MICROBIOLOGA PREDICTIVA.

Tejedor, W., Ruiz, P., Rodrigo M. y Martnez, A.

Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos (CSIC), Apartado de Correos 73, 46100 Burjassot, Valencia, Espaa.

Una de las reas de la microbiologa de alimentos que ms inters ha suscitado en las ltimas dcadas ha sido la microbiologa predictiva, ya que permite anticipar el efecto del cambio en determinados factores medioambientales sobre el crecimiento o inactivacin de los microorganismos. La microbiologa predictiva se sustenta en el desarrollo de modelos matemticos o probabilsticos de segunda generacin y su introduccin en la industria requiere el desarrollo de software de fcil uso o lo que se denomina modelos de tercera generacin. En los ltimos aos, ha habido un gran desarrollo de la modelizacin matemtica y de la microbiologa predictiva, ya que son herramientas valiosas en la planificacin de programas de anlisis de peligros y control de puntos crticos (A.P.C.P.C.) y toma de decisiones, proporcionando la primera estimacin del cambio esperado en la poblacin microbiana cuando se exponen a un grupo especfico de condiciones. Este inters ha quedado patente en los numerosos congresos y cursos que anualmente se vienen organizando en distintos pases como son la Tercera Conferencia Internacional sobre Modelizacin Predictiva en Alimentos, celebrada en Lovaina, Blgica en Septiembre de 2000 y en el Curso sobre Microbiologa Predictiva realizado como actividad previa al Tercer Congreso Iberoamericano de Ingeniera de Alimentos en Valencia, Espaa en Marzo de 2001. La microbiologa predictiva es un campo de estudio que combina elementos de microbiologa, matemticas y estadstica para desarrollar modelos que describan y predigan matemticamente el crecimiento o muerte de los microorganismos, cuando se les somete a condiciones medioambientales especficas (Whiting, 1995). La microbiologa predictiva est basada en la premisa de que las respuestas de poblaciones de microorganismos a factores medioambientales son reproducibles y que por lo tanto es posible, interpolando entre puntos, predecir el comportamiento de esos microorganismos para condiciones que no han sido ensayadas (Ross y McMeekin, 1994). Las condiciones medioambientales incluyen tanto a factores intrnsecos (pH, aw, concentracin de NaCl), como los extrnsecos (temperatura o composicin gaseosa). MODELIZACIN. La Modelizacin microbiolgica comenz en los aos veinte con clculos de tiempo de muerte trmica; los valores D y z fueron empleados con xito para asegurar que los alimentos enlatados estuvieran libres de riesgo de contener toxina botulnica. La mayor parte de la literatura que exista sobre tecnologa de los alimentos, antes de los avances de la modelizacin predictiva, defina las condiciones que eran limitantes al crecimiento cuando el resto de los factores estaban prximos al ptimo. Sin embargo, en muchos alimentos, el control de los microorganismos patgenos depende de una combinacin de

factores inhibidores, siempre que ninguno de ellos est presente en cantidades suficientes como para ser capaz de inhibir a los microorganismos por s mismo. En el desarrollo de un modelo predictivo es necesario identificar claramente el problema para realizar una planificacin cuidadosa y detallada del trabajo experimental. A continuacin, hay que identificar las caractersticas del alimento que se pueden modificar para producir un efecto en los microorganismos, siendo esta variacin controlable. Estos factores van a ser las variables independientes (variables explicativas) a partir de las que se obtendr la prediccin de la variable dependiente, que suele ser el tiempo necesario para que se produzca el desarrollo o inactivacin de un cierto nmero de microorganismos, o bien produccin de una toxina (Whiting, 1995, Baranyi y Roberts, 1995). Los niveles de las variables independientes, es decir, el nmero de condiciones a estudiar dentro de cada factor, han de ser determinadas de modo preciso, pues van a verse limitados por el tipo de alimento estudiado. Por ejemplo, en el caso concreto del alimento estudiado en esta tesis, no tiene sentido estudiar el efecto de una concentracin de vinagre muy elevada, pues el producto sera rechazado por el consumidor. El proceso de modelizacin depende de tcnicas de regresin, por tanto, se deben tener en cuenta las pautas para los anlisis de regresin, incluyendo una distribucin normal y varianzas homogneas. Las directrices para el desarrollo de los modelos incluyen las siguientes consideraciones (McMeekin y col., 1992): - Precisin del ajuste. - Capacidad para predecir combinaciones de factores que no han sido probadas. - Incorporacin de todos los factores relevantes. - Mnimo nmero de variables. - Especificacin del trmino del error. - Los parmetros deben tener un significado biolgico y valores reales. - Reparametrizacin, si con ello se mejoran las propiedades estadsticas. CLASIFICACIN DE LOS MODELOS MICROBIOLGICOS. Se han propuesto varias clasificaciones de los modelos microbiolgicos. La ms comnmente aceptada es la que diferencia a stos en modelos de crecimiento y modelos de inactivacin/supervivencia; y cada uno de ellos es categorizado a su vez en modelos de nivel primario, secundario y terciario. 1. Modelos de nivel primario. Describen los cambios en el nmero de microorganismos a lo largo del tiempo. Este modelo puede cuantificar unidades formadores de colonias por mililitro (UFC/ml), formacin de toxinas, productos metablicos, absorbancia o impedancia. En ellos, una ecuacin matemtica describe el cambio en una respuesta a lo largo del tiempo y con un grupo de valores de unos parmetros determinados. Ejemplos de modelos primarios son el intervalo de crecimiento exponencial y la inactivacin trmica de primer orden. 2. Modelos de nivel secundario. Describen las respuestas de parmetros de los modelos primarios a cambios en las condiciones medioambientales como son la temperatura, pH o la aw. Un ejemplo de modelo secundario es la ecuacin

de superficie de respuesta, aplicable tanto a modelos de crecimiento como de inactivacin. 3. Modelos de nivel terciario. Son programas de ordenador que transforman los modelos de nivel primario y secundario en programas de fcil manejo para usuarios finales del modelo, en la forma de software de aplicacin y sistemas expertos. Estos programas pueden calcular respuestas de los microorganismos a condiciones cambiantes, comparar los efectos de diferentes condiciones o contrastar el comportamiento de varios microorganismos. VALIDACIN Y EVALUACIN DE LOS MODELOS. Los modelos para el crecimiento o la inactivacin se realizan normalmente en medios de cultivo con factores controlados, como el pH, NaCl y la temperatura. Una vez obtenidos, los modelos deben ser validados con nuevos datos obtenidos empleando otra combinacin de factores y de forma independiente (Davies y Banks, 1992; Ross, 1993). Esto proporciona una estimacin de la bondad del ajuste y pone de manifiesto cundo son necesarios datos adicionales. Un segundo paso de la validacin consiste en comparar las predicciones con el comportamiento real de los microorganismos en el alimento. Esto pone de manifiesto posibles limitaciones del modelo, ya que cuando un alimento no est adecuadamente descrito, el modelo sugiere qu factores adicionales deben ser incluidos en el mismo para aumentar su aplicabilidad. Otra forma de evaluar la bondad de un modelo, puede se a travs de ciertos ndices que establezcan la relacin que existe entre los datos obtenidos experimentalmente y los predichos por el modelo. Basado en esto, Ross (1996) sugiri la utilizacin de dos ndices conocidos como el factor BIAS (Bf) y el factor de exactitud (Af). De estos ndices, el factor de exactitud parece ser el que ms informacin aporta acerca de la bondad del modelo ya que considera el promedio absoluto de las desviaciones entre los valores predichos y los observados. APLICACIONES DE LOS MODELOS. Los modelos se deben considerar como estimaciones iniciales del comportamiento microbiano y guas para la evaluacin de problemas potenciales, ya que abarcan desde la investigacin bsica de laboratorio hasta su uso por la industria. Debe resaltarse que los modelos microbiolgicos son herramientas valiosas para hacer predicciones y planificar programas de anlisis de peligros y control de puntos crticos (A.P.C.P.C) (Davies y Banks, 1992; Whiting y Buchanan, 1992), debido a que pueden proporcionar informacin til para tomar decisiones en situaciones como pueden ser, la estimacin de riesgos, la identificacin de puntos crticos de control (P.C.C.) y la evaluacin de reformulaciones. En materia de educacin, los modelos pueden ser herramientas educativas, particularmente para personas que no son especialistas, ya sea mediante la confeccin de grficos o la estimacin de tiempos de crecimiento o de inactivacin para una poblacin microbiana especfica. Con la utilizacin de modelos se puede demostrar la importancia de mantener unas temperaturas de refrigeracin adecuadas, as como los

beneficios de usar materias primas de alta calidad, con poblaciones microbianas iniciales muy bajas. En la actualidad, con el uso de ordenadores, se pueden desarrollar modelos de nivel terciario (programas de ordenador) de fcil manejo por parte de los operarios de la industria de alimentos. Con estos modelos de respuesta microbiana, se podr ahorrar energa y recursos, ya que la mayor parte del trabajo de laboratorio se ve reducido considerablemente. Estos modelos proporcionan rpidamente un nivel de confianza para cada factor y, de ese modo, facilita el diseo de las pruebas de inoculacin experimental de envases, juicios para el almacenamiento y otras tcnicas convencionales para calcular la probabilidad de crecimiento de microorganismos patgenos. LIMITACIONES DE LOS MODELOS. Cuando se desarrolla un modelo microbiolgico, es importante especificar claramente cules son las limitaciones del mismo, es decir, qu microorganismos, qu factores, los lmites de cada factor y qu combinaciones de factores proporcionan respuestas vlidas. La presencia de factores adicionados a un alimento y que no estn presentes en el modelo, invalidan a ste o hacen necesario tener precaucin en la interpretacin de las predicciones. Cada vez se acepta ms que los modelos no pueden ser generales, sino particulares para cada alimento y situacin concreta. Es importante tener en cuenta que, a pesar de que los modelos se estn convirtiendo en una herramienta en investigacin y una ayuda valiosa en la evaluacin y el diseo de los procesos de alimentos, no es posible depender solamente de stos para determinar la seguridad microbiolgica de los alimentos ni de los sistemas de procesado. Todava es necesario comprobar en el laboratorio la propensin que tienen los microorganismos patgenos para crecer o sobrevivir en los productos alimenticios. Y lo que parece claro es que, independientemente de los avances que se puedan hacer en el campo de la modelizacin microbiolgica, los modelos nunca podrn reemplazar completamente las comprobaciones microbiolgicas, ni los juicios de un entrenado y experimentado microbilogo.

CASO PRCTICO DESARROLLO DE UN MODELO PREDICTIVO DE INACTIVACIN.

En la bibliografa cientfica se describen diversos modelos predictivos, matemticos o probabilsticos, que tratan de relacionar el valor D, con la temperatura y algn factor medioambiental. Reichart (1994) desarroll un modelo de inactivacin de Escherichia coli teniendo en cuenta la actividad de agua, sin embargo este modelo presenta el inconveniente de que es necesario conocer la concentracin de iones H+ y OH-. Reichart y Mohcsi-Farkas (1994) ensayaron varios modelos matemticos para describir la relacin entre el valor D, pH y temperatura, en combinacin con otros factores, tales como la aw y el potencial redox, en siete microorganismos no esporulados. Periago y col. (1998) propusieron una ecuacin cuadrtica de segundo orden para describir el efecto del pH y el NaCl en la resistencia trmica aparente de endosporas de Bacillus stearothermophilus, sin embargo este modelo resulta un poco difcil de aplicar debido a que consta de nueve variables explicativas. De todos los factores medioambientales, el pH es el ms interesante por su importante papel sobre la termorresistencia de los microorganismos, y por la presencia de algn tipo de acidulante en la mayora de los productos conservados por calor. En consecuencia, ha sido el factor sobre el que ms estudios se han realizado. El primer modelo para predecir el efecto combinado de la temperatura y el pH en la cintica de destruccin trmica de los microorganismos fue publicado por Davey y col. (1978). Para desarrollar este modelo, los autores se basaron en los datos publicados por Xezones y Hutchings (1965) para inactivacin del Clostridium botulinum y el modelo tena cuatro parmetros basados en la ecuacin de Arrhenius. Otros autores se han basado en la ecuacin de Bigelow para desarrollar sus modelos (Mafart y Legurinel, 1998) y otros han usado modelos polinomiales de primer y segundo grado (Fernndez y col. 1996), debido quizs a que estos modelos polinomiales (principalmente el de segundo grado) tambin han sido ampliamente utilizados para describir la cintica de crecimiento de los microorganismos. Todos los modelos se han desarrollado a partir de datos experimentales obtenidos bajo condiciones de calentamiento isotrmicas. Es muy importante que los modelos predictivos se ajusten a la situacin real que experimenta el alimento durante el proceso de esterilizacin, para que las predicciones puedan ser fiables y objetivas. En general, los alimentos conservados por calor, reciben un proceso de calentamiento no isotrmico. La temperatura del alimento aumenta gradualmente a una velocidad de cambio de temperatura que depende fundamentalmente de las caractersticas del alimento y del medio calefactor. Sin embargo, hasta la fecha no se han desarrollado modelos predictivos que relacionen el pH y la temperatura con la termorresistencia del microorganismo para las condiciones de calentamiento no isotrmicas. El objetivo de este trabajo es analizar los diferentes modelos propuestos en la bibliografa y en base al resultado de dicho anlisis, desarrollar un modelo para las condiciones de calentamiento isotrmicas y otro para las condiciones no isotrmicas,

que describan el efecto de la temperatura y el pH sobre la termorresistencia de las endosporas de Bacillus stearothermophilus calentadas en un alimento complejo. Con esta informacin se pretende averiguar qu modelo, el isotrmico o no isotrmico, da predicciones que se acercan ms a los datos en condiciones de calentamiento reales. Por ltimo se desarrolla un programa de ordenador para un uso fcil del modelo secundario obtenido. MODELOS DE REGRESIN. Se han analizado cuatro modelos de regresin, que han sido propuestos para explicar la termorresistencia de los microorganismos en funcin de la temperatura y del pH del medio de calentamiento. Estos modelos son: a. Modelo basado en la ecuacin de Arrhenius (Davey, 1993). Lnk = c0+(c1/T)+c2pH+c3(pH)2+ (ecuacin 1)

b. Modelo basado en la ecuacin de Bigelow (Mafart y Legurinel, 1998) LogD = LogD*-(1/zT)(T-T*)-(1/zpH)2(pH-pH*)2+ c. Modelo cuadrtico polinomial (Fernndez y col., 1996). LogD = c1+c2T+c3pH+c4(TpH)+c5T2+c6(pH)2 + d. Modelo bsico (Fernndez y col., 1996). LogD = c1+c2T+c3pH+ (ecuacin 4) (ecuacin 3) (ecuacin 2)

Donde, LogD = logaritmo decimal de D; Lnk = logaritmo natural de la constante de reaccin del modelo de Arrhenius (k = ln10/D); T = temperatura de calentamiento; pH = pH del medio de calentamiento; c0-c6 = coeficientes que han de ser estimados; T* = temperatura de referencia (generalmente 121C); pH* = pH de mxima resistencia de las endosporas (generalmente 7); D* = D cuando T = T* y pH = pH*; zT = el valor de z convencional (cambio necesario en la temperatura para que el valor de D disminuya 10 veces); zpH = cambio necesario en el pH, a partir del pH de referencia, para que el valor de D disminuya 10 veces. Al modelo (d), ecuacin 4, se le ha llamado modelo bsico porque se utilizan como variables explicativas las variables bsicas sin ninguna transformacin. ANLISIS DE LOS MODELOS. Para el anlisis de los diferentes modelos considerados se utilizaron datos de la bibliografa para el Clostridium botulinum (Xezones y Hutchings, 1965) en el intervalo de temperaturas de 110C a 118.3C y pH de 4 a 7; Clostridium sporogenes (Cameron y col., 1980) en el intervalo de 110C a 121C y pH de 5 a 7; y Bacillus

stearothermophilus (Fernndez y col., 1994) en el intervalo de 115C a 125C y pH de 4,6 a 6,2. Todos estos datos corresponden a estudios en condiciones de calentamiento isotrmicas. Los coeficientes de la ecuacin para cada uno de los modelos se calcularon mediante regresin mltiple, utilizando el software SPSS versin 10.0 para windows. Este primer trabajo debe permitir elegir el modelo ms general y fiable. Para la obtencin de los coeficientes del modelo predictivo elegido, se utilizan los datos obtenidos en estudios de termorresistencia tanto en condiciones isotrmicas como en condiciones no isotrmicas. Las variables bsicas son la temperatura en el intervalo de 115C a 125C y el pH en el intervalo de 5.00 a 5.82. Coeficiente de determinacin. En primer lugar se calcul el coeficiente de determinacin para cada uno de los modelos ajustados con cada uno de los grupos de datos. Este coeficiente es la proporcin de variabilidad de las observaciones de la variable dependiente (Lnk en el modelo de Arrhenius de la ecuacin 1 y LogD en los tres restantes) explicada por el conjunto de las variables independientes consideradas en cada caso. Estudio de los residuos. Los residuos se definen como la diferencia entre el valor observado de la variable dependiente y su valor ajustado en el modelo (Pea, 1994). En vista de que todos los modelos analizados son modelos de regresin mltiple, se realiz un estudio de los residuos para cada uno de los modelos ajustados, ya que esta es una manera de detectar incumplimientos de las hiptesis de los modelos de regresin. Se estudi la hiptesis de normalidad de los mismos mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov y se hicieron pruebas de linealidad, homocedasticidad y valores atpicos. Tambin se aplic la prueba de Durbin-Watson para ver si se detectaban problemas de correlaciones de residuos consecutivos. Datos influyentes. Los datos influyentes son aquellos que tienen una exagerada influencia sobre el modelo ajustado. Para determinar si existe este tipo de problema se utiliz el estadstico conocido como distancia de Cook. Multicolinealidad. Los problemas de multicolinealidad se presentan cuando una o varias de las variables explicativas del modelo son prcticamente una combinacin lineal de las dems, aportando informacin sobre la variable dependiente que es claramente redundante. Para detectar si existe este tipo de problemas, se calcul el estadstico conocido como Factor de Inflacin de la Varianza (FIV) para cada una de las variables explicativas. Este factor se define como (1 R2)-1, siendo R2 el coeficiente de determinacin obtenido aplicando el modelo de regresin mltiple para explicar una variable explicativa a travs de las restantes.

ndices para evaluar los modelos en microbiologa de alimentos. Tambin se calcularon algunos ndices que han sido propuestos para evaluar la calidad del ajuste de los modelos predictivos en microbiologa de alimentos, como son el factor BIAS (Bf) y el factor de exactitud (Af) (Ross, 1996). El factor BIAS valora si el modelo es seguro fail-safe (en promedio el modelo predice por encima de los valores obtenidos experimentalmente), o si el modelo es peligroso fail-dangerous (en promedio el modelo predice por debajo de los valores obtenidos experimentalmente). El factor de exactitud proporciona una medida del promedio de precisin de los valores estimados. Estos ndices estn dados por las siguientes ecuaciones:

A f = 10

Log ( predicted / observed )

n

(ecuacin 5)

B f = 10

( Log ( predicted / observed ))

n

(ecuacin 6)

Donde, Bf es el factor BIAS, Af es el factor de exactitud y n es el nmero de datos usados para el clculo.

RESULTADOS.
ANLISIS DE LOS MODELOS. Coeficientes de determinacin. En la Tabla 1, se muestran los coeficientes de determinacin para cada uno de los modelos ajustados. Se observa que todos los modelos predicen muy bien, ya que en el peor de los casos se logra explicar un 98,3% de la variabilidad de la variable dependiente. Aunque no se aprecian grandes diferencias, el modelo cuadrtico siempre es el que presenta un mayor coeficiente de determinacin, aunque esto se debe a que es tambin el modelo que utiliza ms variables explicativas. Estudio de los residuos. Se analizaron los residuos para todos los modelos ajustados. Se aplic la prueba de Kolmogorov-Smirnov y no se detect evidencia en contra de la hiptesis de normalidad de los mismos en ningn caso. Tampoco se observ ninguna seal en contra de las hiptesis de linealidad y homocedasticidad. En la Tabla 2, se muestran los resultados de la prueba de Durbin-Watson aplicada a los residuos. Prcticamente no se observan problemas de autocorrelacin para un = 0,05, ya que la mayora de los valores estn dentro del intervalo que tiene como lmite inferior a du y como lmite superior a 4-du, establecido como intervalo de no correlacin, para esta prueba (Pea, 1994). Los nmeros marcados en rojo, indican problemas de autocorrelacin y los nmeros marcados en azul, indican que esta prueba no es concluyente.

Tabla 1. Coeficientes de determinacin para cada uno de los modelos analizados. Microorganismo/ Alimento C. botulinum Spaghetti Macarrn Arroz C. sporogenes Tampn fosfato Pur de guisantes B. stearothermophilus Champin (ctrico) Champin (GDL) n = nmero de datos.

Arrhenius

Bigelow

Cuadrtico

Bsico

32 32 32 30 30 12 12

0,996 0,996 0,997 0,988 0,993 0,992 0,992

0,996 0,997 0,993 0,988 0,991 0,985 0,990

0,997 0,998 0,997 0,990 0,996 0,994 0,998

0,986 0,984 0,983 0,988 0,993 0,992 0,992

Tabla 2. Resultados de la prueba de Durbin-Watson aplicada a los residuos para cada uno de los modelos analizados. Microorganismo/ Alimento C. botulinum Spaghetti Macarrn Arroz C. sporogenes Tampn fosfato Pur de guisantes B. stearothermophilus Champin (ctrico) Champin (GDL) n = nmero de datos. Datos influyentes. Los valores mximos del estadstico conocido como Distancia de Cook se muestran en la Tabla 3. A nivel prctico (Montgomery y Peck, 1992) se considera que una observacin puede ser influyente si el valor de la distancia de Cook que le corresponde es mayor que 1 (marcado en rojo en la Tabla 3). Se observa que nicamente aplicando el modelo cuadrtico para los datos de Bacillus stearothermophilus en champin acidificado con GDL, podra haber algn dato influyente.

Arrhenius

Bigelow

Cuadrtico

Bsico

32 32 32 30 30 12 12

1,639 1,094 1,640 2,310 2,409 2,058 2,556

1,786 1,344 1,774 2,456 2,137 2,325 2,620

2,158 1,709 2,125 2,644 3,272 1,568 2,606

1,476 1,235 1,062 2,571 2,550 1,830 2,581

Tabla 3. Valores mximos de la Distancia de Cook para cada uno de los modelos analizados. Microorganismo/ alimento C. botulinum Spaghetti Macarrn Arroz C. sporogenes Tampn fosfato Pur de guisantes B. stearothermophilus Champin (ctrico) Champin (GDL) n = nmero de datos.

Arrhenius

Bigelow

Cuadrtico

Bsico

32 32 32 30 30 12 12

0,663 0,502 0,347 0,233 0,502 0,324 0,600

0,334 0,323 0,263 0,168 0,689 0,293 0,480

0,402 0,429 0,156 0,133 0,337 0,374 1,265

0,636 0,525 0,426 0,241 0,424 0,354 0,788

Multicolinealidad. En la Tabla 4, se muestran los valores mximos del factor de inflacin de la varianza (FIV) para cada modelo. A nivel prctico (Montgomery y Peck, 1992) se considera que valores de FIV superiores a 10 (marcados en rojo en la Tabla 4), indican serios problemas de colinealidad. Se observa que los modelos de Arrhenius y el cuadrtico presentan, en todos los casos, muchos problemas de este tipo.

Tabla 4. Valores del Factor de Inflacin de la Varianza (FIV) para cada uno de los modelos analizados. Microorganismo/ alimento C. botulinum Spaghetti Macarrn Arroz C. sporogenes Tampn fosfato Pur de guisantes B. stearothermophilus Champin (ctrico) Champin (GDL) n = nmero de datos.

Arrhenius

Bigelow

Cuadrtico

Bsico

32 32 32 30 30 12 12

179 179 179 347 347 574 574

1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

1980 1980 1980 5129 5129 6259 6259

1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

ndices para evaluar los modelos en microbiologa de alimentos. Las Tablas 5 y 6, muestran los valores del factor BIAS y del factor de exactitud. En cuanto al factor BIAS, se espera que ste sea aproximadamente igual a uno, por lo que se considera que el nico modelo que presenta problemas es el modelo cuadrtico, ya que igual se presentan casos en que predice de manera muy segura (Bf = 4,10) y casos que puede considerarse muy peligroso (Bf = 0,50). Con respecto al factor de exactitud, tambin es el modelo cuadrtico el que podra considerarse como poco preciso, debido a que en algunos casos se obtienen valores muy alejados de la unidad. Tabla 5. Valores del factor BIAS para cada uno de los modelos analizados. Microorganismo/ alimento C. botulinum Spaghetti Macarrn Arroz C. sporogenes Tampn fosfato Pur de guisantes B. stearothermophilus Champin (ctrico) Champin (GDL) n = nmero de datos.

Arrhenius

Bigelow

Cuadrtico

Bsico

32 32 32 30 30 12 12

0,98 0,98 1,00 1,00 1,00 1,01 1,00

1,01 1,00 1,00 1,00 1,01 1,00 1,00

0,96 1,06 2,02 1,11 0,93 0,50 4,10

1,00 0,99 1,00 1,00 1,00 0,92 1,08

Tabla 6. Valores del factor de exactitud para cada uno de los modelos analizados. Microorganismo/ alimento C. botulinum Spaghetti Macarrn Arroz C. sporogenes Tampn fosfato Pur de guisantes B. stearothermophilus Champin (ctrico) Champin (GDL) n = nmero de datos.

Arrhenius

Bigelow

Cuadrtico

Bsico

32 32 32 30 30 12 12

1,17 1,17 1,17 1,27 1,23 1,29 1,32

1,07 1,06 1,06 1,10 1,11 1,15 1,15

1,07 1,08 2,02 1,12 1,09 2,01 4,10

1,14 1,16 1,18 1,10 1,09 1,13 1,13

SELECCIN DEL MODELO PARA AJUSTAR LOS DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS EN CONDICIONES ISOTRMICAS. Para seleccionar uno de entre los modelos estudiados, se han seguido los siguientes criterios: Calidad del ajuste, capacidad predictiva y cumplimiento de todas las hiptesis bsicas de los modelos de regresin. Sencillez en cuanto a la complejidad y cantidad de las variables explicativas construidas.

En base a lo anterior, se tiene que los modelos de Arrhenius y el cuadrtico, presentan serios problemas de colinealidad, esto se debe a que para su aplicacin, no se hizo un contraste de hiptesis para determinar las variables que eran significativas, en presencia de las otras utilizadas en el modelo. Otro problema que presenta el modelo cuadrtico es la falta de consistencia en cuanto a seguridad y precisin, puesto de manifiesto en los valores del factor de exactitud y el BIAS. El modelo de Bigelow y el bsico utilizan slo dos variables explicativas, tienen muy buena calidad del ajuste y adems no parecen incumplir las hiptesis bsicas de los modelos de regresin. Sin embargo, se decidi utilizar el modelo bsico por la sencillez de las variables que utiliza, ya que emplea slo las variables bsicas (temperatura y pH) sin ninguna transformacin. De acuerdo a estos criterios, el modelo general empleado ser: LogD = 0 + TT + pHpH + Siendo: LogD = Logaritmo decimal del valor de D. T = temperatura de tratamiento. pH = pH a temperatura ambiente del medio de calentamiento. = trmino de error en el modelo (~N(0,2). 0, T, y pH = coeficientes del modelo. Descripcin de los datos. En la Tabla 7, se muestran los estadsticos bsicos (mnimo, mximo, media y desviacin tpica) de las variables utilizadas en el modelo (ecuacin 4) para las 20 observaciones obtenidas en condiciones isotrmicas. Se han transformado los datos de la variable respuesta segn la funcin logartmica decimal, para cumplir con la primera regla de los modelos de regresin lineal que indica que la variable dependiente debe seguir una distribucin normal. (ecuacin 7)

Tabla 7. Descripcin bsica de los datos utilizados en el modelo. Nmero de datos 20 20 20 Desviacin tpica 0,401 3,796 0,296

Variables LogD T(C) pH

Mnimo -0,301 115 5.00

Mximo 0,921 125 5,82

Media 0,296 119,750 5,404

La Tabla 8, muestra el coeficiente de correlacin muestral entre las distintas variables del modelo. El p-valor asociado corresponde al contraste de hiptesis cuya hiptesis nula especifica incorrelacin entre las dos variables involucradas. Puede observarse que la variable ms correlada (en trminos absolutos) con la variable dependiente es la temperatura. El coeficiente de correlacin muestral entre la temperatura y el LogD es negativo, muy intenso (-0,974) y adems significativo (pvalor = 0,000). Aunque la intensidad de la asociacin lineal entre el pH y el LogD es muy pequea (0,210) y adems no significativa (p-valor = 0,187), posteriormente se ver que en presencia de la temperatura, el pH proporciona informacin significativa sobre el LogD. En todos los contrastes comentados, debe entenderse que el resultado es significativo al nivel = 0,05 cuando el p-valor observado es menor que el valor = 0,05 seleccionado previamente a la resolucin del contraste. Tabla 8. Coeficientes de correlacin entre las variables del modelo. LogD LogD Coeficiente p-valor T(C) Coeficiente p-valor 1,000 T(C) -0,974 0,000 1,000 pH 0,210 0,187 0,000 0,500

El modelo ajustado. El modelo ajustado para las condiciones de calentamiento isotrmicas es: LogD = 11,089 0,103T + 0,284pH (ecuacin 8)

Lo que equivale a tener:

LogD = 11,089 - (1/9,7087)T + (1/3,5211)pH

(ecuacin 9)

Esto quiere decir que, si se aumenta la temperatura en una unidad, manteniendo el pH constante, se obtendra un aumento de (-0,103) en el valor de LogD. De la ecuacin 28, se puede deducir que 9,7087 es la estimacin del nmero de grados centgrados requeridos para que el valor D atraviese un ciclo logartmico, siempre que el pH se mantenga constante. Si lo que se mantiene constante es la temperatura, un aumento de una unidad en el pH, produce un aumento de 0,284 en el valor de LogD, lo que equivale a decir que se requiere un cambio de 3,5211 en el pH para que el valor de D atraviese un ciclo logartmico. Los estadsticos bsicos del ajuste se muestran en la Tabla 9. Se observa que el resultado de cada uno de los contrastes individuales de los coeficientes de regresin es siempre significativo (todos los p-valores son 0,000), por lo que cada una de las variables explicativas, en presencia de las dems, aporta informacin significativa sobre el comportamiento aleatorio de LogD que no pueden explicar las otras variables del modelo.

Tabla 9. Estadsticos del ajuste del modelo. Coeficientes no estandarizados Modelo Constante T(C) pH 11,089 -0,103 0,284 Error tpico 0,289 0,002 0,027 Coeficientes estandarizados (Beta)

p-valor 0,000 0,000 0,000

-0,974 0,210

En la Tabla 10, se muestran los resultados de la tabla de anlisis de la varianza (Tabla ANOVA). El modelo, en su conjunto, es significativo, ya que el p-valor obtenido en el contraste de hiptesis correspondiente es 0,000. Adems se observa que la estimacin insesgada de la varianza del modelo es muy pequea (0,001), y que por lo tanto no hay casi discrepancia entre los valores de la variable respuesta observados y los ajustados. Adems el coeficiente de determinacin es R2 = 0,993, lo que indica que ms del 99% de la variabilidad de las observaciones del LogD puede explicarse a travs de la temperatura y el pH.

Tabla 10. Tabla de anlisis de varianza del modelo (Tabla ANOVA). Suma de cuadrados 3,036 0,020 3,056 Grados de libertad 2 17 19 Media cuadrtica 1,518 0,001

Modelo Regresin Residual Total

F 1272,824

p-valor 0,000

Evaluacin del modelo ajustado. El modelo ajustado es correcto porque no incumple ninguna de las hiptesis bsicas de los modelos de regresin: los errores son independientes, tienen media cero, su varianza es constante y adems su distribucin es normal. En la Tabla 11, se muestra una descripcin bsica de los residuos expresados en distintas escalas (residuos brutos, tpicos, estudentizados, y eliminados). No se detect evidencia en contra de la hiptesis de normalidad de los mismos (p-valor asinttico = 0,89 segn la prueba de Kolmogorov-Smirnov). En la Tabla 11, tambin se muestra el valor del estadstico conocido como la distancia de Cook, el cual muestra que ninguna observacin se puede considerar como influyente sobre el modelo ajustado (valor mximo < 1).

Tabla 11. Descripcin bsica de los residuos del modelo ajustado. Desviacin tpica 0,033 0,946 1,033 0,039 1,091 0,107

Residuo Bruto Tpico Estudentizado Eliminado Eliminado. estud. Distancia de Cook

Mnimo -0,058 -1,685 -1,836 -0,069 -1,989 0,000

Mximo 0,062 1,792 1,950 0,077 2,147 0,411

Media 0,000 0,000 0,006 0,000 0,016 0,067

De acuerdo a la prueba de Durbin-Watson, no se ha detectado la presencia de correlaciones en residuos consecutivos, ya que el valor de este estadstico para el modelo ajustado es de 2,153, superior al valor de 1,41 considerado como el lmite bajo del cual pudiera haber correlacin. Tampoco se detectaron problemas de colinealidad de las variables explicativas, ya que el valor FIV para ambas variables fue igual a 1. Validacin del modelo. El modelo se valid utilizando datos que aparecen en la literatura para un substrato similar (Rodrigo y col., 1999), y se observ que, a pesar de que este substrato tena un pH de 4,81, inferior al mnimo utilizado para desarrollar el modelo (pH = 5,00), las predicciones fueron buenas. Los resultados se muestran en la Tabla 12. El factor de exactitud (Af) del modelo fue de 1,06, considerado como muy bueno y el factor BIAS fue de 0,98, que si bien indica que en promedio el modelo es ligeramente inseguro, para las predicciones hechas para el pH de 4,81, siempre se obtuvieron valores superiores a los valores experimentales.

Tabla 12. Predicciones de los modelos para un pH = 4.81 a diferentes temperaturas. Log D (min) Temperatura (C) 115 118 121 125 * Datos de Rodrigo y col. (1999). Experimental* 3,860,18 1,850,06 0,930,03 0,370,02 Predichos 4,07 2,00 0,98 0,38

SELECCIN DEL MODELO PARA AJUSTAR LOS DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS EN CONDICIONES NO ISOTRMICAS. Con los valores de D obtenidos en condiciones no isotrmicas, se desarroll un modelo matemtico que relaciona la temperatura y el pH del substrato a temperatura ambiente, con el LogD, de manera similar al modelo desarrollado para los datos de calentamiento isotrmico. Debido a que no se encontr en la bibliografa ningn estudio sistemtico donde se estudiara el efecto de la temperatura y el pH sobre la termorresistencia de las endosporas en condiciones no isotrmicas, se procedi a ajustar los datos obtenidos en condiciones no isotrmicas a una velocidad de 1C/min con los cuatro modelos analizados previamente para las condiciones isotrmicas. El modelo de Arrhenius y el cuadrtico volvieron a presentar problemas de colinealidad, por lo que fueron descartados, y entre el modelo de Bigelow y el bsico, nuevamente se decidi usar el bsico por la sencillez de las variables utilizadas. La descripcin bsica de las variables explicativas para las 20 observaciones consideradas es igual a la de las condiciones isotrmicas y la variable dependiente (LogD) oscila entre 0,678 y 0,983 con media 0,260 y desviacin tpica 0,533. La variable explicativa ms correlada con la variable dependiente, tambin es la temperatura, y ambas variables explicativas (temperatura y pH) presentan coeficientes de correlacin similares a los obtenidos con datos isotrmicos, -0,973 y 0,192 respectivamente. El modelo ajustado para las condiciones no isotrmicas es: LogD = 14,735 0,136T + 0,346pH (ecuacin 9)

Siendo: LogD = el logaritmo del valor de D, T = temperatura de tratamiento y pH = el pH del substrato a temperatura ambiente. El contraste de hiptesis para cada una de las variables explicativas demostr que ambas eran significativas (p-valor = 0,000). Igual resultado se obtuvo para el anlisis del modelo en su conjunto. La estimacin insesgada de la varianza del modelo fue tambin muy pequea (0,005).

El modelo ajustado presenta un ndice de determinacin R2=0.983, un factor de exactitud Af=1.19 y el BIAS Bf=1.14. Adems, no incumple ninguna de las hiptesis bsicas de los modelos de regresin, ya que el anlisis de los residuos no evidenci ninguna seal en contra de dichas hiptesis, tampoco se observaron valores influyentes en el modelo (Valor mximo de la distancia de Cook = 0,365), ni problemas de colinealidad (FIV = 1, para ambas variables explicativas).

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SEGURIDAD ALIMENTARIA DE LA CONSERVACIN EN ATMSFERAS CONTROLADAS Martinez, A.; Fernndez P.S1. y Rodrigo M. Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos (CSIC), Valencia
1

Universidad Politcnica de Cartagena, Murcia

Introduccin

El uso da tecnologa de procesado de alimentos basadas en el envasado en atmsferas modificadas (MAP) ha llegado a ser bastante popular debido a que ofrecen alimentos mnimamente conservados con vida til extendida manteniendo la sensacin de frescor. Aproximadamente el 90 % de la carne de ganado vacuno criado en cautividad en los Estados Unidos se envasa bajo vaco o en atmsfera modificada y el 90-95 de la pasta fresca que se vende en el Reino Unido es MAP (Philips 1996). El nmero de productos envasados con estos sistemas incluye carnes cocinadas o frescas, productos de la pesca, pasta fresca, derivados lcteos, frutas y vegetales en general, entre otros. En el sector de productos crnicos y derivados se pueden distinguir dos categoras distintas: i) los productos envasados en atmsferas ricas en oxgeno y dixido de carbono, esto se aplica solo en carnes frescas y ii) aquellos productos envasados en ausencia de oxgeno, aplicado esencialmente a productos cocinados, curados y carne fresca. Para la mayora de estos productos el envasado en atmsferas modificadas se usa en conjuncin con otros factores conservantes como baja actividad de agua, bajo pH, tratamientos trmicos suaves y almacenamiento refrigerado actuando de forma sinrgica para conseguir la estabilidad microbiolgica del alimento.

Mientras que el envasado en atmsferas modificadas ofrece la posibilidad de incrementar el tiempo de vida y la calidad del producto refrigerado, tambin existe la posibilidad de que el periodo de almacenamiento prolongado aumente el riesgo de que microorganismos patgenos capaces de crecer a temperaturas de refrigeracin se desarrollen o produzca sus toxinas. De hecho hay un cambio de la composicin de la microflora en estos productos

envasados en atmsferas modificadas en comparacin con aquellos que estn envasados en aire, lo cual puede contribuir tambin a aumenta los riesgos de alteracin por microorganismos patgenos.

En general el envasado en atmsferas modificadas consta de varias formas mediante las cuales el dixido de carbono se usa como conservador. El empleo de concentraciones aumentadas de dixido de carbono que prolongarn la vida comercial de las carnes frescas se conocen desde 1882. La aplicacin real del dixido de carbono para prolongar la vida comercial de las carnes rojas comenz al final de los sesenta y se desarroll durante los aos setenta. Desde estas fechas su aplicacin en la conservacin de productos crnicos y de sus derivados se ha incrementado constantemente llegando a ser una tecnologa habitual en este tipo de industrias.

En el presente trabajo se analizan los problemas de inocuidad de las carnes y derivados crnicos envasados en MAP y VP y se describen de forma breve algunas herramientas para establecer la inocuidad de tales productos

Aspectos generales del envasado en atmsferas modificadas y al vaco.

Definiciones:

Ha habido una falta de acuerdo en la terminologa que se usa para definir las diferentes formas con que se consigue un nivel de dixido de carbono aumentado y unos niveles de oxgeno disminuidos. La terminologa ms extendida en la siguiente (Jay 2000): i) almacenamiento hipobrico, ii) envasado al vaco, iii) envasado en atmsfera modificada y iv) envasado en atmsfera controlada..

En el almacenamiento hipobrico los alimentos se almacenan a baja presin de aire, a baja temperatura y en humedad elevada. El uso esta tecnologa es actualmente muy limitado.

En el almacenamiento al vaco se elimina el aire de la bolsa impermeable al gas y posteriormente se cierra. Con este tipo de envasado se produce un aumento del dixido de carbono como consecuencia de la respiracin tanto del tejido como de los microorganismos consumindose oxgeno y liberndose dixido de carbono en igual volumen. En el caso de las carnes, la concentracin de dixido de carbono puede alcanzar hasta el 10 o 20 % en las cuatro primeras horas de almacenamiento, pudiendo llegar finalmente una concentracin del 30% como consecuencia de la actividad respiratoria de la flora microbiana aerbica.

El envasado en atmsfera modificada (MAP) es un proceso hiperbrico consistente en modificar la atmsfera en el interior del envase con distintas mezcladas de dixido de carbono, nitrgeno y oxgeno. La concentracin inicial de gas no se puede reajustar durante el almacenamiento.

El almacenamiento en la atmsfera controlada (CAP), aunque considerada por algunos autores diferente al MAP, podramos decir que se trata de una forma de MAP. Si bien en un MAP tpico la composicin de gases puede cambiar durante el almacenamiento, en el CAP la composicin gaseosa permanece invariable durante todo el tiempo de almacenamiento.

Dado que en cualquier caso es el dixido de carbono el agente inhibidor del crecimiento microbiano, en el presente en trabajo no distinguiremos entre unos sistemas u otros al considerar el punto de vista de la inocuidad alimentaria.

Aspectos generales de microbiologa:

Antes de estudiar los efectos especficos que tienen las condiciones de envasado al vaco (VP) y en atmsferas modificadas (MPA) sobre los microorganismos es necesario entender las necesidades, en cuanto al tipo de gases, que tienen las bacterias, levaduras y mohos para crecer. Mientras que la mayora e los organismos vivos superiores requieren oxgeno para sobrevivir, ste no es el caso para todos los microorganismos y mientras que algunas bacterias, mohos y levaduras requieren oxgeno para crecer, otras pueden crecer en la ausencia de oxgeno y algunas otras encuentran que la presencia de oxgeno es txico. Uno

de los principales mecanismos de las tcnicas MAP y VP es cambiar el nivel de oxgeno presente en el ambiente que rodea al alimento lo cual afecta al crecimiento potencial de diferentes grupos de microorganismos. Los microorganismos se pueden clasificar por su necesidad en oxgeno en: i) aerbicos, ii) anaerobios, iii) facultativos y iv) microaerfilos.

Los microorganismos aerbicos no pueden crecer en ausencia de oxgeno libre aunque son capaces de hacerlo, muy lentamente, a niveles reducidos de oxgeno. Estos microorganismos son los responsables de la alteracin de los alimentos envasados en un ambiente aerbico y por la exclusin del oxgeno se inhibe su crecimiento.

Los microorganismos anaerobios no pueden crecer en presencia de oxgeno. Algunas especies son muy sensibles al oxgeno y mueran en su presencia, pero el gnero de mayor inters respecto a la alteracin del alimento y produccin de toxina, el Clostridium, puede tolerar ligeras concentraciones del oxgeno, aunque en lneas generales, no puede crecer en su presencia. No obstante, algunas especies de Clostridium son altamente tolerantes al oxgeno. Por ejemplo, en el caso del Clostridium perfringens, una vez que se ha establecido el crecimiento exponencial, puede seguir creciendo en niveles de oxgeno bajos.

Los organismos facultativos son capaces de crecer tanto en presencia como en ausencia de oxgeno. Por lo tanto la eliminacin del oxgeno no previene su crecimiento aunque para algunas especies dicho crecimiento se puede reducir ligeramente. La mayora de los patgenos de alimentos MAP o VP caen dentro de este grupo: Salmonella, Staphilococcus aureus, Echerichia coli y Listeria monocytogenes as como microorganismos alteraradores de alimentos tales como los Lactobacillus y Enterococcus que tienden a predominar en los productos crnicos VP y MAP. Mientras que eliminar el oxgeno no previene el crecimiento de los microorganismos, el uso de dixido de carbono, que tiene propiedades antimicrobianas especficas y la baja temperatura incrementan la efectividad de estos sistemas de conservacin.

Los organismos microaerofilos requieren oxgeno para crecer pero a niveles ms reducidos que los que se encuentran en la concentracin atmosfrica normal. En algunos casos pueden

necesitar niveles de dixido de carbono aumentados y pueden desarrollarse en MAP conteniendo estas mezclas de oxgeno, nitrgeno y dixido de carbono.

La inocuidad de alimentos MAP o VP.

Las bacterias Gram negativas ( Pseudomonas spp, Enterobacteriaceae, Acinetobacter spp y Moraxella spp) son en general ms sensibles al dixido de carbono que las bacterias Gram positivas (Enterococcus spp, Lactobacillus spp y Brochothrix thermophacta) lo cual afecta a la flora microbiana tpica de los productos MAP.

Los mohos se inhiben cuando se elimina oxgeno y por lo tanto la tecnologa MAP o VP pueden ser tiles en la extensin de la vida de frutas o quesos. Las levaduras, por el contrario, no se inhibe al eliminar el oxgeno y pueden causar la alteracin de productos MAP particularmente de aquellos que se almacena durante periodos prolongados de tiempo y donde los microorganismos aerbicos alternadores se han inhibido.

Los primeros estudios con mezcla de poblaciones de microorganismos en carnes indicaron que el primer efecto del dixido de carbono fue incrementar la fase de latencia de los microorganismos. Al inhibir el crecimiento de los organismos alternadores aerbicos e incrementar la fase de latencia de los microorganismos facultativos y aerbicos se incrementar la vida til de los productos MAP . Sin embargo, es importante entender que el aumento de la vida til puede dar lugar a problemas de inocuidad. Esto es debido a que los microorganismos anaerobios y facultativos patgenos los cuales pueden tener largos periodos de adaptacin y velocidad de crecimiento lentas son capaces de crecer durante estos periodos prolongados de almacenamiento

La principal complicacin con los alimentos MAP y VP estriba en que los organismos aerbicos que normalmente alteraran al producto y prevendran al consumidor de que se ha producido un abuso en la temperatura de almacenamiento han sido inhibidos. As, el alimento puede tener la apariencia fresca y de que no est alterado mientras que contiene

toxinas de microorganismos patgenos a unos niveles suficientes como para causar enfermedad.

Las cepas psicrotrofas de Clostridium botulinum son uno de los principales problemas que se pueden presentar en estos productos, incluidas las carnes y sus derivados, MAP y VP de duracin extendida, particularmente aquellos que han recibido un tratamiento trmico suave (carnes cocidas) (Peck 1997). En estos productos tratados trmicamente la coccin destruye la microflora natural competitiva y la resistencia natural de la carne a la alteracin. El resultado es un producto vulnerable a la recontaminacin post coccin por patgenos potenciales y al crecimiento de esporas bacterianas que han sobrevivido al tratamiento trmico. Hay otros patgenos capaces de crecer en alimentos almacenados a cinco grados centgrados o menos y que son de importancia en productos MAP refrigerados, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes y Aeromonas hidrfila. Tambin hay varias patgenos capaces de crecer entre 5 y 12 grados centgrados, Salmonella, Staphylococcus aureus y Bacillus cereus, estos microorganismos son un problema en aquellos productos que no se han almacenado bajo condiciones de refrigeracin adecuadas durante su vida til.

Considerando la variedad de ambientes gaseosos adecuados para el crecimiento de los microrganismos y la variacin en el efecto antimicrobiano del dixido de carbono sobre ellos, se establece una interrelacin compleja entre organismos patgenos y alteradores. Es posible que el alimento se altere sin perder la inocuidad mientras que otros llegan a ser peligrosos sin que haya signos externos de alteracin.

Si un alimento MAP se somete a abuso de temperatura o el sistema de envasado falla aparecen cuatro escenarios diferentes en la relacin entre microorganismos patgenos y alteradores (Betts 1995). 1. El nmero de ambos, organismos patgenos y alternadores, permanece bajo, as no hay peligro sobre la salud y el alimento no se altera. En esta situacin el sistema MAP funciona correctamente y el tiempo de vida til del producto se puede extender.

2. El organismo alterante prolifera pero el patgeno no crece. Esta no es una situacin deseable, considerando la calidad del producto y por consiguiente no se debe extender la vida til, pero no hay riesgo sobre la salud del consumidor. 3. Ambos microorganismos, patgenos y alteradores crecen en el producto De nuevo el alimento no es aceptable, bajo el punto de vista de la calidad. Sin embargo, en este caso hay un riesgo serio sobre la salud del consumidor. 4. El organismo patgeno crece pero no el alterador. Esta es una situacin bastante grave ya que no hay un indicador de la alteracin y el alimento aparece inocuo a los ojos del consumidor. Esta es la principal preocupacin respecto a los alimentos MAP y VP. Hay estudios que indican que el Clostridium botulinum puede producir toxina antes de cualquier signo de alteracin del producto (Betts 1995).

La carne, es un medio muy favorable para el desarrollo de todo tipo de microorganismos, incluidos numerosos patgenos. Se han identificado brotes de intoxicacin y toxiinfeccin alimentarios asociados al consumo de productos crnicos de todo tipo, producidos por una gran diversidad de patgenos. Entre las enfermedades de origen alimentario asociadas al consumo de carne y sus derivados causadas por bacterias en forma vegetativa, cabe destacar las asociadas a Salmonella, Yersinia, Campylobacter spp. y Escherichia coli O157:H7. Estos dos ltimos microorganismos se han identificado recientemente como patgenos humanos y presentan un elevado ndice de mortandad entre las personas

afectadas, por lo que han sido motivo de numerosos estudios (Beuchat et al, 1997). Se est trabajando extensamente en todos ellos para establecer las condiciones de conservacin que impidan su presencia.

Considerar en este trabajo a todos los microorganismos descritos resultara prolijo, por otra parte los brotes de origen alimentario asociados a bacterias en forma vegetativa son fcilmente controlables aplicando unas medidas higinicas apropiadas, un tratamiento del producto adecuado y evitando recontaminaciones posteriores a su procesado. Por otro lado la inocuidad de los productos MAP ha sido objeto de un proyecto de investigacin Europeo, en el cual se estudi el efecto de varias condiciones de envasado en el nmero de patgenos (no se incluy al Clostridium botulinum). La conclusin inicial del proyecto fue

que en ningn caso los patgenos crecieron mas rpidamente en el producto MAP que en el testigo envasado en presencia de aire (Shaw 1995). En consecuencia, nos centraremos en dos microorganismos esporulados anaerobios capaces de resistir los tratamientos trmicos suaves proporcionados a los derivados crnicos. Por otro lado el Clostridium botulinum es el microorganismo mas estudiado en relacin al envasado de productos crnicos ya que la intoxicacin que produce su toxina suele ser fatal para el consumidor.

En la carne y sus productos se pueden encontrar bacterias esporuladas patgenas, que son mucho ms resistentes a las condiciones de procesado y que pueden causar intoxicaciones alimentarias, las ms relevantes son Clostridium perfringens y Clostridium botulinum. Las esporas de estos microorganismos presentan una elevada resistencia al calor y a numerosos factores medioambientales, y son capaces de producir toxinas que afectan al consumidor, pudiendo producir una sintomatologa grave.

Clostridium perfringens.- Es un microorganismo anaerobio estricto esporulado con una elevada resistencia al calor (puede sobrevivir a tratamientos de 100C de una a cinco horas) que se encuentra ampliamente distribuido en todos los ambientes. Ha dado lugar a numerosos brotes de intoxicacin asociados a carne y productos crnicos mantenidos a temperatura ambiente. La patogenia de este microorganismo consiste en la ingestin de una elevada concentracin de bacterias en forma vegetativa (que se han multiplicado en alimento) que esporulan en el intestino delgado. Durante la esporulacin produce una enterotoxina que da lugar a diarrea y a la aparicin de contracciones abdominales (Beuchat et al, 1997). Para lograr el control de esta intoxicacin es necesario: Limitar la contaminacin de la materia prima Preparacin del alimento y consumo de inmediato Si ha de almacenarse, mantenimiento en condiciones que no permitan el desarrollo del microorganismo (ms de 65C o refrigerar de forma rpida). Si se han dado condiciones en las que ha podido crecer el microorganismo, recalentar con un tratamiento que garantice la inactivacin de las formas vegetativas y sus toxinas.

Clostridium botulinum.- Es un microorganismo esporulado anaerobio estricto, que agrupa a cepas con caractersticas fisiolgicas distintas y que tienen en comn la produccin de la toxina botulnica. Esta toxina es la sustancia de sntesis natural con mayor toxicidad conocida. La intoxicacin se debe a la presencia de toxina botulnica sintetizada en el alimento y los sntomas a los que da lugar son: sequedad de boca, parlisis flccida muscular y en los casos graves, muerte por parada respiratoria (Lund y Notermans, 1992).

En la Tabla 1 se resumen las caractersticas de las principales cepas responsables de intoxicacin alimentaria (cepas proteolticas y no proteolticas).

Tabla 1: Caractersticas fisiolgicas relevantes en alimentos y productos implicados en brotes de botulismo de origen alimentario. Cepas proteolticas (mesfilas) Temperatura mnima de crecimiento Termorresistencia (D100C) pH limitante del crecimiento Concentracin de NaCl (%) limitante para el crecimiento Tipo de toxina serolgico Brotes que han originado A, B, F Alimentos enlatados de baja acidez, caseros e industriales Riesgo en alimentos Productos enlatados y elaborados crnicos (Peck, 1997) B, E, F Productos de origen marino fermentado Productos mnimamente procesados refrigerados 25 minutos 46 10% <01 minutos 50 5% 10C Cepas no proteolticas (psicrotrofas) 33C

C. botulinum ha causado numerosos brotes de intoxicacin alimentaria asociada no solo a alimentos de origen crnico, como se pone de manifiesto en la Tabla 2. Existen importantes variaciones en funcin del pas donde se han registrado los brotes, debido a que los casos de botulismo se asocian con frecuencia a alimentos tradicionales de cada pas, interviniendo

tambin las diferencias existentes en los hbitos alimentarios. El registro de brotes de botulismo, debido a su sintomatologa clara es muy exacto. No obstante, no en todos los casos se ha determinado si los brotes se asocian a cepas proteolticas o no proteolticas.

Tabla 2. Proporcin de casos de botulismo (en porcentaje) en distintos pases en funcin del tipo de alimento implicado. PAIS ESPAA POLONIA ALEMANIA ARGENTINA CANADA FRANCIA JAPON (Peck, 1997) PERIODO 1969-88 1984-87 1983-88 1980-89 1971-89 1978-89 1951-87 CARNE (%) HORTALIZAS (%) 38 83 78 29 72 89 0 60 5 9 36 8 6 1 OTROS (%) 2 12 13 35 20 3 99

Las cepas proteolticas han sido ampliamente estudiadas y estn claramente establecidos los principios para garantizar su inactivacin o inhibicin: un tratamiento trmico equivalente a F0= 3 minutos a 121C o un tratamiento que garantice una seguridad equivalente a 12 reducciones decimales en el nmero de esporas viables presentes en el alimento.

En cambio, las cepas no proteolticas son menos conocidas, pero pueden suponer un riesgo para alimentos que no sufran un tratamiento trmico elevado (a temperaturas inferiores a 100C) y que se envasen en condiciones anaerobias y se almacenen a temperaturas de refrigeracin, a las que son capaces de crecer y producir toxina. El riesgo es especialmente significativo en aquellos productos que presentan carne como ingrediente, debido a su elevada capacidad reductora (es decir, de generar un ambiente anaerobio). Para poder producir de forma segura estos nuevos productos, que estn experimentando un gran crecimiento en toda Europa, es necesario establecer unas condiciones adecuadas para evitar el riesgo de botulismo asociado a estas cepas. Se han llevado a cabo numerosos estudios para establecer combinaciones de tratamiento trmico y refrigeracin que

garanticen su seguridad. Recientemente se ha descrito el efecto de la presencia de dixido de carbono sobre estas cepas (Fernndez et al 2001). En general, una concentracin del 5% estimula su crecimiento. Adems, se ha puesto de manifiesto que la presencia de lisozima, un enzima que se encuentra presente en numerosos alimentos, entre ellos la carne y el huevo, favorece la recuperacin de las esporas de C. botulinum no proteoltico que han sido daadas por el calor (Peck y Fernndez, 1995, Fernndez y Peck, 1997). En la Tabla 3 se resumen algunos de estos resultados.

Tabla 3. Efecto de distintas concentraciones de lisozima en el tiempo necesario para que se desarrollen y produzcan toximas cepas no proteolticas de Clostridium botulinum calentadas a 90 C durante 20 minutos e incubadas a temperaturas de refrigeracin en un sustrato crnico. Concentracin de lisozima (g/ml) 0 10 50 10 (tras el trat. Trm.) (Peck y Fernndez, 1995) Das requeridos para el crecimiento a cada temperatura 8C No crece No crece 68 13 12C No crece 51 31 6 16C No crece 29 24 3 25C No crece 20 9 2

Por tanto, es necesario aplicar una combinacin de condiciones efectiva para garantizar la ausencia de riesgo microbiolgico en estos productos, que permitan garantizar su seguridad y que contribuyan a la expansin de este sector industrial.. El envasado bajo vaco y en ausencia de oxigeno, junto con una higiene extremada y un buen control de temperatura, puede controlar la alteracin microbiana, mientras que la presencia de cloruro sdico o nitrito ofrece alguna proteccin frente a los patgenos anaerobios. Sin embargo la tendencia actual hacia el consumo de productos con niveles reducidos de sal y nitritos, hace que exista un riesgo potencial de intoxicacin por toxina botulnica. Para ello son de gran utilidad las nuevas herramientas disponibles, microbiologia predictiva, Anlisis de Peligros y Control de Puntos Crticos, Valoracin Cuantitativa del Riesgo. Como consecuencia de la

aplicacin de estas herramientas, el comit ACMSF ha recomendado que la vida til de estos productos crnicos no exceda de 10 das bajo almacenamiento refrigerado.

Herramientas para garantizar la inocuidad de alimentos MAP y VP

Microbiologia predicitva:

Los modelos predictivos microbiolgicos son herramientas tiles para estimar las caractersticas probables de crecimiento o de muerte de microorganismos bajo diferentes combinaciones de parmetros intrnsecos y extrnsecos. Un modelo se describe como un sistema de postulados, datos e inferencias, presentados como una descripcin matemtica de una entidad (Webster 1989). La modelizacin predictiva ofrece a los microbilogos relacionados con la inocuidad de alimentos un medio para describir la supervivencia, el crecimiento y la produccin de toxinas por bacterias patgenas en sustratos controlados por factores con accin conservadora como la temperatura, el pH, la actividad de agua, el potencial de oxidacin reduccin, varios aditivos y sus interacciones.

Dado que en muchas ocasiones en la conservacin de carnes y derivados bajo MPA y VA interviene el calor, se describen los distintos modelos de inactivacin-supervivencvia y crecimiento que actualmente hay disponibles para estudiar y establecer la vida til de estos productos considerando siempre la inocuidad alimentaria de los mismos.

Los modelos predictivos empleados en microbiologa se pueden clasificar de acuerdo a distintos criterios. Los primeros modelos predictivos desarrollados fueron los de inactivacin, reflejando la relacin existente entre la temperatura de esterilizacin y la muerte de los microorganismso con el tiempo de tratamiento a dicha temperatura. Con la introduccin de los alimentos mnimamente procesados (MAP, VP, CAP, sous-vide, entre otros), con una problemtica distinta en cuanto a inocuidad alimentaria, surgi la necesidad de desarrollar modelos predictivos de crecimiento de microorganismos patgenos en funcin de la temperatura y el tiempo de almacenamiento. En el caso de los modelos de crecimiento el trabajo se ha centrado principalmente en los microorganismos patgenos

capaces de crecer a temperaturas de refrigeracin (Clostridium botulinum no proteolitico, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, E. coli, Clostridium perfringens, Salmonella). De este esfuerzo salieron dos programas comerciales, Food MicroModel y Pathogen Modeling Program. Para los modelos predictivos de inactivacin el trabajo se ha repartido entre los microorganismos patgenos, fundamentalmente el Clostridum botulinum, y los alteradores, tanto mesfilos como termfilos.

Si atendemos a los niveles de actividad, los modelos de inactivacin y crecimiento se pueden dividir en primarios, secundarios y terciarios. El nivel primario lo constituyen las ecuaciones matemticas que describen los cambios en el nmero de microorganismos en funcin del tiempo. Estas ecuaciones contienen parmetros primarios con significado microbiolgico a travs de los cuales se cuantifica dicha variacin microbiana con el tiempo.

En el nivel secundario, se encuentran las relaciones matemticas o probabilsticas que describen las variaciones de los parmetros primarios en funcin de cambios en factores ambientales o limitantes.

El nmero de microorganismos que muere o crece a una temperatura dada cuando cambian algunas condiciones medioambientales que rodean al alimento es un ndice del impacto que tales cambios pueden tener sobre la inocuidad alimentaria. Para determinar este nmero de microorganismos, los valores para dichos factores se introducen en los modelos secundarios con lo que se obtienen valores concretos de los parmetros primarios. Con estos valores y mediante el uso de los modelos primarios se puede obtener la curva de crecimiento o inactivacin correspondiente a esa combinacin de valores medioambientales.

Para facilitar el uso de las ecuaciones de los modelos primarios y secundarios se desarrollan programas de ordenador, tan sencillos como pudiera serlo una hoja de calculo o tan complejos como aquellos escritos en un lenguaje de alto nivel como C++ o basic. Estos programas se conocen como modelos de nivel terciario de los que comercialmente ya hay algunos.

MODELOS PRIMARIOS. La microbiologa predictiva empez por los aos 20. Bigelow y Esty (1920) publicaron sus trabajos sobre los clculos del tiempo de muerte trmica. Con ello se pretenda aumentar el nivel de inocuidad alimentaria frente al Clostridium botulinum, dotando a la industria y a las Agencias Reguladoras de una herramienta eficaz para comparar

tratamientos y evaluarlos. Las curvas de supervivencia para calcular el valor del parmetro primario D (coeficiente de reduccin decimal) representaran el modelo de nivel primario (Tabla 4). La curva de supervivencia aporta datos sobre la velocidad de destruccin de un microorganismo especfico en un substrato especfico a una temperatura dada, siendo la velocidad de inactivacin constante e independiente del nmero inicial de

microorganismos.

Un aspecto importante del valor D en trminos de inocuidad alimentaria es que ha permitido la elaboracin posterior de parmetros como el FT. Este parmetro cuantifica la letalidad para alcanzar un nmero de reducciones decimales en el valor D previamente establecido mediante el uso de la ecuacin 1.

Frequired = D(ln N 0 ln N )

ecuacin 1

Es incuestionable el record de la industria conservera en cuanto a la ausencia de casos de Clostridium botulinum registrados tras muchos aos de aplicacin de este modelo primario. La aplicacin exitosa de estos principios proporciona un testimonio elocuente de la validez y utilidad en garantizar la inocuidad alimentaria en sus reas de aplicacin tradicionales (industria conservera).

Tabla 4: Modelos primarios utilizados para describir las curvas de inactivacin Exponential ln( N ) = ln( N 0 ) kt
k= 2.303 D

Logistic

ln( N ) = +

log(t ) 1 + exp 4

Weibull distribution

N N 0

bt n = exp

La industria de alimentos es un ente dinmico que constantemente est modificando y desarrollando procesos y productos, tratndose de adaptar a las nuevas necesidades

sociales y preferencias del consumidor. Este dinamismo hace que la inocuidad alimentaria, o los pilares en los que se basa esta inocuidad alimentaria se estn replanteando. No cabe ya ninguna duda que la microbiologa predictiva forma parte importante de los programas para garantizar la inocuidad alimentaria de los elaborados. Sin embargo, es necesario conocer los lmites del modelo o modelos y las alternativas posibles para garantizar la inocuidad alimentaria si el modelo no es adecuado en unas condiciones concretas. Por ejemplo, frecuentemente se han encontrado cinticas de inactivacin no lineales, sobre todo cuando se utilizan nuevas tecnologas (pulsos elctricos, procesos combinados en los que intervienen antimicrobianos, etc.) (Rodrigo et al 2001). En estas circunstancias, usar

valores D para establecer niveles de letalidad requeridos o para comparar la eficacia de los tratamientos puede llevarnos a situaciones de infra-procesado. La respuesta a esta situacin es la bsqueda de nuevas ecuaciones o la aplicacin de nuevos conceptos sobre la inactivacin de los microorganismos. Peleg y Cole (1998) propusieron el uso de la distribucin de probabilidad de Weibull, en el caso de las curvas de supervivencia que no seguan una cintica logartmica. Fernndez et al (1999) demostraron el potencial del

modelo de Weibull al aplicarlo a datos experimentales de dos cepas del microorganismo patgeno Bacillus cereus..

La creciente demanda de alimentos de conveniencia, parecidos a fresco y beneficiosos para la salud ha conducido al mercado principalmente europeo y norte americano hacia los alimentos cocidos-refrigerados de durabilidad extendida, muchos de ellos envasados en atmsferas modificas o controladas. Los medios tradicionales para controlar la alteracin del alimento y garantizar la inocuidad microbiolgica (calor, congelacin o curado) no son compatibles con las demandas de este mercado que se est abriendo. Los conceptos tradicionales de inocuidad tampoco son extrapolables a este tipo de productos. Histricamente la calidad e inocuidad microbiolgica de estos alimentos se ha determinado mediante ensayos de vida til o inoculacin experimental de envases. Este tipo de ensayos lleva consigo la inoculacin del alimento con microorganismos que se sabe causan problemas en el alimento a evaluar. Esto implica la realizacin de mltiples ensayos con base estadstica, los que adems de costosos en tiempo y dinero no resultan de aplicacin a otras condiciones distintas a las ensayadas. Por ello ha sido tan importante el desarrollo de herramientas que permitan una estimacin cuantitativa previa respecto del efecto de

distintos factores y procesos en la alteracin microbiolgica y en el riesgo para la salud. Si se modeliza el comportamiento de los microorganismos respecto a los principales factores se pueden calcular respuestas de crecimiento bajo condiciones no ensayadas con anterioridad. Mediante la aplicacin de modelos predictivos es posible reducir fundamentalmente el nmero de ensayos o solamente aquellos necesarios para una validacin en el alimento de los valores predichos por el modelo, con la consiguiente economa de recursos. Poder ensayar en el ordenador distintas combinaciones de factores permite elegir aquella que ms inocuidad alimentaria proporciona.

Los primeros modelos predictivos de crecimiento de nivel primario predecan el tiempo para crecimiento o de formacin de toxina para el Clostridium botulinum. Estos modelos no indican la velocidad o la extensin del crecimiento pero los trabajos llevados a cabo han puesto de manifiesto los factores ms importantes y las interacciones que pueden influir en el crecimiento microbiano. El tiempo para crecimiento o formacin de toxina dan una

indicacin del impacto de los cambios en la formulacin del producto o condiciones de almacenamiento sobre la vida til y por extensin el resultado es un ndice de inocuidad alimentara.

El aumento del conocimiento sobre el comportamiento de los microorganismos y el incremento de la capacidad de las computadoras ha propiciado el desarrollo de modelos predictivos de nivel primario ms sofisticados. En estos modelos llamados de crecimiento, se intenta ajustar los datos experimentales a una curva de la cual se pueden deducir parmetros importantes que definen las caractersticas de crecimiento de un microorganismo en particular en unas condiciones dadas. Estos modelos son ms flexibles que los de tiempo para crecimiento o formacin de toxina.

Tabla 5: Modelos predicitvos primarios para describir el crecimiento de los microorganismos Exponential ln( N ) = ln( N 0 ) + t Logistic ln( N ) = ln( N 0 ) + a [1 + exp(b cx )]

Gompertz e (reparametrized) ln( N ) = ln( N 0 ) + A exp exp max ( t ) + 1 A (Zwietering et al 1990) Baranyi exp( max An (t ) 1) ln( N ) = ln( N 0 ) + max An (t ) ln 1 + (Baranyi and exp( A) Roberts 1994)

Tradicionalmente el modelo usado par curvas de crecimiento ha sido la ecuacin de Gompertz (Whiting and Buchanan 1997 ). Esta ecuacin tiene tres parmetros importantes: C, es el cambio en el nmero de clulas entre el inculo y la fase estacionaria, B es el ritmo de crecimiento relativo y M es el tiempo al que se el ritmo mximo de crecimiento. Este modelo tuvo un gran impacto en el establecimiento de criterios de inocuidad alimentara en alimentos refrigerados. No obstante el modelo tiene fallos (Whiting and Buchanan 1997). El periodo de latencia predicho no es estrictamente horizontal, tambin la ecuacin se curva de manera continua y no existe un perodo de incremento lineal. El

proceso de ajuste tiende a dar valores ligeramente ms grandes que los correspondientes valores de crecimiento obtenidos del perodo de crecimiento lineal.

Baranyi et al (1994) trataron de solucionar estos problemas aportando una fase ms mecanstica o biolgica . Este modelo incluye una fase de crecimiento exponencial lineal y una fase de latencia que se calcula mediante una funcin de ajuste.

MODELOS SECUNDARIOS

En muchas ocasiones interesa valorar el efecto de los cambios en formulacin los errores de proceso sobre los parmetros cinticos que definen la muerte o el crecimiento de los microorganismos.

Por ejemplo, aumentar el valor del pH del alimento puede originar que el valor para el parmetro D de termorresistencia del microorganismo patgeno aumente. Esta nueva situacin puede hacer que las condiciones de procesado desarrolladas en base al valor original de D, sean inseguras bajo el punto de vista de inocuidad alimentaria. Un modelo matemtico de nivel secundario puede proporcionar el nuevo valor para el parmetro D y por consiguiente, evaluar el impacto del cambio sobre la inocuidad alimentaria del

producto sin necesidad de esperar varios das para obtener los resultados de laboratorio del producto acabado.

Imaginemos un alimento en el que se ha reducido la concentracin de sal, el modelo predictivo puede comparar el tiempo para crecimiento considerando las dos formulaciones, la nueva y la vieja, en condiciones de abuso de temperatura de refrigeracin. Los modelos secundarios pueden por tanto guiar las pruebas sobre el producto y sugerir cambios en las formulaciones mediante mltiples y rpidos ensayos en el ordenador observando el efecto de estos cambios sobre, en este caso, los parmetros cinticos.

El primer modelo de nivel secundario fue la curva de muerte trmica que proporciona el cambio del parmetro D con la temperatura de calentamiento. La inversa negativa de la

pendiente de la recta de regresin es el parmetro Z cuya expresin matemtica se puede apreciar en al tabla 6. Este parmetro ha tenido un significado especial en los clculos de procesos de esterilizacin. Por ejemplo, la letalidad alcanzada por un proceso, es decir, el grado de inocuidad microbiolgica del alimento frente al Clostridium botulinum, se puede calcular mediante la ecuacin 2 donde interviene el valor z que en el caso del Clostridium botulinum vale 10C.

Fo = 10

T -TR 10

ecuacin 2

El aumento de la capacidad de clculo de los ordenadores ha permitido desarrollar modelos ms sofisticados donde pueden intervenir varios factores, pH, aw, concentracin de ClNa, temperatura, etc. Estos modelos se han desarrollado tanto para inactivacin como para crecimiento.

Uno de los primeros modelos publicados para predecir el efecto combinado de la temperatura y del pH sobre la cintica de destruccin trmica de los microorganismos fue el de Davey et al (1978) (Tabla 5). El modelo basado en la ecuacin de Arrhenius tena cuatro parmetros. Otros autores se han basado en la ecuacin de Bigelow para desarrollar sus modelos, Mafart y Legerinell (1998) modelizaron el efecto del pH y la temperatura sobre el valor D. Otros modelos muy utilizados han sido los polinomiales de primer o segundo grado. Periago et al (1998) desarrollaron un modelo predictivo que combinaba el efecto de la temperatura el pH y la concentracin de ClNa.

En cuanto al efecto de los factores medioambientales sobre algunos de los parmetros de las curvas de crecimiento las ecuaciones usadas con ms frecuencia son las relacionadas con superficies de respuesta (modelos polinomiales), la relacin de Arrhenius y el modelo de raz cuadrada.

Los modelos de superficie de respuesta son ecuaciones de regresin que se ajustan usando tcnicas de regresin estndar y pueden contener trminos cuadrticos, cbicos o recprocos

incluyendo adems las interacciones entre los factores considerados (Buchanan et al 1989, Palumbo et al 1992). En estos dos modelos como en los descritos para inactivacin, se predice el valor de, por ejemplo, la constante de velocidad cuando cambia el pH, la actividad de agua o cualquier otro factor medioambiental.

Tabla 6: Modelos de inactivacin secundarios

z-concept

D T Tr log r = z D

Linear b c d log k = a + + + Arrhenius T pH pH 2 Davey (Davey 1993) Polynomial log(D ) = a + b1T + b2 pH + .....bi T 2 (Fernndez et al 1996) Bigelow based 1 1 * model (Mafart log(D ) = log D + T T zpH and zT Legurinel 1998)

+ 2 ( pH pH )

Tabla 7: Modelos de crecimiento secundarios log( ) = a + b1T + b2 pH + .....bi T 2 Linear Arrhenius-Davey (Buchanan and b c ln ( ) = a + + 2 + daw + eaw 2 Phillips 1990) T T Square root ( Whiting 1995) k = a (T T0 )
Polynomial

La relacin de la velocidad de crecimiento con la temperatura se puede modelizar como las velocidades de reaccin qumica mediante el uso de la formula de Arrhenius, donde el logaritmo de la velocidad de crecimiento es inversamente proporcional a la temperatura absoluta. Davey (1989) obtuvieron un modelo lineal de Arrhenius para el efecto de la temperatura y la actividad de agua.

El modelo de raz cuadrada se basa en la relacin que existe entre la raz cuadrada de la velocidad de crecimiento y la temperatura.

Conclusin

La mayor ventaja del procesado MAP y VP parece ser la inhibicin de los mecanismos de alteracin como son el crecimiento de organismos aerbicos o la oxidacin que ocurre en productos envasados con aire. La inhibicin de estos mecanismos de alteracin permite incrementar la vida til de los productos MAP en comparacin con el envasado convencional. El xito de la tecnologa MAP no depende simplemente de la eliminacin del aire del interior del envase, sino que es necesario tambin escoger una correcta mezcla gaseosa y conseguir unas buenas condiciones de almacenamiento refrigerado. La mezcla gaseosa va a influir en la calidad del producto envasado y en los niveles y tipos de organismos que pueden de estar presentes, por lo que el balance entre dixido de carbono, nitrgeno, y oxgeno es crtico para conseguir la inocuidad del producto..

El principal problema es que los productos MAP no son susceptibles de los mecanismos usuales alteracin de los productos envasados en aire y por tanto pueden ser peligrosos ya que aparecen ante el consumidor como organolpticamene aceptables, por esta razn la seguridad de los alimentos MAP y VP debe recaer tambin en otros factores como la temperatura de refrigeracin, valores de pH bajos, tratamiento trmico suave en conjuncin con el MAP o el VP. Para el establecimiento de estas nuevas condiciones de conservacin y almacenamiento, la microbiologa predictiva y su aplicacin en los planes de Anlisis de Peligros y Control de Puntos Crticos o Valoracin Cuantitativa del Riesgo puede desempear un papel esencial en trminos de inocuidad alimentaria.
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