizarse a baja temperatura 30/ -40C con UV, o a 50C con catalizador. No se puede fijar con osmio cuando se polimeriza a baja temperatura, ya que ste absorbe la UV y evita la polimerizacin de la resina.
Ventajas de las resinas hidrfilas en ICQ post inclusin

La hidrofilia facilita la interaccin Ag-Ac, lo que produce mayor eficiencia. La infiltracin y polimerizacin a bajas temperaturas preserva la reactividad de antgenos sensibles al calor, minimiza la extraccin de lpidos y las reacciones qumicas entre monmeros de la resina y componentes tisulares.
CORTE Y MONTAJE

Cortes. Conviene que sean algo ms gruesos que lo normal (color oro) Grillas: de oro o nquel, no de cobre porque pueden reaccionar con los compuestos Utilizacin de grillas cubiertas. No deben ser utilizadas con Epn, especialmente con oro coloidal, ya que aumenta la tincin de fondo inespecfica Deben emplearse con Lowicryl o LR Gold para evitar destruccin del corte con el haz de electrones (se fortalece con la grilla cubierta). Cantidad de cortes por grilla: la mayor posible, ya que algunos cortes se pierden.
ICQ PRE INCLUSIN

Se realiza en: Bloques muy pequeos de tejido Cortes en cristato Material de cultivo celular o tisular
Fijadores para ICQ pre inclusin

Protenas y pptidos
Paraformaldedo 4%, glutaraldedo 0,0 0,5% en buffer fosfato 0,1M pH7,4 Paraformaldehdo 4%, c. pcrico 0,2%, 0,05% glutaraldedo en buffer fosfato 0,1M pH7,3 Acrolena 3,75%, paraformaldehdo 2% en buffer fosfato 0,1M pH7,2
En general no resulta mucho la utilizacin de glutaraldehdo, pero si el antgeno lo resiste es mejor usarlo. En esto no se puede tener un fijador de eleccin, va a depender del antgeno.
Fijadores para ICQ pre inclusin
Carbohidratos y lpidos
Paraformaldehdo 1%, periodato de sodio 0,1%, lisina, 0,6% en buffer fosfato 0,1M pH7,2
No son realmente fijados, sino que se fija el entorno de protenas
Antgenos intracelulares
EDC 1%, glutaraldehdo 0,3% en buffer fosfato 0,1M pH7,0
*EDC: 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
Aplicaciones de ICQ pre inclusin PAP o ABC peroxidasa-DAB

Estudio de antgenos de membrana Cuando se pierde reactividad por fijacin e inclusin Muy utilizado para estudio de marcadores neuronales Lmina basal y matriz extracelular Cultivos celulares Antgenos del citoesqueleto Dermatologa Tumores endocrinos Depsitos inmunes e inmunoglobulinas Rin Microbiologa Sistema nervioso
CONTROLES

Es importante en todo trabajo inmunohistoqumicos usar controles: Positivos _ Tejido que yo se que posee el antgeno que busco. Negativo _ Usar por ej. suero normal de conejo (si se est usando un Ac. hecho en conejo), o quitar alguna de los reactivos de la reaccin. No se puede sacar conclusiones vlidas si no se tiene controles.
Sistema de marcado con inmunogold para SEM (Barrido)
La resolucin de SEM requiere que los sistemas de marcado con immunogold utilicen partculas ms grandes que para TEM o bien partculas pequeas que sean aumentadas mediante post tratamiento con plata Para visualizacin directa con TEM el tamao de partcula ms recomendado es 20nm, 30nm, y 40nm. Para visualizacin con tcnica de intensificacin con plata: 1nm y 5 nm.
Sistema de marcado con inmunogold para ML

En el microscopio de luz es imposible visualizar directamente las partculas de oro coloidal a causa de la limitada resolucin. Para visualizar los depsitos se requiere utilizar tcnicas de intensificacin con plata. Los depsitos de plata alrededor de las partculas de oro permiten su visualizacin. Para visualizacin indirecta (oro-plata) con LM el tamao de partcula ms recomendado 1nm y 5nm. Este tamao de partcula permite una adecuada penetracin en los tejidos y su posterior visualizacin con plata.
El precipitado de DAB se forma porque la peroxidasa acta sobre el perxido de hidrgeno, forma un complejo y si no encuentra un dador de electrones se queda pegada al perxido formando el complejo. La DAB que es incolora y soluble, cuando la enzima est formando el complejo oxida la DAB y esta se transforma en un precipitado coloreado, insoluble y electrn denso, el cual se deposita sobre el tejido, no queda unido al sistema de deteccin. La descalcificacin puede generar problemas en las reacciones HIQ.
Sofa Seplveda Contreras
Autorradiografa- Nancy Olea 63
Autorradiografa
Prof. Nancy Olea 4 de Noviembre de 2003
Uso de istopos radioactivos y emulsiones sensibles a las radiaciones, con el fin de trazar procesos
celulares o localizar sustancias en los especimenes biolgicos. Mtodo:

Administrar al animal u organismo vivo el componente radioactivo. Fijar el tejido. Impregnacin, inclusin y corte. Cubrir con una emulsin fotogrfica. Periodo de exposicin (semanas o meses) en que el emisor radioactivo ocasiona cambios en la emulsin fotogrfica. Revelar la emulsin fotogrfica para reducir el bromuro de plata a plata metlica.
Se obtiene un preparado llamado autorradiografa, una imagen del tejido con puntos negros o granos que aparecen localizados en el sitio de la emisin radiactiva. La autorradiografa es un mtodo que se emplea tanto para MO como para ME, alcanzando una mayor resolucin en esta ltima.
Valor de la tcnica
Ha tenido impactos significativos en la comprensin de aspectos dinmicos de procesos celulares como vas de sntesis o vas metablicas, vas de secrecin y en el conocimiento de la funcin de los organelos celulares. Ej. Secrecin en clulas pancreticas, va metablica de azcares en plantas. Localizacin de RNAm mediante la hibridacin in situ de oligonucletidos marcados con 35S. Estudios de replicacin y transcripcin del DNA. Tambin ha contribuido al estudio de la divisin celular, su mapeo y cuantificacin, y destino final de estas clulas en los organismos. Ha jugado un rol importante en la localizacin del destino de vitaminas, receptores y otras sustancias en los organismos. Esta tcnica es extremadamente sensible permitiendo la localizacin de una molcula determinada. Es una tcnica que permite cuantificar la densidad relativa de marcas o granos revelados por rea de tejido. La autorradiografa a nivel de ME es difcil de realizar, consumidora de tiempo y a veces muy costosa (alto valor de los istopos y de la emulsin) razones que debe evaluar el investigador antes de realizarlo. Como alternativa se puede usar inmunogold, mediciones en contador de centelleo en fraccin. Sin embargo, la tcnica alcanza inigualables niveles de precisin en comparacin con otros mtodos.
RADIOISTOPOS El istopo debe ser administrado como pulso o en forma continua, segn el diseo experimental utilizado. Tambin se utiliza el sistema de pulso y caza (se administra un pulso con el istopo marcado y luego un pulso con la misma molcula sin marcar). es importante manejar los tiempos que requieren las vas metablicas que se desean estudiar. Naturaleza del elemento radioactivo

Algunos ncleos atmicos de los elementos liberan energa o partculas subatmicas espontneamente. Istopos son ncleos atmicos qumicamente similares a los que liberan energa espontneamente pero su masa es distinta Ej:
12 14
C, 13C istopos estables C istopos radioactivo H, 2H istopos estables 3 H istopos radioactivo Las emisiones radioactivas de istopos inestables son de 2 tipos: - rayos o (fotones) - emisin de partculas cargadas. La desintegracin de un elemento se refiere a la emisin de partculas cargadas. Se llama radiacin ionizante a la propiedad de la radiacin de liberar electrones mientras pasa a travs de una sustancia. Para el mtodo autorradiogrfico se emplean las partculas cargadas, que pueden ser: a) : que se caracterizan por viajar en lnea recta debido a que tienen una gran masa y alta energa. Su descarga es equivalente a 2 protones y 2 electrones. Ejemplos: metales pesados. b) : que se caracterizan por viajar en lnea sinuosa, tener una carga negativa y una descarga de baja energa de ionizacin (0.1 a 1.7 Mev) equivalente a un electrn. Ejemplo: 3H, 14C, 32P, 35S, 121I. Las emisiones son las ms usadas en autorradiografa, por ser no txicos, por tener baja energa de ionizacin porque al atravesar la emulsin fotogrfica la impactan y generan una imagen latente, los electrones emitidos por desintegracin son fcilmente detectados por las emulsiones fotogrficas. Cuantificacin de la radioactividad
1Ci (Curie) es igual a 3,7 x 1010 desintegraciones por segundo (dps o Bq), generalmente se usan los mCi (10-3Ci) o uCi (10-6Ci)
LA ACTIVIDAD ESPCIFICA de un compuesto radioactivo se refiere a la fuerza de la sustancia radioactiva y define como la cantidad de radioactividad expresada en Ci en un milimol de la sustancia. VIDA MEDIA de una sustancia radioactiva es el perodo en el cual las desintegraciones reducen la actividad de un compuesto a la mitad de su valor original. No est afectada por la temperatura ni por las reacciones qumicas.
Ejemplo prctico: 1 vial de timidina tritiada que tenga una actividad especfica de 30 Ci/mmol y una concentracin de 1 mCi/ml, nos indica: el tomo radioactivo del compuesto es el tritio, sustituye el H unido al C6 en la molcula de timidina marcada. que el da de la fecha del vial, el nivel marcado de timidina era de 30 mCi/mmol es decir, 111 x 106 dps de timidina. que la concentracin de radioactividad de la solucin del vial es de 1 mCi/ml, es decir, 37 x 107 dps/ml de solucin (dps: desintegracin por segundo) La concentracin de la timidina es trminos de molaridad es: (1 mCi/ml) x (1000 ml/L) / 30.000 mCi/mmol= 0.33 mM. Si desea una actividad especfica ms baja agregar compuesto fro, carrier no marcado.
Cantidad de istopo a administrar

La actividad especfica del compuesto excesivamente alta porque puede hacer dao al tejido. Si es muy baja se deben alargar los tiempos de exposicin del tejido a la emulsin. A partir de timidina 1,9 Ci/mM de actividad especfica. La cantidad de istopo a administrar se puede calcular en base a dosis fisiolgicas, que estn estimadas segn el peso del animal. Se administra una dosis fisiolgica y el tejido se procesa normalmente, despus se mide cunta radioactividad se perdi durante dichos procedimientos y segn esto se calcula la cantidad de istopo que se debe administrar para obtener una radioactividad determinada. Tambin es posible calcular la cantidad basndose en la literatura: para los cortes de microscopa electrnica, la cantidad de istopos debe ser 20 veces mayores que para microscopa de luz, porque los cortes para MET tienen menos puntos emisores. MO_ 0,2 uCi/gm de peso del animal ME_ 2,5 uM/gm de peso del animal
DOSIS FISIOLGICA
La dosis de istopo administrado debe ser suficiente para producir: 10 a 30 granos/100u2 de tejido para MO 3 a 4 granos/110 u2 del tejido para ME sobre el background es importante conocer la vida media del radioistopo, porque puede decaer completamente mientras estamos haciendo el experimento. Nota: el tetracloruro urico se utiliza para intensificar la marcacin Se debe considerar la duracin de la vida media del istopo en trmino del tiempo de exposicin y de la fecha de compra hasta realizar el experimento. Se recomienda que el tiempo de exposicin no exceda 2 vidas medias del istopo, para tener una buena respuesta fotogrfica.
Radioisotopos emisores usados en autorradiografa Isotopo Tritio H Carbono 14C Azufre 15S Fsforo 32P Yodo 131I
3
E mx Mev Vida media 0.018 0.15 0.167 1.71 0.61 12.26 aos 5.760 aos 87.2 das 14.2 das 8 das
Quin los fabrica? Los reactores nucleares. Los compuestos marcados se hacen reemplazando un istopo especfico estable por un istopo radioactivo. Como los cortes son tan delgados, los focos de emisin son menores, por tanto la radioactividad debe ser por lo menos 20 veces mayor que para MO. En MET los cortes deben ser un poco ms gruesos (700-800 A) (color oro) para que exista mayor cantidad de focos. La emulsin tiene un espesor muy delgado y homogneo.
Fijacin para autorradiografa

No sirve glutaraldehdo ni tetrxido de osmio Lo que se utiliza es paraformaldehdo Se usa paraformaldehdo con una concentracin alta de aa no marcados, que compiten con aa libres
El glutaraldehdo no sirve porque deja aa libres que interfieren en la interpretacin de los resultados. Por eso se recomienda usar paraformaldehdo, aunque no conserva tan bien la morfologa, se le agrega aa sin marca, en una concentracin de hasta 100 veces, que compite en la unin de los aa libres. EMULSIONES Tambin se puede hacer autorradiografa con cortes semifinos en epn. Se prepara la emulsin y se sumerge el porta con el corte, dejndolo escurrir inclinado. Los cortes de MET deben ser ms gruesos (800 A) para trabajar con autorradiografa; la capa de emulsin debe ser una monocapa, para que el mtodo tenga mayor sensibilidad. Cortes gruesos = mayor n de granos = menos eficiencia (no se pueden contar los granos)
Emulsiones usadas en autoradiografa de alta resolucin

La emulsin empleada para autorradiografa es sensible a la luz y a los electrones emitidos por el foco radioactivo. La emulsin consiste de una matriz gelatinosa donde estn suspendido cristales de bromuro de plata con algunas imperfecciones como sulfuros de plata. Cuando la luz de los electrones impactan un grano de bromuro de plata ocurre una liberacin de electrones en el cristal. Estos electrones son atrapados por la impureza que es el sulfuro de plata. Esta carga negativa adicional del cristal de sulfuro de plata produce la llamada imagen latente que promueve la reduccin de plata a plata metlica durante el revelado de la emulsin. Todos los granos de bromuro de plata son potencialmente revelables, slo que la energa de activacin de la imagen latente es ms baja, de manera que necesita tiempos ms cortos de revelado Existe una relacin directamente proporcional entre el nmero de emisiones de radiacin ionizante y el nmero de granos de plata metlica. Esta proporcionalidad permite la cuantificacin. Las emulsiones empleadas en autorradiografa para MET se seleccionan de acuerdo a: - sensibilidad: promedio de grnulos revelados en relacin al nmero de electrones exitados provenientes del foco de emisin que impactan en un rea de la emulsin. - tamao del grano: a menor tamao, mayor resolucin. Ejemplo: Ilford L4 grano de 0.14 ; NTB2-Kodak grano de 0.27 . - densidad de grano por unidad de rea de la emulsin: a mayor tamao de grano, menor densidad. - background o velo: consiste en granos de plata revelados no impactados por la radiacin ionizante. Velo natural (dado por la emulsin), velo accidental y qumico. Todas las emulsiones lo tienen y hay que restarlo de la cuantificacin.
Caractersticas de una emulsin fotogrfica

Sensibilidad Grano exposicin del grano Velo o background
Tiempo de exposicin

Tiempo al cual debe exponerse una emulsin fotogrfica a la accin de las radiaciones ionizantes para obtener una marca autorradiogrfica significativa Se determina haciendo test de revelado a distintos intervalos de tiempo
Factores que influyen en el tiempo de exposicin:
Cantidad de istopos por unidad de rea de tejido: - cantidad de istopo administrado - actividad especfica del istopo. Vida media del istopo: no debe exceder 2 vidas medias, la respuesta fotogrfica disminuye notablemente. No se recomienda exponer ms all de dos veces porque ocurre la paradoja autorradiogrfica, desvanecimiento de la imagen del grano. El grano no se ve al tiro, tiene que madurar, por eso cada cierto tiempo hay que sacar una muestra para ver cmo est el grano (trabajar con muchos cortes). Si el tiempo es demasiado largo, toda la muestra se oscurece
Resolucin autorradiogrfica
Resolucin autorradiogrfica (segn Caro 1962) es la relacin entre la fuente radioactiva y el grano de plata. La relacin no es 1:1, sino que 1:2 1:3. Influye el grosor del corte, de la emulsin, la adherencia de la emulsin al corte, la energa de la radiacin ionizante, tipo de revelador, temperatura y tiempo de revelado, tambin la distribucin de los cristales de plata en la emulsin. Los istopos radioactivos incorporados en los tejidos emiten radiaciones en todas las direcciones.
La resolucin depende de los siguientes factores:

Distribucin geomtrica de los cristales de haluro de plata: Cuando los cristales estn compactados en una monocapa se favorece el atrapamiento de la radiacin ionizante. Grosor de la emulsin: si se tiene una bicapa de cristales de haluro de plata, la sensibilidad aumenta pero disminuye la resolucin. Grosor del corte: en cortes gruesos puede haber superposicin de focos emisores y reduccin de la resolucin. Tiempo y temperatura de revelado. Tipo de revelador empleado: revelador qumico: D-19, grano, tallarn revelador fisco: microdol-x (Kodak) grano en coma o punto Energa de la radiacin ionizante: si es alta, disminuye la resolucin. Adherencia de la emulsin al corte: ver teora de Caro.
Teoras acerca de la resolucin autorradiogrfica 1. Teora del crculo (Caro 1962): El 92 98% de los granos de plata revelados estn situados en un crculo de 2250A trazados alrededor de la fuente emisora de radiacin. A mayor distancia entre el foco emisor y la emulsin menor es la resolucin (el crculo crece). La emisin de dos fuentes cercanas puede superponer reas circulares y disminuir la resolucin. 2. Teora del cross seccin (Caro 1962): Si la fuente emisora est colocada a 500 A de la monocapa de cristales de 0,1 m de dimetro, slo los cristales atravesados en su dimetro total por la radiacin, proporcionarn una imagen autorradiogrfica efectiva. 3. Teora de Mosse: La relacin geomtrica entre la fuente emisora y el tamao del grano revelado es igual a la suma del dimetro de cristal de haluro de plata y la media del dimetro del grano revelado. Interpretacin de las autorradiografas: El mayor obstculo en la interpretacin de una autorradiografa radica en la determinacin precisa de la fuente emisora de radiacin. Las radiaciones a menudo siguen direcciones azarosas y pueden viajar alguna distancia antes de impactar un cristal. La teora del crculo en parte cubre las probabilidades de que el foco emisor se encuentra en un radio de 1.100 A. Daniela Araya Caldern
Criomtodos- Nancy Olea 70
CRIOMTODOS
Prof. Nancy Olea Mircoles 12 de Noviembre de 2003
Una caracterstica de estos mtodos, que los diferencia de otros mtodos utilizados
en microscopa electrnica, es que el agua de las muestras se conserva. Estos mtodos se pueden clasificar en: Criofijacin Criosustitucin Criodesecacin Criofractura Criograbado Criomicroscopa electrnica Crioultramicrotoma (no es realmente un mtodo) CRIOFIJACIN La criofijacin es un mtodo que puede servir como paso previo a la criofracturacriograbado y la obtencin de cortes con crioultramicrotoma y consiste en utilizar la congelacin como mtodo fsico para la preparacin de material biolgico para MET o MEB. Las ventajas de esto son las siguientes:

Estabiliza la muestra en su estado nativo, conservando su conformacin tridimensional. Evita el desplazamiento de la muestra y la liberacin o prdida de sustancias qumicas. Facilita la fractura (no se puede hacer en el material blando) Permite la combinacin de criofractura, con tcnicas inmunohistoqumica o histoqumica. La criosustitucin y la criodesecacin tambin se pueden combinar con estas tcnicas
Este mtodo se puede realizar a presin atmosfrica por inmersin o por impacto o a alta presin. Con estos mtodos se debe conseguir enfriar la muestra a alta velocidad para evitar la formacin de cristales de hielo que daan la estructura del tejido. La criofijacin a presin atmosfrica por inmersin se realiza sumergiendo el tejido en un crigeno, que puede ser un lquido-gas de helio, propano, etano o hidrocarburos halogenados como el fren (13 o 22). Esta tcnica se utiliza para elementos pequeos de hasta 10 m de espesor, como soluciones de espermatozoides u ovocitos.
En la criofijacin a presin atmosfrica por impacto el tejido se pone en una mquina que tiene un soporte para la muestra, sobre este soporte hay un resorte y alrededor de l un anillo de fierro que es atrado por un magneto ubicado bajo el soporte. La idea es que la muestra caiga rpidamente sobre un espejo metlico de cobre que est enfriado por helio lquido y as se congele. Esta tcnica se prefiere para tejidos de 20 a 30 m de espesor. La mquina para congelar por impacto fue originalmente diseada por Hoeser que estudiaba la liberacin de neurotransmisores (los mtodos tradicionales de fijacin eran muy lentos como para que l pudiese ver esto). La criofijacin a alta presin se hace en una mquina especial ms un crigeno y se utiliza para muestras de mayor espesor, ya que la alta presin facilita la fijacin (porque el proceso es ms rpido). Los crigenos funcionan a temperaturas muy bajas en un rango de 150 a 190 C y la velocidad de congelacin de la mayora de ellos es de 104 C/segundo (que es la velocidad ptima de congelacin de un tejido). En el caso de la criofijacin por inmersin se puede hacer una fijacin qumica suave (ej: glutaraldehido 0,1 0,2%) y despus se infiltra lentamente con un crioprotector hasta alcanzar una concentracin determinada (ej: glicerol 30% o sacarosa 2,3 M). Cuando la fijacin es por impacto no se usan los crioprotectores. Los agentes anticongelantes o crioprotectores se usan para impedir la formacin de cristales de hielo. Funcionan formando puentes de hidrgeno con el agua, de modo que disminuyen el grado de cristalizacin del agua y reducen el grado de nucleacin de los cristales de hielo, pero impiden un grabado profundo (deep-etching).
Los factores que influyen en la vitrificacin del material biolgico son: Presin hidrosttica (que facilita la penetracin del crigeno y el efecto del crioprotector) Velocidad de congelacin Concentracin del crioprotector Tamao del espcimen Temperatura del agente congelante (hay que mantenerlo en el rango del melting piont, lo que se logra con nitrgeno lquido)
El tamao de los cristales de agua que se forman no debe sobrepasar los 10 para que el tejido no se dae.
El agua es el componente mayoritario de todos los tejidos biolgicos. Puede estar como agua solvente que se congela fcilmente a 20 C, o como agua no solvente que forma complejos con protenas u otras macromolculas y se congela a 40 C o temperaturas menores. Hay 2 formas de congelacin del agua:

Por cristalizacin, que es un arreglo ordenado de las molculas Por vitrificacin, que es una supercongelacin y queda como un compuesto amorfo
La cristalizacin implica nucleacin de cristales y puede ser homognea cuando ocurre en un sistema puro, o heterognea cuando el sistema tiene agua, partculas, contaminantes, etc. Cuando un tejido se congela ocurre cristalizacin heterognea con formacin de cristales cbicos, hexagonales, esferulitas, etc (las distintas formas de cristales aparecen a medida que va bajando la temperatura). La vitrificacin ocurre a 170 C. Cuando la temperatura desciende a estos niveles igual se pasa por la formacin de cristales, por esto se usan crioprotectores que reducen el grado de cristalizacin y mantienen el estado vtreo del sistema. La clula reconoce a los cristales de hielo como soluto, entonces cuando estos se forman, la clula se contrae. Por lo tanto la velocidad de congelacin es muy importante para preservar la estructura de la muestra. El tamao de la muestra tambin es muy importante e influye en el resultado final. Cuando se congela por inmersin, el crigeno debe estar rodeado de un bao de nitrgeno lquido (para que se mantenga a baja temperatura). La congelacin no se hace directamente en nitrgeno lquido porque forma una especie de gas alrededor del tejido que no se congela.
CRIOFRACTURA En esta tcnica el tejido se congela (se puede usar un fijador suave y crioprotector) y luego se fractura. En general la lnea de fractura corre por la mitad de la bicapa en la membrana plasmtica, porque es una zona de uniones hidrofbicas dbiles. De este modo que quedan expuestas protenas perifricas y de transmembrana, que en general quedan en la cara protoplsmica (cara P) que es convexa y en la cara exoplsmica (cara E), que es cncava, quedan los espacios vacos. Esta tcnica ha contribuido a dilucidar muchas cosas que hoy se conocen como la asimetra de la membrana, la relacin de protenas y lpidos con carbohidratos y de protenas con elementos del citoesqueleto.
Esta tcnica sirve para el anlisis de la distribucin de partculas intramembrana y adems permite la marcacin con inmunogold y con citoqumica. Por ejemplo, se puede marcar el colesterol con un antibitico que se llama filipina y as se puede ver su distribucin y se puede contar porque hay una relacin estequiomtrica directa entre el colesterol y la filipina. Tambin se puede identificar receptores, hormonas, etc. Adems sirve para el estudio de uniones intercelulares como las tight junction o las gap junction y tambin para hacer estudios de capping (la endocitosis ocurre por formacin de vesculas cubiertas con clatrina o por capping mediado por receptores de membrana y elementos del citoesqueleto) Otra utilidad son los estudios de cuantificacin de canales de agua, sodio, potasio y calcio (porque se pueden visualizar). Resumiendo, el valor de la tcnica de criofractura es:

Contribucin al estudio de membrana plasmtica, nuclear y de los organismos Estudio de especializaciones de membrana, poros nucleares y uniones celulares Estudios de la organizacin de las protenas de membrana en dominios que tienen diversas funciones Estudios de endocitosis, liberacin de neurotransmisores y distribucin de receptores de membrana Esta tcnica combinada con inmunohistoqumica ha permitido el anlisis de la distribucin de antgenos de superficie, citoqumica de enzimas, citoqumica de lectinas.
CRIOGRABADO Despus de la tcnica de criofractura uno produce una rplica de platino y carbn, que refleja la estructura de la muestra y se mira al microscopio electrnico de transmisin. Para hacer las rplicas hay que:
Fijar suavemente el tejido en glutaraldehido por corto tiempo (si el tiempo se pasa, la lnea de fractura salta entre una capa y otra porque se forman demasiadas uniones) Luego el tejido se infiltra con glicerol 20 o 30% y se monta sobre una especie de sombreo de oro Despus se criofija por inmersin rpida en fren u otro crigeno enfriado en nitrgeno lquido (155 C)
Luego el sombreo se pone en un recipiente con nitrgeno lquido (196 C) Despus se transfiere a una cmara pre-enfriada (150 C), hacerlo rpidamente porque se pasa por el aire a temperatura ambiente Se hace alto vaco en la cmara 10-7 Torr La fractura se hace con una navaja. Primero se elimina el hielo que hay y luego se da un solo golpe para fracturar la muestra Luego se sube la temperatura a 100 C para producir el grabado o etching Luego se sombrea platino en ngulo de 45 y carbn en ngulo de 90 o 45 (dependiendo de si se quieren observar sombras o no) Despus se lleva la cmara a temperatura ambiente La muestra se pone en cido sulfrico o cloro para digerir la materia orgnica (algunos usan enzimas). Despus se lava Finalmente se recoge la rplica con una grilla y se observa al MET
Al calentar a 100 C se expone parte de la estructura de la clula como caras de las membranas y elementos del citoesqueleto, porque se evapora el lquido (sublimacin). El grado de informacin que se obtiene con la profundidad de los detalles depende de la temperatura y del tiempo que dure el etching (2 minutos es lo usual, pero puede ser de 10 minutos = deep etching). Hay que tener cuidado en la interpretacin de estas imgenes, diferenciando la estructura de los artefactos. Se pueden hacer rplicas complementarias El crioprotector inhibe el grabado profundo (deep etching), as que no se debe usar cuando se quiere aplicar este mtodo. Hay que criofijar por impacto, luego fracturar y hacer el grabado de 10 minutos. Despus se pone el platino y el carbn sobre la muestra en rotacin y finalmente se mira el negativo de la foto. En 1995 Fujimoto dise un mtodo en que el tejido fracturado era tratado con SDS, de modo que se eliminaba todas las partes en que la membrana estaba completa y slo quedaba la membrana fracturada (separada). Con esto l pudo marcar con anticuerpos y tener una localizacin muy precisa del antgeno que buscaba. Criterios para calificar una buena rplica:
Buen contraste
Granulacin fina reas extensas de membrana (aqu influye la fijacin y el uso de criopreservantes) El hielo se debe ver uniforme y debe ser fcilmente distinguible
Artefactos en las rplicas:

Cristales de hielo Mellas de la navaja Zonas muy densas (presencia de material orgnico por falta de limpieza) Granulaciones gruesas (cuando no se respeta la distancia mnima a la que debe evaporarse el platino y el carbono) Contaminacin con el aceite de las bombas Varios pasos de planos de membrana (cuando se fija por tiempos largos)
Para mirar una foto de rplicas, siempre se debe mirar con el punto negro hacia abajo (por el punto de bombardeo del platino). Esto es una convencin y si no se hace as, puede haber confusiones al definir las caras P y E. El freeze-etching ocurre cada vez que uno calienta la superficie fracturada de 2 a 3 nm/seg. Con esto se permite la remocin del hielo, exponiendo la verdadera superficie de la membrana y se pueden diferenciar las caras P y E. Deep-etching sirve para mirar el citoesqueleto con visin tridimensional de las estructuras. CRIODESECACIN En esta tcnica el tejido es congelado en forma rpida, se pone en el equipo al vaco, se fractura y luego se sublima el hielo lentamente hasta que el tejido se seca. Despus de esto, la muestra puede ser embebida en resinas acrlicas o epxicas, se corta y se mira al microscopio. Da una visin diferente porque se omite la fijacin.
CRIOSUSTITUCIN Es un mtodo de deshidratacin de un material congelado (puede estar fijado) y se hace en una mquina especial que trabaja a 150 C.
Consiste en reemplazar gradualmente el agua por fijadores como una mezcla de glutaraldehido con tetrxido de osmio (esto es posible por la baja temperatura). Esta fijacin gradual es menos agresiva y los procesos de oxidacin y reduccin se minimizan. Tambin se puede usar formaldehdo y acetato de uranilo o mezclas de cualquiera de ellos. Luego el fijador se sustituye por etanol o acetona para deshidratarlo. Cuando el tejido ya se ha sustituido, se puede subir la temperatura y se incluye en resinas acrlicas para inmunolocalizacin o en resinas epxicas. Con esto se obtiene una visin distinta de las clulas, por ejemplo las mitocondrias se ven redondas.
CRIOMICROSCOPA ELECTRNICA Es una tcnica nueva en que se observa material hidratado y congelado rpidamente (no se tie). El valor de esta tcnica es permitir observar la conformacin nativa en su tampn natural.
Sirve para mirar material particulado altamente purificado, como ribosomas o virus. Este material se pone en grillas cubiertas y sombreadas con carbn, luego se congela y se mira al criomicroscopio (el brazo de este microscopio es congelado y se mantiene a baja temperatura con nitrgeno lquido). El contraste en este caso proviene de las diferencias del contraste de fase entre el elemento y la solucin en que est. Previamente se puede hacer una tincin negativa para verificar el estado de la muestra. Algunas veces se puede tirar un chorro de vapores de acetona para disolver la membrana de colodin y dejar slo el carbn, para mejorar la resolucin (6-8 o menos). Con este mtodo se obtienen imgenes que son captadas digitalmente y con un programa computacional se van armando distintas visiones del elemento que se observ (ej: un ribosoma) y luego se trabaja con un modelo de la forma del ribosoma.
CRIOULTRAMICROTOMA No es un mtodo de estudio en s mismo, pero proporciona cortes de material que no ha sido fijado y que puede estar crioprotegido (por ejemplo con sacarosa). Para esto se usa un ultramicrtomo con cmara fra y los cortes se recogen en sacarosa (no en agua). Para evitar que el corte se destruya se usa metilcelulosa, porque evita la desecacin. Los criocortes sirven para hacer tcnicas inmunocitoqumicas.
Carla Escobar.
MEB Juan Carlos Olavarra 78
Microscopio Electrnico de Barrido (MEB)

Prof. Juan Carlos Olavarra IDIEM Mircoles 12 de Noviembre de 2003
hemos visto, proporciona imgenes carentes de color. En el caso de imgenes coloreadas, el color nos proporciona informacin de la composicin de los materiales, y facilita el reconocimiento de estructuras. Nuestro conocido microscopio ptico tiene como ventaja fundamental la utilizacin del color para destacar detalles citohistolgicos o de estructuras inanimadas. Por su parte, el microscopio electrnico de transmisin aporta resolucin mxima para distinguir el mximo de detalles de estructuras cuyas dimensiones son del orden de algunos . En ambos tipos de microscopio la observacin se hace en cortes; cuando se observa el plano de imagen, y realizando la visualizacin de mltiples cortes, puede conformarse la reconstitucin del volumen de estas estructuras. En el caso del microscopio electrnico de barrido (SEM o MEB), que analizaremos en detalle a lo largo de esta clase, su principal cualidad es la observacin de estructuras tridimensionales (volmenes); este microscopio proporciona una resolucin mxima de 30 a 35 . El MET puede formar 2 tipos de imgenes: imgenes por transmisin de electrones, e imgenes por difraccin de electrones. Por su parte, el MEB puede (en teora) formar imgenes en base a:

El microscopio electrnico de transmisin, como
Electrones secundarios Electrones retrodifundidos Electrones de conduccin Electrones de transmisin?? Fotones *: catodoluminiscencia, Rayos X
Para que los electrones sean transmitidos se necesita un mnimo de 100 kV de tensin. El MEB trabaja con un mximo de 40 kV de tensin, con una menor energa de electrn y por ende, menor poder de penetracin. La informacin de cada tipo de partcula aporta elementos distintos a los que el MET proporciona. Debemos recordar que las longitudes de onda del espectro visible ocupan un pequeo rango dentro del espectro total de longitudes de onda. Fuera del rango del espectro visible, hacia cada extremo de longitudes de onda (mayores y menores) existen cambios sustanciales; sin embargo es posible modificar estas longitudes de onda de tal forma que se hacen visibles y forman imgenes, que posteriormente deben ser interpretadas. Podemos deducir entonces que el
cambio de longitudes de onda , sea por aumento o disminucin de la frecuencia, nos proporcionarn informacin distinta.
Como se mencion previamente, los fotones pueden aportar informacin mediante la catodoluminiscencia, en que fotones dentro del espectro visible pueden ser observados bajo lupa, o bien en la pantalla del MET. Esto ltimo se debe a la estimulacin de material liviano (P, C, Cd) con electrones de cierta energa, lo que produce la estimulacin de los electrones del ltimo orbital de estos elementos qumicos, los que ingresan a orbitales ms internos liberando fotones que oscilan con frecuencias que caen dentro del espectro visible. Otra posibilidad es la emisin de Rayos X, que proporcionan informacin sobre la composicin del material analizado. Cuando se aaden a un equipo de microscopa distintos sensores, pueden verse imgenes distintas formadas por los diferentes tipos de radiacin incidente sobre un material determinado, las que son el reflejo de la forma y constitucin de stas y de la informacin obtenida con estas diversas formas de radiacin con que se estimul el material. La radiacin X nos informa sobre el conteo de existencia de elementos, anlisis cualitativo y cuantitativo y mapeo de materiales. Este tipo de anlisis es posible realizarlos tanto en MEB como en MET. Estas radiaciones tienen baja resolucin, al punto que con lupa puede verse el sector iluminado en la muestra. En el caso de los electrones retrodifundidos, stos proporcionan informacin de topografa y contraste de fases de un material. El MEB no solamente es empleado para observar imgenes tridimensionales o analizar el contraste de fases de material formado por mezclas de compuestos, sino tambin es la base para la construccin de otros instrumentos, como la microsonda, que tiene como principal ventaja trabajar con rayos X para realizar anlisis.
En el caso de las imgenes de contraste de fases, se sustituye la falta de color de la imagen con distintos tonos de grises para sustancias parecidas. Se ven diferentes elementos presentes entre ellos basndose en diferencias de tonalidad. Una aplicacin de reciente aparicin es el microscopio de efecto tnel, que permite ver los radios de los tomos (tienen una mayor capacidad).
Componentes y Funcionamiento del Microscopio Electrnico de Barrido (MEB): El MEB se compone de un can de electrones, un sistema de lentes condesadores y un sistema de lentes adicionales, y al final de este sistema se encuentra el portamuestras; es decir, el haz de electrones no atraviesa la muestra.
Recordemos que en el MET, la iluminacin es homognea para toda la muestra, en tanto que en el MEB un haz fino (delgado) incide puntualmente en la muestra; cuando este haz excita la muestra, genera 2 espectros: 1 de electrones y otro de fotones.
Los electrones generan un espectro amplio, continuo de energa que va desde 0 hasta el ngulo superior izquierdo del haz primario, en tanto los fotones emiten radiacin X continua, con peaks de energa correspondientes a las caractersticas del material; cambios en estos parmetros permiten determinar la composicin del material. El espectro continuo de electrones corresponde a electrones liberados que aparecen sobre la superficie.
Los electrones () tienen una gradiente de penetracin al material (grado de excitacin ntima). Algunos electrones provienen del interior de la materia; cada banda del espectro tiene informacin especfica respecto del tipo de electrones o radiacin caractersticos. As es que la banda de 0 a 50 V corresponde a los electrones secundarios, los que nos proporcionan informacin de pseudotridimensionalidad o volumen, de manera similar a como lo hace la visin.
Ahora bien, cmo capturar los electrones que aportan informacin? Mediante el uso de un detector que capture electrones de baja energa, y que corresponden a seales con deficiencia de amplificacin. Muchas veces son corrientes de nA despreciables, con pocos electrones fluyendo. La corriente del haz primario es habitualmente de 100 pA o nA. La corriente que sale es menor (aproximadamente 2 a 3% del total).
Los electrones secundarios corresponden a partes por milln (ppm) de esa corriente, por lo que es difcil trabajar con la seal. Este hecho es la razn de que se requiera un sensor que pueda captar y amplificar esta seal, el que se ubica en una posicin que impide la llegada de electrones de alta energa. Es un electrodo que atrae electrones de baja energa, los que estimulan a un sistema fotomultiplicador, generando un potencial elctrico perceptible que viaja hacia un tubo de rayos catdicos donde se formar una imagen. Este sistema se comporta del mismo modo que el tubo de rayos catdicos (trc) del televisor.
Cuando hay 0 Volt en el sistema, pasan todos los electrones, en tanto que al haber -17 Volt se corta el paso de electrones. Existe atenuacin en el paso de los electrones, que vara entre los valores extremos sealados. En el TRC existe una rejilla de control que modula el haz de electrones del can que regula el paso de electrones entre 0 y el mximo. Por fuera del TRC hay una bobina o yugo que modula mediante un campo magntico el haz de electrones regulado de forma tal que no sufra distorsiones mayores. En todo el interior del tubo hay vaco para permitir a los electrones desplazarse por l hasta incidir en una pelcula de fsforo a la que excitan que se encuentra en la pantalla, causando en sta todo el fenmeno de fotoluminiscencia que se manifestar como la formacin de la imagen. Cuando llegan muchos electrones al sensor, el voltaje es igual a 0; si existen valores intermedios, vara el voltaje manifestndose en diferencias del grado de brillantez. A mayor brillo mayor cantidad de electrones secundarios esto significa que al haber un voltaje igual a 0 se manifiesta como un punto muy brillante. En caso de no haber electrones secundarios, no hay brillo. El punto formado en la pantalla puede ser desplazado con un magneto o imn. El haz con que se barre la muestra est sincronizado con el haz de electrones que barre la pantalla, por lo que el haz de electrones hace el punteo de 1 lnea con la muestra simultneamente con un punto incidente en la pantalla. Existe coincidencia total entre el rea de la pantalla y el rea de barrido en la muestra. Al generarse emisiones punto a punto de electrones secundarios que son captados por el sensor, existe modulacin del haz del can. Esta emisin punto a punto
da un valor de brillo segn la cantidad de electrones detectados (a mayor cantidad de electrones ms brillo y v/va). Se obtiene una imagen de volumen que funciona con 2 tipos de contrastes; los contrastes ms importantes generado son de imgenes de tipo topogrfico y de contraste de fase. El contraste depende de la cantidad de luz que incide en el objeto o cantidad de electrones generados sobre una muestra. En primer lugar depende de la cantidad de luz y luego del material observado. La imagen de barrido es superficial, lo que hace necesario proteger la superficie del material a observar para que el haz de electrones no lo queme y altere su conformacin. Se ilumina con este haz de electrones la muestra en forma selectiva para atacar ciertos sectores. Hay que recordar que al extraer el agua de material biolgico, ste se hace frgil a la manipulacin por lo que debe ser tratado con suma precaucin. Cuando se hace el secado de un objeto como una hoja, sta se contrae produciendo distorsin de su forma, por lo que este procedimiento debe realizarse de acuerdo con ciertas pautas mediante un sistema de secado por punto crtico, del que se hablar en otra clase. Como recordaremos, el agua es un contaminante en microscopa electrnica, que no es extrable por la bomba de vaco; lo mismo ocurre con material magntico o radiactivo, que pueden alterar el funcionamiento adecuado del microscopio, muchas veces no pueden ser puestos dentro de la columna. Respecto del material magntico, ste magnetiza el equipo con lo que disminuye la calidad de observacin. Amplificacin del equipo: A diferencia del MET, el MEB no tiene lentes de amplificacin, solamente una lente condensadora objetiva, que remodela el haz al punto de hacer que llegue muy fino a la muestra. El tubo de rayos catdicos presenta una bobina deflectora o yugo que mueve el haz de electrones sobre la muestra. El movimiento del haz incidente sobre la muestra, causado por el yugo, es el mismo movimiento que tiene el haz incidente en la pantalla, puesto que estn sincronizados. Para determinar la magnificacin del equipo, se establece una relacin entre el rea de barrido y la pantalla, dada por la frmula: Magnificacin: lado de la pantalla (cte.) = K lado de rea de barrido l sobre la muestra
Veamos con 2 ejemplos cmo se obtiene la amplificacin: si la pantalla mide 20 cm y la muestra 1 cm, la magnificacin es de 20x, en tanto si la muestra mide 0.5 cm, el aumento es de 40x. Al disminuir por ende el rea de barrido, aumenta la magnificacin. Con poco aumento se ve un rea grande, pero al aumentar la magnificacin disminuye el rea observada. La imagen formada, en cualquier caso, va a depender del sistema detector.
Aumento, resolucin y profundidad de campo: El MEB permite visualizar distintos planos (profundidad de campo aumentada). Si un haz de electrones fuese lineal y se deflectara al iluminar cada punto tendra la misma rea de iluminacin, similarmente a lo que ocurre con una linterna.
Sin embargo, el haz de electrones es cnico, por lo que al reflectar (movimiento), el ngulo del punto focaliza un rea de iluminacin dentro del punto, cuyo grosor vara conforme al sitio de proyeccin del haz.
Efecto del grosor del haz: Cuando el haz tiene forma de cono o cilindro (y por ende, rea), presenta los siguientes puntos iluminados tericos:
El rea oscura no emite electrones secundarios, lo que en pantalla se representa de forma similar, se captura el promedio de electrones capturados. En caso alguno la resolucin va a ser mejor que el dimetro del haz, lo que no permite identificar elementos dentro del rea. La nica forma de identificarlos es cuando el rea de observacin es 10 veces mayor que el rea iluminada.
El haz, por lo tanto, debe ser afinado, y esto se hace con el ltimo lente:
En el ngulo de focalizacin no se puede provocar defleccin del haz de electrones.
Debemos tener presente que en el TRC existe una defleccin nica, que adopta esta forma:
Cuando se produce doble defleccin se modifica, como es esperable, el dimetro del haz; as por ejemplo un haz de 20 m puede aumentar a 150 m. Cmo podemos entonces disminuir el ngulo de defleccin? Puede hacerse disminuyendo la apertura, o tambin aumentando la distancia de foco, lo que permite hacer que el haz se comporte prcticamente como si fuese una lnea.
Segn el rea de barrido d, con el lado de pantalla K constante, la frmula proporcionada para la Magnificacin= K/l, si aumenta l disminuye la magnificacin; en la medida que el haz se acerca a 0, la magnificacin tiende a disminuir. Por otra parte, si aumenta el rea disminuye el contraste, y en caso de aumentar el contraste tendremos una disminucin de la magnificacin. A menor dimetro del ngulo, todos los planos tendrn la misma resolucin y se vern focalizados. Debe considerarse siempre que la profundidad de campo aumenta con un incremento de la distancia de trabajo y la disminucin del dimetro de apertura, aunque con prdida de magnificacin (existe un compromiso de la amplificacin y la profundidad de campo, que podemos variar segn nuestras necesidades y el propsito de la observacin). Un ejemplo de esto es la observacin de una hormiga, que requiere una gran distancia de trabajo (7 a 20 mm) en forma normal. En la medida que la topografa de un objeto es ms abrupta cambia el punto de focalizacin. Tngase presente que al disminuir la apertura, disminuye la cantidad de luz y por ende la calidad de la resolucin es menor. En lo relativo a la iluminacin puntual, el sensor recibe un promedio de puntos iluminados, lo que se traduce a la pantalla en sectores claros y oscuros. Contraste: Existen 2 tipos de contraste: topogrfico y contraste de fase. Ejemplifiquemos en la siguiente figura el contraste topogrfico.
El grfico de emisin de electrones representa un material homogneo aunque con cambios en su forma. En las zonas donde hay pendientes, mientras ms inclinadas sean aumenta la cantidad de electrones secundarios detectables.
Cuando se obtienes estas grficas, hay que determinar si se trata de perforaciones o protuberancias, pues podra tratarse de perforaciones que tengan iluminacin de borde (como un cambio de material).
Otra posibilidad es que la muestra sea iluminada lateralmente, por ejemplo un conjunto de bolas dispuestas en forma de roseta, cuando se hace incidir luz desde ambas superficies, aun cuando cada una tiene una fuente luminosa aparece una iluminacin preferencial.
Cuando se observa la presencia de iluminacin preferencial en la imagen generalmente corresponde a la presencia en ese lugar del detector. La iluminacin del objeto puede ser intrnseca al elemento de imagen, o bien preferencial, dependiendo en este caso de la posicin de la muestra respecto del deflector. El segundo tipo de contraste, o contraste de fase, se relaciona con el peso atmico Z de los materiales. En dos materiales con la misma topografa puede demostrarse la composicin atmica diferencial en base a la emisin de electrones secundarios, tal como lo demuestra la figura.
En los materiales de peso atmico (PA) bajo el volumen de excitacin es pequeo; el rea que se bombardea es excitada y genera electrones secundarios de todo tipo. En Z1, el haz es grueso, en tanto en Z2, donde el volumen excitatorio es grande y la densidad de electrones es pequea, el haz es un punto. Sin embargo, el pequeo volumen excitatorio de Z1 tiene una gran densidad de electrones generados. La resolucin obtenible depende del dimetro del haz y de la muestra. Una muestra pequea tiene una buena emisin de electrones secundarios y una alta resolucin. La resolucin
depende en parte del equipo y de los pesos atmicos del material observado. El material biolgico, por ejemplo, tiene bajo PA y resolucin pobre, por lo que deben depositarse metales pesados para su observacin. Existen condiciones para la observacin de las muestras:

La muestra debe ser totalmente conductora. Debe tener peso atmico alto (Pt, Ag, Au, Pb). Gran conductividad trmica y electrnica. El grano de depsito de metal debe quedar fuera del rango de resolucin del microscopio (debe ser menor que sta). Se suelen usar materiales nobles, no alterados qumicamente por el ambiente; cuando se usan sales u xidos, el depsito y la composicin varan. Ejemplo de ello es el xido de aluminio: el aluminio forma granos muy gruesos, y el xido de aluminio acta como aislante. Hay que proteger la muestra del aire. Debe tenerse un contenedor con techo pequeo (a poca distancia de la muestra).
La muestra puede moverse cambiando la distancia de trabajo o la superficie a observar, lo que cambia de paso la profundidad de campo y la resolucin. La pantalla del MEB forma 35 cuadros por segundo cuando se observa una panormica de la muestra; cuando se desea tener una alta resolucin, se trabaja a 1 cuadro por segundo. Se recomienda preferentemente mover el haz de electrones utilizando el sistema de defleccin para observar la muestra y mejorar la resolucin. La pantalla de observacin tiene una resolucin escasa cuando se trabaja con alta remanencia; al disminuir o eliminar esta remanencia, se obtienen imgenes de resolucin elevada, lo que permite asociar o integrar entonces el MEB con un sistema fotogrfico o de captura digital de imgenes. En modelos nuevos de MEB, las imgenes pueden ser procesadas integrando los grises presentes para asignar color a las distintas componentes del material observado. El MEB permite adems manipular los datos agregando una barra de medicin y facilitando la opcin de agregar nombres o hacer evaluacin morfomtrica. La resolucin de la imagen est en relacin con los puntos de lneas y las lneas de cuadro que componen la pantalla. As por ejemplo una pantalla de 2000x 2000 tiene 2000 lneas, cada una compuesta por 2000 puntos. La resolucin de estas imgenes, al ser digitalizadas, es transformada a elementos de imagen o pxeles, con lo que se pierde parte de la informacin en la medida que el nmero de pxeles es menor. Idealmente, debe elegirse al momento de digitalizar la imagen la resolucin mayor para perder la menor cantidad de detalles posible.
ADOLFO ROS-ALCORTA
Requisitos MEB- Nancy Olea 113
Microscopa Electrnica de Barrido (MEB)

TM Nancy Olea Martes 25 de Noviembre de 2003
Al incidir el haz de electrones sobre la muestra se produce una gran cantidad de

tipos de energas: electrones transmitidos (MET), electrones retrodifundidos, electrones secundarios (MES), rayos X, etc., y dependiendo de la seal y del detector es la informacin que vamos a tener. En el caso de los electrones secundarios tenemos un detector de electrones secundarios que nos va a dar una imagen de superficie, topografa.
Cuando el haz incide sobre la muestra va a formar una gota de informacin, y de esta gota, solamente los electrones que estn en la parte ms superficial (secundarios), los que utilizaremos. Si el plano con que inciden est inclinado, obviamente la informacin ser mayor, y cuanto ms inclinado est el plano, la informacin ser mayor. La informacin que dan los electrones retrodifundidos se refiere a los pesos atmicos, ya que estos electrones salen de niveles ms profundos de la muestra. Los rayos X son ms profundos an. En cuanto al destino que pueden tener las distintas muestras biolgicas para SEM puede ser distinto. En el caso de plantas o animales se puede extraer un trozo de tejido, si se lleva a rayos X simplemente se toma un trozo al aire y simplemente lo monta y lo mira. Tambin se puede fijar, deshidratar, secar por punto crtico, metalizar y mirarlo.
Puede hacerse tambin una congelacin rpida y luego llevarlo a una mquina para hacer desecacin. En especmenes no biolgicos es mucho ms simple, se limpian, se pulen, se fracturan y pueden ser mirados al microscopio.
Requisitos bsicos de una muestra observada al microscopio electrnico de barrido

Tener dimensiones compatibles con la cmara (hasta 1cm de altura en el DSM 940; en otros equipos la altura puede ser mayor) Estar seca (completamente deshidratada y no contener material voltil) La superficie de observacin debe estar limpia (libre de partculas contaminantes del vaco) La superficie de observacin debe estar cubierta con una capa metlica de 200 nm app., para: proteger la muestra del calor del haz y mejorar la electroconductividad Estar bien preservada en sus tres dimensiones Ser resistente al vaco Estar perfectamente fijada al soporte por medio de un adhesivo conductor. En el caso del Stic Fix va a ir bajo el metalizado.
Etapas

Seleccin y limpieza Fijacin en aldehdos Fijacin en tetrxido de osmio Impregnacin metlica (opcional) Fractura (opcional) Deshidratacin (generalmente acetona) Lquido de trnsito (CO2 o fren) Montaje sobre soporte Metalizado
Seleccin y limpieza
Muestras duras: semillas, maderas, etc. se utiliza aire comprimido o soluciones fisiolgicas. En el caso de insectos es posible que se necesite pasarlos por alcoholes para que se relaje la musculatura. Muestras blandas: se utiliza soluciones fisiolgicas
Fijacin o estabilizacin de la forma

Se recomienda alargar tiempo de fijacin Se recomienda usar postfijadores que contengan metales pesados. Hay mezclas que se recomiendan que poseen glutaraldehdo, tetrxido de osmio, bicloruro de mercurio, cido tnico, acetato de uranilo, etc.
Manejo de clulas individuales o macromolculas

Tamao menor a 0.2 a 2m, se usa un filtro donde quedan pegadas las clulas, debe resistir acetona. Tamao 2 200m (ej. espermatozoides), se pasan sobre un portaobjetos polilisinado o silanizado. Tamao 300 0.5cm3, se procesan en botellitas o frasquitos.
Secado por punto crtico Es la mejor tcnica de secado. Anderson diseo la mquina para secado por punto crtico, y adems hizo algunos clculos de cunto deformaba la tensin superficial cuando se sobrepasa la fase lquido-aire. Entonces descubri que un microtbulo de la membrana cuando se seca al aire sufre una presin de 1.4 toneladas por cm2, entonces la deformacin es enorme. Este procedimiento obvia esta deformacin. Pasos: Deshidratar en lquidos intermediarios (etanol, acetona o acetato de amilo) Se coloca en aparato SPC inmersa en medio lquido Sustituir lquido intermediario por lquido de transicin (CO2, freon, 13, NO2) por tres a cinco veces Alcanzar temperatura y presin crtica Se ventila la cmara lentamente hasta la presin atmosfrica manteniendo la temperatura Montaje de las muestras Se hace con cinta adhesiva (Scotch) doble faz o con pegamento Metalizado Se realiza en un equipo especial el cual opera con una bomba rotatoria. El equipo posee un ctodo, un nodo y una pastilla de metal que es golpeada por argn producindose la vaporizacin del metal. A veces el metalizado con una mezcla de metales es mejor que un metal solo (ej. Oropaladio) Alternativas para secado por punto crtico

Hexametil-dizilasane (HMDS), conserva bastante bien las muestras Liofilizacin, requiere un equipo bastante caro
Cuando un material no est bien metalizado se ve un efecto de punta?, se ve como reventada, aparecen rayas.
En el caso de especmenes vitelados cuesta mucho fijar, hay que dar tiempos muy largos de fijacin y pueden despus tender a craquearse. Una manera de trabajar con estos materiales es dar una fijacin ms o menos larga y despus cortarlos sin daar la parte que se desea observar. En el microscopio de barrido tambin se puede observar cortes de tejido, trozos de tejido. Especmenes ms grandes pueden ser tratados con congelacin en vez de secado por punto crtico. Tambin se puede hacer estudios sobre rplicas. Sofa Seplveda Contreras.
Microanlisis- Ernesto Crocquevielle 117
MICROANLISIS ELECTRNICO
Prof. Ernesto Croquevielle Laboratorio de Materiales. IDIEM Mircoles 26 de Noviembre de 2003
La primera microsonda electrnica consta bsicamente de un emisor de electrones, no tiene

detector de electrones secundarios, tiene slo ptico. Se obtiene una imagen ptica de microscopio tradicional y una imagen de rayos X, desde el punto de vista de electrones. Una microsonda ms moderna consta de una cmara porta muestra, salida final del haz de electrones, ventanas donde se puede colocar diversos detectores y una salida de evacuacin de gases. Hay que poner nfasis en el porta muestra, que es una mesa ergonomtrica que se puede desplazar en distintas direcciones de manera mecnica, en forma discreta y permite volver al mismo punto de donde se parti observando e incluso medir distancias entre dos puntos. Respecto a los movimientos que permite realizar el porta muestra, estos son: rotar en torno al eje de la muestra mover en el eje x, y subir o bajar Se pueden realizar prcticamente todos los movimientos que se desee, lo que es muy importante desde el punto de vista regulacin de la distancia de la muestra a la fuente emisora de electrones y tambin de la distancia a los detectores. En cuanto al metalizado, hay que tener claro que existen dos formas de metalizado. Una es la forma clsica, que consiste en un sistema combinado con alto vaco (10-5-10-6 mm de Hg), donde en un elemento de sujecin se coloca una barra de grafito y al otro lado hay otra barra de grafito. Se aplica corriente elctrica entre las dos barras para generar un arco elctrico, que produce la volatilizacin del C, que cae por gravedad sobre la muestra. Evidentemente los tiempos para lograr el metalizado por gravedad deben ser estandarizados para cada muestra, porque el C comienza a caer en la zona central de la muestra, donde la capa queda ms concentrada y se va disipando a medida que se aleja del centro. Esto mismo se puede aplicar si en vez de un electrodo de grafito se tiene un canastillo de material precioso (el material precioso, en realidad no lo es, se trata de tungsteno) y en el se coloca una pepita de oro. Se aplica el mismo vaco, la misma corriente y se logra la volatilizacin del oro que cae por gravedad sobre la muestra. El oro se puede cambiar por otros metales como platino, plata, etc. Este mtodo es lento, pero no por eso menos eficiente. El sistema actual, que es ampliamente utilizado, consiste en el depsito de oro con un sistema en el cual se hace bajo vaco y se tienen placas de oro, platino, oro-paladio, etc y lo que se hace es contaminar la cmara completa con un gas noble, como argn, de forma tal que se establece una diferencia de potencial importante entre la placa y la base, que es donde est la muestra. Los tomos de argn chocan contra la superficie de oro produciendo la extraccin de tomos que van a ser atrados por la diferencia de potencial hacia la muestra y su entorno. Este mismo dispositivo se puede modificar y poner un cordn de grafito. Al utilizar la microsonda electrnica, en lugar de trabajar con electrones secundarios, es preferible hacerlo con electrones retrodifundidos (provienen de mayor profundidad y permiten hacer contraste de fase), que tambin dan una imagen tridimensional muy buena y se obtiene adems como accesorio, contraste de fase, que da informacin de diferencia de concentraciones de un elemento a simple vista. Si
es ms oscuro es que se trata de un elemento ms liviano y viceversa. Esto permite ver mayor contraste en la muestra por la diferencia de estado de los elementos, as como distinguir entre componentes distintos. Si se trabaja con un material cristalino, se est trabajando con un material que est formado por una red ordenada, donde se distribuyen los elementos uno a uno. Si se bombardea esa red con electrones o con rayos X, los tomos de la red van a ser incididos por electrones, produciendo que los electrones del tomo se liberen y dejen un espacio, produciendo una inestabilidad del sistema. Para suplir este desequilibrio, probablemente un electrn de otra orbita, de otro nivel energtico, va a cubrir el espacio vaco y as sucesivamente, producindose una migracin interna de electrones. Finalmente, el tomo del que sali el electrn va a recibir un electrn de otro tomo. Lo fundamental es que cada salto de un electrn que cubre el espacio dejado, emite cierta radiacin que en definitiva son rayos X caractersticos, incluso es ms, segn del nivel energtico (orbitales) del que provenga el electrn, sus rayos X caractersticos van a tener una energa distinta, que permiten identificar los elementos presentes en la muestra. Existen fundamentalmente dos sistemas para hacer anlisis: - espectrmetro de energa dispersiva (EDS o EDX) - espectrmetro de longitud de onda dispersiva (WDX) Espectrmetro de energa dispersiva (EDS o EDX) Consiste en un cristal de silicio que ha sido dotado con una capa de litio para que quede contaminado discretamente con litio. Se denomina silicio (litio) o puede ser tambin germanio (litio). Este cristal (de 1 mm) se metaliza superficialmente con oro para poder establecer contacto y se instala en un sistema refrigerado con nitrgeno lquido (-180C) porque al aplicarle voltaje (0.5 KV), si no estuviera refrigerado, actuara como una resistencia y el silicio-litio se evaporara. Entonces, la microsonda tiene una fuente y un haz de electrones, un porta muestra y un detector. Este ltimo est formado por un cristal, un sistema de refrigeracin con nitrgeno lquido y esto tiene que estar con alto vaco. Para llevar la radiacin dentro del sistema que est al vaco hay una ventana de berilio, que es un elemento muy liviano que no acta como pantalla, sino que permite el paso casi total de la radiacin. Cada rayo X caracterstico que golpee sobre la superficie de este aparato, va a generar un desequilibrio a nivel electrnico en este semi conductor. Este desequilibrio va a ser llevado a un pre amplificador que acumula la seal y la enva a un amplificador, a una tarjeta conversora anlogo- digital (MCA) y a un computador.
El desarrollo de estos detectores se llevo a cabo en una universidad de Chicago, donde un grupo de profesores trabajaban desarrollando detectores de radiacin ionizante (contadores geiger). Descubrieron que la radiacin ionizante podan discriminarla por su energa caracterstica, por tanto podan diferenciar elementos. Se contactaron con la NASA y enviaron en el primer viaje mecnico a la luna, uno de estos detectores aprovechando el fro del ambiente y as analizaron suelo lunar. Los elementos que forman parte de este detector no son mviles, obedecen a una geometra fija. Hay ciertos ngulos de salida (45 generalmente) y distancias de trabajo para capturar la informacin que se deben respetar. Mientras ms cerca mejor porque a pesar de la existencia de vaco, los rayos X tambin se dispersan.
Espectrmetro de longitud de onda dispersiva (WDX) El detector en s mismo es sencillo, pero es complejo en su mecnica. Consiste en un cilindro hueco que tiene una ventana transparente de mylar (3-4 cm por 0.5 cm) que es un polmero de tipo polipropileno, que se puede obtener muy delgado y que tiene una altsima resistencia. Esta placa de mylar se metaliza con oro, de forma tal que todo el cilindro es conductor. Por la ventana transparente de mylar metalizado pasan los rayos X que provienen de la muestra. Al centro del cilindro hay un hilo de oro que mide 10 m de dimetro, que acta como nodo y la superficie acta como ctodo. El cilindro se llena con gas, que es una mezcla de argn- metano. Con esto lo que se persigue es que los rayos X al entrar por la ventana ionicen el gas, produciendo descargas entre el nodo y el ctodo, que son las que se cuentan. Es un contador proporcional al nmero de cuentas que estn entrando y al nmero de cuentas que se estn generando por estas descargas. En este caso el WDX es todo lo contrario al EDX en cuanto a simpleza, porque la muestra emite rayos X, pero aqu en vez de un detector nico hay un sistema mucho ms complejo.
Ley de Bragg:
En un cristal (red simple), se reconoce que entre un plano y el otro existe una distancia llamada espacio interplanar (d). De forma tal, que si se bombardea con luz, los fotones se difractan en la superficie del material. Un seor de apellido Bragg invent una ley que dice que al bombardear con una radiacin de longitud de onda conocida, la longitud de onda es directamente proporcional a 2d x sen , lo que significa que es el doble de la distancia interplanar por el seno del ngulo de difraccin de la radiacin. El valor de n en general se toma como 1. n = 2d x sen Esta ley permite, sabiendo la longitud de onda y el ngulo de difraccin de la radiacin () conocer la composicin de un material. Por ejemplo, si se bombardea la muestra con electrones de cobre, que tienen una longitud de onda determinada y si se vara el ngulo de incidencia, tambin se vara el ngulo de salida de la radiacin y se puede conocer, por lo tanto se puede determinar todos los espacios interplanares dentro de un cristal y as identificar mineralgicamente como est estructurado un material por complejo que sea. Si tenemos un sistema que consta de fuente, muestra, cristal y detector. Se puede aplicar la ley de Bragg. La muestra es la incgnita que va a emitir rayos X. Se pone un cristal conocido, cuyo espacio interplanar se conoce y se conoce el ngulo de difraccin de la radiacin. Entonces, se conoce d y el ngulo , quedando la longitud de onda como la incgnita, y usando la ley de Bragg se puede conocer la longitud de onda.
Crculo de Rowland:
Al tener la fuente, que en este caso es la muestra bombardeada por electrones, emite a su vez electrones (posicin 1) que dan sobre el cristal y se difractan con ngulo 1 llegando al detector (D1), se conoce d, que es constante para el cristal, y el ngulo 1. Se puede cambiar el ngulo de la fuente (ngulo con que la fuente emite electrones) a la posicin 2 y 3, y a todas las posiciones de ngulo que permita el sistema detector formando una composicin que permite el reconocimiento de los elementos. Este sistema de deteccin es mucho ms complejo que el anterior porque bastara una pequea desviacin del ngulo, en el recorrido que hace, para que el error fuera desastroso. Tenemos un dispositivo tremendamente complejo, desde el punto de vista que tiene que ser micromtricamente desplazado para poder obtener los ngulos y tener nocin exactamente de cuanto es eso. Con el WDX se puede hacer un barrido de todos los elementos de la tabla peridica, desde el Na hasta el ltimo de la tabla en forma simultnea. Para eso se tiene que hacer el recorrido de todos los ngulos para todas las longitudes de onda, por lo tanto va a ser lejos ms demoroso. Tiene su contra que es el tiempo de demora, pero tiene su lado positivo que es la mejor resolucin de este sistema de longitud de onda dispersiva en comparacin con el sistema de energa dispersiva.
Los cristales van a tener cierto espaciado interplanar, que le va otorgar el poder medir ciertas longitudes de onda, pero desgraciadamente aunque los cristales que se fabrican son extremadamente perfectos y puros, permiten medir ciertos rangos restringidos de elementos. As, por ejemplo, el fluoruro de litio, uno de los cristales que se utiliza por su perfeccin, pureza y ordenamiento, permite medir slo elementos que van entre el N atmico 20-33 en la lnea (electrones del primer nivel) y slo los electrones con N atmico entre el 52-93 en el caso de la n. Para analizar un elemento que tiene un N atmico menor que 20, hay que utilizar otro cristal, como el PET que es el complemento, que va del 1225. Entonces para analizar todos los elementos hay que utilizar cristales que se vayan complementando, normalmente se utilizan como mnimo 4 cristales. En el espectrofotmetro se tiene los cuatro cristales, el detector y un sistema a motor que permite cambiar los cristales. En realidad no slo permite el desplazamiento fsico en el crculo de Rowland, sino que tambin permite realizar el cambio de los cristales segn sea el elemento a analizar. Claramente es ms lento el barrido general, pero al momento de cuantificar, aunque tambin es ms lento, la informacin es lejos mejor. Por esa razn se usa este tipo de dispositivo que permite tener mejor resolucin y amplificacin (no estoy segura si esta es la palabra). En el caso del Cameca (modelo que hay en IDIEM), est constituido por el haz de electrones, la muestra y el dispositivo final donde van las perforaciones que permiten capturar la informacin para las longitudes de onda dispersiva (energa dispersiva): cuatro semi conductores, que son cristales pequeos, los cuatro detectores (captan electrones retrodifundidos) y el que registra los electrones secundarios, adems todava queda la posibilidad de agregar otro detector que capte ctodo luminiscencia. Con esto se puede recolectar una gran cantidad de energa. El espectrmetro de longitud de onda dispersiva tiene una geometra inclinada o semi inclinada y el de energa dispersiva tiene el recipiente con nitrgeno lquido y en su interior el detector hacia abajo enfocando al centro. La microsonda electrnica fue fabricada originalmente con el concepto fundamental de tener una columna, una cmara, un sistema ptico para ver la imagen y tres a cuatro detectores de longitud de onda dispersiva para poder tener alternativas de cristales distintos y obtener con mucha rapidez informacin simultnea de todos los elementos. Al trabajar en una microsonda electrnica, sin importar que pticamente sea buena o mala, es necesario tener por lo menos tres detectores simultneos. Si no es as, si hay menos de tres detectores, se est en presencia de un microscopio electrnico con capacidad analtica, es decir, se privilegia la microscopa y se tiene rayos X como un aditamento complementario. Al contrario, al tener una microsonda electrnica no interesa la imagen, pero si la rapidez y eficiencia desde el punto de vista cualitativo y cuantitativo. Existe un lmite tenue entre lo que es un microscopio electrnico con capacidad analtica (microanalizador) y una microsonda. Las muestras a analizar en la microsonda se ponen en un porta muestras que se introduce en la cmara de muestras. En el porta muestras, se pone adems de las muestras a analizar los estndares.
Fluorescencia-rayos X En cualquier espectrmetro, de energa o longitud de onda dispersiva es un mtodo relativo a los estndares. Se puede hacer anlisis cuantitativo terico, con los errores que eso significa. Para hacer anlisis buenos, se requiere necesariamente tener elementos, los mismos que van a estar en la muestra, y ojal en una matriz anloga. Por ejemplo, si se est analizando cemento, se debe tener una muestra de calcio, silicio, aluminio y fierro del tipo del cemento, no sirve tener fierro metlico. Espectro de fluorescencia- rayos X- EDX
La escala en el eje Y son cuentas por segundo (cps, intensidad) que se refiere al nmero de fotones que vienen por la muestra) y en el eje X est la energa expresada en KeV. Partiendo del cero, aparece el silicio, cromo, fierro y nquel, debe haber ms elementos que no aparecen. La energa dispersiva, EDX, permite analizar desde el elemento sodio en adelante. Si se quisiera analizar elementos ms livianos, se tendra que tener una ventana ms delgada o removerla. Si est todo el microscopio al vaco, se podra sacar la ventana y analizar sin ventana, lo que permite analizar elementos ms livianos. En este espectro aparece ruido de fondo del continuo, background, que necesariamente va a aparecer. Matemticamente se puede eliminar. De todas maneras, la eliminacin del background est incluida en el propio software. Si se estuviera analizando un material orgnico, el ruido de fondo sera ms exagerado aun. En definitiva, la emisin de los elementos livianos es ruido, fundamentalmente por la profundidad de difusin que se produce, que es muy baja. Razn por la cual este sistema se trata de eludir, desde el punto de vista orgnico por el ruido. En cuanto al anlisis cuantitativo, este requiere muestras patrones. Los patrones sirven para integrar el valor del peack de un elemento, como el Fe, lo que da una serie de intensidades que son proporcionales a la concentracin. A travs de un software, previa lectura de la intensidad, se alimenta para la concentracin. Se mide la intensidad, se integra cada mximo y se informa al programa cuales son las concentraciones que tiene. Al medir la muestra, se hace referencia a este sistema de ecuaciones agilizado. Quin quiera tener por esta va valores absolutos no lo logra. Es todo relativo a los estndares, si el estndar escapa mucho a la realidad, no se ocupa. Otra alternativa que se tiene para cualificar y cuantificar es el mapeo superficial. Esto consiste en sincronizar el canal que corresponde por energa o longitud de onda dispersiva. Por ejemplo, si se va a leer, se mide en el espectro que se estaba obteniendo y se da la orden para que se lea slo en una posicin.
Lo que ocurre es que el haz de electrones barre la muestra y cada vez que pasa por un punto, ese punto emite si estn o no los elementos en cuestin. Adems grafica en las zonas de mayor densidad blanca, cuando apareci nquel o plata, comparndola con la imagen original. Tiene intercalado en las zonas donde no hay plata, cobre que est embebido en una matriz de plata. Simplemente a travs de un mapeo superficial. Otra alternativa a travs del microanlisis electrnico usando cualquiera de las dos tcnicas, es hacer lo que se llama un barrido de lnea. Si se est observando una imagen detrs de otra, se da la orden de barrer desde un punto de origen hasta otro punto, detectando las concentraciones relativas de oro, plata cobre y zinc. Pudiendo obtener donde estn los cortes, en cuanto a la distribucin elemental.
Daniela Araya Caldern
Microanlisis- Mauricio Bernal y Ernesto Croquevielle 125
Microanlisis de Rayos X: Principios, Fundamentos y Aplicaciones

Mauricio Bernal Ernesto Croquevielle Laboratorio de Materiales. IDIEM Mircoles 26 de Noviembre de 2003
este momento, en el transcurso de la asignatura hemos visto las aplicaciones de la microscopa electrnica de transmisin y de barrido a la observacin morfolgica de estructuras, principalmente biolgicas. stas se basan en la utilizacin de electrones primarios transmitidos o secundarios desprendidos de las estructuras que son incididas por un haz de electrones. En esta clase, revisaremos brevemente otra de las aplicaciones del microscopio electrnico, consistente en el anlisis de composicin y topografa de materiales (orgnicos o no), de dimetro tan pequeo como 1 m.
Hasta
Figura 1: Esquema de la Microsonda CAMECA Camebax SX-50: (1) ctodo; (2) bomba inica; (3) bobinas de alineamiento; (4) tubo absorbente de electrones; (5) lentes condensadores; (6) sistema de aberturas; (7) regulador del haz de electrones; (8) caja de Faraday; (9) espectrmetro dispersor en longitud de onda; (10) cristal difractor; (11) computador proporcional; (12) muestra; (13) cmara; (14) control portamuestras; (15) espectrmetro dispersor de energa; (16) apertura del EDS; (17) lente final; (18) detector de electrones retrodifundidos; (pre-cmara de vaco).
Puede hacerse anlisis de muestras que contienen partculas que representan menos del 1% del peso de ellas.
Microanlisis- Mauricio Bernal y Ernesto Croquevielle 126
Histopatologa Ultraestructural Renal- Guillermo Murray 127
Aporte de la Ultraestructura al Diagnstico de la Patologa Renal

Dr. Guillermo Murray Servicio de Anatoma Patolgica Hospital Clnico Jos Joaqun Aguirre Universidad de Chile Martes 02 de Diciembre de 2003
La observacin a la microscopa electrnica, como hemos visto, nos proporciona detalles de la

ultraestructura citohistolgica. Estas caractersticas muestran claras diferencias en la normalidad y en las diversas alteraciones que pueden manifestarse en los rganos, tejidos y clulas. En muchas oportunidades ocurre que al observar bajo microscopa ptica una preparacin aparentemente no presenta dao alguno en su composicin, mas al realizar la observacin bajo el microscopio electrnico (especialmente de transmisin), en la muestra existen transformaciones slo percibibles a tal nivel. Esto hace de la microscopa electrnica de transmisin una herramienta til, e incluso fundamental en el diagnstico histopatolgico. Un claro ejemplo de esto es la aplicacin que tiene en el diagnstico de las patologas renales. En estos casos se hace la evaluacin del glomrulo, pues desempea un importante papel en la histopatologa renal. El glomrulo aporta informacin sobre el diagnstico, la patogenia, el pronstico e incluso el tratamiento adecuado de las enfermedades. Existen enfermedades crnicas del rin que requieren ser diagnosticadas. Por ejemplo, un rin cuyo aspecto macroscpico corresponde a una glomrulonefritis crnica, puede tardar entre 1 y 30 aos en manifestar los cambios correspondientes a esta patologa, lo que constituye un patrn de cronicidad. Macroscpicamente ser ms pequeo, fibroso y rugoso con respecto a un rin normal. Algunas causas de esta cronicidad se relacionan con enfermedades incurables asociadas particularmente a orgenes inmunolgicos, como ocurre con el Lupus Eritematoso. Muchas de estas enfermedades crnicas tienen una evolucin ondulatoria (perodos de agravamiento intercalados con remisiones de la enfermedad). Para el diagnstico de la patologa renal es necesario hacer una biopsia de puncin por aguja fina. Mediante este procedimiento mnimamente invasivo, se toman cilindros de aproximadamente 1 mm de dimetro, lo que permite tener mayor cantidad de glomrulos por rea de corte. Mientras mayor dimetro tiene es mejor la biopsia. La biopsia obtenida es utilizada para el examen y diagnstico en microscopa ptica, de fluorescencia y electrnica de transmisin. En el caso de la microscopa ptica, se hace la caracterizacin morfolgica con Hematoxilina y Eosina, y adems, con el mtodo de tincin tricrmica de Masson, en la microscopa de fluorescencia se hace inmunofluorescencia, y en la microscopa electrnica se hace la observacin ultraestructural. Para el caso de los cortes que sern observados al microscopio electrnico, antes de la obtencin de los cortes ultrafinos se obtiene un corte fino o delgado (no superior a 1 m de espesor) del taco de inclusin en resina, que es teido con azul de toluidina para la observacin al microscopio ptico; este corte proporciona mayores detalles que los cortes de 3 a 4 m obtenidos en bloque de parafina para la observacin convencional al microscopio ptico. Este corte fino obtenido es el ltimo corte que se hace del taco antes de proceder a la obtencin definitiva de cortes finos para la microscopa electrnica de transmisin. Habitualmente, una vez realizada la observacin de este corte fino, puede seleccionarse el rea a estudiar en mayor detalle y retallar dejando en plano de corte slo sa rea. Ocasionalmente se sacan 3 cilindros separados para cada tipo de procesamiento. Cuando, como ocurre mayoritariamente, se extrae 1 cilindro, ste se divide, idealmente, en 3 segmentos. Para dividir este cilindro se observa bajo lupa conservando la muestra en suero fisiolgico, pudiendo verse en el cilindro claramente los glomrulos (de aspecto redondeado) repletos de eritrocitos. Cuando el trozo
tomado es largo (app 8 mm), se secciona de forma tal que haya un trozo mayor que es destinado a microscopa de luz, un trozo de tamao intermedio para inmunofluorescencia, y un segmento pequeo para microscopa electrnica. Cuando el trozo es mediano o pequeo, slo se secciona para microscopa ptica y electrnica, y en caso de tener un trozo extremadamente pequeo, se destina slo para microscopa electrnica. La eleccin del procesamiento del trozo de biopsia, especialmente cuando es de tamao medio, se hace en base al diagnstico presunto sostenido en los antecedentes clnicos. En este caso se decide si se hace o no una separacin de un trozo pequeo para microscopa electrnica. Cuando existe una buena sospecha de enfermedad, como por ejemplo una glomerulonefritis con depsitos de Ig A. La glomerulonefritis se caracteriza por el aumento del nmero de clulas o hipercelularidad, con focos necrticos. Para definir la lesin renal, se debe hacer la evaluacin de toda la poblacin glomerular y de cada glomrulo de la muestra. As, tenemos 2 tipos de clasificacin de lesiones glomerulares que son complementarias: 1. En todos los glomrulos (10 glomrulos mnimo): a. Focales: Escasos glomrulos afectados b. Difusas: Todos los glomrulos estn afectados (9 o ms) 2. En un glomrulo enfermo: a. Global: Todo el glomrulo (capilares glomerulares) est afectado b. Segmentaria: Algunas reas del glomrulo estn afectadas Cuando se observa la patologa, podemos tener diversos tipos: a. Celularidad: Por lo general, se trata de aumento en el nmero de clulas (hipercelularidad), que est asociado a procesos inflamatorios. Ocasionalmente, pueden haber procesos de hipocelularidad asociados a degeneracin glomerular. b. Presencia de depsitos: Son materiales anormales localizados en distintas partes del glomrulo; en general se trata de depsitos proteicos. Por ejemplo, pueden existir depsitos granulares que, al observarlos a microscopa ptica con la tincin de Masson, son fucsinfilos, brillantes, homogneos y pequeos. A la inmunofluorescencia, de acuerdo al tipo de protena incorporada presentan un patrn de inmunofluoromarcacin. Mayoritariamente corresponden a depsitos de tipo Ig (G, M, A), componentes del complemento (C3, C1q, C4), fibringeno, cadenas livianas de Ig. A la microscopa electrnica, se observan depsitos densos (ms oscuros o de densidad mayor que la membrana basal). Habitualmente, el desarrollo de estas tcnicas es paralelo. Ejemplo de ello es el hallazgo en inmunofluorescencia de depsitos de IgG, que a microscopa ptica corresponden a depsitos densos, o bien oscuros en microscopa ptica. Los depsitos tienden a localizarse centrales en la zona mesangial, o bien en la zona paramesangial (entre el mesangio y la membrana basal). Esto ocurre tpicamente en ciertas glomerulonefritis (GN) por IgA. Cuando los depsitos estn en relacin a la membrana basal, stos pueden ubicarse: (i). entre las clulas endoteliales y la membrana basal (en el espacio subendotelial), como ocurre en el lupus. (ii). Entre la membrana basal y las clulas epiteliales. (iii). Extramembranosa (GN membranosa). (iv). GN aguda (infantil o adulta). (v). Focos aislados o pequeos
Pueden tambin localizarse en la cpsula de Bowmann y en el intersticio. Ser de acuerdo a la localizacin que se tendr de esta forma nocin clara del diagnstico, as como habrn indicios del pronstico y tratamiento a proporcionar. En ocasiones, el glomrulo es afectado por mecanismos inmunolgicos de dao, que puede ser mediado por anticuerpos, clulas inmunocompetentes, componentes del complemento (debido a activacin por la va alterna como reaccin de defensa contra grmenes que contengan lpidos complejos en su pared o membrana celular,), u otros. Muchas de las patologas renales causadas por mecanismos inmunolgicos se relacionan a enfermedades genticas. En clnica, se ha observado que un 90% de las glomerulonefritis son de tipo inmunolgico. Ejemplifiquemos ahora la utilidad que nos brinda cada tipo de microscopio en el diagnstico de la patologa renal, cuando nos enfrentamos, aparentemente, a un rin macroscpicamente normal. 1. Cuando observamos a la microscopa ptica este rin, nos encontramos con lesiones glomerulares mnimas o con un aspecto normal. Cuando existen lesiones glomerulares mnimas, existe habitualmente una alta correlacin con la deteccin clnica de proteinuria. Si utilizamos ahora la inmunofluorescencia para observar el rgano, no arroja resultados positivos. Sin embargo, cuando lo observamos en el microscopio electrnico de transmisin, en los glomrulos podemos ver que hay ausencia de pedicelos, existiendo una capa contnua de citoplasma, demostrndose una enfermedad de las clulas epiteliales que corresponde a las lesiones glomerulares mnimas observadas a la microscopa de luz. En este caso existe un marcado aumento del transporte de protenas en la membrana basal que, en un intento por impedirlo, es compensado por parte de las clulas con la aparicin de microvellosidades en stas. 2. En un segundo caso, se observan depsitos inmunes extramembrana, correspondiendo a una glomerulonefritis membranosa. La observacin bajo microscopa electrnica muestra la presencia de pequeos depsitos entre la membrana basal y las clulas epiteliales. Estos depsitos, segn se ha visto en los pacientes con esta patologa, aumentan en el tiempo. 3. Otra posibilidad de rin con glomrulos aparentemente normales, corresponde a casos en que la membrana basal es delgada (tiene de 320 a 350 nm). Debe considerarse que el espesor de la membrana presenta variaciones de acuerdo al sexo y la edad (hombres>mujeres>nios). Cuando la membrana basal glomerular es muy delgada, funcionalmente no maneja el contenido celular de los capilares, lo que facilita el paso de los glbulos rojos hacia el espacio glomerular de la cpsula. Esto se manifiesta como una lesin benigna denominada hematuria, que es frecuente en nios y adolescentes, debido justamente al menor espesor de la membrana basal glomerular en eso perodos etarios. 4. Podemos encontrarnos en la presencia de hipercelularidad glomerular en un proceso de glomerulonefritis aguda infantil; sta suele ocurrir en espacios cerrados, y es secundaria a infecciones por streptococo hemoltico. Clnicamente se caracteriza porque la orina del paciente es oscura, sanguinolenta, y hay elevacin de la presin. No se ven etapas precoces a la microscopa electrnica porque los sntomas suelen ser indicador claro para el mdico clnico, que no considera necesario el estudio con microscopa electrnica (debe recordarse que una enfermedad aguda se diagnostica a las pocas horas o das). A la microscopa electrnica, en esta enfermedad se reconocen depsitos grandes aislados en la membrana basal, y clulas epiteliales en joroba (Hunk).
5. En otro caso, de rin aparentemente normal, se ti un corte con el mtodo de Van Gieson para la observacin a microscopa ptica vindose supuestamente intacto; al hacer la inmunofluorescencia del mismo rgano no se obtuvieron resultados positivos, mas al microscopio electrnico, haba claramente una alteracin en la membrana basal, cuyo grosor estaba aumentado, con cambios en la composicin (distintos grados de densidad); este cuadro corresponda a una glomerulonefritis hereditaria infantil, que suele estar combinada con sordera, manifestndose como un Sndrome de Hallart. 6. Otro caso mostrado corresponde a hipercelularidad mesangial, que al ser observado a microscopa electrnica muestra la presencia de depsitos densos en el intersticio y membrana basal de los tbulos; sin embargo, los glomrulos presentan escasos depsitos, aunque en las clulas endoteliales existen estructuras tubuloreticulares en manojo (conocidas como estructuras virales). Estas estructuras corresponden a cisternas de retculo endoplsmico dilatadas y agrupadas, que pueden tambin (pero menos frecuentemente) adoptar la forma de depsitos subendoteliales en forma de huella digital. La presencia de estas estructuras es caracterstica del Lupus Eritematoso Sistmico o Diseminado, enfermedad autoinmune compleja, crnica, presente principalmente en mujeres jvenes, en proporcin de 9 mujeres: 1 hombre. En esta enfermedad se detectan el los glomrulos depsitos immunes de autoanticuerpos contra DNA, adems de IgG y C3. Si bien estas son slo algunas de las mltiples patologas renales, hemos podido mediante ellas revisar y comprender la importancia del diagnstico ultraestructural en las patologas. Adolfo Ros Alcorta
Barreras de Intercambio- Cleofina Bosco 131
Ultraestructura de barreras de intercambio de diferentes rganos

Prof. Cleofina Bosco Programa de Morfologa. ICBM Martes 22 de Noviembre de 2003
El intercambio entre un capilar y un tejido depende del tejido que haya entre estos
dos: la barrera de intercambio. Entre el vaso sanguneo (capilar) y el tejido habr una lmina basal del vaso, tejido conectivo (mnimo) y la lmina basal del epitelio del tejido. Lo que salga o entre al epitelio ser regulado por la barrera de intercambio que es muy compleja (intervienen muchos elementos). La lmina basal probablemente siempre va a ser la misma, tiene una composicin constante. La lmina basal se sintetiza a partir del epitelio y el tejido conectivo (fibroblastos). Una lmina basal tendr 2 zonas al microscopio electrnico, una ms clara (traslcida) y una ms oscura (electrndensa). En la zona traslcida habrn componentes secretados por el epitelio como: colgeno tipo IV, protena que a diferencia de los otros colgenos es globular y, la laminina. La zona electrogndensa tiene elementos fibrilares, lo que significa que hay elementos conectivos como el colgeno tipo VII y tipo III, que son secretados por fibroblastos, adems de la fibronectina (glicoproteina). En conjunto todo esto constituir la lmina basal que esta fuertemente unida al epitelio y al tejido conectivo. Si vemos la lmina con mayor detalle, tiene una serie de otros elementos como entactina y perlecn (proteoglicano de heparan-sulfato) que forman una malla muy densa. Por lo tanto, para que los elementos pasen por esta barrera intervendrn una serie de factores como: la carga de la sustancia, volumen, la diferencia de las concentraciones de un lado y otro, etc. o sea la membrana basal es muy selectiva. En una investigacin uno analizar a unos componentes ms que a otros, por ejemplo la cantidad de laminina que tiene la lmina. La laminina es una glicoproteina que esta formada por una serie de cadenas y tiene forma de cruz. La laminina tiene forma de cruz por la disposicin que tienen sus 2 cadenas beta y 1 alfa. El colgeno IV es muy estudiado y como es globular no es necesario hacer inmunohistoqumica o analizar el estado de la zona electronlcida. El heparn sulfato corresponde a la familia de los glicosaminglicanos. La fibronectina esta muy estudiada del punto de vista bioqumico y morfolgico y nos da cuenta de lo que esta ocurriendo con la lmina basal. Entonces, la laminina y el colgeno IV son aportados por el epitelio, mientas que el heparan sulfato y la fibronectina estn dados por el tejido conectivo. Los glicosaminoglicanos pueden ser de cadenas largas o cortas, cuando son de cadenas cortas son sulfatados que tienen una carga negativa bastante alta que los une a protenas formando los agregados de proteoglicanos. Estos son grandes conglomerados de cargas negativas que su funcin es atraer al agua, es una sustancia muy solvatada y esto permite que los metabolitos acuasolubles puedan atravesar esta lmina. Las clulas
epiteliales tienen medios de unin entre ellas hacia lateral y basal, que no esta interviniendo entre el intercambio, sino que solo esta sosteniendo las clulas. En estas membranas estn los desmosomas como medios de unin entre las clulas epiteliales. En la membrana basal habr hemidesmosomas que sostiene estas clulas con la lmina basal. En una clula epitelial intestinal, los elementos nutritivos pasan como metabolitos que pueden atravesar el epitelio. Este epitelio tiene microvellosidades para favorecer la absorcin de estos metabolitos y tambin tiene medios de unin que son bastante importantes. Uno de estos medios de unin es el complejo de unin que esta constituido por 3 elementos, la unin ocluyente (zonula ocludens) que esta en la parte superior, la zonula adherens y los desmosomas. La zonula ocludens no deja que haya intercambio entre clulas, y direcciona las sustancias hacia basal. Los glicosaminoglicanos tienen un grupo clave en ellos que es la glucosa anillada. Cambios y rotaciones en los grupos alcohlico u oxidrilo determinarn diferentes compuestos. El mas conocido de los glicosaminglicanos de un tejido conectivo es el cido hialurnico (que esta presente en la zona pelcida del vulo). El cido hialurnico es el cido glucornico (grupo cido en C6 de la glucosa) unido por enlaces covalentes a una glucosa con un grupo amino. Este disacrido repetitivo (Ac glucornico + glucosamina) formar el ac hialurnico, el ms comn de los glicosaminglicanos. Si en vez de ac. glucornico uso idosa, se llamar cido idurnico. El cido idurnico con la galactosamina da la heparina, sustancia que tiene la capacidad de sulfatarse. El heparn sulfato es un glicosaminglicano de cadena corta que tiene c. idurnico en vez de ac glucornico. El otro componente de la barrera es el capilar que tambin esta formado por un epitelio monoestratificado y plano llamado endotelio. Estos capilares no solamente estarn constituidos por endotelio sino que tambin por pericitos que es una clula que esta adherida al endotelio. Los pericitos son una especie de miofibroblastos que participan en la contraccin. Tienen el ncleo por la parte externa del endotelio. En contraste, el endotelio tiene sus ncleos hacia el lumen del vaso. Existen diferentes tipos de capilares: 1- continuos: fenestrados y no fenestrados 2- discontinuos. Un capilar continuo no tiene espacios entre una clula y la vecina, el discontinuo (tambin llamado sinusoide) dejar un espacio entre clulas. Adems, los continuos son de calibre constante, mientras que el discontinuo es de calibre variable. El tipo de capilar estar relacionado al grado de intercambio del tejido. Un tejido de alto intercambio tendr un capilar continuo fenestrado o discontinuo. Los capilares fenestrados presentan poros que son zonas en donde se adelgaza el citoplasma y quedan membranas muy delgadas de alto transporte (Ej: rin, intestino).
Un ejemplo de capilar discontinuo son los del hgado. Por las divisiones celulares podemos saber cuntas clulas componen al capilar. La placenta es un rgano de alto transporte y acta como rin, pulmn, intestino, etc. para el feto. La placenta a la vez acta como barrera entre feto y madre, con una barrera de intercambio entre los capilares maternos y fetales. La sangre fetal y materna estarn divididas por las lminas basales de cada uno (endotelio), un poco de tejido conectivo y un epitelio llamado sinciciotrofoblasto. La placenta humana tiene un capilar de tipo continuo no fenestrado (la placenta tiene una alta regulacin del intercambio). En el caso de la rata, el endotelio de la placenta es de tipo continuo fenestrado. Es importante considerar diferencias como esta dependiendo de la especie con la que estamos trabajando. Lo que siempre ser constante es la membrana basal, constituida por 2 lminas basales. Habr que saber reconocer un capilar por su endotelio y no por los glbulos rojos que hay en su interior porque no siempre encontraremos glbulos rojos. El conjunto de lmina basal, tejido conectivo y lmina basal se denomina membrana basal. Cualquier alteracin en la membrana basal determinar trastornos en el intercambio, por ejemplo, existe un problema que se llama Tiroiditis en donde hay una alteracin de la membrana basal. La tiroides tiene capilar continuo fenestrado. Esta alteracin aumenta la permeabilidad y permite que el precursor de la hormona tiroidea pueda salir a la circulacin sangunea. El sistema inmune no reconoce esta protena por lo que se generan anticuerpos contra esta protena (en la glndula tiroides), generndose la tiroiditis o enfermedad de Hashimoto. En el glomrulo renal habr filtracin de la sangre hacia el espacio de la cpsula de Bowmann. El epitelio presente en el glomrulo es el epitelio de la hoja visceral de la Cpsula de Bowmann conformado por los podocitos. Este epitelio esta envolviendo al capilar y la sangre filtrar por los espacios que queden entre las prolongaciones de los podocitos (epitelio monoestratificado de la cpsula). Las prolongaciones se apoyan sobre su lmina basal, luego hay muy poco tejido conectivo y posteriormente la lmina basal del capilar continuo fenestrado del glomrulo. Los espacios entre los podocitos se llaman diafragmas. Los fibroblastos en este tejido conectivo se llaman clulas del mesangio. Las fallas renales son por dao en su barrera de intercambio, es decir, por alteraciones en los podocitos, la lmina basal o el mesangio. La barrera hemato-enceflica es muy selectiva en el intercambio. En esta barrera no hay tejido conectivo entre el capilar y el epitelio. El epitelio de esta barrera esta conformado por los astrocitos. Los astrocitos tienen estructuras llamadas pies vasculares que se unen a los capilares. Los astrocitos son glias que se interponen entre el capilar y la neurona. En este caso el capilar es continuo no fenestrado y hay pericitos.
Estas barreras controlan la entrada y salida de diferentes sustancias, sin embargo existe una barrera que no deja que nada salga a nivel de los capilares del timo. Los capilares del timo estn envueltos por las clulas del estroma del timo. Esta barrera es hermtica y pueden pasar muy pocos nutrientes, esta es la barrera hemato-tmica. En el hgado hay capilares discontinuos. Tampoco hay continuidad de la membrana basal, por lo tanto, pasa gran cantidad de sustancias hacia el hepatocito. El hepatocito es una clula que tiene microvellosidades hacia ambos extremos (como si no tuviera porcin basal), como si tuviera 2 porciones apicales que se enfrentan hacia capilares. En el bazo tambin hay capilares sinusoides (discontinuos con membrana basal interrumpida) para permitir el paso de los eritrocitos. En resumen, segn el rgano puede variar el tipo de tejido y el tipo de capilar pero siempre encontraremos la misma membrana de intercambio.
Emilio Herrera.
Morfometra- Enrique Castelln 135
MORFOMETRA
Dr. Enrique Castelln Mircoles 03 de Diciembre de 2003
la tridimensionalidad de los cuerpos. La morfometra es el estudio cuantitativo de la morfologa y se basa en los principios cuantitativos de la estereologa, aplicndolos a las estructuras biolgicas. Los procedimientos morfomtricos que se apliquen dependern de lo que se pretenda cuantificar. En microscopa electrnica obtenemos cortes finos para poder obtener una visin ultraestructural, al obtener estos cortes lo que hacemos es sacrificar la tridimensionalidad del tejido, virtualmente reducimos a dos dimensiones una muestra que en realidad posee tres dimensiones. En una microfotografa observaremos un rea, pero esta rea representa un volumen que puede ser estimado a partir de ella. La derivada de un volumen es un rea y la integral de un rea es un volumen. En un corte tendremos un rea con lneas (por ejemplo: membrana plasmtica o mitocondrial) y puntos (por ejemplo: fibras de DNA). Tridimensionalmente, los puntos correspondern a lneas y las lneas a superficies o reas; como ya dijimos las reas correspondern a volmenes.
La estereologa es el estudio de
Nomenclatura:

Letras maysculas: se refiere a valores totales. Letras minsculas: se refiere a valores individuales. V: volumen (m3) Vv: fraccin de volumen o densidad volumtrica (m3/ m3) v: volumen de la estructura i (por ejemplo: cada mitocondria) VI: volumen colectivo de la estructura (volumen de todas las mitocondrias) A: rea (m2) AA: fraccin de rea (m2/ m2) A?: rea promedio (Aa/Na) (m2) SV: relacin superficie volumen o densidad superficial (m2/m3) L: largo, test de lneas (m) LL: fraccin de lnea (m/ m3) LA: lnea en relacin a un rea (m/m2) LV : lnea en relacin al volumen (m/ m3) NI: nmero total de estructuras I NV: nmero de estructuras en un volumen o densidad numrica

P: nmero de puntos PF: fraccin de puntos Densidad volumtrica: fraccin de volumen ocupado por la estructura i. Densidad superficial: cantidad de rea en el volumen.

La relacin superficie/volumen da una idea de la forma de la estructura. Principio de Delesse: VVI = AAI (relacin de reas = relacin de volmenes) y tambin: VVI = AAI = PPI (las fracciones de volumen, rea y puntos son equivalentes). Mediciones:

Obteniendo una relacin de peso. Cuadrcula: Dividir la unidad del rea con lneas equidistantes, a menor separacin (mayor nmero de lneas) la medicin es ms precisa. Cuadrcula: Se puede ver cuntas lneas atraviesan la seccin, se mide el largo de las lneas, este largo se divide por el largo total. Se debe realizar varias mediciones y luego promediarlas. Esto se denomina relacin de lneas y es igual al volumen o relacin de volumen o densidad volumtrica. Otra manera es colocar puntos equidistantes, conociendo el total de puntos en mi unidad de rea. Se cuenta el nmero de puntos en mi estructura y se divide por los puntos totales. Se expresa en unidad de volumen. PT = Pn + Pm + Pe + Px (puntos en cada una de las estructuras) VVI = PI/PT = PPI
Densidad superficial: Medicin de un contorno o lnea. Se cuentan los puntos de las lneas de una cuadrcula que interceptan el contorno o lnea (ejemplo: membrana plasmtica). SVI = SI /VT SVI = 2 N I /LT = 2NL I cuento los interceptos, los multiplico por 2 y lo divido por el largo total. Relacin superficie/volumen: Se usa una malla mixta, posee lneas cortas equidistantes con puntos en sus extremos, en un patrn repetitivo.
Las lneas permiten determinar los interceptos. SI / VI = 4NI / ZPI Z : largo del segmento
Densidad numrica: Nmero de estructuras en un rea o volumen. No se puede deducir la forma Si es una esfera: NAI = V x DI (dimetro promedio I) Para calcular el dimetro promedio se debe hacer varios cortes y considerar el dimetro mayor (dimetro real). NVI = 1 / I x NAI 3/2 / VVI : coeficiente de forma NVI = 1 / I x NAI 3/2 / VVI x K K: coeficiente de tamao y K varan para tamaos muy diferentes (tablas) Estudios morfomtricos:

Considerar orientacin de la muestra en la inclusin. Elegir determinados elementos en forma azarosa. La ocurrencia de las estructuras que aparecen en la microfotografa es representativa del tejido (cantidad relativa). Se debe observar varios sectores de una grilla. Para que sea aleatorio se puede seguir algunas reglas, como: contar una misma zona en las distintas ranuras de la grilla. La morfometra depende del tipo de muestra en estudio. Considerar el n de la muestra, ocupar el mayor n posible. microfotografa conteo resultado conclusin
Muestra
Algunas aplicaciones:

Combinacin de morfometra y anlisis bioqumicos. Se puede medir la eficiencia de un tejido. Ejemplo: intercambio gaseoso en pulmn. Mediciones pre y post tratamiento.
A veces, despus de un determinado tratamiento, se puede observar que la densidad de partculas intracelulares disminuye, lo que puede deberse a una disminucin de partculas o a un aumento de volumen, para determinarlo se debe calcular la densidad numrica. La digitalizacin de imgenes y los softwares computacionales han facilitado estos anlisis.
Francisca Jeria Peredo
Manejo y Anlisis de Imgenes digitales en MET/MEB Hctor Vega 138
Elementos Fsicos de Adquisicin de Imgenes. Ajuste de Histogramas. Reduccin de Ruido. Filtros Unsharp.
Prof. Hctor Vega Divisin de Informtica Facultad de Medicina Universidad de Chile Martes 9 de Diciembre de 2003
esta oportunidad, analizaremos brevemente algunos aspectos de la imagenologa digital aplicada a la microscopa con la finalidad de comprender el manejo y posterior anlisis de la informacin que obtenemos en el microscopio electrnico, sea este de transmisin o barrido. En fsica ptica y en morfofisiologa de la visin humana, se ha establecido que el ser humano percibe o ve un subconjunto de radiaciones electromagnticas comprendidas entre los 350 a 700 nm, rango denominado espectro visible de radiaciones.
En
2002. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores.
Asimismo, se ha determinado que la frecuencia y longitud de onda de la radiacin electromagntica se relacionan de manera inversamente proporcional: esto implica que a mayor longitud de onda, la energa es menor. El producto de estas dos magnitudes da una constante, que es la velocidad de la luz. Dado que los colores que vemos tienen distintos valores de energa, es esta propiedad la que se utiliza para capturar una imagen. En la actualidad, los dispositivos empleados para la captura de imgenes son: 1. fotomultiplicadores 2. fotodiodos 3. CCD Las cmaras digitales utilizan CCDs, que son una especie de matriz bidimensional (aunque actualmente Nikon dispone de un avanzado modelo con una matriz tridimensional), con pequeos fotodiodos que corresponden a elementos electrnicos que se comportan de distinta manera segn el color (energa) que los estimula (efecto fotovoltaico) y son capaces de generar un diferencial de potencial. Cuando estos dispositivos son adquiridos en las distintas casas comerciales que los proveen vienen con una hoja informativa o data sheet, en que se indica cmo se comporta este dispositivo segn el intervalo de frecuencia; este tipo de comportamiento hace que se le considere un dispositivo dinmico. Como sealamos, los CCDs son matrices bidimensionales de tamao pequeo (con una diagonal de 16 mm) que tienen muchos fotodiodos. Al remontarnos al pasado en la historia de la ptica y la imagenologa, hacia fines del siglo XIX no se tena clara la forma de perturbar un metal con luz y extraer de l electrones, creyndose por entonces que al aumentar la intensidad (mayor nmero de fotones por unidad de tiempo), iban a salir ms electrones del metal. En 1905, Einstein estableci una frmula que permiti explicar el denominado efecto fotoelctrico, demostrando que no se trata de disparar una gran cantidad de fotones sobre el metal, sino que esos fotones tengan energa suficiente para sacar electrones del metal. Ejemplifiquemos esto: si necesito 10 unidades arbitrarias de energa para sacar un electrones, aunque fotones de 9 unidades no sacar ninguno; sin embargo, cuando envo fotones con 11 unidades, podr extraer electrones sin dificultad. No obstante esto, recordemos que la ley del efecto fotoelctrico es una ley del todo o nada, es decir, que al usar fotones de 11 unidades se emplearn las 10 unidades necesarias, as como no bastar con enviar muchos fotones de 9 unidades pues no son sumativas. Imagen de electrones.
Otro aspecto o concepto que debe tenerse presente es la base de colores, correspondientes al rojo, verde y azul, que son los colores bsicos captados por los fotorreceptores oculares. Son estos, y no los que tenemos en la rosa cromtica los que permiten al cerebro humano y del mismo modo a los dispositivos de captura de imagen construir los dems. Esta base de colores es obtenible con un prisma que separa los tres colores, siendo esta seal descompuesta la que es captada por 3 fotodiodos. Tambin debemos tener en consideracin los pxeles o puntos de imagen, pues de ellos depende la resolucin con que vemos una imagen. A mayor nmero de pxeles, no solamente podemos tener una imagen ms depurada, sino que implicar adems un mayor consumo de memoria fsica del computador para procesarla. Adems, deben tenerse en cuenta los tonos de grises: cuando consideramos dos tonos, obtenemos imgenes en blanco y negro. En tomografa axial, se han identificado rganos corporales empleando 256 niveles de grises entre 0 y 255, aunque el ojo humano slo puede distinguir 40, lo que nos da mayor definicin que el empleo de otros colores. La digitalizacin de una imagen implica llevar una imagen analgica a digital (es decir de una imagen capturada y plasmada en medios convencionales como celuloide o papel, a medios electrnicos, donde estar almacenada como informacin en bits o bytes). En caso de desear digitalizar una imagen que tiene desde un celeste muy claro a un azul muy profundo y que cada tono diferente tiene distinto potencial, tendremos que 0 volt equivaldr al celeste claro y el azul oscuro a 5 volt; no obstante ello, el computador slo puede almacenar informacin como 0 y 1 (sistema binario), por lo que deben establecerse rangos, atribuyendo en el ejemplo al blanco valores entre 0 y 5, en tanto que para el azul oscuro valores mayores que 5. hay que tener presente que cada pxel de la pantalla se comporta como una variable binaria equivalente a un bit de informacin. Recordemos que 8 bits constituyen 1 byte. De esta manera la imagen resultante podra ser muy pobre, por lo que generalmente se aumenta el rango de valores, lo que se traduce en combinaciones de dos o ms nmeros (00, 01, 10, 11, etc.) que requerirn 2 o ms bits de informacin. Esta es la razn de que a medida que subdividimos la imagen necesitemos mayor memoria. Explicado esto, podremos ver entonces que en cualquier imagen digitalizada, podremos analizarla en funcin de la cantidad de pxeles de un determinado color o valor presentes en ella, mediante un histograma. Cada imagen y segmento de imagen tiene su propio histograma, a partir de cuyo anlisis es factible determinar el ruido de una imagen. Para realizar este clculo se saca un promedio de las barras que representan el ruido (es una barra ms alta que el resto) con respecto a las barras vecinas, para suavizar la imagen. Se ha establecido que cada pxel tiene 9 pxeles vecinos. Filtro Unsharp.
Universidad de Chile Facultad de Medicina ICBM
Elementos Fsicos de Adquisicin de Imgenes.
Hctor A. Vega Cruz

La radiacin electromagntica se extiende en el intervalo de 10-15 nm a 10+13 nm, pero en este caso nos interesa la parte de la luz visible del espectro:
La cual se extiende en el intervalo de 400 nm a 700 nm aproximadamente
Asociado al color se encuentran como podemos ver la longitud de onda () y la frecuencia (), lo cual queda an mas claro en el siguiente diagrama.

La longitud de onda () y frecuencia () se relacionan de la siguiente manera: c= donde c es la velocidad de la luz en el vaco (300.000 Km/s). La teora del fotn de Einstein nos da la herramienta necesaria para relacionar energa con el color de la luz: E=h Donde h es la constante de Planck (6.6260... x 10-34 Joulessec), de manera tal, que ahora podemos asociar energa al color de la luz, y esto ser lo que nos permitir proceder a la captura y reconstruccin de imgenes.
Para esto los elementos mas utilizados son: -Tubo Fotomultiplicador -Fotodiodo -CCD
Un elemento importante a considerar en el efecto fotoelctrico es la relacin entre la frecuencia de la luz incidente y la energa de los electrones liberados: T = h - h o T es la energa de los electrones liberados, es la frecuencia de la luz incidente, h es la constante de Planck y o es la frecuencia mnima para la cual empiezan a salir electrones del metal, es decir, ho es la energa necesaria para arrancar un lectrn del metal, y es caracterstica para cada metal.

En el caso del tubo fotomultiplicador, se usa este efecto para amplificar una seal de luz muy dbil.

Fotodiodo La deteccin de luz usando fotodiodos puede de una de las 2 maneras siguientes: -Efecto fotovoltaico -Efecto fotoconductivo

En el primer caso cuando el fotodiodo absorbe un fotn, se genera un voltaje en sus extremos, que puede ser medido directamente.
En el caso de efecto fotoconductivo, la absorcin de un fotn resulta en una variacin de la conductividad (inverso de la resistencia) del fotodiodo, que puede ser medida con un circuito adecuado.
CCD Un CCD es dicho de manera muy simple una matriz (CCD Array) de fotodiodos, de dimensiones definidas como se indica a continuacin: Denominacin 1 Pulgadas 2/3 Pulgadas 1 / 2 Pulgadas 1/3 Pulgadas Horiz. (mm) 12.8 8.8 6.4 4.8 Vert.(mm) 9.6 6.6 4.8 3.6 Diag.(mm) 16 11 8 6

Hace 3-4 aos Uno de los mas comnmente usados (el CCD 2/3 Pulgadas) consta de un arreglo de 768 x 480 fotodiodos, de esto va a depender la calidad de la imagen. Segn sea el material utilizado, la sensibilidad puede ir desde el azul (400 nm) hasta el infrarrojo mediano (2400 nm). 768 x 480 = 368640 pixeles = 0.35 Megapixeles Hoy Cmara mas simple 1.3 Megapixeles, idealmente >= 2Mp

Existen cmaras con 1 CCD y con 3 CCD, resultando relevante en la calidad del color. 3CCD: cada fotodiodo se encuentra triplicado (RGB)

Pensemos el caso simple que tenemos un detector para un solo color de luz, por ejemplo Azul:
0 < V <= 5 Volts = Blanco 5 < V <= 10 Volts = Azul Cada pixel de la pantalla puede ser representado por una variable de 2 estados (binaria) que pueden ser 0 1 en la memoria de video del computador, esto es lo que se conoce como 1 bit de informacin, un conjunto de 8 bits conforman 1 byte de informacin.

Si ahora disponemos de un monitor y tarjeta de video capaz de desplegar colores, y quisiramos mejorar la calidad de nuestra imagen, podramos por ejemplo pensar en dividir el espectro de color en 4 intervalos:
-00 = 0x2^1 + 0x2^0 = 0 -01 = 0x2^1 + 1x2^0 = 1 -10 = 1x2^1 + 0x2^0 = 2 -11 = 1x2^1 + 1x2^0 = 3 -Cada pixel requiere ahora 2 bit de memoria.
Ajuste de Histogramas Reduccin de ruido Filtro Unsharp
Hctor A. Vega Cruz

Funcin Inversa:
50 # de pixeles 40 30 20 10 0 0 100 200 300 Color (0 - 255)
Original
Filtrado
p = 255 - m

Funcin Cuadrada:
50
p = m^2 / 255
# d e p ixe le s
40 30 20 10 0 0 100 200 300 Color (0 - 255)
Original
Filtrado

Funcin Cbica:
50 # de pixe le s 40 30 20 10 0 0 100 200 300 Color (0 - 255)
Original
Filtrado
p = m^3 / 255^2

Funcin Raz Cuadrada: p = sqrt(255*m)
50 # de pixeles 40 30 20 10 0 0 100 200 300 Color (0 - 255)
Original
Filtrado

Funcin Raz Cbica: p = (255*255*m)^(1/3)
50
# de pixeles
40 30 20 10 0 0 100 200 300 Color (0 - 255)
Original
Filtrado

Funcin Logartmica:
50 # de pixe le s 40 30 20 10 0 0 100 200 300 Color (0 - 255)
Original
Filtrado
p = 255*(ln(1+m)/ln(1+255))

Consideremos una lnea de 10 pixeles, con ruido: 50 50 0 50 50 50 50 255 50 50
300 200 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 P ixe le s

Filtrando a primeros vecinos se obtiene: 50 50 0 50 50 50 50 255 50 50 50 33 33 33 50 50 118 118 118 50
300 200 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 P ixe le s

Filtrando a segundos vecinos se obtiene: 50 50 0 50 50 50 50 255 50 50 33 37 40 40 40 91 91 91 101 118
300 200 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 P ixe le s

Filtro Unsharp: g(x,y) = f(x,y) - fsuavizada(x,y)
ANEXOS
Universidad de Chile Facultad de Ciencias Fsicas y Matemticas IDIEM
SEMINARIO ID42A CIENCIA DE LOS MATERIALES II MICROSCOPIA ELECTRNICA DE BARRIDO
Profesores: Vctor Poblete P. Mauricio Pilleux C. Integrantes: Cristian Ibarra Fernndez Rodrigo Muoz Ortzar Marcelo Ramrez Salgado
4/05/2001
1.- Historia de la Microscopia Desde la antigedad el hombre ha buscado la forma de poder aumentar su poder de resolucin y de hacer visible lo invisible. Con este propsito se descubren las lentes y con la combinacin de ellas se obtienen imgenes de mayor resolucin. Nace el microscopio de luz y se comienza a incursionar en el mundo microscpico de la naturaleza. EL Holands Van Leeuwenhoeck, entre los aos 1660-1690, usando un sistema de lentes consigui fabricar microscopios de 200 aumentos aproximadamente, con los que se observo glbulos rojos, protozoos, bacterias y otros microorganismos. En la misma poca el ingles Robert Hooke desarrollo el microscopio compuesto de Galileo, con el descubri la clula. Con el paso de los aos el progreso no solo se realizo en el desarrollo de los microscopios sino tambin en el refinamiento de las tcnicas de preparacin de muestras lo que permiti un anlisis cada vez mas fino de las distintas estructuras observadas. En 1873 Ersnt Abbe, fsico y profesor de Jena, imprimo un gran impulso a la ptica terica y practica al concluir que el aumento de un microscopio depende ms de la longitud de onda de la luz que de la calidad del sistema ptico. Gracias a los trabajos de Luis de Brglie en 1924 sobre mecnica ondulatoria y la generacin de longitudes de onda 10000 veces mas pequeas que la longitud de onda de la luz visible, permiti el surgimiento del germen de un nuevo tipo de microscopio, el microscopio electrnico. De Brglie demostr que asociado a cualquier movimiento rpido de partculas, existe una nueva forma de radiacin, de pequea longitud de onda. De Brglie extendi la idea de una naturaleza ondulatoria-corpuscular (cuantica) de la luz, a otros tipos de radiaciones, como los rayos catdicos, andicos, inicos, X, etc. En otras palabras comprob que los electrones respondan tambin a las caractersticas de las radiaciones ondulatorias.
La ecuacin fundamental de la mecnica cuantica expresa que la longitud de onda de una partcula en movimiento es funcin de su velocidad y de su masa: = h/mv h: cte de Planck m: masa del electrn v: velocidad Como la velocidad depende del potencial acelerador en el caso de los electrones, se puede decir que la longitud de onda asociada al electrn solo es funcin del voltaje. Analizando datos experimentales se obtiene que la longitud de onda efectiva de un haz electrnico es aproximadamente 100000 veces menor que la onda de la luz visible. En 1926, Bus descubre que los rayos electrnicos son refractados por campos magnticos, de forma similar a la refraccin de la luz por las lentes de vidrio, y adems demuestra que las leyes geomtricas de la ptica son obedecidas tambin por los sistemas electrnicos. La idea de utilizar estos descubrimientos en un microscopio de alta resolucin no surgi de inmediato. No esta claro quien fue el de la idea original, sin embargo alrededor de 1930 un grupo de alemanes del instituto tcnico de Berln (Ruska, Knoll, Von Borries y otros) construyo el primer microscopio electrnico, y la primera patente surge en 1931, firmada por Redenberg de la Siemens. En 1932, Knoll y Ruska publican una descripcin del primer microscopio electrnico de transmisin (MET), el que puede ser considerado el prototipo de los instrumentos modernos, este microscopio constaba de una fuente de electrones y dos lentes electromagnticas sin condensador, aunque este instrumento proporcionaba una resolucin inferior a la de un buen microscopio ptico con el se logro obtener las primeras electro micrografas. En 1934 Ruska describe una versin corregida a la que aade una lente condensadora, este modelo fue el primero en sobrepasar el poder de resolucin del microscopio fotonico. Aunque con este microscopio se obtuvieron algunas imgenes algunos especimenes se carbonizaban producto del intenso bombardeo electrnico. A pesar de lo anterior Ruska
logro en 1934 una resolucin cinco veces mayor al poder de resolucin del microscopio ptico. Lo anterior dio pie para que nuevos investigadores buscaran mejoras al microscopio de Ruska, lo que llevo a la obtencin de mejores resoluciones. En 1938, Von Borries y Ruska construyeron un aparato de diseo avanzado, con el que se obtienen resoluciones de hasta 100 Angstrom En 1939 la firma Siemens-Halske inicia la produccin comercial del instrumento diseado por Von Borries y Ruska. En 1939 Mahl construye el primer microscopio electrnico electroesttico y la firma AEG se encarga de la produccin de un nmero limitado de ellos. Con el comienzo de la segunda guerra mundial se interrumpi la comercializacin de estos instrumentos, pero luego de su fin se reinicio la construccin masiva de estos microscopios en las firmas Siemens y AEG-Zeiss de Alemania, RCA de Estados Unidos, Phillips de Holanda, Hitachi de Japn, etc En 1955 se llega a resoluciones de 10 Amstrong, aumentos de 250000 x y voltajes aceleradores de 10000 voltios. Todo esto da comienzo a la era de la Microscopia Electrnica. El microscopio electrnico proporciona informacin directa de las estructuras que oscilan entre 0,2 y 200 nm, lo que aumenta extraordinariamente las posibilidades de investigacin en las distintas ramas de la ciencia.
2.- Microscopio Electrnico de Barrido ( MEB). La emisin secundaria se utiliza en la construccin de la imagen en el MEB, el cual a diferencia de los MET, posee un haz mvil de electrones que barre o recorre el espcimen en reas seleccionadas. La microscopia electrnica de barrido, en sus diversas modalidades, surge en forma experimental entre los aos 1930 y 1940, en Alemania. En 1935, Knoll propone un instrumento bastante similar a los actuales, destinado a estudiar fenmenos de emisin secundaria. En 1938, Von Ardenne disea un nuevo tipo de microscopio, con el objeto de estudiar muestras relativamente gruesas. Este instrumento operaba con lentes electrostticas y barrido electromagntico, pero careca de dispositivos de amplificacin y pantalla de observacin. El haz de electrones atravesaba la muestra e incida directamente sobre una placa fotogrfica que se desplazaba en sincrona con el haz, pero a mayor velocidad. Las imgenes en este instrumento slo podan observarse una vez obtenida las placas fotogrficas. Von Ardenne sugiri tambin la posibilidad de observar la superficie de cuerpos opacos, recogiendo y amplificando los electrones secundarios emitidos por ellas, para modular la intensidad del haz de un tubo de rayos catdicos. En 1942, Zworokin, Hillier y Zinder disearon un microscopio con el cual se observaban directamente superficies de muestras metlicas, y publicaron las primeras micrografas electrnicas de barrido. Estos estudios se descontinuaron durante la Segunda Guerra Mundial, pero resurgieron en 1948 en un programa bajo la direccin de C.W. Oatley en el Laboratorio de Ingeniera de la Universidad de Cambridge, donde se iniciaron una serie de proyectos que permitieron grandes avances. En 1952 McMullan disea un microscopio con importantes adelantos. Utiliza una tensin de aceleracin mayor, se reducen los efectos de contaminacin y se introduce un nuevo tubo fotomultiplicador que mejora considerablemente la calidad de la imagen. La observacin de la imagen se efectuaba en un tubo de rayos catdicos de larga persistencia. Este microscopio es modificado luego por Smith, quien en 1959 consigue micrografas de muy buena calidad. Como resultado de estas investigaciones, entre los aos 1963 y 1965, surgen los primeros microscopios electrnicos de barrido comerciales, que
alcanzaban unos 250 de resolucin. Actualmente se desarrollan a escala comercial microscopios que garantizan una resolucin de 35-100 ( 3,5-10 nm ).
Descripcin del Microscopio Electrnico de Barrido ( MEB ). Un MEB moderno consta esencialmente de las siguientes partes : Una unidad ptica-electrnica, que genera el haz que se desplaza sobre la muestra. Un portamuestra, con distintos grados de movimientos. Una unidad de deteccin de las seales que se originan en la muestra, seguida de un sistema de amplificacin adecuado. Un sistema de visualizacin de las imgenes (tubo de rayos catdicos). Un sistema de vaco, un sistema de refrigeracin y un sistema de suministro elctrico, relativamente similares a los del MET. Un sistema de registro fotogrfico, magntico o de video. Un sistema de procesamiento de la imagen con ayuda computacional (optativo).
Sistema de Vaco. Si se desea obtener un haz uniforme de electrones, es necesario mantener la columna del microscopio a un alto vaco. Se denomina sistema de vaco al conjunto de dispositivos y procedimientos que se utilizan para este fin. Un alto vaco corresponde a una baja presin, y la unidad que se utiliza es el mmHg o Torr. Se recomienda utilizar el Pascal (Pa), que es la fuerza de presin que ejerce un Newton sobre 1 m2 ( 1 atmsfera = 101325 Pa ). La columna debe mantener un alto vaco, bsicamente por cuatro razones: 1.- Para permitir el desplazamiento de electrones. Como la distancia entre el can de electrones y la pantalla es de aproximadamente un metro, se debe evacuar el gas de toda la columna. En caso contrario, los electrones seran dispersos o detenidos por molculas de gas, dada la escasa energa cintica de ellos. La forma ideal de trabajo sera remover todo el
aire de la columna, pero esto es imposible. Gases, principalmente aire y vapor de agua, penetran en el sistema y deben extraerse continuamente. La mayora de los microscopios operan con un vaco del orden de 1,33x10-4 Pa; en estas condiciones, un electrn puede viajar tericamente unos 2,5 m antes de encontrar molculas de gas. Un alto vaco correspondiente aproximadamente a 10-5 Torr. Se considera bajo vaco aquel comprendido entre 10 a 10-3 Torr. Un muy buen vaco es 10-6 Torr; un cm3 de aire a esta presin contiene aproximadamente 10x1010 molculas. 2.- Para evitar descargas de alta tensin en el can electrnico. Cualquier molcula de gas presente entre el filamento y la placa andica se convierte en un in positivo al ser bombardeado por los electrones. Esto producira una descarga elctrica entre el filamento y el nodo, lo que impedira la formacin de un haz estable de electrones, adems de interferir en el contraste de la imagen. 3.- Para evitar contaminacin del espcimen y de las aberturas. Los gases residuales se condensan en el espcimen y lo contaminan. 4.- Para incrementar la vida til del filamento. A bajo vaco, la vida del filamento se reduce significativamente por oxidacin del tungsteno. Esta oxidacin tambin afecta la eficiencia de filamento para emitir electrones. Se ha comprobado experimentalmente que una presin de gas del orden de 10-4 mm de mercurio es suficiente para que la dispersin electrnica sea mnima, la duracin del filamento aceptable y no se produzcan descargas. El vaco de la columna se obtiene con diversos tipos de bombas: bomba mecnica o rotatoria, bombas de difusin de aceite o de mercurio, bombas termoinicas, turbomoleculares, etc. Es difcil crear un alto vaco en una sola etapa. Por lo tanto se utiliza un sistema donde se emplean diferentes tipos de bombas, en serie. Esto es factible gracias a una serie de vlvulas de distribucin, cuyo movimiento es automtico, en los modelos nuevos, y manual en los antiguos. En una primera etapa se crea un pre-vaco de ~ 10-1 a 10-3 Torr, que se obtiene con una bomba mecnica de rotacin, de gran capacidad pero de bajo rendimiento. En la segunda etapa, se obtiene un alto vaco de aproximadamente 10-5 Torr, por medio de dos bombas difusoras que funcionan con vapores de Hg una, y vapores de aceite, la otra.
Las bombas difusoras deben funcionar continuamente mientras el microscopio est trabajando, por as pequeas fugas de aire que puedan existir, y porque constantemente se producen gases que conviene eliminar ininterrumpidamente. Por muy bueno que sea el sistema de bombas utilizado, es difcil obtener un vaco perfecto, ya que siempre existe gas residual. Por ejemplo, a temperatura ambiente y a una presin de 10-8 mm de mercurio, el nmero de molculas por cm3 es de aproximadamente 3x108, y a temperatura ambiente y presin atmosfrica existen alrededor 3x1019 molculas por cm3. Es decir, se extraen millones de molculas por cm3. Las condiciones de presin del microscopio se controlan utilizando diferentes tipos de manmetros entre ellos: tubos de descarga de gases y manmetros trmicos, como el Pirani y el Penning. Estos ltimos se basan en el hecho que la conduccin trmica en gases a bajas presiones, es funcin de la concentracin molecular. Con el objeto de eliminar la necesidad de ventilar y reevacuar toda la columna despus de cada cambio de espcimen o pelcula fotogrfica, se incorporan al sistema una serie de vlvulas que permiten que ciertas secciones de la columna sean aisladas de las restantes. As, slo estas reas vuelven a la presin atmosfrica y pueden ser rpidamente reevacuadas, y luego conectadas al resto de la columna.
Sistema de refrigeracin. Es un sistema que permite enfriar tanto las bombas difusoras ( que generan considerable cantidad de calor ), como las propias lentes, que tambin se calientan cuando pasa a travs de ellas una corriente elctrica. Esto se consigue haciendo circular a su alrededor agua tratada, filtrada y refrigerada. Deber existir una unidad de refrigeracin con bombas de agua que permitan el movimiento de sta a travs del sistema. Las lentes de caractersticas ms crticas disponen de un serpentn interior, por el cual circula una corriente de agua, que estabiliza su temperatura. De esta forma se evitan pequeas pero importantes dilataciones de sus elementos.
Unidad ptico-electrnica. Esta unidad incluye un can electrnico, un sistema de barrido y un sistema de lentes electromagnticas que producen un haz finamente colimado. Can electrnico: La fuente emisora de electrones ms utilizada es un filamento de tungsteno que se calienta al rojo-blanco por medio de una corriente elctrica, en un vaco del orden de 10-5 Torr. Entre el nodo acelerador y el filamento se coloca un electrodo adicional, llamado cilindro de Wehnelt o placa catdica, que permite que los electrones emitidos por el filamento se focalicen en un punto ligeramente por debajo del cilindro de Wehnelt. Con un diseo adecuado y un potencial convenientemente elegido, se puede lograr una zona de entrecruzamiento de dimetro menor que el dimetro de la zona emisora de electrones en el filamento. En efecto, mientras esta ltima es del orden de 90 m, la zona de entrecruzamiento puede llegar a unos 10 m. El voltaje de aceleracin de los electrones puede variar entre 0,5 y 50 kV, dependiendo de las caractersticas de las muestras a observar. La intensidad de la corriente del haz flucta entre 10-7 y 10-12 Ampere. Es posible obtener una fuente electrnica ms brillante y de mayor duracin utilizando un ctodo de hexaboruro de lantano ( LaB6 ), pero requiere un vaco de aproximadamente de 10-7 Torr. Si se desea aumentar la emisin electrnica, se puede aumentar la temperatura de trabajo del emisor. Pero en la prctica este mecanismo tiene un lmite, dado por la resistencia mecnica del filamento y la duracin del mismo. Otra forma de aumentar la emisin es utilizar el llamado ctodo fro. Este nuevo can electrnico est compuesto fundamentalmente por un ctodo de tungsteno de punta muy aguda, y un nodo situado muy cerca del ctodo conectado a un potencial positivo. El campo elctrico resultante, de aproximadamente 107 volt/cm sobre la punta, es suficiente para arrancar electrones de la misma. En esta forma, se obtiene un brillo considerablemente mayor que el producido por una emisin termoinica. Este tipo de can electrnico requiere de un vaco de aproximadamente 10-10 Torr.
Sistemas de lentes electrnicas: el microscopio electrnico de barrido emplea dos, tres o cuatro lentes electromagnticas, cuya funcin es disminuir el dimetro del haz de electrones de aproximadamente de 50 m en su origen, a valores comprendidos entre 25 y 10 nm al incidir sobre la muestra. As se obtiene un haz de electrones extremadamente fino y, de acuerdo con el voltaje de aceleracin, penetra un poco en el espcimen, determinando un volumen de interaccin haz/objeto de una forma aproximada, de donde se desprenden electrones secundarios, retrodifundidos y rayos X, adems de otras radiaciones. La resolucin de un microscopio electrnico de barrido est directamente relacionada con las dimensiones de la zona de muestra que es excitada por el haz primario. La intensidad de las seales emitidas est influida por las dimensiones de las zonas de donde ellas se generan, y por la absorcin por la muestra misma, lo que a su vez est determinado por la composicin de la muestra y la energa de los electrones del haz incidente. Como la energa de los electrones secundarios es muy baja ( 10-50 eV ), stos son totalmente absorbidos al atravesar una distancia del orden de 10 nm y por lo tanto, slo una pequea parte del volumen contribuye a emitir electrones secundarios que pueden llegar al detector. Las dimensiones de esta seccin son ligeramente mayores que el dimetro del haz incidente. Reduciendo el dimetro del haz que incide sobre la muestra, se reducen las dimensiones del volumen excitado, y se mejora la resolucin. Pero esto tiene un lmite. Normalmente el haz de un microscopio de barrido tiene unos 8 nm de dimetro, y la resolucin obtenida es de aproximadamente 10 a 20 nm, dependiendo de la naturaleza y condiciones de la muestra tanto como el voltaje de la operacin y tamao de la abertura del diafragma. La resolucin de la imagen de electrones secundarios se reduce al disminuir la tensin de aceleracin de los electrones incidentes. En la resolucin influyen tambin otros factores como el tipo de muestra, el tipo de electrones con que se trabaja, el tiempo de exposicin, la contaminacin, las vibraciones elctricas y mecnicas, etc.
Sistema de barrido: este sistema consiste en un campo de deflexin simple o doble, que puede ser electrosttico o electromagntico, y que produce el desplazamiento del haz
electrnico sobre la superficie de la muestra. Este campo se localiza cerca de la ltima lente condensadora, mal llamada objetiva, en algunos casos. El haz de electrones se mueve en lneas rectas superpuestas, barriendo la superficie del espcimen en un rea rectangular. La misma seal que se aplica a las bobinas deflectoras, se utiliza para barrer en forma sincronizada el haz del tubo de rayos catdicos, producindose as una correspondencia punto a punto, entre la superficie de la muestra, que es barrida por el haz de electrones y la pantalla donde se observa la imagen. Este sistema es similar al de la televisin, pero con velocidades de barrido ms bajas. El tiempo de barrido oscila entre 0,5 y 500 segundos, indicando con estos valores el tiempo que demora el haz parar barrer verticalmente la zona de la muestra que se est observando en la pantalla. Usualmente se trabaja con un tiempo de barrido de 10 segundos, durante la observacin preliminar de la muestra. Las fotografas se toman con un tiempo de 50 segundos, con lo cual se tiene un mayor nmero de lneas de barrido, y por lo tanto, una mayor definicin.
Portaespcimen La cmara portaespcimen est situada en la base de la columna del microscopio y en lnea con el haz electrnico. La pieza o platina que sostiene el espcimen permiten varios movimientos: a) desplazamiento en coordenadas rectangulares ( ejes X e Y ) en un plano a lo largo de la superficie observada de la muestra. b) Movimiento de rotacin sobre el propio plano de la muestra ( en 180 ) y movimiento de inclinacin en el plano horizontal entre ( -5 y +45 ). Esto permite inclinar el espcimen, tomando como eje cualquier punto que se que se est observando. Tambin es posible inclinar el espcimen sin necesidad de variar el enfoque, lo que es indispensable si se desea tomar un par estereoscpico de fotografas. Existen diferentes tipos de portamuestras, segn el tamao del espcimen a observar. Es preferible usar un portamuestra ms pequeo con una distancia de trabajo menor, y obtener as mayor resolucin. Dispositivos anexos permiten calentar la muestra por medios
elctricos, o bien enfriarla por medio del sistema de dedo fro. Es posible tambin tensarla o comprimirla mecnicamente.
Sistema de deteccin. La emisin secundaria surge cuando el haz primario tiene energa de varios de cientos de electrn volts. Si bien en un principio la corriente secundaria es proporcional a esa energa, llega un momento que nuevos incrementos energticos del haz primario saturan la superficie emisora, estabilizndose la salida de electrones, e incluso disminuyendo si la energa aumenta excesivamente. Cada material presenta un coeficiente de emisin secundaria () que es caracterstico, y que se define como la relacin entre los electrones emitidos por la superficie respecto a los primarios que la impactan. Los electrones secundarios son de menor energa que los primarios, y por esta razn, an cuando se produzcan profundamente, slo pueden abandonar la muestra los que se generan muy superficialmente (< 50 ). Los electrones secundarios que se desprenden de cada punto, se detectan mediante un cristal de centello, cuya superficie se mantiene a un potencial positivo de 10 a 12 kV. Este cristal est unido al extremo de un bastn de Lucita, que tiene el otro extremo descansando contra la ventana del tubo fotomultiplicador. As, los electrones secundarios colectados alcanzaran un centellador, donde se origina una seal luminosa que, amplificada por un fotomultiplicador, se convierte en una cascada de fotones. Estos fotones inciden en el fotoctodo, que es parte del fotomultiplicador, y se genera finalmente una seal elctrica amplificada, capaz de modular el haz de un tubo de rayos catdicos, obtenindose de esta forma un punto correspondiente de la imagen. El alto voltaje que se aplica a la grilla del detector hace que los electrones secundarios, de baja energa, recorran una trayectoria curva al dejar la superficie de la muestra. Esto permite obtener seales an de regiones muy inclinadas con respecto al detector, adems de acelerarlas en direccin a l. Esto no sucede en el caso de electrones retrodifundidos, que viajan en lnea recta produciendo imgenes de contraste muy marcado con efectos de luz y
sombra bien definidos. Tanto electrones secundarios como retrodifundidos son captados por un mismo detector. La variacin de intensidad de las seales generadas por la muestra se convierten en seales elctricas, lo que permite obtener imgenes en un microscopio de barrido. No es una imagen ptica de superficie, pero si una buena aproximacin.
Sistema de proyeccin o visualizacin de las imgenes. Las imgenes se proyectan en dos tubos de rayos catdicos de alta resolucin, que funcionan en sincronizacin con el barrido electrnico de la muestra. Uno de ellos, para observacin visual, tiene una pantalla de gran persistencia. Fijando el tiempo de barrido en 10 segundos, se obtiene una imagen de 500 lneas. La pantalla del segundo tubo es azul, para registro fotogrfico y de baja persistencia. Adosada a esta segunda pantalla va la cmara fotogrfica. Aqu se utiliza un barrido ms lento, de 1000 o ms lneas. Cuando mayor sea el nmero de lneas en la pantalla fotogrfica, mayor ser la resolucin de la imagen final. Las dos pantallas pueden tener el mismo tamao (100x100nm), siendo ste el tamao mximo de la imagen, la cual puede reducirse hasta un mnimo de 10 x 10 mm, en cualquier parte de la pantalla fluorescente. Al modular la intensidad del tubo de rayos catdicos con la seal elctrica dada por los detectores, se obtiene en la pantalla una especie de imagen de la muestra. Es decir, en la pantalla se describe la variacin de un tipo dado de emisin producida por la superficie de la muestra barrida por efecto del haz primario. A = largo pantalla / largo de la regin barrida. El aumento lineal de esta imagen obtenida con un sistema de haces mellizos, es simplemente una relacin de tamao de los rastreos sincrnicos. En otras palabras, el aumento est dado por la relacin entre el ancho de la pantalla de observacin y la amplitud de la zona barrida por el haz primario. Para altos aumentos, la regin barrida del espcimen
es muy pequea comparada con la regin rastreada en la pantalla fluorescente. El MEB permite un rango de aumentos que va desde 15 a 100000 veces, dependiendo de la naturaleza y la forma del material examinado.
Imgenes obtenidas por electrones secundarios: Se ha demostrado que un cambio de inclinacin de la superficie de una muestra con respecto al haz electrnico incidente, an de pocos grados, produce una variacin apreciable en el nmero de electrones secundarios emitidos. As, un borde agudo o una protuberancia sobre la superficie generan un gran nmero de electrones secundarios. Lo mismo sucede si se trata de un escaln profundo sobre la superficie de la muestra. Las hendiduras o depresiones producen menos electrones detectables. Estos hechos deben considerarse al analizar las imgenes obtenidas. Los efectos de variacin de la emisin secundario en funcin de las caractersticas topogrficas de una superficie, permiten que se pueda interpretar la imagen de electrones secundarios como una imagen ptica de dicha superficie. Entre los factores que influyen en el contraste de una imagen podemos mencionar: a.-El ngulo de incidencia del haz electrnico sobre la superficie. Este es un factor determinante en la emisin de electrones secundarios: cuanto ms rasante sea el haz, ms electrones sern emitidos, ya que solamente los electrones originados en regiones muy prximas a la superficie pueden ser captados por el detector. b.-La composicin qumica del material en estudio. En las imgenes de electrones secundarios tambin se observan variaciones de contraste, debido a diferencias en la estructura atmica, ya que aparte de los electrones que llegan al detector son en realidad electrones secundarios producidos por electrones previamente retrodifundidos. Las imgenes obtenidas con electrones secundarios son de gran utilidad para estudios topogrficos y como hemos mencionado, sus trayectorias son curvas, de modo que la imagen aparece con sombras suaves y difusas; en un segundo plano se observan las depresiones o reas escondidas.
3.-Evolucin del microscopio electrnico de barrido
Todos los microscopios electrnicos cuentan con varios elementos bsicos. Disponen de un can de electrones que emite los electrones que chocan contra el espcimen, creando una imagen aumentada. Se utilizan lentes magnticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones. El sistema de vaco es una parte relevante del microscopio electrnico. Los electrones pueden ser desviados por las molculas del aire, de forma que tiene que hacerse un vaco casi total en el interior de un microscopio de estas caractersticas. Por ltimo, todos los microscopios electrnicos cuentan con un sistema que registra o muestra la imagen que producen los electrones. Cuando un haz de electrones interacta con un espcimen determinado, este puede transmitir los electrones que inciden en el, reflejarlos, absorberlos, emitir electrones secundarios, producir calor, fotones, rayos X, o bien emitir electrones cargados positivamente. Los electrones que atraviesan la muestra sin ser afectados se denominan electrones primarios. Gran parte de ellos modifican su trayectoria sin cambiar su energa, (dispersin elstica) y otros electrones sufren cambios en ella. (dispersin inelstica) La interaccion entre electrones puede producir diferentes fenmenos: Desprendimiento de electrones del tomo que son emitidos como electrones libre y debido a su baja energa, solo aquellos cercanos a la superficie pueden ser acelerados y ser captados por un detector. En lugar de desprenderse de la muestra los electrones excitados saltan a un nivel energtico superior y volver a su estado de energa estable, emitiendo la diferencia de energa en forma de rayos X, luz visible o electrones Auger. Una porcin de electrones puede ser reflejada en ngulos prximos a los 180. Estos electrones que han perdido parte de su energa se denominan retrodifundidos.
Por otro lado el haz de electrones puede ser fijo, de 1m a 1mm de dimetro, o mvil, que recorre punto por punto la muestra, de 2 a 200 ngstrom. Basndose en los diferentes tipos de interacciones entre el haz de electrones y los tomos de la muestra, y las distintas seales a que dan origen se han desarrollado distintos instrumentos de anlisis. Hay dos tipos bsicos de microscopios electrnicos: el Microscopio Electrnico de Transmisin, MET (Transmission Electron Microscope, TEM) y el Microscopio Electrnico de Barrido, MEB (Scanning Electron Microscope, SEM). Un MET utiliza un haz fijo de electrones, y en la formacin de la imagen se aprovechan los electrones primarios, por esta razn solo es posible obtener imgenes de muestras lo suficientemente delgadas como para transmitir entre el 50% y 90% de los electrones que inciden el ella, de aproximadamente 0.1m de espesor. Se han desarrollado microscopios electrnicos de alto voltaje de 200KV hasta 3MeV donde es posible observar preparados de hasta 5m. Sus principales ventajas son: Alto poder de penetracin de los electrones, para muestras ms gruesas. Menor dao que sufre el espcimen, dado que el tiempo de interaccin del haz y los tomos de la muestra es menor por la velocidad de los primeros. Alta resolucin en muestras gruesas.
Otro ME que utiliza un haz fijo es el de Reflexin, que aprovecha los electrones reflejados. Sin embargo da imgenes de baja resolucin. Un MEB crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto, utilizando un haz mvil de electrones que recorre la muestra en reas seleccionadas. No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. El MEB explora la superficie de la imagen punto por punto, al contrario que el MET, que examina una gran parte de la muestra cada vez. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisin. Los
electrones del haz pueden dispersarse al alcanzar la muestra o provocar la aparicin de electrones secundarios. Los electrones dispersados y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrnico situado a los lados del espcimen. Cada punto ledo de la muestra corresponde a un pxel en un monitor de televisin. Cuanto mayor sea el nmero de electrones contados por el dispositivo, mayor ser el brillo del pxel en la pantalla. A medida que el haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los microscopios electrnicos de barrido pueden ampliar los objetos 100.000 veces o ms. Este tipo de microscopio es muy til porque, al contrario que los MET o los microscopios pticos, produce imgenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto. Se han desarrollado otros tipos de microscopios electrnicos. Un microscopio electrnico de barrido y transmisin (Scanning Transmission Electron Microscope, STEM) combina los elementos de un MET y un MEB, ya que utiliza un haz de electrones mvil para recorrer una muestra delgada, para luego captar los electrones primarios transmitidos. Otro tipo de MEB es el microscopios de sonda de barrido que utiliza una sonda que recorre la superficie de una muestra, proporcionando una imagen tridimensional de la red de tomos o molculas que la componen. La sonda es una afilada punta de metal que puede tener un grosor de un solo tomo en su extremo. Un tipo importante de microscopio de sonda de barrido es el microscopio tnel de barrido (siglas en ingls de Scanning Tunnelling Microscope, STM) desarrollado en 1981. Este microscopio utiliza un fenmeno de la fsica cuntica, denominado efecto tnel, para proporcionar imgenes detalladas de sustancias conductoras de electricidad. La sonda se coloca a una distancia de pocos ngstrom de la superficie del material y se aplica un voltaje pequeo entre la superficie y la sonda. A causa de la poca distancia entre el material y la sonda, algunos electrones se escapan a travs del hueco, generando una corriente. La magnitud de la corriente del efecto tnel depende de la distancia entre la superficie y la sonda. El flujo de corriente es mayor cuando la sonda se acerca al material y disminuye cuando se aleja. A medida que el mecanismo de barrido mueve la sonda por encima de la superficie, se ajusta de modo automtico la altura de la sonda para mantener constante la corriente del efecto tnel. Estos ajustes minsculos permiten dibujar las ondulaciones de la superficie.
Despus de muchas pasadas hacia adelante y hacia atrs se utiliza una computadora para crear una representacin tridimensional del material. Otro tipo de microscopio de sonda de barrido es el microscopio de fuerza atmica (Atomic Force Microscope, AFM), que no emplea la corriente de efecto tnel y que, por tanto, se puede utilizar tambin en materiales no conductores. A medida que la sonda se mueve a lo largo de la superficie de la muestra los electrones de la sonda de metal son repelidos por las nubes electrnicas de los tomos de la misma. La altura de la sonda se ajusta de modo automtico para mantener constante la fuerza de repulsin. Un sensor registra el movimiento ascendente y descendente de la sonda y entrega la informacin a una computadora, que a su vez la utiliza para dibujar una imagen tridimensional de la superficie del espcimen. Un instrumento que se ha desarrollado para el anlisis de muestras a travs de un ME es el microanalizador de rayos X. El microanlisis de rayos X se basa en la excitacin de los electrones presentes en una muestra, para producir un espectro de rayos X caracterstico, ya que cada elemento presenta una distribucin definida de electrones en sus tomos. El microanalizador de rayos X se anexa al ME(T/B) con el objeto de detectar dichas longitudes de onda y determinar en forma precisa la composicin de la muestra en estudio. En anlisis qumico tanto cualitativo y cuantitativo puede hacerse a muestras biolgicas o metales, minerales, semiconductores, etc.
4.- Aplicaciones Actuales Junto con el desarrollo de la microscopia electrnica, el campo de aplicacin de la misma se ha ido extendiendo, a continuacin se detallan algunas aplicaciones del microscopio electrnico de barrido.
Ciencia e Ingeniera de Materiales: -Caracterizacin morfolgica y analtica de materiales -Estudio de superficies -Procesos de difusin -Segregacin -Anlisis de fallos -Control de calidad -Irregularidades de piezas fabricadas en cadena
Geologa: Una eficaz ayuda en estudios geomtricos y morfolgicos relacionados con la mineraloga y metalurgia. El microscopio electrnico de barrido -SEM- es el mejor mtodo adaptado al estudio de la morfologa de las superficies. A diferencia de un microscopio ptico que utiliza fotones del espectro visible , la imagen entregada por el SEM se genera por la interaccin de un haz de electrones que "barre" un rea determinada sobre la superficie de la muestra. La trayectoria del haz pasa por una serie de lentes electromagnticos que lo desmagnifican y focalizan, de modo que, cuando el haz finalmente incide sobre la muestra tiene un dimetro de slo 10 cm. El bombardeo de electrones sobre la muestra produce varias formas simultneas de radiacin, entre ellas, la emisin de electrones secundarios. La deteccin de esa seal en un gran nmero de puntos sobre el rea barrida, previa transformacin electrnica, genera la imagen que se visualiza en una pantalla de TV o es fotografiada mediante una cmara adosada al equipo. La excelente resolucin (4nm) y la gran profundidad de foco (del orden
de 2 micrones) permiten la aplicacin del SEM a disciplinas del mbito geolgicometalrgico, biotecnologa y ciencia de los materiales. -Textura de rocas y minerales -Identificacin de minerales y sustancias sintticas
Metalurgia: -Observacin de composicin de materiales -Fenmenos de difusin -Composicin de aleaciones -Crecimiento de granos -Estudios de corrosin de metales y aleaciones
Biologa: -Observacin de los distintos organelos intracelulares -Diferenciacin de clulas -Estructura y ultra estructura de tejidos y rganos animales y vegetales -Inmunocitolocalizacin de macromolculas -Patologas animales y vegetales -Estudios forenses (bsqueda de partculas, tejidos, hilos, semen)
Otros: -Biodeterioro de obras de arte
Bibliografa Serie Cientfica Avanzada: El microscopio Electrnico Centro de Extensin Biomdica Facultad de Medicina Universidad de Chile M. L. Lpez Enciclopedia Microsoft Encarta 2000 http://www.biologia.arizona.edu/cell/tutor/cells/cells2.html http://usuarios.iponet.es/jan3d/3d3/Fotografia_cientifica_en_tres_/fotografia_cientif ica_en_tres_.html http://club.idecnet.com/~modegar/video/comoseve/HowLDsLookLike.htm http://www.cedex.es/lceym/eq_labce/eq_cmmeb.html http://www.uma.es/Investigadores/servinv/microscopia.html Instituto de Geologa econmica aplicada http://www.udec.cl/gea/esp/sem.htm
ANEXOS
Deteccin Citoqumica de Polisacridos: Lectinas y su utilizacin en Citoqumica Ultraestructural.

En tejidos como los epitelios, las clulas que los componen es posible que a travs de molculas expresadas en la superficie celular, puedan reconocer otras molculas que forman parte de la matriz extracelular; es importante entonces recordar la organizacin de sta para comprender el modo de trabajo en microscopa electrnica. La superficie celular (cualquiera sea el tipo de clula de entre todas las que nos constituyen), incluso en tejidos constituidos por un mismo tipo celular; este es el caso del hgado, que a microscopa ptica nos parece similar. Sin embargo, los anlisis bioqumicos y ultraestructurales demuestran que hay una gradiente de composicin caracterstica dentro del lobulillo heptico. Adems, la composicin y funcin cambia entre cada hepatocito. Las superficies del hepatocito tienen diferentes receptores, azcares y otros componentes, que lo hacen ser particular. Si bien podemos observar clulas que parecen equivalentes en forma y funcin, cuando indagamos en forma ms profunda comprobamos que no es as. Esto es fundamental tenerlo presente para los propsitos de investigacin, pues incluso en cultivos celulares ninguna clula es igual a otra, pese a que tengan un mismo patrn. Adicionalmente, debe considerarse el nivel de complejidad existente, relacionado con la diversidad de tipos de molcula de membrana, o de los dominios. Por ejemplo, una clula plasmtica no equivale a una clula epitelial, pues esta ltima se relaciona con clulas vecinas, un lumen y una matriz extracelular, mostrando una complejidad diferencial en su superficie dependiendo de las relaciones establecidas. La membrana plasmtica se observar como una estructura de 2 zonas densas separadas por una zona clara formando una unidad de membrana (segn Robertson). Sin embargo, al comparar las unidades de membrana de diferentes clulas observadas al microscopio electrnico de transmisin, no es posible sealar que sus funciones y composicin son equivalentes. Ms an cuando se estudian procesos de transporte, se esquematizan procesos como el transporte, los dibujos muestran un grado de confusin, pues da una visin simplista de la funcin de las molculas. El caso tpico es el de los canales de potasio, que en modelos 3D, con sus diferentes dominios, estn formados por 2 subunidades que en parte miran al extra y al intracelular, y que son complejas. El modelo de membrana de mosaico fluido de Robertson, planteado en 1962 y que sigue emplendose hasta hoy, ha tenido pocas modificaciones. Este modelo propone que las membranas estn formadas por una bicapa altamente fluida y lquida a la temperatura fisiolgica de los organismos, y que las protenas se insertaban en toda ella, hacia un lado u otro de la bicapa, y que la bicapa era mvil, con cierto grado de libertad de movimiento de lpidos transversalmente en el plano de la membrana. Por 40 aos se ha trabajado con este modelo. Haba bicapas ms ricas en c. grasos saturados, insaturados, y dependiendo del punto de fusin de stos iba a estar en estado ms o menos lquido, pero se supona que las membranas tenan un mismo grado de fluidez en ambos lados. Por otra parte, se pensaba que una misma molcula (fosfolpidos) tena 2 centros diferenciales: las colas hidrofbicas de cidos grasos, y un extremo amino alcohol. Una membrana puede tener una cantidad de fosfolpidos no equivalente a la otra. En M.E. puede observarse esta unidad de membrana de bolsa equivalente, pero no mirndola como si tuviese los mismos constituyentes. A qu nos lleva esto? Dependiendo de las alternativas de tener un mismo tipo de cido graso pero con diferente rotacin y que cambie solamente el amino alcohol, tendremos un enorme nmero de posibilidades de fosfolpidos diferentes que dan asimetra a la membrana, ubicndose algunos hacia la cara extracelular y otros hacia el citosol. Aquellos fosfolpidos de la cara extracelular no podrn estar hacia el citosol, y viceversa, salvo que medien procesos como la apoptosis, que tendrn un flip-flop de algunos de ellos, que puede usarse como marcador de dao celular temprano.
En la ltima dcada ha surgido nueva informacin que aporta elementos nuevos de conocimiento sobre las membranas. Las membranas no solamente son una interfase formada por fosfolpidos y otros lpidos como el colesterol, libremente desplazables, sino adems existen unidades con composicin diferencial respecto de las dems, que estn constituidas por esfingolpidos y colesterol en altas concentraciones, presentes en la cara exoplsmica de la bicapa. Estos sectores denominados dominios raft o balsa , se caracterizan por ser resistentes a la solubilizacin en detergente, mostrando un cambio en el concepto del modelo clsico de mosaico fluido de membrana, en que todos los componentes eran solubles en detergentes inicos y no inicos, y que a 4 C hay una baja densidad de flotacin en una gradiente de sacarosa. Operacionalmente, desde el punto de vista fsico, la membrana dej de ser una entidad contnua, concepcin inicial, hasta hace unos 5 aos atrs. Los esfingolpidos ms participativos son los ganglisidos (sustituidos por monosacridos o subunidades mayores) y cerebrsidos. Existen familias de ganglisidos, que aportan a los dominios diversidad y especificidad de funcin para cada membrana que tenga este tipo de molculas. Tambin debemos considerar el colesterol, especfico de todas las membranas, pero concentrado en la monocapa externa de los dominios raft. Una clula, tiene una difusin alternada entre los dominios Raft y no Raft, sin separacin fsica. Al microscopio electrnico se ven iguales, slo si esos dominios Raft, adems de su composicin lipdica forman cavolas, se puede discriminar morfolgicamente entre dominios Raft y postcavola; y la cavola tendr la composicin de lpidos Raft y protenas como caveolinas, que le permiten quebrarse e invaginarse. Es decir, requerir la presencia de una maquinaria mecnica que le haga perder su continuidad e invaginarse. Estos dominios no se forman en la propia membrana, sino que se forman en Golgi. Es la ltima cisterna del trans Golgi que destina vesculas, sea de composicin Raft o no, pues la destinacin viene del intracelular. En la hoja exoplsmica hay protenas unidas por tallos de lpidos GPI (glicosil fosfatidil inositol), asociados a transporte, transcitosis, adems se han estudiado en su relacin con la transduccin de seales. Los dominios Raft al verlos en 2 tipos de clulas epiteliales, como el epitelio intestinal y en hepatocitos veremos lo siguiente: en hepatocitos estn discretamente distribuidos en forman ms o menos homognea en todas su superficies (canalicular, sinusoidal, intermembrana). Cada una de sus caras forma interacciones diferentes. En el caso del intestino, existe una superficie luminal, una basolateral, y una cara que da hacia la matriz extracelular. Las clulas se contactan entre ellas por interacciones o uniones estrechas, por el lado basal interacta a travs de receptores de adhesin con componentes de la matriz extracelular. Comparando la distribucin con los dominios de estas clulas, los dominios Raft estn distribuidos mayoritariamente en la superficie apical. Cada tipo celular tendr una distribucin asimtrica, pero no en el plano de la bicapa, sino en el de los dominios de membrana (apical y basolateral); esto no solo es vlido para lpidos, sino tambin para protenas. En la membrana hay protenas integrales de membrana, de transmembrana que atraviesan una o varias veces sta, protenas asociadas con cidos grasos, perifricas asociadas a protenas integrales. Cmo se distribuyen las protenas dentro de una clula con un gradiente de polaridad, como las que forman epitelios (presentan un dominio apical, uno basal y uno lateral, generalmente la regin apical mirando hacia un lumen y la basal hacia la matriz extracelular). Cmo se distribuyen las protenas en una misma superficie? En una clula epitelial, un nutriente como la glucosa no ingresa si no est acoplada funcionalmente a 4 tipos de receptores o canales; por ejemplo ingresa por la cara luminal a travs de un transportador de tipo bomba sodio potasio ATPasa, otro que corresponde a un canal de potasio; para que la glucosa llegue a la sangre deben funcionar 4 tipos de protenas que medien el transporte de la glucosa, ubicadas en diferentes dominios. El citoplasma servir de reservorio, que dependiendo de la concentracin de glucosa o sodio activar otras molculas para que el proceso ocurra. Hay un acoplamiento qumico funcional y un dominio separado fsicamente por barreras de tipo uniones estrechas que impiden la deslocalizacin de los componentes proteicos sea de la cara basal o la apical. Es importante al identificar molculas a nivel de superficie, saber que an sin conocer la ubicacin de estos sistemas, debe mantenerse la integridad fsica que impida el reordenamiento de componentes de una superficie a otra.
Por ejemplo al desconocer la ubicacin de un transportador, se disocian las clulas para hacer un cultivo de clulas primarias, es probable que se distribuya en toda la clula; por ende, es fundamental mantener las uniones estrechas entre las clulas, para dar as polaridad de dominios que permitan identificar mejor la ubicacin del transportador en estudio, en caso de no poder hacer la identificacin en tejido. Existen anticuerpos que no pueden ser utilizados en tejido ni en material fijado incluido posteriormente en resinas. Entonces debe hacerse la inmunodeteccin en tejido sin fijar, permeabilizando los extendidos, porque sera necesario tener los dominios mirando hacia el extracelular. Es muy importante entonces tener presente que las molculas deben ubicarse en el extracelular, adoptar precauciones, y tener claro la ubicacin del epitelio. Las cavolas, analizadas en la dcada del 50 por Palade, han sido retomadas para el estudio. Se defina antes como una unidad invaginada de membrana plasmtica de 50 a 100 nm; Disanti, en la actualidad, agrega que adems de invaginaciones pueden haber estructuraciones en vesculas, estructuras aplanadas, racimos; todas estas formas pueden ser momentos o estados de la invaginacin. Estas invaginaciones tienen distribucin diferencial en las diferentes superficies celulares. Cuando se da un tratamiento a las clulas para extraer las bicapas y dejar el componente proteico, se observan ovillos que son diferentes entre s. Todas estas protenas forman cubiertas a estas estructuras. Existen isoformas de una protena denominada caveolina, que forman una cubierta a la cavola, y podran ayudar a explicar las diferencias en las formas de stas. Cuando la cavola adopta una forma hexagonal o pentagonal, su cubierta est formada por clatrina. Dependiendo del tipo celular las cavolas pueden ser transitorias y cumplir funciones de endocitosis y fusionarse con la membrana plasmtica basal celular y transitar compuestos a travs de la clula. En un corte de MET de un capilar sanguneo, cuya principal funcin es la de transporte, en que se ven clulas endoteliales cortadas a diferente plano, se ven una serie de vesculas hacia basal. A mayor aumento, las vesculas corresponden a cavolas (segn Disanti seran con forma de racimo, interconectadas, y que llegaran a la superficie basal), se ven vesculas abiertas que han vaciado su contenido a la matriz extracelular, otras prontas a fusionarse, surge la pregunta: si realmente en estos sistemas, y dada la alta eficiencia operativa del transporte en los vasos sanguneos, es necesario esto? En otros tejidos como el intestino, rin, hepatocito u otras clulas, esta organizacin no se encuentra. Entonces la organizacin es particular del tipo celular estudiado. No esperaremos que las cavolas de un tipo celular se presenten de la misma forma en otro tipo. Se ha postulado un modelo contnuo que conecta el extra e intracelular a travs de este racimo de estructuras que van a fusionarse con el intracelular; otro punto que no puede desconocerse al hacer estudio de membranas es el movimiento de protenas y lpidos en la membrana celular. La temperatura del organismo est sobre el punto de fusin de los cidos grasos; con mayor razn a 37 C. En los 70 Singer y Nicholson se basaron en el experimento de Frye y Edwin para postular el modelo de mosaico fluido. Con linfocitos y Ac contra una protena de membrana unido a un fluorocromo, se incub y al tiempo cero se vi que la protena estaba localizada en forma localizada, y a los 30 minutos se observ una redistribucin de la marca. Si bien inicialmente se ubicaba en un polo de la clula; cuando se mira con otros marcadores, puede determinarse la polaridad de stos. Las clulas, pese a ser libres, tiene una distribucin de sus componentes de superficie no equivalentes en su longitud, porque de alguna forma fueron destinados para producir la endocitosis y la degradacin de los componentes. En el caso de componentes como el glicoclix, formado por azcares unidos covalentemente unidos a protenas y lpidos, no debe perderse de vista su procedencia; la glicosilacin de protenas y lpidos de membrana ocurre en el Golgi. En el caso de las protenas empieza en retculo y se modifica en Golgi, en tanto en el caso de los lpidos se inicia en el Golgi; despus, con seales apropiadas, y por un proceso de secrecin constitutiva (recambio de componentes de membrana) cambian en forma particular el componente degradado y se ubica as en la superficie extracelular. Es un proceso complejo.
Como sealamos las protenas inician su modificacin en retculo, y una vez que se sintetiza el pptido se le agregan oligosacridos caracterizados por tener 2 grupos de N-acetilglucosaminas, 9 manosas y 3 glucosas, que corresponden a los precursores de los oligosacridos de las glicoprotenas.
Algunos grupos se procesan en retculo y otros en Golgi. En un ejemplo se muestra un residuo de asparragina que es glicosilado y el resto corresponde a los azcares ya mencionados. En el Golgi la protena sigue su procesamiento, por lo que en los distintos compartimientos deben haber enzimas que agreguen, saquen y transfieran azcares: glicosidasas y transferasas. El trmino de la glicosilacin ocurre a este nivel. Pueden originarse 3 tipos de producto, 3 grandes grupos de azcares: un tipo rico en manosas (6 tipos de manosa), otro que pierde manosa y se agregan otros azcares en Golgi (Nacetilglucosamina, galactosa en posicin subterminal y cido silico (NANA) en posicin terminal. A partir de estas enzimas pueden generarse 3 tipos diferentes de azcares: rico en manosa, hbrido (contiene menos manosa que el rico en manosa pero ms que el que las ha sustituido totalmente por otros 2 oligosacridos agragados en el Golgi), y un tipo complejo. Cuando hay mutaciones gnicas en clulas de Sacaromycces cerevisiae que carecen de la enzima GlcNac no puede agregar galactosa y cido silico, y por ende las glicoprotenas no son funcionales pese a tener una destinacin correcta. Mediante tcnicas metodolgicas se ha podido estudiar los azcares y su participacin en el metabolismo. Debe definirse previamente la molcula a identificar. Por ejemplo, en el caso del cido silico, que tiene cargas negativas, se ocupan diversas tcnicas, que identifican las caractersticas aninicas del cido silico, o bien permiten reconocer el residuo de cido silico como tal. En este caso est en juego el grado de especificidad. Por ejemplo, empleando rojo rutenio, colorante de baja especificidad que permite teir la superficie celular, se hace un control negativo tratando con enzimas otros tejidos para determinar cunto disminuye y cunto aporta el grupo COOH a identificar los sitios aninicos. Para la identificacin de residuos completos, por ejemplo de cido silico, se emplean unas protenas que antiguamente se pensaba que slo estaban en vegetales, pero que hoy se conoce su participacin en animales tambin, las lectinas. stas se caracterizan por tener un sitio de unin especficos para ciertos residuos, por ejemplo algunas lectinas como la LPA slo reconocen cido silico; la WGA (aglutinina de germen de trigo) reconoce N-acetilglucosamina y tambin cido silico, pero la constante de afinidad favorece el reconocimiento de cido silico. Otra lectina, la concanavalina A (Con A), que induce la proliferacin celular, reconoce residuos de manosa, fucosa y glucosa. Pero los azcares de superficie no tienen glucosa, pues se encuentra en retculo. Entonces no habr problema en la identificacin de los residuos glucosa. Debe discriminarse entre fucosa y manosa, para lo que se usa manosidasa o fucosidasa que la extraigan para as determinar cual es el residuo que est siendo reconocido. Estas tcnicas se complementan con el control de unin de tratamiento con enzima. Luego se emplean anticuerpos para determinar un tipo o grupo de azcares, con un nivel mayor de especificidad. Por ejemplo con anticuerpos policlonales se reconocen por ejemplo otros epitopos. Todos estos sistemas de reconocimiento, con excepcin del rojo rutenio que da un color electrondenso a la microscopa electrnica, son protenas, por lo que no pueden ser observadas directamente al microscopio, y requieren entonces de un marcador, que pueden ser enzimas (unidas covalentemente a lectina o anticuerpo) como la peroxidasa y las fosfatasas, o bien marcadores particulados, como la ferritina (protena que tiene un sitio o ncleo con una alta cantidad de Fe+3 electrondenso al haz de electrones), la hemocianina (de tamao muy grande, presenta problemas de identificacin), y la ms empleada actualmente que es el oro coloidal. ste permite una mejor resolucin y pueden fabricarse diferentes tamaos de partculas desde 5 nm hacia arriba, lo que permite hacer colocalizacin de ms de una molcula de azcar o eptopo de una protena, en forma simultnea.
Hace 20 aos se usaba ferritina principalmente, ahora se emplea ms oro coloidal. En un podocito de glomrulo renal se hizo identificacin utilizando una lectina unida a enzima, lo que se hace despus que la lectina se ha unido, es incubar con un sustrato que sea electrondenso, adems insoluble para que no sea extrable con los lavados. Dependiendo del tiempo de incubacin (si tengo una enzima activa y con suficiente cantidad de sustrato), tanto sustrato se convierte a producto como sustrato exista. Si se desea hacer una localizacin exacta y no se sabe cunto de lo que se est identificando hay, se parte con una determinacin de este tipo; si bien no es cuantitativa dar por el manejo experimental hecho o por lo grosera de la reaccin, en caso de dar negativa la reaccin, se comprueba que no existe la molcula que se busca. Dando diferentes tiempos de incubacin, si se obtiene una cantidad de precipitado, se seala que hay una cantidad determinada. Para hacer ms cuantitativo el anlisis, si los mismos podocitos estudiados con la misma lectina, unida a ferritina, se ven unos pequeos grnulos correspondientes a la lectina unida al residuo, en este caso a cido silico, al extraer las glicoprotenas de membrana por fraccionamiento subcelular, se obtiene una nica protena rica en silico. Existe una patologa en que cuando hay alteraciones de la glicosilacin no se produce transformacin proteica en los podocitos y da alteraciones a nivel proteico. Es importante tener la visin de una misma estructura observada con 2 metodologas diferentes para discernir cul conviene ms emplear y la cantidad de sustrato a utilizar. En otro caso, en endotelio se observan partculas de oro que se depositan sobre la superficie, que se endocitan, hay reaccin. Este caso muestra una albmina glicosilada de diabtico. Cuando se identifica en estas tcnicas de estudio de ligandos a nivel de membrana y superficie, se necesita una molcula que reconozca al ligando y un marcador, que puede ser particulada o difusa, y controles. En una reaccin de verificacin de azcares se puede usar enzimas (control ms especfico), y uso de inhibidores competitivos. Se incuba en este caso las lectinas con haptenos, azcares similares a las estudiadas y modificadas qumicamente para tener mayor afinidad por la lectina, el hapteno se une a lectina en incubacin previa de 30 minutos. Luego la clula es incubada con las lectinas y luego se desarrolla la reaccin, debiendo en teora haber escasa o nula marca. Existen problemas de cncer asociados a glicosilacin, que pueden ser pesquisados por seguimiento de enzimas y glicoprotenas para determinar cul producto est aumentado o disminuido. Debe tenerse cuidado con el anlisis de estas molculas. Existen, como en todo tipo de estudio, limitantes, que al igual que las ventajas que tenga, deben ser conocidas, pues ellas pueden incidir en resultados negativos o en falsos positivos. Hay limitaciones en la identificacin, en la localizacin y la cuantificacin. 1. Identificacin: uniones altamente especficas, no encontrar marcador si existe endocitosis o difusin del componente en estudio (se sugiere para evitar esto bajar las temperaturas, el movimiento de membranas haciendo la incubacin a 4 C), cambios de exposicin del receptor (enmascaramiento). 2. Localizacin: adems de los anteriores problemas, existencia de movimiento la molcula en identificacin, movimiento pasivo, uso de marcadores no localizacin (la distribucin pudiera ser homognea en toda la superficie o localizada puntualmente en un dominio de la membrana); es importante marcador a utilizar. inducido, activo de particulados en la bien en parches, o definir el tipo de
3. Cuantificacin: a los anteriores se suman la afinidad y avidez (interaccin apropiada del ligando con el marcador) de unin, la razn entre ligando y marcador (estequiometra de los elementos
que participan), tamao de la molcula ligando, del marcador, del nmero de valencia del ligando (ms de un sitio de unin), la exposicin de los sitios de unin, pptidos y azcares.
No puse los ejemplos que dio en clase de los acinos glandulares, porque lo esencial de la materia ya fue expuesto. Adolfo Ros-Alcorta
Lectinas y Oro Coloidal- Esteban rdenes 1
Lectinas y Oro Coloidal

Prof. Esteban rdenes Jueves 03 de abril de 2003
Lectinas: Protenas provenientes de las ms diversas fuentes que son capaces de unirse a grupos o secuencias de azcares especficos. Tambin se les llama aglutininas, ya que son capaces de aglutinar determinados grupos especficos de clulas. Otro nombre que reciben es fito(hem)aglutininas, pero es incorrecto porque no solo provienen de las plantas. Su naturaleza y funcin muchas veces es desconocida A pesar de sus diversos orgenes, tienen en comn la capacidad de unirse a grupos qumicos de tipo carbohidratos en forma muy especfica, por ejemplo glucosa, Nacetilglucosamina, etc. Otras lectinas se unen a secuencias especficas de una determinada azcar, similar a lo que ocurre en el reconocimiento Ag-Ac. Dado que la mayora de las lectinas tienen dos sitios de unin para los carbohidratos, son capaces de tomar dos partculas grandes, por ejemplo, dos clulas que proyectan hacia la superficie carbohidratos que actan como elemento de reconocimiento celular (p. ej. Los grupos sanguneos, que se expresan en todas las clulas y no solo en glbulos rojos). Fuentes de Lectinas: Plantas Animales Microorganismos Virus Desde el punto de vista molecular: La mayora son multmeros, constituidas por subunidades asociadas covalentemente Las subunidades pueden ser iguales o diferentes entre si. A la estructura multimrica se atribuye la propiedad de aglutinar clulas (clulas pegajosas) o formar precipitados con glicoprotenas en forma anloga a lo que ocurre con las reacciones antgeno-anticuerpo. En general, la mayora de las subunidades de las lectinas tiene un PM entre 100 y 150 kD. El punto isoelctrico va entre 5 y 6. Las lectinas han proporcionado una herramienta invaluable para explorar numerosos procesos y estructuras celulares en forma similar a lo que se puede hacer con los Ac. Gracias a la especificidad que cada lectina posee por grupos especficos de carbohidratos, an oligosacridos de igual composicin pero distinta estructura pueden ser diferenciados. Por ejemplo: Algunas lectinas se unen slo a grupos de azcares con resduos de manosa o glucosa
Otras slo se unen a aquellos con resduos de galactosa Ciertas lectinas slo se unen al azcar si est en el extremo del oligo, en cambio otras pueden unirse a ella en el medio del oligo La estructura de carbohidratos a la que se une la lectina se denomina receptor Todas las lectinas tienen una abreviacin; estn disponibles en el comercio en forma pura o conjugadas, por ejemplo, con biotina. La lectina de Ulex europeo se utiliza con muy buenos resultados en reemplazo de Ac dirigidos contra endotelios, porque todas las clulas endoteliales expresan el receptor para esta lectina. Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin (AAL) Catalog No.B-1395Unit Size 1 mg add to wishlist Aislada del hongo Aleuria aurantia, esta lectina es un dimero de 2 subunidades idnticas de 300 kDa, cada una con un punto isoelctrico cercano a pH 9.0. A diferencia de las lectinas Ulex europaeus y Lotus tetragonolobus que se unen preferencialmente a residuos ( -1,2) fucosa, Aleuria aurantia se une preferencialmente a estructuras relacionadas con o ricas en fucosa unida en posicin ( -1,6) a N-acetilglucosamina o en posicin ( -1,3) a N-acetil lactosamina. El azcar de inhibicin/elusin es la L-fucosa 100 mM. La lectina de Aleuria se une preferencialmente (ntese que dice preferencialmente, otras lectinas lo hacen exclusivamente) a glucosa unida a N-acetilgalactosamina con enlace (1-6). Por eso es importante ver la especificidad de las lectinas.
Muchas de estas lectinas son inhibidas por la presencia de cido silico, aunque est presente el receptor de la lectina, pero Uds. Pueden sacar el cido silico usando una enzima como la tripsina o la neuraminidasa.
Para bloquear las lectinas se utiliza el azcar especfico de la lectina que se est utilizando; tiene que ser el azcar libre. No siempre funciona bien la peroxidasa sola con las lectinas, porque da mucho background; en vez de peroxidasa se puede unir a fluorocromos. Las lectinas funcionan en todas las condiciones: tejido fresco, cortes por congelacin y tejidos incluidos en parafina.
Oro Coloidal
Se obtiene por condensacin de partculas metlicas micromoleculares en partculas ms grandes de tipo coloidal (Zsigmondi y Thiesen 1925; Weisser 1933; Jirgenson y Traumanis 1962). Se procede a reducir cido clorourico con un agente adecuado; dependiendo del agente reductor se obtendrn partculas que varan en tamao y color. La mayor parte de este material se usa para microscopa electrnica, sin embargo tambin sirve para microscopa de luz, se ve de color caf oscuro. Se puede hacer en el laboratorio o comprar, pero tiene ciertas desventajas. Al igual que las lectinas, puede conjugarse con otras molculas. Ejemplos: Con fsforo: 1 - 3 nm o 5 - 12 nm segn la tcnica empleada Con citrato trisdico: 15-150 nm Propiedades del oro coloidal: Hidrofbico con carga negativa en su superficie La estabilidad del coloide es mantenida por repulsin electrosttica Electrolitos en concentraciones sobre 7mM provocan floculacin y precipitacin. Este efecto se evita agregando protenas a los coloides (sustancias hidroflicas cargadas elctricamente). Las protenas son adsorbidas a las partculas de oro formando complejos estables. Conjugados con oro coloidal: Protena A-Oro: Se produce por ultracentrifugacin (60.000 a 105.000 x g por 1 a 1,5 h a 4C) de oro coloidal y protena A (utilizada en inmunoprecipitacin) purificada de estafilococos. Protena A reconoce fragmento Fc de los Ac Conjugados de anticuerpo-oro coloidal: como mnino se necesitan dos anticuerpos secundarios conjugados con oro coloidal (un antiratn y otro anticonejo, que son los ms usados). Aplicaciones en ICQ del oro coloidal: De eleccin en la mayora de los estudios de ICQ Tcnica rpida y relativamente fcil Se puede utilizar en material incluido y osmicado
Alta resolucin Permite estudios de doble marcacin No apropiada para antgenos que pierden fcilmente su reactividad
Ventajas del oro coloidal: Forma definida y alta densidad electrnica Pueden ser producidas en diferentes tamaos. Se puede hacer marcaciones dobles Son fciles de preparar y se pueden almacenar por largos perodos de tiempo Caractersticas de los sistemas de marcado con inmunogold Alta especificidad Baja aglomeracin (85% de las partculas permanecen separadas) Baja reactividad cruzada Tamao de partcula uniforme (por esto no conviene hacerlo en el laboratorio: se obtienen partculas de distinto tamao y es muy difcil separarlas posteriormente.) Alta concentracin Consideraciones con inmunogold: La eficiencia del marcaje es inversamente proporcional al tamao de partcula (partculas ms grandes penetran menos) Las partculas ms grandes son ms fciles de detectar En experimentos de doble marcaje utilizar partculas de tamao bien distinto: 5/10; 10/20 En una solucin de oro coloidal siempre hay partculas de diverso tamao. Estudiar histogramas de hoja de especificaciones para ver si hay superposicin de tamaos. Las suspensiones de oro coloidal deben refrigerarse pero no congelarse. En buenas condiciones, las soluciones duran 6 meses a 1 ao.
Lectinas- Esteban rdenes G. 106
LECTINAS
3 de abril de 2003 Gamaliel Ordenes
Lectinas: Protenas provenientes de las ms diversas fuentes que son capaces de unirse a grupos o secuencias de azcares especficos. Tambin se les llama aglutininas, ya que son capaces de aglutinar determinados grupos especficos de clulas. Otro nombre que reciben es fitoaglutininas, pero es incorrecto porque no solo provienen de las plantas. Su naturaleza y funcin muchas veces es desconocida
A pesar de sus diversos orgenes, tienen en comn la capacidad de unirse a grupos qumicos de tipo carbohidratos en forma muy especfica, por ejemplo glucosa, Nacetilglucosamina, etc. Otras lectinas se unen a secuencias especficas de una determinada azcar, similar a lo que ocurre en el reconocimiento Ag-Ac. Dado que la mayora de las lectinas tienen dos sitios de unin para los carbohidratos, son capaces de tomar dos partculas grandes, por ejemplo, dos clulas que proyectan hacia la superficie carbohidratos que actan como elemento de reconocimiento celular (p. ej. Los grupos sanguneos, que se expresan en todas las clulas y no solo en glbulos rojos). Fuentes de Lectinas: Plantas Animales Microorganismos Virus Desde el punto de vista molecular: La mayora son multmeros, constituidas por subunidades asociadas covalentemente Las subunidades pueden ser iguales o diferentes entre si. A la estructura multimrica se atribuye la propiedad de aglutinar clulas (clulas pegajosas) o formar precipitados con glicoprotenas en forma anloga a lo que ocurre con las reacciones antgeno-anticuerpo. En general, la mayora de las subunidades de las lectinas tiene un PM entre 100 y 150 kD. El punto isoelctrico va entre 5 y 6. Las lectinas han proporcionado una herramienta invaluable para explorar numerosos procesos y estructuras celulares en forma similar a lo que se puede hacer con los Ac. Gracias a la especificidad que cada lectina posee por grupos especficos de carbohidratos, an oligosacridos de igual composicin pero distinta estructura pueden ser diferenciados. Por ejemplo:
Algunas lectinas se unen slo a grupos de azcares con resduos de manosa o glucosa Otras slo se unen a aquellos con resduos de galactosa Ciertas lectinas slo se unen al azcar si est en el extremo del oligo, en cambio otras pueden unirse a ella en el medio del oligo La estructura de carbohidratos a la que se une la lectina se denomina receptor
Todas las lectinas tienen una abreviacin; estn disponibles en el comercio en forma pura o conjugadas, por ejemplo, con biotina. La lectina de Ulex europeo se utiliza con muy buenos resultados en reemplazo de Ac dirigidos contra endotelios, porque todas las clulas endoteliales expresan el receptor para esta lectina. Lectina biotinylada de Aleuria aurantia (AAL) Catalog No.B-1395Unit Size 1 mg Aislada de hongos Aleuria aurantia Esta lectina es un dmero de 2 subunidades idnticas de app. 36000 daltons cada una, con un punto isoelctrico alrededor de pH 9. A diferencia de las lectinas de Ulex europaeus y Lotus tetragonolobus preferencialmente unidas a residuos (-1,2) fucosa, la lectina de Aleuria aurantia se une preferencialmente a fucosa ligada (1,6) a N-acetylglucosamina o a fucosa unida (-1,3) a estructuras relacionadas con N-acetyllactosamina. Azcar de Inhibicin/Elucin: L-fucosa 100 mM La lectina de Aleuria se une preferencialmente (ntese que dice preferencialmente, otras lectinas lo hacen exclusivamente) a glucosa unida a N-acetilgalactosamina con enlace (1-6). Por eso es importante ver la especificidad de las lectinas.
Muchas de estas lectinas son inhibidas por la presencia de cido silico, aunque est presente el receptor de la lectina. Pero Uds. Pueden sacar el cido silico usando una enzima como la tripsina o la neuraminidasa. Para bloquear las lectinas se utiliza el azcar especfico de la lectina que se est utilizando; tiene que ser el azcar libre. No siempre funciona bien la peroxidasa sola con las lectinas, porque da mucho background; en vez de peroxidasa se puede unir a fluorocromos. Las lectinas funcionan en todas las condiciones: tejido fresco, cortes por congelacin y tejidos incluidos en parafina.
ORO COLOIDAL Se obtiene por condensacin de partculas metlicas micromoleculares en partculas ms grandes de tipo coloidal (Zsigmondi y Thiesen 1925; Weisser 1933; Jirgenson y Traumanis 1962). Se procede a reducir cido clorourico con un agente adecuado; dependiendo del agente reductor se obtendrn partculas que varan en tamao y color. La mayor parte de este material se usa para microscopa electrnica, sin embargo tambin sirve para microscopa de luz, se ve de color caf oscuro. Se puede hacer en el laboratorio o comprar, pero tiene ciertas desventajas. Al igual que las lectinas, puede conjugarse con otras molculas. Ejemplos: Con fsforo: 1 - 3 nm o 5 - 12 nm segn la tcnica empleada Con citrato trisdico: 15-150 nm Propiedades del oro coloidal: Hidrofbico con carga negativa en su superficie La estabilidad del coloide es mantenida por repulsin electrosttica Electrolitos en concentraciones sobre 7mM provocan floculacin y precipitacin. Este efecto se evita agregando protenas a los coloides (sustancias hidroflicas cargadas elctricamente). Las protenas son adsorbidas a las partculas de oro formando complejos estables.
Conjugados con oro coloidal: Protena A-Oro: Se produce por ultracentrifugacin (60.000 a 105.000 x g por 1 a 1,5 h a 4C) de oro coloidal y protena A (utilizada en inmunoprecipitacin) purificada de estafilococos. Protena A reconoce fragmento Fc de los Ac Conjugados de anticuerpo-oro coloidal: como mnino se necesitan dos anticuerpos secundarios conjugados con oro coloidal (un antiratn y otro anticonejo, que son los ms usados). Aplicaciones en ICQ del oro coloidal: De eleccin en la mayora de los estudios de ICQ Tcnica rpida y relativamente fcil Se puede utilizar en material incluido y osmicado Alta resolucin Permite estudios de doble marcacin No apropiada para antgenos que pierden fcilmente su reactividad Ventajas del oro coloidal: Forma definida y alta densidad electrnica Pueden ser producidas en diferentes tamaos. Se puede hacer marcaciones dobles Son fciles de preparar y se pueden almacenar por largos perodos de tiempo Caractersticas de los sistemas de marcado con inmunogold Alta especificidad Baja aglomeracin (85% de las partculas permanecen separadas) Baja reactividad cruzada Tamao de partcula uniforme (por esto no conviene hacerlo en el laboratorio: se obtienen partculas de distinto tamao y es muy difcil separarlas posteriormente.) Alta concentracin Consideraciones con inmunogold: La eficiencia del marcaje es inversamente proporcional al tamao de partcula (partculas ms grandes penetran menos) Las partculas ms grandes son ms fciles de detectar En experimentos de doble marcaje utilizar partculas de tamao bien distinto: 5/10; 10/20 En una solucin de oro coloidal siempre hay partculas de diverso tamao. Estudiar histogramas de hoja de especificaciones para ver si hay superposicin de tamaos. Las suspensiones de oro coloidal deben refrigerarse pero no congelarse. En buenas condiciones, las soluciones duran 6 meses a 1 ao.

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