MATERIALES DE LABORATORIO

Materiales de uso en el laboratorio 1. El Vidrio - tiene una gran resistencia quimica (acidos, bases), mecanica y estabilidad termica; vidrio de borosilicato (Pyrex, Kimax) - gran resistencia termica. Precauciones: cambios bruscos de temperatura / tensiones termicas; colocar en la estufa de secado o esterilizacion en frio, calentando despues, acabado en tiempo de secado o esterilizacion ==> dejar enfriar antes de retirarlo; no aplicar fuerza sobre llaves, tapones; no someter a variaciones bruscas de presion; no conservar soluciones concentradas de alcalis en vidrio de borosilicato ==> condiciones causticas destruyen la calibracion del vidrio. 2. El plastico - de usar multiple (probetas, matraces, vasos de precipitado); de un solo uso / desechables (puntas de pipeta, placas de petri, cubetas de espectrofotometro); las ventajas - resistencia a la rotura y su bajo peso; hechos de monomeros organicos polimerizados; desventaja: no soportan temperaturas elevadas, pueden ser atacados por disolventes organicos y acidos o bases fuertes. 3. La porcelana - resisten altas temperaturas y tiene un gran uso en analisis gravimetrico; estan vidriados totalmente o por su parte interna para evitar la adherencia de particulas a sus paredes. Material Volumetrico - Mediciones de Volumen Todo el material volumetrico esta calibrado para ser utilizado de una forma determinada y a una temperatura estandar (20oC); volumen ocupado por una determinada masa de un liquido varia con la temperatura. Instrumentos volumetricos con sus tipos de calibracion: - Instrumentos calibrados para verter (vert, Ex o TD): pipetas, buretas (la cantidad de liquido que permanece adherido a la pared del vidrio, debido a la humectacion, se ha tenido en cuenta al realizar la calibracion. - Instrumentos calibrados para contener (cont, In o TC): matraces aforados (la cantidad de liquido vertido se encuentra reducida en la cantidad de liquido que permanece adherida a la pared del vidrio. Error de paralaje - desplazamiento aparente de un objeto cuando se observa desde diferentes puntos debido a un defecto de posicion del operario. Al leer el volumen, el ojo debe estar al mismo nivel que el menisco/ marcada curvatura (por encima de menisco = volumen menor; por debajo de menisco = volumen mayor). Linea de enrase - el ojo debe estar al mismo nivel que la superficie de liquido. Matraces aforados (para contener liquidos - no verter): - forma de pera con fondo plano o ligeramente convexo y cuello largo, estrecho. - el extremo cerrado por tapon hermetico de vidrio esmerilado o caucho o plastico. - lleva marcada una linea delgada (de aforo) que indica la capacidad. - en las paredes, se indica la capacidad y a que temperatura deben utilizarse. - algunos estan calibrados para verter con 2 aforos o escala graduada en el cuello - volumen: 0,025 lt - 1 lt - se usan principalmente para la preparacion de disoluciones valoradas (concentracion conocida) y diluir muestras hasta un volumen fijo 1.preparar una disolucion a partir de un producto solido: se pesa el producto, se traslada a un vaso de precipitado, se disuelve con pequeo vol de disolvente, se trasvasa al
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matras aforado con embudo, lavando varias veces el vaso con el disolvente, se llena el matraz con el disolvente hasta la linea de aforo, se homogeneiza por rotacion y se aade disolvente gota a gota hasta la linea de enrase. 2.preparar una disolucion a partir de un liquido: se mide el volumen con una pipeta o probeta, se deja caer resbalando por la pared dentro del matras aforado, se aade el disolvente de la misma forma explicada anteriormente. Pipetas manuales (para transferir: 1 ml - 50 ml): - capacidad 1,2,3,4,5,10,25,50 mililitros. - llevan grabadas la capacidad y la temperatura a la que deben utilizarse en sus paredes - llevan banda de color oscuro como codigo del volumen, presicion, tiempo de espera etc. 1.pipetas manuales (volumetricas) - medir un solo volumen de liquido (indicada su capacidad y la temperatura de uso) 2.pipetas graduadas - medir un volumen cualquiera hasta su capacidad maxima. Manejo - succionar suavemente, aspirando despacio, cerrar el extremo superior con el dedo indice, separar la pipeta del liquido y colocar la linea de enrase a la misma altura de los ojos, disminuyendo ligeramente la presion del dedo para dejar pasar el liquido hasta que la parte inferior del menisco coincida con el enrase. - nunca deben pipetearse directamente con la boca liquidos corrosivos o venenosos (los acidos concentrados). - nunca deben soplarse para eliminar las ultimas porciones de liquido. - se puede utilizar aspiradores que se incorporan a la parte superior. Micropipetas (pipetas lambdas) - para transferir cantidades muy pequeas de liquidos (1 - 500 microlitros/ lambdas); Lang-Levy - muy exactas, pero muy poco utilizadas por su fragilidad y dificultades de limpieza. Micropipetas automaticas (Eppendorf) - mayor precision, disminuye a fatiga de repetidas tareas, ventajosas en inmunoanalisis; funcionan mediante un piston, llevan puntas desechables de plastico (evitar contaminaciones), en volumen fijo o variable; algunas con dispositivo para la expulsion de la punta de plastico; para sustancias que reaccionan con el plastico ==> micropipetas con capilares de vidrio. Probetas (menos exactos / poca precision) - con un pico en la parte superior para facilitar el vertido del liquido o con un tapon para contener. Dispensadores automaticos - para agregar repetidamente un determinado volumen de un reactivo o diluyente a una solucion. Utensilios Basicos de Laboratorio 1- Vasos de precipitado (no son exactos / no calibrados) - para verter facilmente los liquidos; para la preparacion de reacivos y como contenedores de sustancias. 2- Matraces Erlenmeyer (no son exactos) - vasijas de fondo plano y cuello corto; condensa vapores o retarda la evaporacion; contener las disoluciones a valorar. 3- Embudos - los que hay para filtrar, para transferir liquidos o solidos y de separacion con llave en el extremo inferior. 4- Tubos de ensayo y tubos de centrifga - redondo, conico en punta, conico. 5- Frascos lavadores - capacidad de 500 a 1000 mililitros. 6- Varillas de vidrio y puente de tincion 7- Gradillas
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8- Escobillas y escobones 9- Triangulos Material especifico del laboratorio clinico 1- Porta objetos 2- Cubreobjetos (cubres) - 18x18, 22x22, 22x32 mm 3- Placas de Petri 4- Cubetas 5- Recipiente de muestras 6- Pipetas Pasteur y pipetas cuentagotas 7- Asas de siembra Camaras de Recuento - constituida por una placa base de vidrio especial de tamanyo semejante a portaobjetos; la parte central es separada de los extremos por unas ranuras, esmerilada y pulida donde se encuentra las cuadriculas de recuento; si un portaobjetos se coloca encima del campo central existe una ranura de 0,1 mm. Neubauer improved - sistema de camaras de recuento mas utilizado en la actualidad; la profundidad de la camara es de 0,1 mm; la cuadricula de recuento muestra consiste en 9 cuadrados grandes, cada uno de 1 mm2. Limpieza del material de laboratorio Tipos de limpieza: 1- Limpieza a mano por frotado: por arrastre mecanico de la suciedad con un cepillo (si es necesario), agua del grifo, jabon y lejia, se enjuaga bien con mas agua y al final se enjuaga con agua destilada de un frasco lavador. El utensilio que no sea de plastico, seca en la estufa durante 30 minutos. 2- Limpieza a mano por inmersion: se colocan los aparatos en la solucion de limpieza, totalmente cubiertos durante 20-30 minutos, se enjuaga con agua corriente y al final con agua destilada. 3- Limpieza a maquina: maquinas lavadoras Metodos de purificacion del agua 1- Destilacion (se obtiene agua de tipo I o II): el agua se calieta hasta la evaporacion, condensandose a continuacion; se obtiene agua exenta de sustancias extraas y con muy baja conductibilidad (aparato - destiladores en acero inoxidale o de vidrio); se puede obtener agua bidestilada mediante un agente oxidante (permanganato potasico) que destruye materias organicas subsistidos despues del primer proceso. Inconvenientes: no elimina impurezas como el amoniaco, dioxido de carbono, cloro y algunos compuestos organicos; acumulacion en el destilador de las materias no volatiles que necesitara una limpieza periodica del mismo. 2- Desionizacion (se obtiene agua de tipo 2 o 3): purifica el agua que pasa a traves deuna columna portadora de lechos de resinas de intercambio ionico acidas o basicas o una mezcla de ellas; las resinas son capaces de eliminar las impurezas cargadas positivamente o negativamente; la vida de la columna es limitada y puede ser regenerada con tratamiento alcalis o acidos (es necesario el control del agua obtenida).Inconvenientes: no elimina componentes organicos ni microorganismos; conveniente realizar una purificacion preliminar. Para obtener agua

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de tipo I, es necesaria un tratamiento posterior con carbon activado o filtros para eliminar microorganismos y impurezas organicas. 3- Osmosis inversa (se obtiene agua del tipo III): el paso bajo presion del agua a purificar a traves de membrana semipermeable que detiene particulas inorganicas y organicas (eficacia 90 - 100); es utilizado como sistema preliminar de purificacion del agua antes de pasar por una unidad desionizadora. 4- Filtracion (se obtiene agua del tipo III): el paso de agua a traves de membranas semipermeables; la calidad de la filtracion sera inversamente proporcional al tamao del poro del filtro. 5- Adsorcion: se utiliza como agentes adsorbentes el carbon vegetal activado, arcillas, silicatos; mediante el paso del agua a traves de estas sustancias se logra principalmente la remocion de impurezas organicas.

APARATA JE DEL LABORATORIO

A. Bao Maria - recipiente con agua i el control de temperatura a traves del termometro (entre temp ambiente y 100C) que se puede ajustar con resistencia que calienta el agua (lo normal 37C). Se utiliza para incubar sueros, reactivos etc. B. Centrifuga - acelera la sedimentacion natural de una disolucion; consta de un rotor donde se coloca las muestras. Tipos de cabezal: - cabezal horizontal u oscilante: oscilan libremente entre las ramas del motor; las muestras dentro de los contenedores ocilan hasta poner en posicion horizontal, agulo recto con el eje del rotacion. - cabezal angular de angulo fijo: los tubos de muestra estan en posicion fijo formando un angulo entre 25-40 con el eje de rotacion o tambien puede ser en angulo de 90 en caso de hematocrito. El eje de la centrifuga - soporta el rotor y actua como el eje de la rotacion El rotor Los accesorios - temporizador, alarma, la luz. Utilidad: - separar suero /plasma de una sangre total, centrifugar 3000 rpm, 10-15 minutos - concentrar celulas 10.000-15.000, 10-15 minutos - sedimentos de liquidos biologicos (orina, liquido sinovial, etc.) Manejo: tubos resistentes a la centrifugacion; tapas cerradas; equilibrar correctamente la centrifuga; tacometro - chequear la velocidad de la centrifuga; limpieza periodica de la centrifuga. C. Autoclave (una olla de presion) - produce esterilizacion (capacidad de destruir todos los microorganismos incluyendo formas esporadas /esporuladas en virus de la hepatitis B que son capaces de sobrevivir a > de 100C) por calor humedo a presion;esterilizacion ==> metodo fisico y quimico (controles con tiras de papel). Descripcion - camara esterilizadora con tapa hermetica; fuente de calor con resistencia electrica; un deposito de agua coneccion directa a la parte inferior del autoclave; sistema de purga de aire para evacuar el aire del interior de la camara esteril; valvula de seguridad que se descarga cuando sobre pasa y manometro y termometro para regular la presion y la temperatura.

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Utilidad - esterilizar ropa, gomas, metales, liquidos; en general la presion es atmosfera y temperatura 120C, tiempo 15 minutos. D. Estufas y Hornos - mantener en el interior una determinada temperatura a lo largo de un tiempo; tipos - 1. estufas bacteriologicas o de cultivo; temperatura - ambiente hasta 60C; 2. estufas para desecacion y esterilizacion con temperatura 50-300C. Consta - caja interior con pared metalica, doble aislamiento, una puerta frontal (doble en estuva de cultivo), fuente de calor electrica y circulador de aire; las estufas de bajas temperatura utilizadas en el lab para la incubacion de germenes y para la incubacion de tecnicas inmunologicas; las que son de mas temperaturas ==> secado de material y esterilizar. E.Basculas y Balanzas - masa y peso son intimamente unidos y confunden tomarlos como sinonimos; hay que diferenciar claramente. Masa - mide la cantidad de materia de un objeto y es invariable Peso - valor de la fuerza con que un objeto es atraido hacia el centro de la tierra, debido a que la atraccion de la gravedad varia con la altitud y latitud geografica; el peso es una unidad variable. Condiciones que debe cumplir una Balanza: - balanza exacta: cuando al aadir masas identicas a cada uno de los platillos no se modifica la posicion del equilibrio. - balanza electronica exacta: en el display aparece un 0 sin intermitente. Fidelidad/ precision - caracteristicas mas importantes de la balanza; si se repite varias veces una misma pesada, se obtiene el mismo resultado. Sensibilidad - define la calidad de la balanza; la masa mas pequea que es capaz de modificar el 0 de reposo de una balanza electronica. Capacidad de carga - maxima carga que es capaz de pesar una balanza Clasificacion segun su construccion - 1. mecanicas 2. electronicas Clasificacion segun su sensibilidad - 1. de precision 2. analiticas Balanzas de precision - su sensibilidad comprendidas entre 0,1gr - 0,01gr ( 100 mgr 10mgr) Balancas de analitica - su sensibilidad igual o menos de 0,001 gr (1 mgr)

DISOLUCIONES Y DILUCIONES
Disoluciones - mezclas intimas de dos o mas cuerpos diferentes que nos ofrecen a simple vista un aspecto homogeneo; cuerpo disperso o soluto (menor proporcion) ycuerpo dispersante o disolvente (mayor cantidad); disolucion en agua => disolucion acuosa; estado fisico de disolvente o soluto puede ser solido, liquido o gaseoso; la disolucion adopta el estado fisico del disolvente. Disolucion saturada - cuando se alcanza el limite cantidad (maxima) de soluto que se puede disolver en un disolvente a determinada temperatura; disoluciones diluidas - baja cantidad de soluto; disoluciones concentradas - cerca de la saturacion. Porcentaje en volumen (%v) - expresa los mililitros de soluto contenidos en 100ml de disolucion; % v = ml de soluto / ml de disolucion x 100

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Porcentaje en peso - volumen (% p/v) - expresa los gramos de soluto contenidos en 100ml de disolucion; % p/v = g de soluto / ml de disolucion x 100 Diluciones - aumentar la cantidad de disolvente de una disolucion ==> dos soluciones con distintas concentraciones, pero que contienen la misma cantidad de soluto; e.j. diluir muestras o reactivos para obtener concentraciones adecuadas a las tecnicas; la perfecta preparacion de estas diluciones es imprescindible para obtener resultados correctos. Si diluimos una solucion, el volumen de la misma aumentara a la par que disminuye su concentracion, mientras que la cantidad de soluto presente permanecera constante; 2soluciones con distintas concentraciones, pero que contienen las mismas cantidades de soluto, estan relacionadas de la siguiente forma; V1 x C1 = V2 x C2; unidad C ==> gr / lt; V ==> ml C2 = V1xC1 / V2 = C1 x V1/V2 El cociente de volumenes se domina cociente de dilucion y se representa 1/d: C2 = C1 x 1/d Para calcular la concentracion de la nueva solucion diluida, hay que multiplicar la concentracion inicial por el cociente de dilucion. Tendremos que dividir la concentracion inicial entre factor de dilucion. En Inmunologia es frecuente la utilizacion de diluciones seriadas (despues de la primera son todas iguales). La razon de dilucion entre ellas es de sin modificarse el volumen de los tubos. Ejercicios: 1. Preparar 1 lt de etanol al 5% (v/v) ==> 50 ml de etanol + 950 ml de agua ==> hasta completar 1 lt 2. Preparar 500 ml de etanol al 40% (p/v) a partir de etanol del 70% (p/v) ==> hay que averiguar el vol de solucion inicial que ha de coger ==> V2 = 40 x 500 /70 = 285,7 ml + agua ==> hasta completar 500 ml 3. Preparar 250 gr de solucion NaOH al 10% partiendo de un reactivo al 80% de pureza ==> hay que averiguar el peso de soluto NaOH de concentracion inicial 80% que ha de coger ==> 250 x 10 /80 = 31,25 gr + agua ==> hasta completar 250 gr de solucion liquida.

COMPOSICIN Y CARACTERISTICAS DE LA SANGRE (FISIOLOGIA SANGUINEA)

La sangre - un liquido, espeso, viscoso y rojo, esta compuesta por una suspension de celulas en un medio acuoso, impulsada a traves de los vasos sanguineos por la accion motora del corazon. Volemia - 70 ml/kg de peso corporal (80% del peso corporal??) ==> 70 kg = 5 lt de sangre. Viscosidad - la resistencia que ofrece un fluido a deformarse (la sangre es 5 veces la del agua) y depende del hematocrito y la concentracion proteica del plasma. Temperatura = 37 oC; Ph = entre 7,3 - 7,4; Nacl = igual que el agua del mar (3,5%) Composicion:
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1. Fraccion forme - 45% del volumen total (hematocrito) compuesta por eritrocitos, leucocitos y plaquetas. Hematies - biconcavas, anucleadas, contiene proteina compleja Hemoglobina que da color rojo a la sangre y transporta O2/CO2, 4,5 millones /mm3, vida media de 120 dias y se producen en MO. Leucocitos - redondadas y nucleadas, granulocitos (PMN neutrofilos, PMN eosinofilos y PMN basofilos), agranulocitos (linfocitos, monocitos), 5.000 - 10.000 /mm3, producidos en MO (linfocitos se desarollan en el timo, funcion de defensa). Plaquetas - fracciones citoplasmaticas celulares de los megacariocitos (no son celulas completas), producidos en MO, intervenir en la coagulacion, 150.000 - 400.000 /mm3, vida media de 10 dias. 2. Fraccion liquida - 55% de total, transparente y ambarino, 90% agua; regulacion de la temperatura corporal; 10% ==> glucidos - glucosa (funcion energetica), lipidos - TG, colesterol, etc (funcion energetica y reserva); proteinas - albumina: reserva proteica, 55% de total porteinas plasmaticas, transporte de sustancias, concentracion 3 - 4,5 gr/dl, - globulinas - funcion inmunologica y transporte, fraccion muy heterogenea; se clasifican por electroforesis en alfaglobulinas, betaglobulinas y gammaglobulinas; 38% del total; fibrinogeno - 0,3% del total; funcion de la coagulacion sanguinea; cuando al plasma se le retira el fibrinogeno se le domina suero; funcion de proteinas plasmaticas: nutricion celular, transporte, mantener la presion osmotica; funcion inmunologica, coagulacion sanguinea; electrolitos (sodio, potasio, cloro, calcio); sustancias reguladoras(hormonas, enzimas, vitaminas); producto de deshecho (acido urico, urea, creatinina, bilirubina) Funcion de la sangre: 1. transporte de O2 y CO2 mediante la hemoglobina, transporte de sustancias (sustancias absorbidas tras la digestion, medicamentos, secreciones hormonales, liquido intersticial) 2. defensiva de leucocitos (funcion fagocitica y produccion de anticuerpos que destruyen a microorganismos patogenos, protegiendonos de las infecciones) 3. Termoreguladora de la temperatura corporal (homeostasis). 4. Antihemorragica o hemostatica de las plaquetas y de los factores plasmaticos de la coagulacion, cuando se lesiona un vaso, la sangre detiene sus propias perdidas. 5. Funcion excretora que conduce productos de desecho de catabolismo hasta organos de excrecion (riones). El circuito de aparato circulatorio - Vasos sanguineos 96.550 km - desde el corazon la sangre pasa por las arterias (sangre arterial u oxigenada) ==> arteriolas ==> capilares (se produce intercambio gaseoso y nutritivo con las celulas) ==> venulas ==> venas ==> corazon.

ESPECTROFOTOMETRIA
La naturaleza de la radiacion electromagnetica La radiacion electromagnetica - una forma de energia radiante

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Longitud de onda - la distancia entre dos max de un ciclo completo del movimiento ondulatorio (unidad nanometros 1nm = 10 -9 m = 1 mu = 10 A) Frecuencia - numero de ciclos por segundo >< longitud de onda Fotones - paquetes discontinuos de energia que depende de su freq y long de onda Longitud de onda >< energia de radiacion electromagnetica El espectro electromagnetico - cubre un intervalo de energia radiante desde rayos gamma (long de onda corta) hasta ondas de radio (long de onda larga); ojo humano puede captar 380 - 750 nm en color complementario; instrumentos puede captar onda mayores (IR) y menores (UV); luz solar o luz de filamento de tungsteno - mezcla de radiaciones de distinta longitud de onda ( luz blanca). La interaccion entre luz y materia (absorcion o emision energetica) 1. Proceso de absorcion - particula en estado de reposo o fundamental interacciona con un haz de luz ==> estado excitado ==> regresar espontaneamente al estado fundamental, desprender energia absorbida en forma de calor. Espectro de absorcion - caracteristico de cada especie absorbente (cromogeno/solucion que absorbe la luz) representa la relacion entre la longitud de onda incidente y la absorbancia en condiciones definidas; utilidad - seleccionar la longitud de onda mas adecuada (absorcion maxima) para una medida cuantitativa y identificacion cualitativa. 2. Proceso de emision - compuestos que tras ser exitados, de retornar a su estado fundamental produce emision de energia radiante que se puede medir por tecnica fotometria o fluorescencia. Espectrofotometria de absorcion - la medida de la radiacion que llega a un detector tras producirse absorcion de luz por parte de una sustancia absorbente. En analisis clinica el espectro: 220 - 800 nm. Fotometro o colorimetro - emplea filtros Espectrofotometro - emplea monocromadores prismas o redes de difraccion (ventajas: sensibilidad elevada, determinaciones rapidas y grado de especificidad alto) LEYES DE ABSORCION Transmitancia - la relacion entre la luz incidente y la luz transmitida (intensidad menor) Solucion de referencia (blanco) - se tara para evitar interacciones por parte del solvente o cubeta, asi se mide solo la absorcion del compuesto de interes. Absorbancia - no es una cantidad medible; se calcula a partir de la transmitancia (la concentracion >< y logaritma transmitancia; la concentracion =proporcional la absorbancia) La ley de Beer - la absorbancia de una solucion es directamente proporcional a la concentracion y a la longitud del paso de luz; aplicacion: averiguar la concentracion de una sustancia de interest en una solucion, basandonos en la relacion lineal: 1. por comparacion con una solucion conocida: Ast/Ap = Cst/Cp o Cp = Cst x Ap/Ast 2. curva de calibracion: ensayar varias soluciones de concentraciones conocidas en identicas condiciones y determinar sus absorbancias ==> se construye la curva de
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calibracion (recta) ==> averigua por interpolacion de las absorbancias de las soluciones problema en la recta de calibracion. Cuando la concentracion de cromogeno en la solucion sobrepasa los limites de linearidad, la ley de Beer deja de cumplirse, conviertiendose la recta de la grafica en una curva a partir de ese punto de concentracion (indica:falsamente baja de cromogeno); ante esta situacion, hay que diluir la muestra para que su concentracion entre dentro de los limites de linearidad (diluir en , despues multiplicar en 2). Instrumentacion de Fotometros y Espectrofotometros: - fuente estable de energia radiante (lampara de filamento de tungsteno 360-950 nm) - rendijas de entrada y salida (estrechan /reducir la luz difusa, evitar que se dispersa) - selector de longitud de onda /monocromador (bandas espectrales mas estrechas y se ajustan facilmente dentro de una amplia zona del espectro) - cubeta de plastico contiene la muestra (el proceso de absorc con 1 cm de paso de luz) - detector de energia radiante (convierte la energia radiante de la luz no absorbida/transmitida en energia electrica) - presentacion de datos (lector digital que registra la energia electrica) Espectrofotometros de haz simple Fuente de luz => rendija de entrada => monocromador => luz incidente => rendija de salida => cubeta => luz transmitida => detector => medidor/lector ASPECTOS PRACTICOS Empleo de blancos - elimina posibles interferencias de absorcion o reflexion por parte de la cubeta o solvente del cromogeno / reactivo; blanco de sueros - el suero diluido en la misma proporcion en un solvente inerte, con el que no reaccione para eliminar posibles hemolisis, lipemia, bilirrubinemia, color de una orina, etc.; blanco de reactivos - elimina posibles interferencias que pueda introducir el reactivo. Desviaciones de la Ley de Beer - producidas en la linearidad de la relacion entre concentracion y absorbancias; la recta se curva antes de su limite de linearidad; causas: - se miden concentraciones muy elevadas de cromogeno - la radiacion incidente no es monocromatica (el aparato estropeado) - la absorbancia del solvente es significativa comparada con la del soluto - la luz es transmitida por otros mecanismos (problema del aparado) - los lados de la cubeta no son paralelos - interferentes de otros cromogenos que absorben tambien esa long de onda - si existe fenomeno de fluorescencia

Calibrador / Standar / Patron

Es un especimen / analito / solucion que conocemos la concentracion exacta del analito. Los terminos son sinonimos aunque el termino Standar o Patron se utiliza mas para referirse al preparado comercial donde el analito esta disuelto en H2O o buffer aquosa (ph conocido).

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El termino Calibrador se utiliza mas al hablar del standar para autoanalizadores, donde el analito disuelto en suero, plasma o solucion de una viscosidad semejante. Standar - pueden llevar 1 o mas analitos aunque normalmente solo lleva 1 Cpr = Apr Ast x Cst (formula viene de => Ast/Apr = Cst/Cpr)

E.j. Standar de colesterol 250 mgr / dl Reactivo (R), Tubos 1/1, 1/2, 1/3, 1/4, buffer suero fisiologico, cubetas, espectofotometro. 1/1 ==> 1/2 ==> 50 micro litro St + 500 micro litro R 25 St + 500 R 50 St + 1000 R (no!) 50 (1/2 - diluida en SSF) St + 500 R 50/3 St + 500 R 50 St + 1500 R (no!) 50 (1/3 - diluida en SSF) + 500 R 50 (1/4 - diluida en SSF) + 500 R

1/3 ==>

1/4 ==>

Control (suero humano deshidratado)

Es un especimen conocido del intervalo de concentracion de uno o mas analitico. St Glucosa ==> 150 gr /dl Control (que se usa) ==> 135 - 155 gr /dl (no es exacta /aprox.) Los controles y los standares se usan para calibracion y valoracion de las tecnicas ycontrol de calidad de los aparatos de laboratorio. Se presenta en forma de liofilizacion para alargar el periodo de caducidad. Algunos son en forma liquido. Es importante saber reconstituir St y Controles.

OBTENCIN DE MUESTRAS DE SANGRE

Introduccion Sangre - liquido rojo y espeso que circula por sistema vascular sanguineo y formada por plasma + elementos solidos en suspension. Podemos diferenciarlas en 3 tipos segun por elemento vascular que circulan (arterial, venosa, capilar). Para la extraccion de cada tipo de sangre, necesitamos el mismo material, pero el metodo varia sensiblemente. Como norma general evitaremos pinchar a ciegas para no martilizar al paciente. Debemos tener paciencia, habilidad y comprension. Diferencias No existe una diferencia signifacativa entre ellas. La sangre arterial tiene + O2 y se utilizara para la determinacion de gases y ph en sangre. La glucosa se encuentra en mayor proporcion en sangre capilar (10 - 30% mas). Tampoco conviene determinar potasio en sangre capilar, debido que puede aumentar por la compression ejercida al hacer la extraccion.
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Plasma y Suero Suero - porcion liquida de la sangre que queda tras la centrifugacion de sangre coagulada.No tiene elementos formes ni fibrinogeno ni la mayoria de los factores de coagulacion. Plasma - porcion liquida de sangre que queda tras la centrifugacion de sangre anticoagulada. No tiene elementos formes, pero si fibrinogeno y factores de coagulacion. Obtencion de sangre capilar Se puede obtener de lobulo de la oreja, de los pulpejos de los dedos anular y corgado y dedo gordo de pie o del talon (nios). Material - algodon /gasas, alcohol, lanzetas con o sin lanzador, tubos de capilares heparinizados, guantes, rotulador /etiquetas y plastilina. Procedimiento - elegir el area a puncionar, frotar vigorosamente con algodon + alcohol para reactivar la circulacion y secamos al aire. Mediante la lanzeta efectuar una puncion profunda. Desechamos la primera gota mediante algodon /gasas, efectuar una presion alternativa en la zona, 1 cm por encima del lugar de puncion para que salga la sangre. Recoger la sangre mediante el capilar heparinizado presionando y aflojando sobre la zona hasta que tengamos suficiente sangre. Posteriormente aplicamos algodon + alcohol sobre el lugar de puncion presionando hasta que deje de fluir la sangre. Poner plastilina por un extremo del tubo. Identificamos la muestra. Precauciones - no hay que ejercer demasiada presion, porque sino, ademas de la sangre,saldra tambien liquido tisular. Nunca pinchamos en miembro edematoso, infectado, o inflamado. Secar la primera gota de sangre que pueda quedar plaquetas adheridas y darnos falsas trombopenias y por otro que se nos coagule la sangre. Obtencion de sangre venosa Las venas deben de evaluarse y nunca pinchar a ciegas. Normalmente se escoge venas de flexura del codo (cefalica, basilica o mediana basilica). Si no podemos pinchar un brazo, intentaremos en el otro brazo. Sino, en las venas de las manos /pies. Material - guantes, alcohol, algodon, goma compressor (smarch), jeringas, agujas, material extraccion de vacio (0.8 / 0.9 agujas o las palomitas), tubos de recogida con o sin coagulante, etiquetas o rotulador de vidrio. Procedimiento - preparar el material, colocar el paciente sentado / tumbado, brazo extendido y puo cerrado. Seleccionar la vena a pinchar, y la palpamos. Elegimos el volumen de jeringa, montamos la aguja sobre la jeringa, comprobamos que el embolo funciona bien. Colocarse los guantes y aplicar el smarch por encima de la vena que se va a puncionar. El Smarch tiene que ser colocado sufficientemente fuerte, para el paso de sangre venosa, pero no tan fuerte como para impedir el flujo. Pedir al paciente que abra y cierre la manoalternativamente para favorecer la dilatacion de la vena. Palpar la vena con el dedo indice, desinfectar la zona con el algodon y alcohol / yodo y proceder a la extraccion, teniendo cuidado de colocar el bisel hacia arriba. La inclinacion de la aguja sera 45o, extraer cuidadosamente y cuando esta apunto diacabar, retirar el smarch, sacamos la aguja y presionar la zona de venopuncion con el brazo extendido. Retirar la aguja de la jeringa y distribuir la sangre en los tubos siempre resbalando la sangre por la pared del tubo. Los tubos que lleva anti coagulante, se agitar suavemente y etiquetar el tubo. Sistema del vacio - en las casas comerciales vacutainer / venoject. Material es el mismo cambiando la jeringa y aguja con el sistema de vacutainer / venoject. El procedimiento - lo mismo. Palomita - el material es el mismo cambiando con palomita. Observacion - evitar la extraccion en un miembro donde se aplica solucion parenteral. Si no queda mas remedio, pinchar por encima de la via. Tampoco pinchar hematomas, o
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infecciones. Tener siempre bien preparados los tubos y etiquetarlos. No extraer sangre ni lenta ni muy rapido. Se extrae los tubos cuando ya no llena mas / dejar de llenar. Obtencion de sangre arterial Suponer cierta mayor dificultad que sangre venosa. Ademas riesgo de hemorragia, las punciones arteriales pueden provocar dolor, hematomas, lesiones nerviosas, alteracion de circulacion, espasmo arterial, trombosis etc. Zonas adecuadas - arteria radial, humeral y femoral. Arteria radial es la mejor eleccion por razones:- relativamente superficial. Si hay problema, la arteria cubital proporcionaria una circulacion colateral a la mano. Antes de realizar puncion arterial, tener en cuenta factores que nos podrian falsear los resultados de analisis (hiperventilacion) que provoca el temor del paciente al ser pinchado.Pueden falsear los niveles de PCO2: - exceso de heparina en la jeringguilla altera niveles de PH y PCO2 en sangre. - aire ambiental mezclado con la muestra - metabolismo de celulas sanguineas, altera el resultado (+/- tiempo) Material - jeringuilla 2 ml, agujas de bisel corto, heparina, alcohol, povidona yodada (betadine), torundas / gasas, etiquetas, guantes, o un kit de jeringa. Procedimiento - Explicar al paciente que se le va hacer y procurar que no este ansioso. Las manos lavadas y guantes puestos. Aspirar la heparina necesaria, cubrir toda la jeringa y expulsar de vuelto y solo nos que da heparina en el espacio muerto. Elegir punto de puncion (normalmente arteria radial de la mano no dominante). No pinchar en zona hematomas, heridas y infeccion. Colocar el brazo del paciente con muneca extendida y en rotacion.Comprobar la circulacion lateral utilizando la maniobra de Allen. Mientras el paciente abre y cierra el puno comprimir ambos arterias (radial y cubital) hasta que la palma este palido, se deja de presionar la arteria cubital. Mientras se continua presionando arteria radial, a continuacion la palma deja de estar palido por el flujo que entra de la arteria cubital. Si no es asi, no deberiamos pinchar esta mano. Preparar zona a puncionar con alcohol / povidona (yodo). Colocar otros guantes. Localizar arteria radial colocando indice y corazon en los estremos de la parte que notamos el latido. Sujetamos el embolo como lapiz y pinchar con bisel hacia arriba, penetrar lentamente la piel en un angulo de 45o directamente encima del punto max. del pulso. Avanzar con aguja y parar cuando veamos el retorno del flujo sanguineo. Tirar el embolo hacia atras para extraer. Extraer la aguja de la jeringa y taponar presionando la zona de puncion (al menos 15 minutos)

ANTI COAGULANTE
Concepto Anticoagulante - sustancia que se oponen / retarda la coagulacion de sangre, circunstancia que ocurre de forma natural cuando se extrae del torrente circulacion. Clasificacion Atendiendo su naturaleza y mecanismo de accion: 1- Inhibidores naturales: anticoagulantes que circulan /producido por el propio organismo (heparina + AT III) 2-Anticoagulacion de accion en vivo: productos medicamentosos que pueden tener accion directa sobre la sangre (heparina, dicumarinicos - accion anti vit K). Estos medicamentos se utilizan cuando existe una hiper coagulabilidad.

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3-Anticoagulacion de accion en vitro: la accion se produce fuera del organismo (usados en los labs; e.j. EDTA). Tipos de anticoagulante en vitro Los anticoagulante deben de elegirse en funcion de las determinaciones que se vayan a realizar, asegurndose que su presencia no afectara a los resultados. Los anticoagulante puede utilizarse en forma liquida o secarse en las paredes de los tubos de recogida. Los mas utilizados: 1- Oxalato (de Li/litio, K/potasio o Na/sodio) Su mecanismo de accion - inhibir la coagulacion al combinarse con el calcio sanguineo Ca++ factor IV de la coagulacion y precipitarlo. Desventaja - disminuye hematocrito, porque contraer los hematies y si seutilizan en alta dosis pueden provocar hemolisis. 2- Citrato (de Na) en forma liquida. Para determinar VSG y pruebas de coagulacion en estos casos: citrato trisodico al 3,8%. Tambien en banco de sangre para anticoagular sangre destinada a las transfusiones. Para las pruebas de hemostasia, seutiliza en proporcion 1+9 y para VSG 1+4. Mecanismo de accion - lo mismo al oxalato 3- Solucion de ACD (acido citrico citrato destrosa). No se utiliza en lab, pero si en hemoterapia /banco de sangre para conservar sangre gracias a su PH. Mecanismo de accion - lo mismo 4- Fluoruros Se usa muy poco, tiene doble accion de mecanismo - Quelan el Ca++, miden la glucolisis de los hematies. Se utilizaba (antes) para medir la glucosa. 5- EDTA (epsilon diamino tetra acetico) Pueden utilizarse la sal disodico Na2 EDTA o tripotasica K3 EDTA - mas usada. Mecanismo de accion - lo mismo Deben respetarse la proporsion de anticoagulante - sangre. Un exceso de EDTA nos va a modificar la morfologia leucositaria y eritrocitaria. Es mas utilizado en hematologia. Nos permite conservar la sangre 24 horas a 4 C sin modificacion. 6- Heparina La que menos interfiere en las diferentes pruebas, pero no para hacer frotis sanguineos, porque al teirlos, imprime coloracion muy azulada al fondo. Mecanismo de accion - inhibir dentro de la cascada de coagulacion, el paso de protrombina (II) a trombina (IIa) ==> Fibrinogeno (I) a Fibrina (Ia). Estabilizador de las plaquetas: la mas usada es heparina de litio a razon 20 por ml de sangre. En todos los casos debe hacerse al menos 60 inversiones del tubo (2 minutos en el agitador hematologia). Conservacion Cuando una sangre entera se conserva > 24H, los parametros tanto bioquimicos como celulares se alteran, sobretodo los leucositos; por ello para poder conservar sus componentes bioquimicos > 24H es imprecindible la centrifugacion de esta sangre 3000 rpm 15 minutos y su posterior separacion de su suero / plasma y ademas conservar la a 4C o mejor su congelacion.
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EL MICROSCOPIO
Microscopio instrumento que permite amplificar la imagen de un objeto o de un ser pequeo (micros: pequeo y scopein: ver); inventado 1610 por Galileo, el primer cientfico italiano observando el exterior de una abeja o Jansen, el holands. Fundamento Si se sita entre el ojo y el objeto un sistema ptico capaz de aumentar el angulo visual, se podr ver el objeto con mayor amplitud y claridad. El sistema de lentes produce una imagen aumentada de una muestra diminuta. El objetivo - pequea lente de proyeccin que aumenta y proyecta la imagen primaria del objeto hacia el extremo superior del tubo del microscopio (imagen area). El ocular (lupa) - aumentando la imagen area. La imagen final - se forma en la retina del ojo. La imagen virtual (el ojo percibe la imagen final en el plano virtual). Aumento es el numero de veces que se ve el tamao de un objeto por encima de su valor real. En el microscopio ptico compuesto, se calcula multiplicando el aumento individual del objetivo por el aumento individual del ocular. Objetivo - x4, x10, x40, x100. Aumento ptico ocular - x5, x10 Resolucin la capacidad del microscopio para mostrar los detalles ms finos de un objeto. Poder de resolucin (limite de resolucin o distancia resoluble) la distancia minima entre dos puntos que permite distinguirlos como tales (la capacidad de microscopio para distinguir 2 puntos separados aunque estn muy prximos entre si. Disminuir la distancia resoluble = aumentar el poder de resolucin = aumentar la apertura numrica (AN) = disminuir la longitud de onda de la luz empleada = aumentar el ngulo alpha en el espacio objeto = aumentar el ndice de refraccin (IR) en el espacio objeto (rellenar el espacio existente entre la muestra y el objetivo con una sustancia de mayor ndice de refraccin, como aceite). Numero de campo dimetro de la imagen observada a travs del ocular (en mm). Profundidad de foco el espesor de la muestra que es posible tener enfocado por completo >< aumento y AN de la lente. El contraste para mejorarlo, disminuye el cono de iluminacin (se controla mediante el diafragma de apertura) procedente del condensador. Partes de un microscopio ptico compuesto: Parte mecnica sistema de soporte o esttico (pie, brazo, cabezal); sistema de ajuste (anillo de ajuste de las dioptras, tornillo de fijacin del cabezal, tornillos reguladores de la platina, tornillo de elevacin del condensador, tornillos de centrado del condensador, tornillo de seguridad del condensador, control del diafragma de apertura del condensador, anillos de enfoque macromtrico y micromtrico, control de ajuste de la claridad/ la luz). Parte ptica sistema de iluminacin (fuente de luz - lampara halogena de intensidad graduable; condensador - dispositivo que contiene una lente que concentra la luz, generada en la lampara, hacia la preparacin; diafragma de apertura - el control adecuado del cono de iluminacin que atraviesa la muestra y entra en el objetivo = se ajusta
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AN); lentes (objetivos - generan imagen real, invertida y aumentada del objeto; oculares captan la imagen formada por el objetivo y la amplian) Material necesario para la visualizacin microscpica portaobjetos esmerilado y biselado, cubreobjetos 22x22, lquido de inmersin (se usa sin cubreobjetos) es imprescindible cuando se observa muestra desecada con objetivo de 100x (tradicionalmente aceite de madera de cedro, actualmente aceites sinttico)

Tipos de microscopios: Microscopio de campo oscuro si dentro de la muestra hay elementos transparentes, con un indice de refraccin diferente al del medio que los circunda, la luz es difractada e incide sobre el objetivo y pueden ser visualizados; permite la observacin de seres microscpicos transparentes y no teidos (treponema pallidum preparacin en fresco). Microscopio de fluorescencia consta de una fuente de luz muy intensa (lmpara de Hg a alta presin), emite una radiacin que puede incidir en la muestra desde abajo, tras atravesar un condensador de campo oscuro (iluminacin transmitida); se emplea un tipo especial de liquido de inmersin (glicerina); Tipos de fluorescencia: Fluorescencia primaria fluorescencia natural (auto fluorescencia) - vitamina A-tiamina, vitamina Briboflavina; Fluorescencia secundaria - colorantes fluorescentes: auramina (demostrar la presencia del bacilo de Koch en esputos), naranja de acridina (detectar gardnerella vaginalis en los exudados vaginales; Fluorescencia terciaria inmunofluorescencia - fijacin del fluorocromo (colorante) como rodamina y ficoeritrina al elemento investigado (a traves de Ac marcado). Fuente de luz => Filtro primario => Muestra Fluorescente => Filtro secundario => Luz fluorescente de exitacion (UV) Observador Microscopios electrnicos de transmisin (TEM) una gran amplificacin y permite la observacin de elementos que son demasiado pequeos como para ser vistos en un microscopio ptico, pero no sirve para observar elementos vivos, a causa del vaco que ha de establecerse dentro del tubo y es muy costoso (solo se usa en lab de investigacion). El poder de resolucion en microscopio electronico es x1000 > que microscopio

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optico; emplean electrones en lugar de unas fotones; microscopio optico < 200 nm fotones: 400 - 700 nm longitud de onda. Microscopio electrnico de barrido (MEB) no tiene tanto poder de resolucin como el de transmisin, pero sin embargo, proporciona una enorme profundidad de campo y genera unas imgenes que producen una gran sensacin de tri dimensionalidad. 1973 se comercializo el 3 modelo que une las caracteristicas de los 2 anteriores (la gran resolucion de los TEM y la gran definicion y contraste de los MEB.

CARACTERSTICAS GENERALES DE LA SANGRE mira apuntes!

Volemia (volumen de sangre circulante) 68 77 ml por kg de peso corporal (70 kg = 5 lt de sangre). Valor hematocrito (fraccin forme) 45% del volumen total. Trombocitos (plaquetas) fragmentos de clulas megacariocitos, ovalada, sin ncleo, clulas mas pequeas, factores de coagulacin en su interior, 140.000 400.000 por mm3, se producen en MO y destruidas por los macrfagos del sistema retculo endotelial (SRE) situado en la medula sea en el hgado y en el bazo, dura unos 10 das. Eritrocitos (hemates/ glbulos rojos) disco bicncavo, sin ncleo, protena compleja en su interior (hierro, hemoglobina), 4.500.000 por mm3, las mas abundante, se producen en la medula sea, dura 120 das, destruidos por los macrfagos del SRE (Hb se transforma en bilirrubina color amarillento y eliminada por hgado a travs de la bilis) Leucocitos (glbulos bancos) clulas mas grandes, las nicas con ncleo, granulocitos (neutrfilos, eosinfilos y basfilos), agranulocitos (monocitos y linfocitos) 5.000 - 11.000 por mm; formula leucocitaria (porcentaje que representa el numero de leucocitos de cada tipo con respecto al numero total de ellos), granulocitos y monocitos se forman en la medula sea exclusivamente, a los linfocitos intervienen los ganglios linfticos y rganos linfoides, destruidos por los macrfagos del SRE. Plasma (fraccin liquida) 55% del volumen total, transparente de color ambarino, constituido 90% por agua, 10% slidas (glucidos: glucosa, lipidos: colesterol triglicridos, protenas : albmina, globulinas, fibringeno, etc., electrolitos : iones sodio, potasio, calcio, cloruro etc., sustancias reguladoras: vitaminas, enzimas, hormonas, productos de desecho : acido rico, urea, creatinina, bilirrubina, etc.) se llama suero cuando se le retira el fibringeno. Funciones de la sangre respiratoria, nutritiva, regulacin hormonal, excretora, regulacin trmica, mantenimiento del volumen intersticial, mantenimiento de pH ( ph. plasmtico es 7,4), defensiva, hemosttica (plaquetas y sustancias factores de coagulacin). Caractersticas fsico qumicas de la sangre: Viscosidad la resistencia que ofrece un fluido a deformarse (+hematocrito => policitemia vera, +fibringeno plasmtica => hiperfibrinogenemias, +globulina => mieloma mltiple), sndrome de hiperviscosidad (aumento de la viscosidad).

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Osmolalidad plasmtica el numero de partculas de soluto presentes en una masa de disolvente, osmolalidad plasmtica normal 280 300 mOsmol/kg de agua, depende de la concentracin en iones sodio (Na+) su soluto mas abundante, regulada por hormona antidiurtica/ADH (generada en la nurohiposifis), osmolalidad (+) diabetes inspida por dficit de ADH, coma hiperosmolar de la diabetes mellitus. El sistema retculo endotelial (SRE) o mononuclear fagoctico tejido presente en el bazo, hgado y medula sea, comprende a los capilares sinusoides (senos venosos) de estos rganos formados de dentro a fuera por dos capas: una capa de clulas reticulares (macrfagos bordeantes o clulas reticulares bordeantes) con poros entre ellas que pueden ser atravesados por otras clulas (hemates que estn en buen estado); cuando realizan su actividad macrofagica, su volumen aumenta, su citoplasma se llena del material fagocitado y su ncleo se vuelve voluminoso, ovalar y con un nucleolo bien visible (clulas de Kupffer); una capa de fibras de reticulina (una red que rodea circularmente a las clulas bordeantes y las separa de las otras clulas del rgano.

EXTENSIONES SANGUINEAS
Extensin o frotis sanguneo recubrir parcialmente un portaobjeto con una gota de sangre, de tal manera que las clulas de esta se dispongan formando una sola capa de ellas; se puede hacer manual o automticamente con un Skinner que centrifuga el porta con la sangre depositada en su centro. Partes: cabeza (donde se encuentra mayor proporcin de linfocitos y los hemates forman pilas de moneda), cuerpo (adecuada proporcin entre los distintos tipos de leucocitos), cola (se encuentra mayor proporcin de leucocitos grandes (granulocitos y monocitos, los hemates deformados y plaquetas), bordes (contienen una mayor proporcin de leucocitos grandes, difciles de reconocer si estn deshilachados/deformados). Una buena extensin fina y homognea con barbas, longitud de partes del portaobjetos. Defectos de una extensin excesiva o escasa longitud y grosor (inadecuado tamao de la gota de sangre), escalones o estras (falta de uniformidad en el deslizamiento), zonas redondeadas (presencia de restos de grasa o de suciedad en el porta), excesivamente dentado/desflecado. Utilidad anlisis morfolgico de las clulas hematicas, realizacin del recuento diferencial linfocitario (RDL) y reticulocito, la distincin de una autentica trombopenia de una pseudotrombopenia producida por agregados plaquetarios y comprobar el funcionamiento de los autoanalizadores hematolgicos. Practica VII (realizacin de una extensin sangunea): Material: 2 portas limpios, guantes desechables, rotulador de vidrio Reactivo: desinfectante alcohol etlico (etanol) 70 o povidona yodada, solucin de etanolter etlico en proporcin de 50:50 Muestra: Sangre capilar no anticoagulada o sangre venosa adecuadamente anticoagulada con EDTA (no con heparina para no producir un fondo azul con el colorante de Wright) extrada en menos de 3 horas para no alterar su morfologa. Sangre capilar contiene ms hemates y leucocitos y menos plaquetas que la sangre venosa. Tcnica depositar una gota de sangre (5 ul) a 2 cm de un extremo de la porta; formar un ngulo de 45 con el porta esmerilado, dejar que la gota se extienda por capilaridad a lo
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largo del extremo del extensor; deslizar la porta hacia otro extremo, secar al aire y escribir el nombre del enfermo. TINCIONES HEMATOLOGICAS Coloracin de las estructuras que componen las clulas sanguneas: Tinciones vitales se practican sobre clulas que estn vivas (introduccin de un colorante en la circulacin de un organismo vivo, p.e. el verde Jano, el azul de metileno Tinciones supra vitales se practica sobre clulas o tejidos vivos, pero que estn aislados del organismo de que proceden. Tinciones no vitales se realizan sobre clulas muertas. Fijacin conservar inalteradamente la estructura y adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos (mediante calor o etanol o metanol) Tinciones tradicionales derivados de anilina (4 grupos): colorantes cidos (eosina) para estructuras alcalinas como hemoglobina; colorantes bsicos (azul de metileno) para las estructuras acidas como cidos nucleicos; colorantes neutros (eosinato de azul de metileno) tien ncleo de un color y el citoplasma de otro; colorantes indiferentes, insolubles en el agua (Sudan III - para teir las grasas) tien sustancias con poder de disolucin superior al del liquido empleado; Colorantes Romanowsky consta de colorante acido (eosina) y colorantes bsicos (tiaminas azul de metileno y sus derivados) obtenidos por desmetilacion oxidativa (azur); se emplean en el diagnostico hematolgico son la de Wright y la Giemsa sola o en combinacin con la de May Grunwald. Las tinciones especiales se usan en circunstancias especficas: -Tincin fluorescente: colorantes (fluoro cromos) se fijan a las clulas y estimulados por una luz ultravioleta, emiten un color caracterstico; los ms utilizados: naranja de acridina y el rojo neutro. -Tinciones histoqumicas: tenyir la presencia o la ausencia de sustancias localizadas en el interior de los grnulos citoplasmticos de los leucocitos; sirven para reconocer clulas leucocitaria normales o anmalas (diferenciar unas clases de leucemias de otras). Las estructuras coloreadas: -Estructuras acidofilas u oxifilas : fijan naturaleza acida, captan la eosina/ atrae estructuras basicas (eosinofilas); tincion tradicionales - adquieren un color rosado. -Estructuras basofilas: fijan naturaleza alcalina (tincin tradicionales - adquieren color azulado; tincin tipo azur-azurofilas-color lila o prpura); atrae estructuras acidas Errores en las tinciones tradicionales de frotis : -Demasiado rosa: ph bajo, tiempo insuficiente, lavado excesivamente prolongado) -Demasiado azul: un grosor excesivo de extensin, pH alto, tiempo excesivo, lavado insuficiente) -Aparecen artefactos o/y precipitados en la extensin: portaobjetos sucios, falta de filtracin, tiempo excesivo, secado del colorante, lavado insuficiente)

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Practica IX (tincin de Giemsa): neutro? Introduccion: Las tinciones hematologicas tipo Romanowsky : Giemsa, Wright, Leishman y panoptico de Pappenheim (May-Grunwald - Giemsa), y panoptico rapido - capaz de discriminar entre las distintas estructuras celulares. Tecnica: -un frotis /extensin en puente de tincin -cubrir /fijar el frotis con metanol durante 3 minutos, escurrimos y dejar secar al aire -cubrir con GIEMSA de Panreac diluido 1/7 con solucin tampn, recin preparada durante 25 minutos -lavar con agua grifo y posteriormente con agua destilada -dejar secar en vertical -observar con objetivo de 100x con aceite de inmersin -Los hemates se tien de color rosa malva, las plaquetas de color violeta, los neutrfilos (ncleo de color azul violeta, citoplasma rosa y granulacin finas de color violeta rojizo), los eosinfilos (citoplasma de color rosa con grnulos rojo anaranjado abundantes), los basfilos (ncleo de color prpura, granulacin de color azul oscuro) el citoplasma rosa no se ve /tapado, los monocitos y linfocitos (nucleo de color azul violeta, citoplasma azul, mas claro en el linfocitos que en el monocito - azul grizace) Practica XI (tincin panptico rpido): Fundamento: tecnica de inmersion my rapida y sencilla de realizar. Tecnica: -una buena extensin /frotis sanguneo -sumerge en el 1 solucin (alcohlica de triarilmetano o metanol) fijar 5 segundos mov. de vaiven -sumergir en 2 solucin (tamponada de xanteo/acido) 3-5 segundos -sumergir en 3 solucin (tamponada de tiazina/bsico) 15 segundos -escurrir entre paso y paso y secar la gotitas -lavar el exceso con agua destilada/ de grifo (dejar caer suavemente), dejar secar -observar al microscopio de 100 x con aceite de inmersin Lectura: -Los eosinofilos salen mas oscuros (maronazos) -La diferencia de las otras tinciones: se permite reteir y se puede variar la intensidad de tincion modificando el tiempo en los colorantes no.2 y no.3, segun desee destacar las tonalidades ros as o azules. Tincin MayGrunwald GIEMSA (con barilla/ puente de tincion): -una buena extensin o frotis sangunea -cubrir el frotis con MG durante 2 minutos, -sin retirar el colorante, cubrir con el mismo volumen de agua destilada 2 minuto
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-se retira el exceso sin lavar -cubrir con GIEMSA 1/10 durante 20 minutos (dilucion: 2 gotas de Giemsa/ ml de agua destilada) -lavado con agua destilada, dejar secar -observar al microscopio de 100x con aceite de inmersin Tincion May Grunwald - Giemsa (por inmersion): -una buena extension o frotis sanguinea -1er cubeta de colorante May-Grunwald durante 2 minutos (sumergida) -2nd cubeta de colorante May-Grunwald 1/1 extemporanea (50% diluido en agua destilada o solucion tampo de PH neutro durante 3 minutos (sumergida) -3er cubeta de colorante Giemsa duluido estemporaneamente 1:10 durante 20 minutos (sumergida) -escurir entre cubetas -lavar con agua del grifo, secar y observar 100x con aceite de inmersion.

RECUENTOS CELULARES
RECUENTOS DE CELULAS DE SANGRE
Camara Neubauer Mejorado -Tiene superficie de 9 mm2 en 9 cuadros grandes. Cada cuadro grande tiene de 1 mm2 de superficie y de 0,1 mm de altura. Por tanto tiene 0,1 mm3 de volumen. -Cuadrado grande central se compone de 25 cuadros medianos de 0,2 mm de lados cada uno y 0,04 mm2 de superficie. -Cada uno de cuadro mediana tiene 16 cuadros pequeos y cada uno tiene 0,05 mm de lado cada uno, es decir 0,0025 mm2 de superficie. -Los cuadrados medianos estan limitado por un triple rallado, cuya linea media es la linea de separacion para delimitar que hematie se encuentran en un cuadrado y cuales no estan dentro.

CONTADOR AUTOMATICO
Recuentos de Leucocitos - El canal peroxidasa (enzimas leucocitarias), se recuentan los leucocitos y se realiza la formula leucocitaria a excepcion de los basofilos. En este canal, celulas rojas son lisadas conservando celulas blancas, que son fijadas y teidas de manera especifica. La intensidad de la de la tincion es proporcional a la actividad peroxidasa. - Eosinofilos produce intensa actividad peroxidasica - Neutrofilos produce actividad peroxidasica fuerte - Monocitos produce actividad peroxidasica debil - Linfocitos y LUC no tienen actividades peroxidasicas Por otra parte, celulas pasan de 1 a 1 a traves de detector de luz y detectan en campo oscuro, sensibles a la luz difractada (analisa el tamao celular) y otro detectan en campo brillante, sensible al grado de tincion (mide la absorbancia), aqui donde se produce la diferenciacion por la actividad peroxidasica. Las celulas vienen caracterizadas por una combinacion del tamao y actividad peroxidasica. En el citograma, la difraccion del tamao celular en el eje Y y en el eje X (abscisas) actividad peroxidasica (absorbancia).
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La formula de recuento diferencial se hace sobre 9.000 celulas. El sistema informatico incorporado, calcula, define y analisa las agrupaciones de celulas. En el canal de peroxidasa se hace el recuente de celulas blancas y formula de recuento diferencial a excepcion de los basofilos. Tambien en este canal, se realiza el parametro MPXI (indice medio de peroxidasa) que refleja la actividad peroxidasica media de los neutrofilos y este indice debe ser entre -10 y +10. - Canal de basofilo / basofilia / nuclear, analiza junto con otro canal, la formula leucocitaria . Canal basofilo se usa para medir y determinar la conformacion de los nucleos de las celulas blancas. Se basa en observacion de que cuando las celulas blancas se someten a la accion de un sulfactante especifico, las membranas y citoplasma de neutrofilos, eosinofilos, linfocitos y monocitos son eliminadas y por conseguiente, celulas ofrecen solo el nucleo desnudo; por el contrario las membranas de citoplasma de los basofilos permanecen intactas, lo que permite que se realice un recuento especifico de los basofilos. Constan de 3 fases: 1. dilucin de la sangre, 2. computo del numero de clulas, 3. calculo matemtico del numero de clulas presentes en 1 mm3 de sangre.

Recuentos manuales en cmara de recuento o cuenta glbulos

o hemocitometro; tipos: Burker, Thoma y Neubauer. Material: -cmara de recuento -cubreobjetos -pipetas diluidoras de Thoma (para leucocitos) y de Potain (para hematies) de cristales que constan de un largo tubo capilar graduado y de una dilatacin ampular o bulbo (dividido en 10 partes iguales y marcadas la 5 con un 0,5 y la 10 con un 1), el bulbo contiene una perla de vidrio (roja para el recuento de hemates y blanca para el recuento de leucocitos) para facilitar la mezcla de la sangre con el liquido de dilucin y acaba en un tubo capilar corto; la capacidad del bulbo es 100 veces superior a la del tubo capilar largo en las pipetas de hemates (marca 101) y en las pipetas de leucocitos la capacidad del bulbo es 10 veces mayor (marca 11). -goma de aspiracin es un tubo de goma que permite la aspiracin de la muestra y del liquido de dilucin, encajada una boquilla en un extremo y se ensambla al tubo capilar corto por el otro. -reactivos para el recuento de hemates contienen cloruro sodico (isotnico para evitar la hemlisis) algn otro tipo contiene citrato sodico y antisptico formalina; los mas utilizados es de Hayem ; -reactivos para el recuento de leucocitos contienen el acido actico glacial (sustancias tensoactivas/detergentes) que rompe los hemates (una lisis previa de los hemates) y
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colorante violeta de genciana que tie el ncleo de los leucocitos; los mas utilizados es de Turck; -reactivos para el recuento de plaquetas incorporan sustancia hemoltica y un antiagregante plaquetario (oxalato de potasio). -Dilucion de Hematies 1/200, de Leucocitos 1/20 y de Plaquetas 1/100 -muestra: sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA y diluida.

Recuentos en contadores electrnicos componentes:

-diluidor: una solucin isotnica con capacidad conductora. -compresor-aspirador: aporta la presin y el vaco necesario para transportar la sangre. -dispositivo de medida: es la cmara donde de cuentan realmente las clulas sanguneas (cmara de medida o de lectura); sistema: deteccin celular por medida de la impedancia o pticos de deteccin celular. -transductor: transforma las seales, procedentes del dispositivo de medida, en impulsos elctricos. -discriminador: diferencia los impulsos elctricos generados por cada uno de los tipos de clulas sanguneas (en funcin del tamano, nucleo y enzima paroxidasa). -lector : recoge los datos obtenidos, los procesa y los proyecta en una pantalla. -registrador: imprime en el papel los resultados conseguido

Mtodos electrnicos de recuento celular:

1-Mtodo de la resistencia elctrica o de la impedancia; descubierto por Coulter 1956 - el numero de seales elctricas generadas (de la resistencia electrica y un cambio de potencial entre los electrodos) indica el numero de clulas presentes en la sangre y la amplitud de estas seales es directamente proporcional al volumen celular (detectadas y registradas por el aparato; debido que la naturaleza lipdica de la membrana (mal conductor) conducen mal la electricidad; el dispositivo de medida - un orificio de 100 lambdas de diametro a traves del cual se hace pasar la sangre diluida con un electrodo a su entrada y otro a su salida + corriente electrica constante de ese mismo orificio; otras marcas 70-100 lambdas hematies/plaquetas y 100-120 lambdas leucocitos. 2-Mtodos de la dispersin de la luz o de la difraccin (TECHNICON - mas caro): a. mtodo del campo oscuro (el numero de seales luminosas detectado indica el numero de clulas presentes en la sangre, y la intensidad de la dispersin luminosa producida por cada una de ellas es directamente proporcional al tamao de estas); > angulo -- > tamano de celula (la intensidad de la dispersion luminosa = tamano de las celulas y no.de senal = no. de celulas. b. mtodo del rayo lser (el numero de interferencias indica el numero de clulas presentes en la sangre y el grado de interferencia que produce cada clula a su paso
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es directamente proporcional a su tamao); no.de interferencias = no.de celulas y grado de interferencias = tamano de celulas. Parmetros que determina un contador electrnico: Numero de hemates, plaquetas y leucocitos por mm3 de sangre, porcentaje de reticulocitos, ndices hematimetricos (eritrocitarios, reticulocitarios, leucocitarios y plaquetarios), valor hematocrito, concentracin de hemoglobina en la sangre, velocidad de sedimentacin globular. Recuento de hematies - determinado por el numero de seales de paso celular registradas en la cmara de lectura de glbulos rojos . En este recuento la sangre esta muy diluida. Recuento de reticulocitos el nico mtodo automtico que nos permite determinar el porcentaje de reticulocitos en la citometra de flujo que consta de tres sistemas principales (sistema hidrulico, ptico y informtico); se tie el ARN (a travs de la difraccin de la luz absorbida, permite diferencia a los hemates maduros de los reticulocitos. Citometro de flujo tambin efecta medidas de absorcin de la luz que hace posible diferenciar a los hemates maduros de los reticulocitos (tamao mas grande). Citometria de flujo: un metodo analitico - se mide la emision del mltiples fluorescencia y la dispersin de luz LIGHT SCATTER de clulas / partculas microscpicas alineadas secuencial mente mediante una corriente liquida, laminar cuando son presentadas de 1 en 1 a gran velocidad (hasta miles de clulas/segundo) frente a unas de luz lazer de longitud de onda adecuada. Recuento de leucocitos - es necesaria una lisis previa de los hemates mediante sustancias tensioactivas (detergentes); el numero de leucocitos es determinado atendiendo al numero de senyales de paso celular, registradas en la cmara de lectura de leucocitos; la sangre no esta muy diluida. Recuento diferencial leucocitario la diferenciacin entre los distintos tipos de leucocitos se realiza mediante distintas tcnicas: -resonancia magntica nuclear por Coulter -rayo lser por CELL-DYN de LAB Abbott -tcnicas de difraccin luminosa y absorcin de luz lser que consigue el contenido en peroxidada de su citoplasma (Technicon) -a traves del examen de frotis sanguineos tenyidos con coloracion panoptica, mediante microscopios especiales que incorporan sistemas de analisis computerizado de las celulas (automatizada). Recuento de plaquetas - se cuenta en la cmara de lectura de los hemates, debido su escaso tamao producen senyales muy pequeas y fcilmente distinguibles de las originadas por los hemates. Sin embargos se puede dar confusiones en el caso de microcitosis; para facilitar el recuente plaquetario tambin es posible la separacin de los hemates por ejemplo mediante centrifugacion.

Factor de Correccin

CN (control normal) - Hb en la hoja de la casa comercial 13.9 +/- 0,5; Coulter 14,2 factor de correccin CN: 13,9/14,2 = 0,97
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CL (control low/patolgico) - Hb en la hoja de la casa comercial 6,3; Coulter 6,5 factor de correccin CL: 6,3/6,5 = 0,95 La media del factor de correccin: fCN + fCL/2 = 0,97 + 0,95/2 = 0,96 Resultado de Muestra en Coulter: 15,5 ==> 15,5 x 0,96 = 15 resultado real. ndices eritrocitarios (tradicionales): 1-Volumen Corpuscular Medio (VCM o en ingles MCV) valor medio del volumen de los hemates; se calcula a partir del hematocrito (HCT) y del recuento del numero de hemates (RBC); VCM = HCT x 10 (+/- 60 lambdas, si no hay problema medular/ anemia) RBC Valor normal 80-100 u3 (1u3 = 1 femtolitro = 10 _15 litros); menor de 80 fl = microcitosis (ferropenia, talasemia) y mayor de 100 = macrocitosis (carencia de vit B12 o acido folico, hepatopatias crnicas y reticulocitosis) 2-Hemoglobina Corpuscular Media (HCM en ingles MCH) valor medio del contenido en hemoglobina en los hemates ; se calcula a partir de la concentracin Hb y RBC; formula: HCM = (Hb / RBC) x 10 Valor normal 27-31 pico gramos (1pg = 10_12 g); menor de 27 = hipocromia (macrocitosis) y mayor de 31 = hipercromia relativa (macrocitosis) 3-Concentracin Hemoglobina Corpuscular Media (CHCM en ingles MCHC ) el valor de la cantidad de hemoglobina (en g) contenida en 1 dl de hemates (la cantidad de Hb); calculada a partir de la concentracin Hb y del hematocrito (HTC); formula: CHCM = (Hb / HTC) x 100 Valor normal 32-36 g/dl; mayor de 36 g/dl = hipercromia absoluta (esferocitosis hereditaria y deshidratacin eritrocitaria o xerocitosis perdida excesiva de agua por parte del hemate); disminucin de CHCM = hidrocitosis o estomatocitosis congnita por la dilucin del contenido hemoglobinico eritrocitario) Nuevos ndices eritrocitarios: 1-ndice de Distribucin de los Hemates (IDH) o Anchura de la Distribucin Eritrocitaria (ADE) en ingles RDW o CV-GR el coeficiente de variacin (CV) de los volmenes de los glbulos rojos (GR), es un parametro estadistico que indica/ expresa el grado de dispersin existente entre los valores obtenidos (en este caso, entre los volmenes de los hemates evaluados); se calcula a partir de la desviacin estndar (SD) y de la media de los valores obtenidos (en este caso de los volmenes de los glbulos rojos); formula: IDH = SD GR x 100 VCM Valor normal debe ser igual o inferior al 15% (indica la variacin existente entre los tamaos de los hemates); superior a 15% = anisocitosis (ferropenias y transfusiones) 2-Anchura de la Distribucin de la Hemoglobina (ADH) o ET-Hb en ingles HDW la desviacin estndar de las concentraciones de hemoglobina de los hemates , estima el grado de dispersin de los valores obtenidos (las concentraciones de Hb de los hemates evaluados); formula: SD = V E (X mx) 2 n1 X = cada uno de los valores obtenidos; mx = media de los valores obtenidos (CHCM);
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n = numero de valores obtenidos. Valor normal 2,2 3,2 g/dl; disminucin ADH = hemates hipo crmicos, el aumento ADH = hemates hper crmicos; la separacin del ADH de valor normal = anisocromia. 3-ndices reticulocitarios Los modernos contadores hematolgicos proporcionan: -Volumen Corpuscular Medio de la poblacin reticulocitaria (VCMr); su valor normal 101119 fl -Concentracin Hemoglobinica Corpuscular Media de la poblacin reticulocitaria (CHCMr); su valor normal 23 29 g/dl -Coeficiente de variacin del tamao de los reticulocitos (RDWr) -Desviacin estndar de la distribucin de hemoglobina en los reticulocitos (HDWr) -Contenido de hemoglobina de la poblacin reticulocitaria (CHr o HCr); su valor normal 25 30 pg; hay una correlacin directa entre los niveles de hierro y el Chr (>Fe >Chr indicador precoz y sensible de la disponibilidad de hierro, es til en la valoracin de enfermos crnicos; < 25 pg = debe instaurar un tratamiento con hierro. Valor hematocrito (HTC) calculada (indirecta); formula: HTC = (VCM x RBC) /10 Determinacin de hemoglobina: se aade un agente ltico a la sangre completa diluida que rompe los hemates y transforma la hemoglobina en cian metahemoglobina, la cantidad de cian metahemoglobina (+ reactivo ciannuro y detergente no ionico) se mide espectrofotometricamente; el mtodo se puede emplear tambin en el recuento de leucocitos. Velocidad de sedimentacin globular (VSG) metodo de antes: se mezcla la muestra ( 1,1 ml) con el citrato sodico (0,33 ml), se homogeneiza 10 minutos y reposar 30 minutos. Al cabo de este tiempo el censor luminoso lee el inicio de la columna de hemates; actualmente: ya existen aparatos que miden VSG del tubo primario de EDTA.

FISIOLOGIA ERITROCITARIA
Eritropoyesis se produce en la capa endosito de la medula sea roja en los huesos (adulto) del crneo, clavculas, esternn, costillas, vrtebras, la cintura pelviana y los huesos largos de las extremidades.

Fase de proliferacion y diferenciacion:

- Celulas madre pluripotentes o indiferenciadas (stem cells = celulas tronco) de 1er compartimento; de estas puede salir cualquier celulas en funcion de la presion ambiente (lo que demanda el organismo); morfologicamente irreconocibles; poseen marcador de membrana CD34; pueden formar colonias en cultivos celulares "in vitro"; capacidad de automntenimiento; CFU-LM ==> celulas madre linfoides (linfocitos) y cm mieloides (otras celulas). - Celulas progenitoras comprometidas o precursores comprometidos (2nd compartimento de MO); morfologicamente indistinguibles; gran potencial de proliferacion; tipos: CFU (colony forming unit) pude cultivarse y formar colonias y otro BFU (unidad formadora de brotes)
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1. El precursor CFU-S (unidad formadora de colonias en el Bazo) o CFU-GEMM; se origina por diferenciacion de CFU-LM; se diferencia hacia precursores de la serie mieloide 2. El precursor BFU-EM; se origina por diferenciacion de CFU-GEMM; se diferencia hacia precursores eritrociticos o megacariociticos (compartida con trombocitos) 3. El precursor BFU-E; seorigina por diferenciacion de la celula BFU-EM; se diferencia hacia un precursor eritrocitico. 4. El precursor CFU-E; se origina por diferenciacion de BFU-E; se diferencia hacia proeritroblasto (1era celula morfologicamente reconocible; ocupan 3er comparimento de MO.

Fase de proliferacin y maduracin:

- El proeritroblasto o pronormoblasto o rubriblasto; se origina por diferenciacion de CFU-E; tamao 20-25 micras, redondo ligeramente ovalado; nucleo grande en el centro de color violaceo rojizo; cromatina es laxa y homogenea, engloba de 2-5 nucleolos, algo azulados; citoplasma escaso de color azul intenso (muy basofilo) sin inclusion; se divide en 2 celulas - El macroblasto; similar al proeritroblasto, menor tamano y estructura nuclear menos homogenea. - El eritroblasto basofilo o normoblasto basofilo o prorrubricito; se origina por division y maduracion del proeritroblasto-macroblasto; tamano 15-20 micras redondeado; nucleo esferico, central y azulado /violeta; cromatina mas condensada con grumos no engloba nucleolos; citoplasma mas abundante, basofilo sin inclusion; se divide 2 veces sucesivas ==> 8 celulas - El eritroblasto policromatofilo o normoblasto policromatofilo o rubricitico; se origina por division y maduracion del eritroblasto basofilo (16 celulas); tamano 8-12, redondeado; nucleo redondeado, central y azulado; cromatina fuertemente condensada en gruesos bloques de aspecto una mora o rueda de carro, no engloba nucleolos; citoplasma abundante azulado con matices rojizos (de Hb) sin inclusion; sin capacidad de division (empieza la maduracion) - El eritroblasto ortocromatico o normoblasto o metarrubricito; se origina por maduracion del eritroblasto policromatofilo, tamano 7-10 micras, redondeado con limites poco definidos; nucleo pequeno, redondo, tendencia a excentrarse, color azul oscuro casi negro (casi muerto - necrobiotico); cromatina condensada con aspecto muy homogeneo, oscuro (picnosis nuclear); citoplasma abundante de color rojo con matices azules, a veces con granulos de hemosiderina (visibles mediante la tincion de Perls ==> sideroblasto VN 20-50% en MO); en su proceso de maduracion expulsa su nucleo y fagocitado por macrofagos de Sistema Mononuclear Fagocitico (SRE); se encuentran en MO, solo en sangre periferica en situaciones patologicas de metastasis en MO que rompen la barrera medular o hematopoyetica. - El reticulocito; se origina por maduracion del eritroblasto ortocromatico, tamano 8-9 micras; sin nucleo (expulsado por e.ortocromatico); citoplasma con restos de ARN, tonalidad azulada, con restos de sustancia ribosomica y reticular (visible con tincion azul de cresil brillante ==> granulo filamentosa, se observa reticulocitos verde-azulados con sustancia granulofilamentosa de color negro-azulado); aun es capaz de sintetizar Hb (por tener restos de ribosoma); permanece 2-4 dias en MO y 1 dia en sangre periferica hasta terminar de madurar y se transforma en hematie VN 0,5-1,5% de total hematies circulantes.

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Laxa ==> mas o menos condensada Desarrollo en condiciones normales la transformacin de proeritroblasto a hemate dura entre 7 y 9 das; un proeritroblasto puede dar menos hematies de los previstos, porque algunas divisiones son abortadas (eritropoyesis ineficaz normal +/- 5%); Proceso de maduracion: disminucion del tamano, descenso del tamao ncleo celular hasta su perdida por expulsion, condensacion de cromatina nuclear (cada vez mas homogenea y basofila), aumento del volumen citoplasmatico, incrementacion de la coloracion rojiza (acidofilia) del citoplasma, por aumento del contenido Hb y disminucion del contenido ARN, desaparecion de las oganelas citoplasmaticas. Regulacin regulada por dos tipos de sustancias: las cito quinas (de los linfocitos) y la eritropoyetina Cito quinas o citocinas producidas por los linfocitos T: -LIF: promueve la proliferacin de las stem cells embrionarias -Interleuquinas 3 y 6 (IL-3 e IL-6) estimulan el crecimiento y la diferenciacin de los precursores hematopoyticos Eritropoyetina o EPY o Ep o EPO hormona generada por glicoprotena renal (factor eritropoyetico renal FER/ eritrogenina) y una globulina plasmtica (de origen heptico); presenta acciones de inducir/facilitar el proceso eritropoyesis ; estimulada por insuficiente oxigenacin de los tejidos, estmulos hormonales (androgenos); su secrecin se frena cuando existe una poliglobulia. Eritrocinetica entre 90 95% de todas las clulas sanguneas son hemates (4-5,5 millones /mm3 en las mujeres y 4,5 6 millones /mm3 en los varones); morfologa (normocitos): -tamao 7 8 micras dimetro longitudinal, 2 micras dimetro transversal mayor y 1 micra dimetro transversal central), forma disco bicncavo. -carece de ncleo y organelas citoplasmticas; citoplasma es rojizo homogneo contiene hemoglobina. -capacidad de elasticidad y deformacin (viscoelsticas) para atravesar el filtro del SRE y la pierde al envejecer, atrapado por las aberturas de los sinusoides del SRE y destruidos por los macrfagos tras 120 das en el hgado y medula sea; la destruccin de los hemates anmalos se produce en el bazo. -principal funcion es transporte de O2 y en menor medida de CO2, mediante Hb. -eritron o eritrina: conjunto de hemates circulantes (masa eritrocitaria) y sus precursores medulares; su homeostasis (estabilidad) esta autoregulada por el equilibrio entre sistema eritropoyesis y SRE.

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Prctica XIII (recuento de hemates o RBC red blood count)

Concepto: RBC ==> determinar el numero de hematies presentes en cada mm3 o microlitro de sangre) Metodica: se diluye la sangre problema en un liquido Hayem, posteriormente se deposito en la camar de recuento Neubauer Mejorado. Reactivos : liquido de dilucin (debe ser isotnico con el plasma para evitar alteracin y lisis) de Hayem o SSF. Muestra: sangre venosa con EDTA; dilucin 1/200 (10 lambdas de sangre + 1990 lambda de Hayem Tcnica: situar el cubre sobre el retculo de la cmara, se desliza presionando ligeramente sobre las bandas laterales y humedecidas con Bau de su porcin central; depositar una gota entre la cmara y el cubre ayudados de un capilar de hematocrito; dejar reposar unos minutos para sedimentarse, observar con el objetivo de 10x para ver la homogeneidad (una vision global); enfocar con el objetivo de 40x, el condensador a media baja altura, verificar que la distribucin de los hemates es homognea; contar los hemates en 80 cuadrados pequeos del cuadrado grande central (4 cuadrados medianos de las esquinas y del centro) ==> 5 cuadrados medianos x 16 cuadrados pequenos; para evitar contar repetidamente, solo se cuentan los que estn contenidos dentro del cuadrado y los que estn en contacto con sus lneas de demarcacin superior o izquierda y sigue el orden en zig-zag. Lectura: el cuadro grande central tiene 25 cuadrados medianos (multiplica por 5); los lados del cuadrado grande central es de 1 mm y el espacio entre el retculo y el cubre es de 0,1 mm (multiplica por 10); si la dilucin se aade a partir de 1, multiplicar por 100 y si se hace a partir de 0,5 se multiplica por 200. RBC = H x 5 x 10 x D (100 o 200). El margen de error de esta tcnica es alto (20%); disminucin RBC = anemias y aumento = policitemias. RBC valor normal = 3,8 - 5 millones / mm3 en mujeres y 4,5 - 5,5 millones / mm3 en varones. Practica XIV (determinacin del valor hematocrito HTO o HTC o HCT mediante el micro mtodo) Fundamento: HCT==> la relacion existente entre el valor ocupado por celulas formes y el ocupado por la sangre total, expresada en %; no es exactamente igual en todas las zonas vasculares del organismo (HTC capilar 5% > HTC venosa); se determinar por mtodos manuales (1-2 unidades mas alto porque se cuenta leucocitos, plaquetas y el plasma atrapados entre los hemates): centrifugacin de 10.000 g (micro mtodo mas utilizado) o mtodos automticos /prueba counter (mas exactos con 0,01 % de error): calculo matemtico a partir de RBC y VCM y anlisis de la sombra en un campo oscuro. Material: tubo capilares de vidrio (1 mm de dimetro 7,5 cm de longitud) heparinizados para sangre capilar o no si es sangre venosa; plastilina, algodn o gasas, centrifuga micro hematocrito 10.000 g mas utilizado, regla milimetrada o lector de micro hematocrito. Reactivos : EDTA tri potsico dispuesto en tubos (para sangre venosa) Muestra: sangre capilar (se echa la primera gota obtenida tras la puncin) o venosa (en tubo con edta se homogeneiza bien antes de usar). Errores ==> la sangre con EDTA empieza a sedimentar; Tcnica: La determinacin ha de hacerse por duplicado (usando 2 tubos por fiabilidad de los resultados). Llenar cada tubo con sangre partes de su longitud, sellar el extremo con plastilina, colocar equilibradamente en la centrifuga para conservar el eje de la centrifuga (evitar averia), centrifugar 10.000 durante 5 minutos. Una vez centrifugado, medirlo rpido para que no se mezcle. Si hay burbujas, se deseche y volver a repetir; no se cuenta el sobrenadante de leucocitos.
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Lectura: Medir las columnas formadas con regla milimetrada y el porcentaje de eritrocitos que corresponde. Entre los 2 tubos no debe haber una diferencia superior al 2% o la media no >50; si lo hay, se repite la determinacin centrifugando a 10 minutos mas. Valor normal HCT 35-45% en mujeres, 43-55% en varones, en recin nacidos 56%, nio de 1 ao 35%, nio de 10 aos 37% - valores de referencia igual que un adulto; (disminucin = anemia, hemorragias, embarazo y aumento = poli globulina transitoria o patolgica, patologia renal, plicitemia y poliglobulia relativa); falsos descensos en hemodilucion/ aumento en la cantidad de plasma, pero los hemates quedan igual (hidremia del embarazo); falsos ascensos en hemoconcentracion (deshidratacin - deportistas). Causas de error: la sangre no es reciente; que haya sedimentado (a los 10 minutos - agitar); error en la medicin (contar leucocitos o tubo es sucio); plastilina mal puesta (extra vasacin); tubo mal puesto en la centrifuga (rotura); tubo roto (limpieza centrifuga de cristal y sangre); centrifuga mal calibrada; Practica XV (alteraciones del hematocrito con la concentracin de anticoagulacin) La relacion optima de anticoagulante / sangre de be ser de 1/10 para muestras con valor hematocrito normal; si usamos anticoagulante que necesita cantidad, puede afectar el resultado del hematocrito (aumenta en plasma); heparina se usa muy poca cantidad; edta son los mejores para no alteran el hematocrito; si HCT <, anticoagulante > (+ plasma + factores de coagulacin + coagulante) y cuando HCT >, anticoagulante <. Se observa una disminucin de HCT a medida que s aumenta la concentracin de anticoagulante en la muestra; esto se debe al aumento de la presin osmtica fuera del hemate, con lo que sale liquido del interior celular y disminuye su volumen (el grado de empaquetamiento de los hemates es mayor y el HCT es menor).

Practica XVI (recuento de reticulocitos)

Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros con tamao de 8-9 u de dimetro que contienen un retculo o red cromatinica formada por restos de ARN (ribosomas - donde se forman la globina de Hb), mitocondrias (donde se sigue formando todavia protoporfirina IX - parte de HEM) y otros rganos celulares; permanecen en medula sea unos 2-4 das y salen a sangre perifrica donde terminan de madurar en unas 1-2 dias; su cantidad en sangre perifrica es un reflejo de la actividad eritropoyetina medular (0,5 - 1,5%). Fundamento - Podemos observar los reticulocitos mediante la tincin con colorantes vitales, azul de metileno nuevo o azul de cresil brillante que causa la precipitacin de los restos de ARN y se observan como filamentos de color azul intenso en el interior de la clula; - Si acaba de salir de MO la red es mas compleja; 1-4 das van desapareciendo (nos indica la maduracin); el numero de reticulocitos nos indica: que la eritropoyesis es funcional, para dosificar las anemias en regenerativa o arregenerativas; para verla eficacia de los tratamientos con vitamina B12. - Si hay aumento de reticulocitos y no hay anemias, ni hemorragias visibles esta perdiendo sangre en algn sitio (hemorragias internas) como en ulceras digestivas son las + frecuentes en hemorragias ocultas. Material: microscopio ptico, reactivo de azul de cresil brillante, pipetas automaticas, portas, bao de agua, o estufa 37oC. Muestra: sangre anticoagulada con EDTA; los reticulocitos tambin maduran in Vitro, por esto es aconsejable que la muestra es recientemente extrada (mx. 6 horas antes de su anlisis, mejor en 1 y 2 hora) Tcnica: el colorante viene preparada; es una tincion supravital (se hace mientras las celulas aun estan vivas); al tubo de reactivo preparado, echamos 3 gotas (150 lambdas) de sangre total, mezclamos suavemente, tapamos con papel para film e introducimos en el bao de agua a 37C durante 10-15 minutos (o incubar en el espectrofotmetro); pasado este
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tiempo volvemos a homogeneizar y tomamos una gota de la suspensin y depositarla en un porta, realizamos una extensin y dejamos secar al aire; observamos la extensin con una gota de aceite de inmersin con el objetivo de 100 x; elegir una zona, contar 100 hemates. Lectura: los hemates se tien de color verde azulado y los reticulocitos se diferencian con unos hilos finos (granulocitos) de color azul en su interior; contar 1000 hemates en total y calcula el porcentaje de reticulocitos con la formula: % reticulocitos = n de reticulocitos contados x 100 n de hemates contados Para descartar errores, debemos realizar 2 extensiones y hacer el recuento en ambas y la diferencia entre ellas sea igual o menor a 5 reticulocitos o 1,5% (el resultado final es la media de los dos porcentajes obtenidos). Valores normal en adultos y nios 0,5 1,5 % o 35.000-80.000/mm3 de sangre; disminucin (reticulopenia = aplasia medular, anemia ferropnica, anemia megaloblstica (falta de acidofolico) y anemias con dificultad en la eritropoyesis; aumento (reticulocitosis = anemia hemolticas y post-hemorrgicas donde se aumenta la produccin de hemates para contrarrestar su perdida); y tambien en el inicio del tratamiento de las anemias ferropenicas y megaloblasticas; Cuando < hemates por anemia, > la produccin reticulocitos; la correccin se hace en base al valor hematocrito del paciente y se calcula: % de reticulocitos corregido = % reticulocitos x HCT paciente HCT normal (45%) Causas de errores del contaje: - recuento insufficientes de hematies o de reticulocitos. - confundir reticulocitos con cuerpos de Heinz (puntos purpureos oscurros) /bolitas pegadas a la membrana; consecuencia de patologia de hematies por deficiencia de una enzima glucosa 6Pato deshidrogenasa. - confundirlos con corpusculos de Hb (punteado basofilo) en patologia alfa talasemia y Hbpatia o restos de Hb desnatura, lizada por el azul de cresil y aparecen como granulos azul verdosos a las 3 horas de incubacion y se observan en la mayor parte de los hematies de la extension. Desviacin reticulocitaria un periodo de maduracin intramedular mas corto y una etapa de maduracin en sangre perifrica mas larga de reticulocitos (cuando el HCT muy bajo, la MO intenta compensar reduciendo el tiempo de maduracin intramedular, por lo que tardara + das en madurarse en sangre perifrica); se observa en el frotis como hemates grandes con un color azulado (macrocitos poli cromticos). ndice de produccin reticulocitaria (IPR) una segunda correccin del % reticulocitos en funcin de los das que tarda en madurar en sangre perifrica con la formula: IPR = % reticulocitos corregido Das de maduracin en sangre perifrica IPR mayor de 3 = aumento de la actividad eritropoyetica medular; IPR menor de 2 = escasa actividad eritropoyetina. Los das que tarda en madurar el reticulocitos: HCT del paciente: 45 35 25 15 Tiempo de maduracin: 1 1,5 2 2,5 En hemorragia muy importante hay que mantener la volemia, evitar el estado de shock con el suero, sangre y O2 para evitar infarto por disminucin de volemia. La MO reacciona produciendo reticulocitos inmaduros.

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HEMOGLOBINA
La hemoglobina o Hb o HGB un cromoproteido se encuentra en el interior del hematie, 97% de su peso seco y encargado del transporte de O2 desde los pulmones a los tejidos; constituido por 2 porciones: un grupo prosttico (no proteico) HEM o HEMO que proporciona el color de sangre y un grupo proteico globina (sin color/ incoloro). HEM consta de 4 ferro porfirinas idnticas; cada una esta compuesta por una protoporfirina IX / 4 pirroles y un tomo de hierro ferroso (Fe++) en el centro; De las 6 valencias de Fe, 4 se unen a los atomos N2 del grupo pirrol y otros 2 quedan libres para unirse a la cadena de globina y unirse al O2). La globina consta de 4 cadenas polipeptdicas, iguales 2 a 2 (e.j. 2 alfa y 2 beta en HbA de los adultos) y cada una esta constituida por algo ms de 140 aminocidos. Cada cadena polipeptdica de la globina se engarza a travs de un aminocido histidina, al tomo de hierro de su ferro porfirina correspondiente. Cadenas de globina: cadena alfa (141 aa), beta (146 aa), gamma, delta Epsilon, Gy (c.gamma con glicina), Ay (c.gamma con alanina). Al combinarse entre si, darn lugar a las diferentes clases de Hb que irn variando a lo largo de desarrollo humano. Sntesis empieza de forma apreciable, en el eritroblasto policromatofilo y alcanza un nivel mximo en el reticulocitos; su sntesis comienza en las mitocondrias, con la condensacin del aminocido glicina y de succinil-coenzima A procedente del Ciclo de Krebs, en presencia de fosfato de piridoxal (Vit. B6) y bajo la accin de la encima ALAsintetasa, para formar el cido delta-aminolevulinico (ALA). El hierro se inserta en la molcula de protoporfirina IX mediante una enzima mitocondrial (ferroquelatasa) y se termina la sintesis de la ferroporfirina. El Fe se incorpora en estado ferroso y se penetra mediante la transferrina en el eritroblasto. Todas las cadenas de globina se forman en los ribosomas; el engarce de una cadena de globina con su ferroporfirina correspondiente da lugar a una sub unidad de hemoglobina. La conjuncin de 4 de estas sub unidades da lugar a la hemoglobina propiamente dicha (e.j. 2alfa + 2 betas). El aumento de la concentracion del grupo HEM estimula la sintesis de globina. La estructura terciaria de las cadenas de globina, forman una cavidad donde se instala el HEM y la unin de HEM a cada cadena polipeptidica, se hace atraves de las valencias de unin de Fe y por otros puntos de anclaje mediante algunos amino cidos de la protena. HB pesa 67.000 daltones y tiene estructura 3 dimensional.

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Resumen del sntesis Hb (ocurre en las mitocondrias) desde eritroblasto policromatofilo reticulocito: Succinil-Coa (procedente del ciclo de Krebs) + ALA-sintetasa + B6 + aa.Glicina ==> 4 Pirroles ==> Protoporfirina IX + Fe (ferroso) a travs de la transferrina + ferroquelatasa ==> Ferroporfirina + cadena de globina - alfa,beta,delta,gamma,epsilon (se forman en los ribosomas) que contiene cada uno > 140aa - se unen a travs de aa histidina al Fe (ferroso) ==> subunidad Hb x 4 (2alfa y 2 beta) Tipos: -Hemoglobina A (Hb A): 2 cadenas alfa y 2 betas; la mayora en adulto 97% de total -Hemoglobina A2 (Hb A2): 2 cadenas alfa y 2 delta; en el adulto 2,5% de Hb total -Hemoglobina Fetal (Hb F): 2 cadenas alfa y 2 gamma; es la mas abundante en cuarto mes del embarazo los 6 meses; en pequeo porcentaje se encuentra en el adulto. Mayoritarias en el embrin: -Hemoglobina Portland: 2 cadenas dzeta y 2 gamma -Hemoglobina Gower I (Hb GI): 2 cadenas dzeta y 2 epsilon -Hemoglobina Gower II (Hb GII): 2 cadenas alfa y 2 epsilon Funcin (1) transportar O2 desde los alvolos pulmonares hasta los tejidos; puede transportar mx.4 molculas de O2 (Hb saturada) cuando el valor de PO2 es elevada; oxihemoglobina (Hb-O2) predomina en la sangre arterial y desoxihemoblogina o Hb reducida (Hb-red / Hb libre / HbsinO2) predomina en la sangre venosa. El grado de saturacion de Hb depende de la pO2 (presin parcial de oxigeno) en el medio. pO2 en los alvolos: 100 mmHg (98% saturada) Factores que disminuyen la afinidad de la Hb por el O2: temperatura alta, disminucin del pH del medio (efecto Bohr), elevacin de CO2 en el medio, la presencia en el medio de un metabolito de la gluclisis 2,3 bifosfoglicerato (2,3 BPG). Aumento de 2,3 BPG = descienda la afinidad de la HB por el O2 = liberacin de o2 a los tejidos (oxigenacin). Hb F (infant, hasta 6 meses) tiene mas afinidad por el O2 que la Hb A (adulto) = captacion por el feto de O2 presente en la Hb materna; en condicin normal, debido a la enzima diaforasa (NADH-metahemoglobina-reductasa) ==> 99% de Hb se une al Fe ferroso o reducido (Fe++) y 1% al Fe ferrico u oxidado (Fe+++) = metahemoglobina; en condicin patolgica, metahemoglobina se eleva a > 10% y aparece una coloracin azulada de la piel (falsa cianosis - por no poder fijar a O2). No hay que confundir con cianosis verdadero (aumento de la Hb-red en la sangre capilar por enzima de los 5 % lo que se da en la anoxia o otras circunstancia (genosis??).

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(2) Transporte del CO2 por a Hb o en el plasma (en forma bicarbonato) desde los tejidos hasta los alvolos pulmonares, contribuye a la regulacin del pH sanguneo; Hb que transporta el dixido de carbono (carbaminohemoglobina Hb-CO2) da un color algo mas oscuro que normal y contribuye a la regulacin del pH sanguneo; mayor parte de CO2 es transportada en forma de bicarbonato (HCO3-); la unin entre CO (monoxido de carbono) y Hb es mas fuerte que con O2 (patolgico) ==> HbCO (carboxihemoglobina) que confiere una coloracin de la piel rojo cereza (contrasta con el estado de asfixia que origina). Catabolismo tras destruccin de los hemates por los macrfagos en SRE, Hb es catabolizada: -la globina se desdobla en aminocidos, forma parte de la reserva y posteriormente son reutilizados. -el hierro se almacena temporalmente como ferritina por los macrfagos , captado por la transferrina plasmtica y transportado a MO para su reutilizacin. -la protoporfirina IX (HEM) se transforma en bilirrubina indirecta, pasa al plasma, captado por el hgado que la conjuga con acido glucoronico (forman bilirrubina directa) y la elimina atravs de la bilis hacia el intestino. La bilirrubina directa liberada en el intestino, sufre 2 procesos: 1- Reabsorbida a la sangre y eliminada por via renal (urobilinogeno/pigmento - da color ambar a la orina) ==> urobilina. 2- Degradada por las bacterias intestinales a formar esterco bilinogeno que le da el color a las heces ==> estercobilina. Ademas Hb que accede a la plasma que es mnima en condicin normal. En caso de hemolisis es grande, captada por una protena alfa 2 globulina (haptoglobina) y la lleva hasta SRE para evitar ser filtrada por el rinyon y por lo tanto eliminado por la orina. En estado de hemolisis, las haptoglobinas no pueden transportar todo la HB, por esto existe hemoglobinuria. Resumen (destruccion de Hb en SRE - MO, Higado (normal) y Bazo (anomalos): - Globina ==> reserva aa ==> reutilizados en MO - Fe ==> reserva ferritina en SRE/macrofagos + transferrina plasmatica ==> reutilizacion en MO - Protoporfirina IX ==> bilirubina indirecta desde sangre hacia higado + acido glucuronico ==> bilirrubina directa, eliminada atraves de bilis ==> intestino (pasa a la sangre, eliminado por via renal/ urobilinogeno ==> urobilina o degradada por bacteria del intestino/estercobilinogeno ==> estercobilina).

Practica XVII (determinacin de hemoglobina en sangre) Parte del diagnostico de las anemias (recuento de hemates, HCT, Fe, Hb), se recomienda el mtodo colorimtrico de la cian metahemoglobina por su exactitud y precisin ; el mtodo de la oxihemoglobina (HbO2) es mas rpido y simple, pero no tiene patrn y no es estable. El mtodo colorimtrico se basa en la transformacin de la hemoglobina en cian metahemoglobina mediante los siguientes pasos: Fe2+ +hemoglobina + ferricianuro potasio (Drabkin) Fe3+ +hemoglobina (metahemoglobina) + cianuro potasio cian metahemoglobina estable con absorcin mximo a 540 nm (cuanto + Hb + cianmetahemoglobina) Material: tubos de ensayo, cubetas, pipetas de seguridad, espectrofotmetro o foto colormetro, cubetas para colorimetra. Reactivos: Drabkin (ferricianuro potsico 20 mM, cianuro potsico 43 mM, conservantes y estabilizantes), estndar (cianmetahemoglobina) = a 20g de Hb /dl.

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5ml de Drabkin + 20 lambdas de sangre (0,02 ml) o 2,5 ml de Drabkin + 10 lambdas de sangre (0,01 ml) Muestra: sangre total anticoagulada con heparina o EDTA. Tcnica: cubeta BR/blanco reactivo (2,5 ml de reactivo), ST (2,5 ml), PR/problema + reactivo (10 lambdas de muestra + 2,5 ml reactivo), CN y CP (2,5 ml de reactivo + 10 lambdas de los controles); incubar 10 minutos a temperatura ambiente; pipetear siempre agitar la solucin y siempre limpiar la punta; posibles errores: -pipeteo incorrecto (de la sangre, sobre todo, porqu es muy pequea la cantidad -que la sangre no sea reciente -que la longitud de onda no sea la adecuada (540) -que las proporciones sean incorrectos (2,5ml/0,01 ml o 10 lambdas) -caducidad de reactivos -tubos sucio o manipulado o rayado (cubetas) no clara la lectura adecuada -que hayamos esperado mucho tiempo para hacer la lectura (la reaccin de la sangre con el Drabkin es de 8 horas). Lectura: se hace la lectura de la absorbancia (DO) en las cubetas foto colorimetra a 540 nm; Clculos:DO PR x 20 = g de hemoglobina / dl DO ST Valores normales hombres: 14-18 g/dl, Mujeres 11-16 g/dl, Nios 10-14 g/dl

INDICES ERITROCITARIOS o INDICES HEMATIMETRICOS o INDICES CORPUSCULARES

Son una serie de parametros que expresan diferentes caracteristicas de los hematies; Los tradicionales (secundarios) se calculan a partir de los valores obtenidos de RBC (mm3), de HCT (%) y Hb (gr/dl).

a.Volumen Corpuscular Medio (VCM) - valor medio del volumen de los hematies HCT/RBC x 10; Valor normal 80-100 u3 (u3=1 femtolitro=10 -15 litros); menor ==> microcitosis (a.ferropenica y talasemia); mayor ==> macrocitosis (deficit vit.B12 o acido folico en hepatopatas cronicas y reticulocitosis); b.Hb Corpuscular Media (HCM) - valor medio del contenido en Hb de los hematies Hb/RBC x 10; Valor normal 27-31 picogramos (1 pg = 10 -12 g); menor ==> hipocromia y microcitosis; mayor ==> hipercromia relativa y macrocitosis.
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c.Concentracion Hbica Corpuscular Media (CHCM) - la cantidad de Hb en gr contenida en 1 dl de hematies Hb/HCT x 100; Valor normal 32-36 g/dl; mayor ==> hipercromia absoluta; disminucion ==> hidrocitosis o estomatocitosis congenita (dilucion del contenido Hbico eritrocitarios); aumento ==> esferocitosis hereditaria (disminucion de la relacion entre la superficie y el volumen eritrocitario) y deshidratacion eritrocitaria o xerocitosis (perdida excesiva de agua por parte del hematie). Nuevos indices eritrocitarios a.Indice de Distribucion de los Hematies (IDH/ADE/RDW) - indica la variacion existente entre los tamaos de los hemates; el coeficiente de variacion de los volumenes de los hemates; expresa el grado de dispersion existente entre los volumenenes de los hematies evaluados; valor normal =/< 15%; mayor ==> anisocitosis (en periodos iniciales del tratamiento de las ferropenias, fases inmediatas a la administracion de transfusiones y cuando haya alteracion medular). b.Anchura de la Distribucion de la Hb (ADH/HDW) - desviacion estandar de las concentraciones de Hb de los hematies; el grado de dispersion de las concentraciones de Hb de los hematies evaluados; valor normal 2,2 - 3,2 g/dl; disminucion ==> hipocromicos; aumento ==> hipercromicos; separacion ADH de sus valores normales ==> anisocromia (hematies de diferente color).

HIERRO
Utilidad importante en metabolismo celular; es elemento integrante de la estructura de protenas fundamentales: mioglobina del msculo, citocromo, hemoglobina de los eritroblastos y enzimas: catalasa, peroxidadas; necesidad diaria de hierro 0,7-1 mg/dia (hombre) 1-1,2 mg/dia (mujer) (aumentan en el embarazo, menstruacin, lactancia y la pubertad); dieta normal diario aportan 10-30 mg en forma de complejos ==> Fe3+ (digerido), absorbido por el duodeno: 5-10% en forma de Fe2+ (reduccin/ferroso) con ayuda de HCL gstrico y vitamina C (proceso de reduccin), el resto se elimina con las heces. Atravesar las clulas intestinales y transportado hacia el torrente sanguneo, se transforma a F3+ (proceso de oxidacin) para ser recogido por un tercio parte de la transferrina plasmtica o siderofilina (beta globulina), de all se distribuye por todo el organismo; en condicion normales 1/3 de la transferrina esta saturada de Fe; pequenya parte se une a la apoferritina ==> ferritina (hidrosoluble) al nivel de SRE (MO, Higado y Bazo); si la apoferritina es baja (insuficiente) ==> en forma de hemosiderina (compuesto insoluble amorfo). El hierro se pierde diaria 1 mg (exfoliacin clulas cutneas y mucosas, eliminacin sudor y bilis) y 1 mg mas en el embarazo, la lactancia y menstruacin). Los valores normales de sideremia: (concentracin plasmtica de hierro) 60-160 ug/100ml en el varn y 37-145 ug/100 ml en la mujer. Los valores normales de transferrina en sangre: 200 -350 mg/dl.

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Dficit de hierro la cantidad ttl de Fe por debajo de los limites normales; 1a fase agotamiento ferrico al nivel de la reserva (Hb y Fe serrico son normales); 2a fase - periodo sub clinico / asintomtico (Fe serico y saturacion de transferrina son bajos); 3a fase - el cuadro de anemia ferropnica (la produccin limitada de eritrocitos por la disponibilidad de hierro en el plasma); causas: -Dieta: ingesta insuficiente carne y el consumo inhibidores de la absorcin del hierro como maz o te). -Absorcin insuficiente de hierro : ciruga gstrica o mal absorcin intestinal. -Prdidas de hierro: sangrado gastrointestinal (varices esofgicas, hernia de hiato, ulcera pptica, gastritis, hemorroides o neoplasia del tubo digestivo); en las mujeres: menstruaciones abundantes, abortos consecutivos. -Necesidades aumentadas: la infancia (crecimiento), el embarazo y la lactancia. Sobrecarga de hierro aumento en cantidad de Fe plasmtico (a) por una absorcin intestinal mayor de lo normal (defecto congnito) puede causar hemocromatosis idioptica con lesiones orgnicas en el tejido epitelial y heptico; (b) otras causas: transfusiones sanguneas mltiples (siderosis transfusional), absorcin intestinal de hierro excesiva y eritropoyesis ineficaz (anemias sideroblasticas), aumento en la liberacin de hierro en el higado (hepatopatia aguda con necrosis de los hepatocitos), aumento de la destruccin de eritrocitos al nivel SRE (anemias hemolticas).

Mala movilizacin del hierro almacenado en el SMF. En un proceso inflamatorio o infeccioso se produce un aumento de interleuquina-1 (IL-1) y otras citoquinas producidas por los macrfagos activados. La IL-1 es la responsable en los hepatocitos del aumento de los reactantes de fase aguda (uno de ellos, la alfa1 antitripsina dificulta la unin de la transferrina a sus receptores en los precursores eritroides) y de la disminucin de la transferrina y albmina. En los macrfagos origina un aumento de la sntesis de ferritina con el consiguiente incremento de la capacidad de depsito de hierro, de la actividad fagoctica de los macrfagos y de su activacin con mayor secrecin de IL-1. La accin de la IL-1 sobre los granulocitos aumenta la liberacin de lactoferrina. Es una protena similar a la transferrina y con mayor afinidad por el hierro. Pero el hierro unido a la lactoferrina no se transfiere a los precursores eritroides y se acumula en el SMF; debido a esta captacin de hierro, la concentracin srica disminuye. Se cree que es un mecanismo de defensa frente a infecciones que depriva a los microorganismos del hierro que necesitan para proliferar.
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Mtodos de determinacin (5) parmetros del metabolismo del hierro que sirve para diagnosticar la patologa subyacente. 1.Sideremia: la concentracin de hierro presente en el suero (hierro serico) se determina por colorimtrico (separar el hierro de la transferrina y reaccionar con sustancia cromogenica (derivado de la fenantrolina - ferrozina), se mide con espectrofotometro; hiposideremia (valores por debajo) en la anemia ferropnica, sndromes inflamatorios crnicos y procesos neoplsicos avanzados; hipersideremia (v. por encima) en sobrecarga de hierro: hemocromatosis idioptica, anemias sideroblasticas (eritropoyesis ineficaz), anemias hemolicas y hepatopatias agudas o crnicas (Fe no se almacena bien); valor normal varn 60-160 ug/100ml, mujer 37 - 145 ug/dl (max.150 ug/dl para ambos). 2.Capacidad total de fijacin del hierro (CTFH): cantidad total de hierro que puede captar la transferrina (hierro circulante en el plasma unido a la transferrina; cada gr de transferrina es capaz de fijar 1,25 mg de Fe; normal: 1/3 transferrina saturada de hierro ==> cada molecula de transferrina transporta 2 moleculas de Fe) consiste en aadir +Fe (excesivamente) al suero problema ==> saturar la transferrina ==> el sobrante de Fe + un quelante (carbonato de magnesio) para eliminar el exceso ==> medir la sideremia con el espectrofotometra; valores normales 250-400 ug/100ml (un triple de sideremia normal - el calculo para hayarlo es CTFH = transferrinemia x 1,25); valores aumentado en deficiencia de hierro, anemia ferropnica o hepatopatias agudas y valores disminuidos en sobrecarga ferrica, procesos crnicos y perdida generalizada de protenas y transferrina en sndrome nefrtico. 3.Porcentaje de saturacin de la transferrina transferrina plasmatica 200 - 350 mg/dl (la media de 250 mg/dl) juntos con la sideremia y CTFH es fundamental para un diagnostico diferencial entre ferropnica verdadera y pseudoferropenia (por defecto en utilizacin hierro de reserva); formula: % de saturacin = sideremia (normal) x 100 CTFH (sideremia en condicin transferrina saturada) valores normal 25 45% (varn) y 20 -35% (mujer); aumentados en sobrecarga de hierro, disminucin de la formacin de eritrocitos por deficiencia de vitamina B6 o perdida de protenas en el sndrome nefrtico; disminuidos en deficiencia de hierro (anemia ferropnica) o procesos crnicos. 4.Tincin de Perls (azul de Prusia) pone de manifiesto la presencia de hemosiderina (un compuesto insoluble amorfo) en el citoplasma, se emplea fundamentalmente sobre frotis de MO para localizar depsitos de hierro no heminico (no pertenece al grupo prostetico/ no unido a Hb) en las clulas del sistema mononuclear fagoctico / SRE (macrfagos histicos) y en eritroblastos (sideroblastos); la hemosiderina se aprecia, dentro de las clulas, como grnulos de color azul-verdoso. 5.Ferritinemia cantidad de ferritina/circulante en el suero (pequea cantidad de Fe3+ absorbido + apoferritina ==> ferritina en SRE), sirve para cuantificar el nivel de reservas de hierro en el organismo (evitara una puncin MO para hacer la tincin de Perls); compuesto hidrosoluble de hierro trivalente (pasa a la sangre) que se une a una protena apo ferritina, como reserva en el hgado, MO y bazo; la determinacin sirve para cuantificar el nivel de las reservas de Fe en el organismo y puede suplir la puncin medular en tincion de Perls; se utilizan tcnicas inmunolgicas de marcaje radiactivo, tipo RIA e inmuno ensayos con enzimas fijadas, tipo ELISA; valores normal 30-150 ug/l en el varn y 20-150 mg/l en la

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mujer; valores aumentados en sobrecarga frrica (hemosiderosis) y inflamacin cronicos y neoplsicos; valores disminuidos en la anemia ferropnica / carencia de Fe (< 12 ug/l). Practica XIX (determinacin de la sideremia) Fundamento: el hierro ferrico (Fe3+) presente en la muestra y unido a la transferrina es liberado por el guanidinio hierro ferrico libre es reducido a ferroso (Fe2+) por la hidroxilamina reacciona con ferrozina forma un complejo coloreado (la intensidad de formacin es medida espectrofotometricamente. Material: 4 tubos de plstico de un solo uso, un rotulador de vidrio, 2 pipetas graduadas de 1 ml, 1 pipeta automtica capaz de dispensar 200 ul, puntas de pipeta automtica, 5 cubetas de espectrofotometra, un espectrofotmetro. Reactivos : 1-Cloruro de guanidina 1M, Hidroxilamina 0,6 M, Tampn acetato 0,4 M (evitar el contacto con la piel y los ojos irritante); 2-ferrozina 40 mM; 3-Reactivo de trabajo = reactivo 1 + reactivo 2, se agita suavemente (estable 6 meses a 2-8 C); patrn de hierro (solucin de hierro) concentracin 100ug/dl; agua destilada; Muestra: suero o plasma heparinizado Tcnica: todos los reactivos, el patrn (St) y la muestra a temperatura ambiente o a 37, rotular 4 tubos de ensayo BR (blanco de reactivo: agua destilada 200ml + reactivo de trabajo 1 ml), St (patrn/estndar: solucin patrn 200ml + reactivo de trabajo 1 ml), BPR (blanco de muestra/problema : muestra 200ml + reactivo 1 1 ml) y M (muestra/ problema: muestra 200ml + reactivo de trabajo 1 ml); agitar el contenido de todos los tubos, dejar que reaccionen 5 minutes a temperatura ambiente, ajustar el espectrofotmetro a 560 nm, leer la absorbancia (A) del tubo BM , despus leer tubos P, M y BR. Lectura: Sideremia (ug/dl) = A muestra A blanco de muestra x concentracin del patrn (200) A del patrn (St) con esta tcnica, los valores normales mujeres 55-140 ug/dl, varones 70-155 ug/dl

ALTERACIONES DE LOS HEMATIES

Alteraciones del tamao hemates normociticos tiene dimetro longitudinal 7-8 u, dimetro transversal (espesor) perifrico 2u, central 1u, superficie 120-140 u2, volumen 80-100 u3. 1-Anisocitosis: coexistencia de distintos tamaos de hemates en la misma muestra de sangre. E.j. pacientes transfundidos / poli transfundidos y a.megaloblasticas (dficit vit.B12 o cido folico) 2-Microcitosis : dimetro longitudinal < 7u y volumen < 80u3; casi siempre denota escasee de Hb, que presenta halo claro, central, aumentado con una transicin suave de color hacia la periferia. (talasemias por alteracin de Hb, a.sideroacresticas por alteracin den la movilizacin del Fe y a.ferropenicas. 3-Macrocitosis : dimetro longitudinal > 8u y volumen > 100u3; el contenido de Hb es normal (alcoholismo y hepatopatias crnicas y a.megaloblasticas)
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4-Megalocitocis : dimetro longitudinal > 11u; fisiologicamente se produce en la poca embrionaria (a.megaloblstica)

Alteraciones de la forma hemates normociticos tienen forma disco bicncavo. 1-Acantocitosis : hemates con espculas de longitud y posicin irregular/acantocitos (abetalipoproteinemia mal absorcin de grasas y cirrosis heptica) 2-Dianocitosis: hemates planos, en forma de diana y sombrero mejicano/ dianocitos, cuyo su reborde y centro coloread con zona anular plida, parecido a leptocitos (talasemias, hepatopatias, a.ferropenicas intensas; a veces cuando solo aparecen en algunas zonas de extensin, to tiene significado clnico, es simplemente un artefacto /producto de manipulacin errnea) 3-Drepanocitosis : en forma de hoz o hemates falciformes o drepanocitos (anemia de clulas falciformes - contienen Hb anomala / Hb S) 4-Eliptocitosis: forma elptica/eliptocitos) u oval/ ovalocitos); es normal encontrarlos en condicin normal en 1% aproximadamente. (en anemias ferropenicas - hasta un 10%, anemias megaloblstica y mielo fibrosis trastornos de medula osea; tpica de eliptocitosis hereditaria - hasta 25-90 %) 5-Equinocitosis: forma espculas cortas/equinocitos o hemates crenados/arrugados y distribuidos regularmente a lo largo de toda su superficie (uremia, hemates pobres en K+ y hepatopatias neonatales y tambin en sangre conservada y como artefactos de una extensin debido a contraccin de los hemates en un medio hipertonica - se deshidratan) 6-Esferocitosis: forma esfrica/esferocitos habitualmente tambin de pequeo tamao/microesferocitos; alto contenido de Hb (hidrocitosis hemates sobre hidratados, anemias hemolticas autoinmunes y esferocitosis hereditaria). 7-Esquistocitosis: fragmentados/esquistocitos; son muy pequeos 2-3u que se forman por extrangulacion de filamentos de fibrina o por fragmentacion mecnica (a.hemoltica microangiopata en la hemlisis mecnica - por la prtesis valvular en el corazn y quemaduras graves) 8-Estomatocitosis: invaginacin central en forma de boca/estomatocitos en forma discos uniconcavos (alcoholismo, hepatopatias crnicas y estomatocitosis hereditaria) 9-Excentrocitosis : hemates cuya Hb esta concentrada en uno de sus polos/excentrocitos (anemia de dficit de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa)

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10-Keratocitosis / hematies en forma de sombrero de polichinela / hematies en casco: dos espculas en su superficie/keratocitos (anemia hemoltica microangiopatahemlisis por prtesis cardiacas y en hemangioma cavernosotumor benigno de los vasos sanguneos) 11-Poiquilocitosis : una sola prolongacin alargada en forma de una raqueta de tenis/poiquilocitos o de una lagrima/dacriocitos en talasemias y en las anemias severas.

Alteraciones del color hemates normo crmicos con la tincin habitual, presenta un color rosada (eosinofila), es mas intensa en la periferia que en el centro. Por lo tanto, la coloracin del hemate depende de la cantidad de Hb contenida en ellos. 1-Anisocromia: falta de uniformidad en la coloracin entre unos hemates y otros; es una alteracin importante que refleja un trastorno profundo de la eritropoyesis (tratamiento de las anemias carenciales, anemia hipocroma que son transfundidos) 2-Hipocromia: color plido en el centro y cambio brusco en la periferia/ hipocromicos u anulocitos / celulas Donut (a.ferropenicas) 3-Hipercromia: intensamente coloreados/hper crmicos (esferocitosis hereditaria) 4-Policromasia / Policromatofilia : una coloracin ligeramente basofila/ azulada que realmente son reticulocitos) Inclusiones intraeritrocitarias los hemates normales solo contienen Hb y homogneo; Hay que diferenciar entre los que se tien con panptica y los que se tien con una tincin vital o citoquimica. 1-Sustancia granulo filamentosa o reticulofilamentosa: procede de restos ribosmicos agregados, visible con tincin vital de azul de cresil brillante (realmente son reticulocitos) 2-Cuerpos de Heinz: precipitados de Hb, pequeas granulaciones en la periferia, visible de color prpura con tincin cristal violeta/ panptico (enfermedades congnitas /defecto congnito de Hb o dficit congnita de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, inestabilidad de Hb y por medicamentos sulfamidas, antipaldicos, antipirticos, analgsicos, habas etc. que causa precipitacin de la Hb oxidada) y tambin en las anemias de dficit de glucosa 6 fosfatos deshidrogenasa) 3-Cuerpo de Howell-Jolly: pequeo residuo nuclear nico +/- 1u, adosados a su membrana, un grumo visible de color entre rojo oscuro y negro (pacientes esplenectomizados y enfermedad sprue/celiaca/ mal absorcin)

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4-Cuerpos de Pappenheimer o grnulos sideroticos: acmulos de hemosiderina unida a protenas que estn en tal cantidad que pueden ser visibles en los hemates y en los reticulocitos; grnulos basfilos con las tinciones habituales, y se tien de una llamativa color verde con la tincin de Perls/azul de Prusia (esplenectomizados, en cualquier caso de sobrecarga ferica y anemias sideroacresticas) 5-Punteado basfilo (Hb H)/ mrula: agregados ribosmicos por degeneracin vacuolar del citoplasma o precipitados de cadenas globinicas libres; puntitos basfilos, tamao variable y dispersos por toda la superficie del hemate, no se tien con la tincin de Perls (intoxicaciones por plomo/ saturnismo, talasemias alfa y leucemias) 6-Anillos de Cabot: restos de la membrana nuclear o de microtbulos debido a mitosis anormal, hilos basfilos en forma de anillo o de ocho y pueden ocupar toda la periferia celular (algunos trastornos de eritropoyesis, a.megaloblstica). 7-Inclusiones parasitarias : hemate parasitado por un trofozoito en forma anular/anillo paldico; en babesiosis / plasmodium dan aspecto de anillo o de pera en el interior de los hemates. 8-Vacuolas: A veces los hemates pueden parecer que estn vacuolados, esto no tiene importancia; es un artefacto de una tincin. 9-Ncleos; pueden aparecer en ciertas patolgicas, e.j. anemias importantes, leucemias, son normoblastos ortocromatico; aunque puede haber formas mas jvenes en caso de anemias muy graves y tambin en pacientes esplenectomizados.

GENERALIDADES SOBRE LAS ANEMIAS

Anemia disminucin de la concentracin de Hb en sangre perifrica (acompaado siempre por - HCT y en general - RBC) que origina hipoxia histica (el dficit en la oxigenacin de los tejidos); valores inferiores a: -en nios de 6 meses a 6 aos 11 g/ 100 ml (12 g/dl +/- 2) -en nios de 6 aos a 14 aos y en mujeres adultas 12 g/ 100 ml (14 g/dl +/- 2) -en varones adultos 14 g/ 100 ml (16 g/dl +/- 2) Falsas anemias en el embarazo (hemodilucion), al contrario de una hemorragia aguda importante. Manifestaciones clnicas: (causado por mecanismos de adaptacin para paliar dficit de O2 de los tejidos (hipoxia hstica) -Intraeritrocitarios : disminucin de la afinidad Hb por el oxigeno por el aumento de 2,3 bifosfoglicerato. -Extraeritrocitarios : estimulo de eritropoyesis (+secrecin de EPO por falta de oxidacin de los tejidos), redistribucin sangunea/palidez de la piel (responsable de taquicardia, soplo sistlico, palidez por vaso-constriccin apreciable en la conjuntiva de los ojos y dilatacin cardaca), debilidad, astenia, fatiga fcil, amenorrea/ ausencia de menstruacin, intoleracion al fri, perdida de concentracin, alergia, dolor de cabeza, perdida del deseo sexual, en crisis aguda puede producir: mareo; lipotimias y uremia (insuficiencia renal).

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Clasificacin segn distintos criterios: -segn el origen: anemias centrales (MO), anemias perifricas (sangre perifrica) -segn la afectacin de la eritropoyesis/ afectacin de MO: anemias arregenerativas (alteracin cualitativa o cuantitativa de los eritroblastos en MO y descenso de reticulocitos en la sangre perifrica); anemias regenerativas (incremento eritroblastos y ascenso de reticulocitos). -segn Hb de los eritrocitos: anemias hipocromas (HCM<27pg), anemias normocromas (HCM normal), anemias hipercromas (HCM > 31 pg) -segn el tamao de los eritrocitos : anemias microciticas (macrocitosis <7u y <80u3), anemias normociticas (normocitosis) y anemias macroctica (macrocitosis >8u y >100u3) Para el diagnostico de anemia y la causa que la produce, es bsico el estudio clnico del paciente ya que la anemia no es una enfermedad en si misma. Es un sntoma de una enfermedad. Hay que hacer un perfil hematologico bsico que hay que incluir un recuento celular, Hb, HCT e indices, reticulocitos, VSG y estudio de frotis.

ANEMIAS MICROCITICAS
1-Anemia ferropnica el dficit del Fe es la causa mas comn de las anemias llegando a padecerla millones de personas en el mundo; carencia de hierro que afecta la formacin de Hb, formacin de mioglobina muscular y enzimas celulares: por falta de aporte (dficit nutricional) y disminucin de la absorcin (gastrectoma, sndromes de mal absorcin), aumento de las necesidades (adolescencia, embarazo), incremento de las perdidas (hemorragias digestivas y genitales); Manifestaciones clnicas: sndrome de Plummer-Vinson (trastorno de formacin de mioglobina muscular y algunas enzimas celulares - aparte de alteracin en formacin Hb), incremento de la fatigabilidad, glositis con dificultad en la deglucin,rgades/baqueros (heridas en los labios), re-secamiento de la piel, la cada del cabello, uas frgiles, secas y planas (en vidrio de reloj); Datos de laboratorio en la sangre perifrica: hemates pequeos VCM bajo (microcitosis), plidos/hipocroma, con aspecto de anillo/anulocitos, HCM y CHCM son bajas; disminucin de reticulocitos (por no poder formar eritroblastos), hierro srico bajo, CTFH alta y cuando la sideremia baja, tambin % de saturacin de transferrina baja, ferritina srica baja, descenso de bilirrubina srica (por < Hb, < degradacin, el color de suero mas claro); la concentracin de transferrina alta, cuando hay menos Fe (manera compensatoria).

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Datos de laboratorio en la MO: discreta hiperplasia eritroblstica, eritroblastos anmalos (pequeos con un reborde citoplsmico desflecado - normoblastos de papel), con tincin Perls se observa ausencia de hierro en las clulas reticulares y ausencia de sideroblastos . Tratamiento - hierro bivalente por va oral +/- 3 meses. 2-Anemias de las afecciones crnicas se origina en las patologas: infecciones bacterianas y fngicas, inflamacin prolongada, colagenosis (lupus eritematoso), nefropatas, hepatopatias, carcinomas, linfomas; mecanismo de produccin: -baja formacin de los eritrocitos por secuestro del hierro en el SER; -cierto grado de hemlisis generado por: esplenomegalia en infecciones, eritrociticas anmalas en las hepatopatias crnicas, toxinas hemolticas (producida por clostridium), metabolitos hemolticos que se acumulan en la insuficiencia renal; -una insuficiente de elevacin de la eritropoyetina en relacin al grado de anemia; -el aumento inflamatorio de la ferritina (reactante de fase aguda, aumentada en inflamacin) Datos de laboratorio en la sangre perifrica: ligera microcitosis e hipocromia o norm ocitosis y normocromia (al principio); discreto descenso de reticulocitos; disminucin del hierro serico y CTFH (porque no hay aumento de transferrinemia compensatoria sino que esta disminuida); la ferritina srica alta; pequeo ascenso de bilirrubina. Datos de laboratorio en la MO: eritropoyesis normal, algo incrementada; con tincin de Perls se observa un secuestro de hierro en forma de grumos en el SER (hayhemosiderina), disminucin o ausencia de sideroblastos. Tratamiento es de la afeccin causal. 3-Anemias sideroacrsticas/sideroblsticas utilizacin defectuosa del hierro y trastorno en la sntesis del HEM; pueden ser congnitas mediante una transmisin ligada al sexo (cromosoma X) o adquiridas : idiopticas (primaria/esencial) o secundarias (actualmente se piensan que son por leucemias (alteracin de MO) p.e. intoxicacin crnica por plomo (saturnismo) y dficit de piridoxina (vitamina B6), alcoholismo y sustancias queinhiben la sntesis mitocondrial de la protoporfirina (las mitocondrias de eritrocitos no pueden sintetizar la protoporfirina IX y el Fe que ha penetrado no tiene molcula donde unirse para formar HEM, y se deposita en las mitocondrias daando las y provocando la lisis de muchos eritroblastos y los que logran madurar sern hemates hipocromicos). Datos de laboratorio en la sangre perifrica: anisocitosis, anisocromia, microctica e hipocromica o normocromica y normocitica (doble poblacin), cuerpos de Pappenheimer, reticulocitos disminuido, hierro srico normal o aumentado, CTFH normal
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o disminuida, ferritina srica aumentada, % de saturacin de la transferrina estar normal o aumentada en funcin como esta el Fe.

Datos de laboratorio en la MO: hiperplasia eritroblstica, con tincin de Perls se observa sobrecarga de hierro en SRE, exceso de sideroblastos (eritroblastos con grnulos de hemosiderina/oxido de hierro esparcidos en su citoplasma /sieroblastos en anillo). Tratamiento: el de la afeccin de base 4-Hemoglobinopatias alteraciones de la globina por mutacin es genticas que condicionan una variacin en la estructura de la cadena (hemoglobinopatas estructurales) y una disminucin en la sntesis de la misma (talasemias); son anemias hemolticas.

4.1. Hemoglobinopatas estructurales (hereditarias): 95% de casos son sustitucin de un aa en una de las cadenas polipeptdicas de Hb da lugar a hemoglobinas anormales en cuanto a afinidad por el oxigeno, inestabilidad, etc (>250 variantes afectan cadena alfa y >350 afectan cadena beta; la mayora sin sintomatologa clnica: a-Hb S: sustitucin de aa glutmico por una valina en la posicin 6 de la cadena beta; en pacientes homocigticos acarrea/causa deformacin de los hemates en forma de hoz (drepanocitos), favorecido en situaciones de disminucin pH e hipoxia ya que la HbS cuando esta oxigenada es normal; este tipo de anemia (hemoltica) se llamaa.de clulas falciformes / a.drepanocitica; los drepanocitos debido a su forma son mas fcilmente destruibles ==> cuadro hemoltico y aumentan viscosidad de sangre ==>
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tromboembolicos, infartos mltiples y dolorosos en diversos rganos; electroforesis manifiesta la banda de HbS entre 50-80%; frecuente en Africa (raza negra); en pacientes heterocigoticos no hay sintomatologia; tratamiento - evitar infecciones, prevenir hipoxia, evitar formacin de los drepanocitos (analgsicos, hidratacion y oxigeno).

b-Hb con funciones anormales: mayor afinidad por el O2 (Hb Hiroshima), menor afinidad por el O2 (Hb Kansas) y Hb en forma de matahemoglobina (Hb Boston); Hb Hiroshima provoca hipoxia tisular y Hb Kansas - Hb Boston provoca cianosis; se pueden detectar mediante electroforesis. c.Hb inestables : la sustitucin del aa afecta a la zona de contacto entre las cadenas alfa y beta o la bolsa de Hb ==> defecto en el enlace de Hb, aparicin de cuerpos de Heinz (tetramero de globina intracelular) nicos y excntrica que modifican la elasticidad de hemate ==> hemolisis; diagnostico - a. hemoltica con reticulocitos aumentados, hiperbilirrubinemia y descenso de haptoglobina (protena que transporta Hb desde la sangre hacia SRE para su almacenaje, as evitar su eliminacin por la orina); prueba biologa molecular, resistencia al calor,etc; tratamiento - evitar los frmacos oxidantes.

4.2.Talasemias - grupo heterogneo de enfermedades hereditarias originadas por defecto de sntesis parcial o total de una o mas de las cadenas polipeptdicas de la globina que forman la hemoglobina. La secuencia de aa es normal, por lo que se considera a las talasemias defectos cuantitativo; thalassa (mar) ==> frecuente entre habitantes de la cuenca mediterrnea y
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trastorno gentico mas frecuente en el mundo; 2 criterios para clasificar: - Clnico, segn la gravedad la talasemia sera mayor (homocigtico) o menor(heterocigtico) - Gentico-bioqumico, depende de la cadena que se deja de sintetizar sera talasemias alfa o talasemias beta/delta-beta (tambin las hay delta o gamma); La sntesis defectuosa de la cadena de globina ==> a.microctica hipocroma, forman tetrmeros de Hb inadecuados ==> produce menos Hb A (alfa2beta2) y exceso de cadenas no apareadas ==> precipitan en el eritroblastos; intramedularmente ==> eritropoyesis ineficaz; extramedularmente ==> hemlisis.

a.Talasemias alfa: disminucin de la sntesis de cadenas alfa (implica tener un exceso de cadenas beta y se forman tetrmeros de cadenas beta4, llamada Hb H), frecuente en individuos de color y los asiticos y muy rara en Espaa; t.a.menor ==> no presenta sntomas clnicos ni hematlogicos, se necesita un estudio de ADN para diagnosticar, porque no se detecta por electroforesis; t.a.intermedias ==> a. microctica hipocroma de intensidad variable con Hb H visualizado al teir con azul de cresil brillante como un punteado basfilo en forma de mrula y se detecta por electroforesis;t.a.mayor/hidropesa fetal ==> ausencia total de cadena alfa, se forma Hb Bart (gamma2 beta2) en lugar de HbA, incapaz de transportar O2 (en todas las Hb normales hay cadena alfa). b.Talasemias beta: disminucin de la sntesis de cadenas beta, frecuentes en nuestro entorno; t.b.menor ==> portadores heterocigticos, son asintomticos o presentan anemia leve microctica hipocroma (pseudopoliglubulia microctica, RBC normal, Hb baja), se agrava con infecciones o embarazo; electroforesis ==> HbA2 (alfa2 delta2) elevada >4%, compensa la menor produccin de cadena beta; t.b.mayor ==> homocigticos (a.de Cooley), forma muy grave donde se acumula cadenas alfa y provoca eritropoyesis ineficaz y hemlisis, presenta a. microctica con punteado basfilo y dianocitos; electroforesis ==> HbA2 (alfa2 delta2) y HbF (alfa2 gamma2) elevadas; el exceso de Fe originado por mltiples transfusiones ==> hemosiderosis progresiva que provoca la muerte; tratamiento ==> transplante de MO.

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Datos de laboratorio en las talasemias microcitosis e hipocroma, hemates con punteado basfilo, anisocitosis, dianocitos, poiquilocitos, etc; talasemia beta menor ==> pseudopoliglubulia microctica (aumento RBC, VCM disminuido y RDW disminuido); disminucin de HCT y Hb; aumento moderado de reticulocitos; Hierro srico aumentado y CTFH disminuida; Ferritinemia normal o aumentada, Bilirrubina srica aumentada; aumento de eritroblastos en sangre perifrica en formas mas graves; maduracin anmala de eritroblastos (diseritropoyesis) y aumento de los eritroblastos sideroblastos; las anomalas hemoglobnicas detectadas por electroforesis de Hb ==> Hb H /beta4 y Hb Bart (gama2 beta2 migran mas rpidamente que la HbA.

Tratamiento - transfusiones y transplante de MO en anemias mayor o intermedias; t.beta menor ==> vigilancia sin tratamiento (excepto cuando Hb este por debajo de 10 gr/dl o existan manifestaciones clnicas); en situaciones de embarazo, crecimiento ==> preparados con cido flico + vit.B.7.

ANEMIAS NORMOCITICAS
1.Insuficiencias Medulares - engloba varios procesos patolgicos en los que esta afectada la produccin de clulas sanguneas por parte de la MO. a.Anemia aplasica o pancitopenia Etiopatogenia (porque y como se produce el desarrollo de la enfermedad): se debe a la destruccin de las clulas madres pluripotentes conlleva una disminucin en la produccin de hemates, leucocitos y plaquetas, excepto en el caso de la "aplasia pura de clulas rojas" (solo disminucin de la serie roja); causas: congnita; adquiridas (inducidas por radiaciones ionizantes, toxicas: por derivados del benceno, medicamentosas: como antibiticos y anti-inflamatorios, infecciosas: virus hepatitis E, auto-inmunes); idiopaticas >50% de los casos. Manifestaciones clnicas: sntomas y signos de anemia, el paciente sufren anemia aplasica, mayor tendencia al padecimiento de infecciones (hay menos leucocitos) y hemorragias, astenia, debilidad, etc.

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Datos de laboratorio - en la sangre perifrica: a.normocromica normocitica o ligeramente macrocitica; el recuento de reticulocitos bajo (reticulopenia); el recuento de granulocitos es inferior a 500/mm3 y el plaquetas es inferior a 20.000/mm3; hierro serico elevado y CTFH normal. - en la MO: descenso de la celularidad, con sustitucin del ejido hematopoyetico por tejido graso. Tratamiento: el pronostico es pesimista y el tratamiento es de mantenimiento; supresin de posible agente etiologico como primer objetivo; androgenos, transfusiones, transplante de MO. b.Anemia Mielotisica - se debe a una infiltracin de la MO por: procesos neoplsicos (leucemias y metstasis de carcinomas de mama, de pulmn de estomago, etc), tuberculosis de los rganos hematopoyeticos, depsitos de sustancias, fibrosis. c.Anemia dismielopoyeticas refractarias o sndromes mielodisplasicos una maduracin alterada de las tres clases celulares de la MO que conlleva una insuficiencia medular; generalmente en ancianos y puede surgir tras un tratamiento con algunos quimioterapicos. d. Aplasias eritrocitarias puras - trastorno aislado en la formacin de eritrocitos, la mayora de los casos idiopaticas o de carcter auto inmune. 2.Anemias Hemolticas - etiopatogenia: Vida media de los hemates 120 das - 250 km (gracias a la elasticidad de su membrana y contenido enzimtico); cada da 1% fagocitado/destruido por SRE (bazo, hgado y MO) y MO produce la misma cantidad (homeostasis); en una hemolisis alta, MO hace un esfuerzo superior para compensar, sino, se produce anemia hemoltica. Clasificacin - intracorpusculares: defecto de la membrana (membranopatias), de los enzimas (enzimopatias) o de la Hb (Hb inopatias); son hereditario o adquirido; hemolisis extra-vascular (SRE) - extra-corpusculares: presencia de Acs antieritrocitarios, parsitos, sustancias toxicas, frmacos; son adquiridas; hemolisis intra o extra-vascular.

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Anemias Hemolticas Intracorpusculares (AHI) a. AHI Membranopatias: - Esferocitosis Hereditaria (enfermedad de Minkowski-Chauffard); autosomica dominante, frecuente en europea; disminucin en la fosforilizacion protenas espectrina y anquirina ==> adoptan forma esfrica, rgido/ inflexible y fcilmente destruidos por el bazo; la hemolisis crnica provoca anemia moderada desde la edad infantil, ictericia y espenomegalia. Datos de laboratorio - hemates redondos e hipercromicos en el frotis y reticulocitosis; prueba de fragilidad osmtica es positiva. Tratamiento - esplenectomia despus de los 6 anyos (un rgano importante en la defensa de las infecciones); el defecto no se corrige, pero alarga la vida del hemate. - Eliptocitosis Hereditaria: anomala en la protena espectrina que adopta forma elptica; menos incidencia que esferocitosis y pacientes no presentan clnica ==> no necesitan tratamiento. - Hemoglobinuria Paroxistica Nocturna HPV (enfermedad de Marchiafava-Miceli); defecto adquirido en la ausencia del factor acelerador de envejecimiento (protena fijadora C8) ==> sensibilidad especial al complemento ==> crisis hemolticas nocturnas y desencadenadas por infecciones, ingestin del hierro, menstruacin; 50% de los casos a la manyana siguiente ==> emisin de orina roja (hemoglobinuria macroscopica); el hallazgo de clulas epiteliales con hemosiderina en el sedimento de orina; granulocitopenia, trombocitopenia y tromboticos; re-generativo de MO ==> reticulopenia; otro 50% de casos ==> cuadro clnico hemoltico mas larvado/ocultado con leucopenia y/o plaquetopenia y reticulopenia; en lab ==> los eritrocitos se muestran mas sensibles al calor, al medio cido y a la sacarosa; frecuente en adultos jvenes y paliada mediante transfusiones. b.AHI Enzimatopatias: el dficit de las enzimas que intervienen en la glucolisis (degradacin de la glucosa) intraeritrocitaria anaerobica o aerobica ==> carencia de energa suficiente en forma de ATP ==> no puede mantener la forma discodea del Hemate, Fe en estado ferroso y Hb en estado funcional. - Dficit de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G-6-PD): trastorno hereditario, ligado al sexo (cromosoma X); se desencadena tras unas horas o escasos das de la ingestin de sustancias oxidantes en medicamentos (analgsicos, sulfamidas) y alimentos (habas/favismo) ==> acumulo de perxido de hidrgeno en el hemate ==> oxidacin de Hb (precipitacin Hb ==> cuerpos de Heinz) y peroxidacion de los lipidos de la membrana (alterada) ==> hemolisis; la crisis hemoltica cursa con fiebre, ictericia, anemia normocitica-normocromica, reticulocitosis, cefaleas, etc. - Dficit de piruvato-quinasa (PK): se transmite de forma recesiva autosomica (portador) y solo los homocigticos tiene manifestaciones clnicas.
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c.AHI Hemoglobinopatias: (mirar anemias microciticas)

Anemias Hemoliticas Extracorpusculares (AHE) a.AHE Auto inmunes: por la accin de Acs (idiopaticas) que se adhieren a la membrana de los hemates (forman aglutinados de glbulos rojos ==> retenidos/hemolizados por SRE) acortando su vida media; si Acs se combina con el complemento ==> hemolisis directa; algunos Acs acompaan a colagenosis (lupus eritema-toso diseminado) y a enfermedades malignas proliferativas del sistema linfocitico o reticuloendotelial (leucemia linfocitica crnica y reticulosarcoma). b.AHE toxicas, infecciosas y mecanicas: por la accion de sustancias toxicas (plomo, benzol), por la accion de microorganismos (plasmodium penetrado directamente dentro de los hemates o estreptococo hemoltico atraves de sustancias hemolisinas que sintetizan), por un efecto mecnico (vlvula cardiaca artificial) Manifestaciones clnicas de las anemias hemolticas - ademas del cuadro clnico de anemia: - esplenomegalia por aumento de la funcin destructiva del bazo - ictericia por hiperbilirrubinemia - trastornos del crecimiento y deformaciones esquelticas, por hiperplasia medular compensatoria - en la esferocitosis hereditaria, son muy frecuentes los clculos biliares.

ANEMIAS MACROCITICAS
A.Macrociticas se caracterizan por tener sus hemates un VCM > 100u3 siendo 95% de ellas megaloblasticas; principal etiopatogenio es el fallo de sintesis ADN (cidos nucleicos) debido a deficit de vitamina B12 (cobalamina) y/o de cido folico ==> perturba la divisin celulares que se renuevan rpidamente (las intestinales y el tejido hematopoyetico ==> defecto en la formacin de los eritrocitos y otras clulas sanguneas; leucocitos resultan grandes tambin); 5% restantes no son megaloblasticas (producidas por alcoholismo, hepatopatias crnicas, neoplasias, etc).

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A.Megaloblstica - son anemias centrales, arregenerativas y la mielopoyesis caracterizada por una maduracion nuclear y citoplasmatica asincronica en todas las estirpas celulares (mieloide y eritroide y se les llama asi para describir los precursores normales eritroides que aparecen en la MO de los pacientes; las a.megaloblasticas se deben a una carencia de vit.B12 (cobalamina) o cido folico;

Dficit de vit. B12 - abunda en alimentos de procedencia animal (carnes y lcteos), no existe en los vegetales; funcin de vit.B12 ==> participan en el metabolismo de los folatos y degradacin cidos grasos; necesita glucoproteina secretado por la mucosa gstrica (FI de Castle) para atravesar la pared del leon; ==> sangre (transportada por protena transcobalamina 1&2) ==> MO (rganos de utilizacin) o hgado (deposito 3/5 anyos); necesidades diarias de vB12 = 1 ug y su reserva heptica 1.000-2.000 ug; los motivos de su carencia: congnita ausencia de actividad del FI (los ninyos padecen la anemia en 1er/2nd anyo de vida cuando ya han consumido todo la vit.B12 de la madre), absorcin dificultosa del complejo vB12-factor intrnseco y dficit de transcobalamina; adquiridas aporte insuficiente (vegetarianos estrictos), robo intestinal por parsitos (tenia) o bacterias consumidoras de vB12 (asa ciega en el intestino), escasa produccin de FI (Acs contra el FI, gastritis atrfica o gastrectomizados) y sndrome de mal-absorcin; Las a.megaloblasticas causado por dficit de FI ==> a.perniciosas o a.de Addison Biermer. Dficit de acido flico folia (hoja), abunda en vegetales (esprragos/ brecol/ lechuga/ espinacas/ judas-verdes) y en el hgado (se inactiva con el calor ==> hervidos/ enlatados), necesidades diarias 25-50 ug, se absorbe por el yeyuno y se almacena en el hgado y tambin en el rinyon (3/4 meses); en la sangre ==> transportado por albumina hacia los rganos de utilizacin; los motivos de su carencia: aporte insuficiente, necesidades aumentadas en el crecimiento y embarazo, sndrome de malabsorcion, alcohlicos crnicos y ingesta de sustancias antagonistas (frmacos citostaticos, anti51/120

convulsivantes/difenilhidantoina y toxoplasma /pirimetamina), aumento de demanda hematopoyeticas. Manifestaciones clnicas: sntomas y signos propios de la anemia, alteraciones del sistema nerviosos (neuropatas, trastornos psiquitricos) y alteraciones de las mucosas (glositis). Datos de laboratorio en la sangre perifrica: megalocitos con forma ovalada o elptica; macrocitosis e hipercromia relativa (CHCM normal ==> proporcin entre cantidad Hb y el volumen de hemate), tambin coexisten macrocitosis ==> anisocitosis; poiquilocitosis y policromasia por inmadurez de los megalocitos; reticulopenia, trombocitopenia y leucocitopenia ==> menos cantidad (los neutrfilos son anormalmente grandes e hper segmentados >/= 5 lbulos); hierro serico y bilirrubina serica ligeramente aumentados por hemlisis; VN vit.B12 > 150 pg/ml VN cido flico 3mg/ml. Determinaciones ==> ensayos biolgicos sobre bacterias o radio ensayos con istopos del cobalto puede diferenciar entre las carencias de vit B12 (su concentracin en el suero) y las de acido flico (en el suero y en los hemates). Un test de Schilling puede diferencia una anemia megaloblstica por dficit de vB12 o de FI: saturar el organismo con vit B12 1.000 gammas (ug) de cobalamina (inyeccin intramuscular) as saturamos el transportador (transcobalamina) 2 horas despus v B12 por va oral marcada con 58Co posteriormente si no se detecta la radioactividad urinaria, se confirmara la existencia de un trastorno en la absorcin oral de la vitamina B12; despus de 2 horas se administra va oral Vita B12 marcada con un istopo radiactivo del cobalto y ligada a FI si no se detecta la radioactividad urinaria, se confirmara la existencia de un dficit de B12 por absorcin dificultosa del complejo vitamina B12-FI. Datos de laboratorio en la MO: hiperplasia con numerosos megaloblastos de gran volumen, basofilia, con cariorrexis (desintegracin nuclear) y frecuentemente en mitosis; las clulas de granulopoyesis son grandes y sus ncleos son excesivamente lobulados; con la tincin Perls se observa presencia abundante de hierro en las clulas del SER (por hemolisis?).

Tratamiento: administracin de vit B12 o de acido flico por la va apropiada.

A.Perniciosa (a.megaloblastica por dficit del factor intrnseca de Castle) - pueden ser congenitas o adquiridas; e.j. gastritis de larga duracin que conduce a una atrofia de las celulas secretoras del FI; tambien por alteracion inmunologicas contra FI aunque muchas veces sera de origen desconocido; datos de laboratorio y tratamiento son iguales que a.megaloblastica.

POLICITEMIAS Y POLIGLOBULIAS
Policitemia aumento de la masa eritrocitaria, leucocitaria y trombocitaria; Poliglobulia o eritrocitosis incrementa la masa eritrocitaria.

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1.Poliglobulia relativa o pseudopoliglobulia HCT / hemo-concentracin alto (volumen plasmtico disminuido), reticulocitos, plaquetas y WBC normal - en MO tambin normal; por la ingesta de diurticos o deshidratacin (quemaduras graves y diarrea); tambin puede generarla el estrs (sndrome de Gaisbock) y consumo abusivo de alcohol. 2.Poliglobulias secundarias incremento de HCT por consecuencia de otras patologas: hipoxemia exgenas de las grandes alturas - falta O2 en la atmosfera, hipoxemias endgenas por EPOC (enfisema pulmonar, bronquitis crnica); metahemoglobinemia; inhalacin humo de tabaco/incremento de CO2; alteraciones hormonales del cortisol en el sndrome de Cushing o de la testosterona en tumores masculinizantes; hipernefroma (hper produccin de eritropoyetina) y hemoglobinopatias (Hb tienen una elevada afinidad por el O2); hipoxemias y hemoglobinopatias por elevada afinida de Hb por el O2 ==> hipoxia tisular ==> la secrecin de EPO.

3.Policitemia vera (PV) o policitemia esencial o enfermedad de Vazquez dentro de la clasificacin de sndromes mieloproliferativos (junto con la mielofibrosis, leucemia mieloide crnica y trombocitemia primaria); hiperactividad e la MO que afecta las 3 series celulares y predomina hiper-funcin eritropoyetina sin aumento sericos de EPO;MO podra tener una hiper-respuesta medular; frecuente en los varones entre los 5060 anyos y los judos; suele evolucionar hacia leucemia aguda; en 15% de pacientes suele evolucionar en un proceso agudo, otro 15% suele evolucionar hacia una metaplasia mieloide (proliferacion exagerada en MO de fibroblastos, osteoblastos) con focos de metaplasia tambin en baso, hgado, MO y ganglios linfociticos ==> conduce a hemorragia interna. Manifestaciones clnicas: sntomas anodinos/no significante (debilidad, mareos, disnea, cefaleas), cursa con: coloracin rojiza de la piel/la cara (eritrosis); aumento HCT, hiperviscosidad sangunea trombosis arteriales; hemorragias por anomala en la funcin de las plaquetas; hepatomegalia y esplenomegalia (por hiper-funcin);
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hiperuricemia ==> gota y clculos renales; ensanchamiento de la cavidad medular que causa dolores seos; es frecuente la hiper tensin arterial en 40% de los pacientes y prurito tras el banyo, probablemente por la liberacin de histamina por los basofilos que estan aumentados. Datos de laboratorio en la sangre perifrica: volemia aumentada ligeramente, pero lo que caracterizan el aumento de la masa eritrocitaria que sera microcitica y hipocroma secundaria (?) a un dficit de Fe por la hiper produccin; concentracin de Hb > 18g/dl en varones y > 16 g/dl en las mujeres; HCT > 54% en los varones y > 50% en las mujeres; RBC > 6 millones en los varones y > 5,6 millones en las mujeres; mltiples anomalas en la forma y tamao de los hemates (en las fases avanzadas de la enfermedad); leucocitosis con desviacin a la izquierda (jvenes); FAL (fosfatasa alcalina leucocitaria/ enzimas de los neutrofilos) elevada; precursores inmaduros de los eritrocitos y leucocitos; trombocitosis - pero no funcionan bien (hay hemorragia); (?)vit B12 serico incrementado; (?)hiperuricemia e (?)hiperuricosuria (cido rico); la saturacion de O2 normal, sirve para diagnostico diferencia con las poliglobulias secundarias a la hipoxia de los broncopatas (EPOC). Datos de laboratorio en la MO: la MO es hipercelular y pobre en grasa; el Fe disminuido. Diagnostico mayores: -aumento de la masa eritrocitaria (medida con 51Cr) >36 ml/kg de peso corporal en varones y > 32 ml/kg en mujeres; -incremento de la saturacin arterial de oxigeno (SaO2) > 92%; -esplenomegalia. Diagnsticos menores: -trombocitosis > 400.000 plaquetas por mm3; -leucocitos > 12.000 por mm3 (sin que haya infecciones); -ascenso de la fosfatasa alcalina leucocitaria > 100 UI (sin infeccin) y > B12 serico > 900 ng/ml. Diagnostico PV se establece con la concurrencia de 3 criterios mayores o 2 primeros criterios mayores y 2 criterios menores. Tratamiento: sangras/donar sangre (flebotoma) - no perjudica al receptor de la sangre? y melo supresores (p.e. 32P e hidroxiurea). 4.Eritroleucemia o sndrome de Di Guglielmo proliferacin excesiva de la serie eritroide, anormalidades en los eritroblastos y hper produccin granulocitica (de menor cuantia); su cuadro clnico es el propio de una leucemia.

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Velocidad de Sedimentacin Globular - VSG

Concepto - consiste en determinar la velocidad en que se sedimentan los hemates al colocar la sangre en una columna durante una unidad de tiempo generalmente 1 hora. Los hemates poseen carga electrosttica (-) en su membrana que provoca fenmenos de repulsin entre ellos y los mantienen suspendidos sin aglomerarse. En condicin normales, si se coloca la sangre en un tubo en posicin vertical, las clulas debido a la fuerza de la gravedad tienden a depositarse en el fondo. Si la carga electrosttica disminuye por la causa que sea, los hemates tienden a aglomerarse aumentando la velocidad de sedimentacion. VSG se expresa como los milmetros que las clulas han descendido, durante un periodo de tiempo (1 hora), antes tambin se hace en 2 horas. Fases - (1) periodo inicial de agregacin y durante esta fase se forman apilamientos y la VSG relativamente lenta y dura +/- 10 minutos (no hay cambios?) (2) periodo de sedimentacin rpida; durante este periodo la velocidad es estable y dura +/- 45 minutos. (3) periodo final de concentracin; dura el resto de tiempo. Factores - VSG depende fundamentalmente de las protenas de plasma y algo menos de los elementos formes; todo elemento de las globulinas o fibrinogeno plasmticos, acelera la VSG, lo que ocurre en la mayora de las infecciones. (1) factores fsicos/fisiolgicos (mayor o menor tendencia de los hemates que forman agregados) - mas alta en mujer, vejez y embarazo. (2) factores qumicos; la gran influencia que tienen las protenas plasmticas; niveles alto de fibringeno provocan una disminucin de la carga electrosttica de los eritrocitos. (3) factores biolgicos; destacan el embarazo y menstruacin (4) factores plasmticos; los niveles elevados de fibringeneo y en menor medida de lasglobulinas favorecen la aceleracin de VSG; estas protenas actan disminuyendo la carga electrosttica de los hemates lo que favorece la formacin de apilamiento. (5) factores eritrocitarios : a. la carga elctrica y el numero de eritrocitos - VSG es inversamente proporcional al numero de hemates; b. tamanyo celular - los macrocitos caen mas rpidamente que los microcitos; c. la forma - VSG disminuye porque los hemates anmalos no se pueden apilar normal. (6) factores ajenos - anti-coagulante que se usan; si existe o no hemolisis; por la inclinacin de tubo; burbujas de aire; temperatura; tiempo de VSG. Mtodos - manual estandarizado (westergren) Material - pipetas de westergren +/- 1 ml y esta graduada de 0-200 mm, gradilla o soporte de westergren, tubos mezclados de VSG que llevan anti coagulante incorporado (citrato sdico 3,7%) en que la proporcin es 1 parte de citrato y 4 de sangre; reloj avisador y la sangre total; Tcnica - extraccin de sangre, vertemos al tubo hasta la senyal, mezclamos, introducimos la pipeta dentro del tubo en la gradilla, en un lugar en posicin vertical durante 1 hora; Resultad - acabo de 1 hora, vemos la columna de plasma que se ha formado por el descenso de los hemates (en mm); vn de varn: 1-10 mm (primera hora); vn de mujer: 3-14 mm (porque hay menos hemates); Mtodos - automtico (zetafuge de casa coulter) es un sistema que utiliza la centrifugacion de unos capilares en posicin vertical en 4 ciclos de 45" de duracin. Los tubos se leen de forma semejante a lo de HCT (zetacrito); el calculo Hto/ Zto (mira una escala); un sistema totalmente automtico "diesse" que proporciona el
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resultado equiparables a los obtenidos por el mtodo de westergren; utiliza tubos especiales de plstico con anti-coagulante incorporado; tienen una forma especial como una seccin rectangular estrecha en la parte anterior y superior; para la lectura se utiliza un analizador capaz de procesar un alto numero de muestras de forma simultanea; se realiza primero una agitacin automtica de los tubos, para seguidamente proceder a las lecturas a los 0-30-60 minutos; mediante sensores de luz infrarrojo que mide el nivel de opacidad de la columna de sangre. La segunda y la tercera lectura miden el descenso de nivel opacidad con respecto a la primera lectura. Libro: La membrana de los glbulos rojos tiene una carga electrosttica negativa (potencial zeta). Esta carga electrosttica negativa da lugar a unas fuerzas de repulsin entre os hemates que hacen que los eritrocitos tiendan a permanecer en suspensin, pero acaban depositndose debido a la fuerza de la gravedad en el fondo del recipiente en 3 fases: 1.fase inicial de agregacin, sedimentacin lenta, dura 10 minutos 2.fase de sedimentacin rpida, a velocidad alta y constante, dura 40 minutos 3.fase final de concentracin, se endentece, hasta el final de la segunda hora; la determinacin de VSG la rapidez con la que sedimentan los hemates de una muestra; en condiciones patolgicas con mayor facilidad y VSG aumenta. VSG = longitud del recorrido que desciende la columna de eritrocitos, desde la parte superior del tubo hacia abajo, en un intervalo de tiempo.

FISIOLOGA LEUCOCITARIA I
Clasificacin de los leucocitos : -segn su origen: leucocitos mieloide (neutros, eusinos, basos) y linfocitos -segn la presencia de granulaciones en su citoplasma: granulocitos y agranulocitos (linfos, monos) -segn la forma de su ncleo: polimorfo nucleares (PMN) y mononucleares -segn su funcin: fagocitos e inmunocitos Valores normales de total leucocitos : 5.000 11.000 /mm3 Neutrfilos segmentados 35-65%: 2.000-8.000 /mm3 (> neutrofilia y < neutropenia) Neutrfilos en cayado 0-5% (> desviacin a la izquierda y < desviacin a la derecha) Eosinfilos 2-4%: 0-800 /mm3 (> eosinofilia y < eosinopenia) Basfilos 0-1%: 0-200 /mm3 (> basofilia y < basopenia) Monocitos 3-6%: 160-1.000 /mm3 (> monocitosis y < monocitopenia) Linfocitos (total) 20-45%: 1.000-5.000 /mm3 (>linfocitosis y < linfopenia) Linfocitos T : 70-80% de total linfocitos; Linfocitos B 15-20% y clulas NK +/-10%

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Granulopoyesis/el proceso de formacin de los granulocitos (PMN) neutrfilos, eosinfilos y basfilos (se clasifican segn las afinidades tintoriales de sus granulaciones citoplasmticas); ncleos no son redondeados, presentan lobulaciones, parecen tener varios ncleos (polimorfonuclear - un solo ncleo estrangulado), granulaciones citoplasmticas visibles al Microscopio ptico (granulocitos); Neutrfilos: Formacin Granulopoyesis Neutrofila (leucopoyesis): dura 8-11 das CFU GM(neutrfilos y monocitos) CFU-G (precursor comprometido granuloctico) mieloblasto: 1a clula reconocible morfolgicamente (tipo I/sin granulaciones en su citoplasma o II/finas granulaciones primarias azurfilo/rojizo), redondeado, 20-25 u, ncleo grande rojizo cntrico y ovalado con ligera hendidura, cromatina laxa, 2-5 nucleidos visibles y confluir, citoplasma escaso y ligeramente basfilo se divide y madura promielocito: redondeado, 16-25 u , nucleo grandes esferico y tiende a excentrarse, cromatina laxa con nucleolos, citoplasma abundante azulado y repletos de granulos primarios azurofilos/rojos (lisosomas llenos de sustancias hidrolasas acidas, fosfatasa acida, mielooeroxidasa, muramidasa), tipo I o II, se divide varias veces y madura mielocito neutrfilo: redondeado, 12-18 u, nucleo mas pequeo emnos redondeado mas azulado excentrico, cromatina mas condensada comienza mostrar grumos se ven nucleolos, citoplasma abundante rosado-marron con abundantes granulos especificos o secundarios de color pardo-violeta repletos de sustancias (muramidas, colagenasa, fosfatasa alcalina) y granulos primarios azurofilos; madura y se dividen varias veces tambien metamielocito: ya no tiene capacidad mitocica, 12-15 u, citoplasma rosado, ncleo arinado-juda, cromatina densa-grumosa neutrfilo en banda o en cayado (en la MO y 3-5% en la sangre perifrica); ncleo se adelgaza, elonga y arquea de forma C o S sin estrangulaciones, morado oscuro en forma de herradura, el citoplasma es rosado con finas granulaciones secundarias de color pardo oscuro (ya no se sintetizan as granulaciones); en la sangre perifrica ya no maduran neutrfilo segmentado: redondeado, dimetro 12-15 u, ncleo de color violeta oscuro con varios lbulos unidos por finos puentes de cromatina, cromatina es espesa y densa, pequeo apndice en palillo de tambor en su ncleo (cromatina sexual) en la mujer, citoplasma es acidofilo (rosado) con grnulos neutros finos parda-rosado; 10-20% primarios (lisosomas con sustancias hidrolasas acidas, fosfatasa acida, mieloperoxidasa, muramidasa) y 80-90% secundarios (sustancias muramidasa, colagenasa, fosfatasa alcalina); la fosfatasa alcalina (enzima principal, pero tambin hay otras importantes - lactoferrina y fosfatasa cida) tambin forma parte de estructuras microsomas y fraccin de la membrana;
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Regulacin Neutrofila y tambin se cree que la baso-fila - la Granulopoyesis estimulada por: glucoproteico (factor estimulante de las colonias /FEC en ingles CSF) producido por macrfagos y linfocitos activados; dura 8-11 das; la granulopoyesis a la vez inhibida por: factores chalonas liberado por los propios granulocitos, mientras los macrfagos sintetizan prostaglandina E (PGE) que tambin se opone al efecto de FEC; la proliferacin de neutros y monos esta equilibrado por FEC y PGE.

Cintica (8-11 das): por cada neutrfilo circulante hay de 10-15 precursores suyos en la MO; metamielocitos, segmentados en cayado y segmentados maduros en MO constituyen la reserva granulocitica medular (pool de reserva RGM); estadio (1)maduracin con proliferacin: va desde la fase mieloblasto a mielocito, de manera que 1 mieloblasto ==> 8 metamielocitos /pool mitotico; estadio (2) los metamielocitos sin capacidad mitotica sufren en 2 das un proceso de maduracin que conduce a la formacin del granulocitos madura (no pasan inmediatamente a la sangre perifrica, sino permanecen en MO +/- 3 das; los granulocitos maduros, los cayados y los metamielocitos son pool de reserva; una parte de neutrfilos circulan con la sangre (pool granulocitos circulante o PGC) - 35-65% de total leucocitos, y el resto pegada a las paredes de los vasos (pool granuloctico marginal o PGM); PGC pueden pasar a PGM y viceversa; su vida media es de 14 das, despus de 6 horas en la sangre, pasan definitivamente a los tejidos (funcin extra vascular) y abandonan el organismo a travs de orina, saliva o destruidos en el SER; en circunstancias patolgicas (leucemias) - trastornos en la produccin precoz/inmaduros: los neutrfilos funcionan mal, mas tiempo en la sangre, vuelven a los tejidos y se dividen en la sangre y en los tejidos. Funcin fagocitosis (mas importante): atrados hacia el foco infeccioso por quimiotaxinas (protenas bacterianas pptidos formil-met-leu-phe, fraccin del complemento C5a, quimitactico de neutrfilos NCF producido por mastocitos y basfilos, leucotrienos B4 producido por macrfagos) vasodilatacin y diapdesis fagocitosis directa o tras opzonizacin (recubrimiento del germen con unas sustancias opsoninas como IgG y fragmento C3b del complemento; cuando el microorganismo se fija al neutrfilo sistema actomiosinico contrctil (seudpodos/ fase de ingestin del microorganismo) alrededor del germen (formar una cavidad) se cierra (vaculo fagoctica o fagosoma) vertidos los grnulos citoplasmticos el germen es destruido por diversas enzimas (perxido de hidrgeno, mieloperoxidasa, lisozima, lactoferrina, etc.) digerido por enzimas hidroliticas productos de degradacin liberados al exterior; los neutrfilos son muy efectivos contra las bacterias pigenas (generadoras de pus ) y su capacidad fagoctica puede ser inhibida por corticoides y alcohol etlico. Eosinfilos : Granulopoyesis Eosinfilica: (ocurre en la MO) CFU-S ==> CFU-Eo eosinofiloblasto (1ra clula morfolgicamente reconocible) promielocito eosinfilo;
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los grnulos eosinfilos (pequeas gris-pardo/ pardo-anaranjado segn el grado de maduracin) pueden ocultar la gr anulacin azurfila y el ncleo; mielocito eosinfilo; (semejante a mielocito neutrfilo) citoplasma basfilo, ocupado por grnulos eosinfilos pardo-anaranjado metamielocito, eosinfilo en cayado ==> eosinfilo segmentado: redondeado, dimetro 12-17 u, ncleo de color violeta con dos lbulos segmentados de unin finos (aspecto anteojos / alforja), cromatina condensada en grumos; citoplasma es rosa repletos de grandes grnulos acidfilos que cubren el ncleo, que contienen sustancias (protena bsica principal (MBP), la peroxidada, fosfatasa acida, hidrolasa acida, fosfolipasa y catepsina); a diferencia de los neutros, no poseen ni lactoferrina ni fosfatasa alcalina se tien con la eosina de color pardo-anaranjado; La divisin y maduracin de CFU-Eo estimulada por un compuesto producido por linfocitos T (CSF-Eo).

Cintica - constituye 2-4%; hay 100 veces mas abundante en los tejidos que en la sangre y ejercen de barreras frente al mundo exterior (piel, pulmn y tubo gastrointestinal); su vida media = neutrfilos; pasan a los tejidos cuando aumenta la concentracin de hormonas crtico adrenales en la sangre; cuando han cumplido su funcin son fagocitados por los macrfagos tisulares. Funcin fagocitara inferior que neutrfilos (parece que no fagocitan bacterias, pero si complejos Ags-Acs): atrados al foco inflamatorios por factor quimiotctico de eosinfilos (ECF) liberado por basfilos y mastocitos; los parsitos grandes como helmintos no pueden ser fagocitados pero pueden estar tapizados por C3b eosinfilos se fijan a travs de sus receptores de C3b, se activa y liberan protena bsica principal (MBP) catinica que lesiona la membrana de los parsitos (ataque extra celular); otra funcin modulan reacciones alrgicas (accin de la IgE y desgranulacin de sustancias de basfilos y mastocitos) in-activando las sustancias emitidas. Basfilos: Granulopoyesis baso-filia: posibilidad de precursor: lo mas probable cuando CFU-GM se diferencia hacia CFU-G y CFU-M, tambin lo haga hacia CFU-Ba; otra teora de CFU-S sale directamente CFU-Ba mieloblasto basfilo (1ra reconocible); nuclolos poco evidentes/no visibles, citoplasma escaso con grnulos basfilos/violeta, de diferentes tamaos, pueden ocultar el ncleo; vacuolas que proceden de grnulos disueltos promielocito basfilo (semejante a promielocito neutrfilo) mielocito basfilo (semejante a mielocito neutrfilo) metamielocito basfilo - basfilo cayado - basfilo segmentado: redondeado, dimetro 12-14 u, ncleo es violeta oscuro con hendiduras de forma trbol/bilobulados, cromatina densa sin grandes grumos, citoplasma escaso de color rosa claro lleno de grnulos grandes esfrica o irregular de color azul intenso (basfilos) contiene sustancias cidas (heparina, histamina, peroxidasas y fosfatasas cidas) y algunas
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vacuolas derivadas de grnulos vaciados; Los grnulos se tien con colorantes bsicos de color azul oscuro.

Mastocitos o clulas cebadas son clulas de tejidos conectivos, se parecen mucho a los basfilos (se cree que son basfilos modificados/transformados en los tejidos; residen en los tejidos (MO, el timo y el bazo), mientras los basfilos son circulantes: redondeada, su contorno algo poligonal, tamao > que basfilos, ncleo esfrico de color violeta en el centro, citoplasma rosado repleto de grnulos; los grnulos de citoplasma son algo mas pequeos de color azul oscuro o violeta oscuro, metacromticos y pueden ocultar el ncleo (cambian de color segn el la tincin); tienen caractersticas citoqumicas similares a basfilos. Cintica su vida media = neutrfilos, constituyen 0-1% de la formula leucocitaria, pasan a los tejidos cuando aumentan la concentracin de hormonas crtico adrenales en la sangre. Funcin tanto mastocitos como basfilos (activado por C3a y C5a) sintetizan sustancias mediadores preformados (almacenados en sus grnulos): histamina, factor quimiotactico de eosinfilos (ECF), factor quimiotactico de neutrfilos (NCF), factor activador de las plaquetas (FAP) y interleuquinas; tambin sintetizan mediadores reciente sintetizados (que solo se producen tras la activacin de estas clulas por C3a y C5a); sustancias quimiotcticas eosinfilos/ECF y neutrfilos/NCF (inducen la migracin de los eosinfilos y neutrfilos hacia el foco infeccioso, para destruir parsitos y bacterias); sustancias vasoactivas (histamina, leucotrienos y prostaglandinas) provoca vasodilatacin, aumento de flujo sanguneo y diapdesis (brechas que se forman entre las clulas endoteliales), asi incrementa la llegada de los leucocitos; cuando un Ag especifico reacciona con el Ig(E) que hay en la membrana de basofilos y mastocitos ==> se libera sustancias mediadores + IgE desgranulacion descontrolada hipersensibilidad tipo I (alergia). FISIOLOGIA LEUCOCITARIA II Mononucleares Monocitos comparten el mismo precursor comprometido que los neutrfilos (CFU-GM) CFU-LM ==> CFU-S ==> CFU-GM ==> CFU-M ; Monopoyesis estimulada por FEC/CSF factor estimulante de las colonias): CFU GM monoblastos (muy similar a mieloblasto neutrfilos) promonocito (1a clula reconocible - poca capacidad fagocitica): dimetro 20-25 u, ncleo con hendidura e irregular, cromatina laxa con grumos, contiene 2-5 nuclolos visibles, citoplasma abundante (gris azulado) con finas granulaciones azurfilas/lisosomas primarios; se divide 2x y madura; solo se distinguen con promielocito mediante tcnicas citoqumicas y la proporcin/relacin entre citoplasmancleo monocito: forma irregular y redondeada, dimetro 20-25 u, ncleo grande
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arrionado, cromatina condensada, citoplasma de color basfilo claro (azul grisceo/rosa grisceo depende de la tincin) con finas y escasas granulaciones azurofilas cerca del ncleo con vacuolas; produce (en el aparato de Golgi): enzimas hidrolticas peroxidasa, fosfatasa cida, arilsulfatasa, lisozima, etc; se adapta a las formas de los hemates (impronta de los H); los monocitos en sangre perifrica 3-6% de total leucocitos (160-1000/mm3) pool circulante y pool marginal (3,5 veces mas cantidad en el marginal que pool circulante); Monopoyesis es muy rpida (+/- 24 horas) y al contrario de granulopoyesis, el monocito salen inmaduro a la sangre perifrica.

Cintica 8 horas en circulacin emigran a los tejidos y adoptan formas de histiocitos (macrfagos); los macrfagos/histiocitos se encuentran en los espacios pleural y peritoneo, hgado, baso, donde reciben diferentes nombres; son clulas grandes 20-80u, se mueven lentamente, emitiendo seudopodos gigantes; los macrfagos inmaduros tienen capacidad de sntesis de ADN y la divisin celulares, dando el macrfagos maduros que ya no se replica; su fase hstica dura varios meses y pueden dividirse; sistemas mononuclear fagoctico (SMF): conjunto de precursores monociticos medulares, monocitos sanguneos y los histiocitos; Funcin de SMF - (a) secreciones de defensa contra ciertos microorganismos, (b) eliminacin de clulas lesionadas y restos celulares y (c) interaccin con clulas linfoides en ciertas fases de las reacciones inmunolgicas (como clulas presentadoras de Ag (APC). Mononucleares Linfocitos Linfopoyesis - proceso de formacion de los diversons tipos de linfocitos que comienza en MO. Clases de linfocitos segun su morfologia - linfocitos grandes, medianos y pequeos; segun su funcin - linfocitos T & B. Caracteristicas generales del Sistema Linfocitario: - localizados en los tejidos circulantes, en la sangre o en la linfa ==> sistema celular principalmente responsable de las reacciones inmunitarias en el individuo; - linfocitos T y B presentan un aspecto homogeneo (indistinguible morfologicamente) ==> se diferencia solo por tecnicas inmunologicas; - celulas madres pluripotenciales ==> CFU-LM (monopotenciales) ==> linfoblastos (pro-B y To/celula pretimica; Linea T ==> linfoblasto To emigra durante su embrionaria al Timo, se madura en la zona cortical ==> T1, se desplaza a la zona medular donde se siguen madurando ==> pasan a los organos linfoides 2os para acabar de madurar y adquirir su
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plena inmunocompetencia al ponerse en contacto con los Ags; Linea B ==> linfoblasto proB permanecen y maduran en MO ==> pre-B hasta llegar a linfocito B maduro ==> pasan a la sangre hacia los organos linfoides 2os para adquirir su plena inmunocompetencia; puede retornar a MO para realizar una maduracion final. Para ejercer como defensa inmuinologica, deben: -ser capaz de distinguir entre Ags propios y Ags extraos (tolerancia); sin esta capacidad, podrian originar un ataque autoinmune (destruccion de las celulas propias); -responder a nuevos Ags toda la vida mediante celulas programadas a responder a ellos; -crear una memoria inmunologica que acelerara el proceso inmunologico ante un nuevo encuentro con el Ag en cuestion. -tener gran movilidad para poder estar en completa y constante vigilancia; Ontogenia del sistema linfocitario (como se desarolla) El desarollo de sus funciones especializadas empieza y continua toda la vida, porque el sistema deben acumular informacion (memoria inmunologica) para actuar con mayor velocidad y efectividad ante los Ags; la tolerancia a los propios Ags se desarolla durante la vida fetal (sist linfo envuelto por Ags especificos y protegidos de agentes antagonicos externos;los factores de autorreconocimiento: - la concentracion antigenica respecto a la cantidad y grado de maduracion de celulas receptoras; - el modo y la configuracion de los Ags; - la cantidad y funcionalidad d elas celulas complementarias que intervienen en el proceso; rganos linfopoyticos primarios MO y el timo, es organo retroesternal compuesto de corteza y medula, muy desarollado en la infacia y adolescencia y involuciona en el adulto; proporcional celulas indiferenciadas; rganos linfoides secundarios el bazo, los ganglios linfticos, el tejido linfoide asociado al intestino (placas de Peyer y apndice cecal) y aparato respiratorio (amgdalas y adenoides); los rganos linfoides son conectados entre si mediante los vasos linfticos .

Formacin Linfocitos T: clula madre linfoide precursor CFU-LM (colony forming unit-lymphoid Myeloid) linfocito To (clula T virgen o pretimica) migran desde MO hasta la corteza del timo para madurar (influenciados por hormonas del epitelio timico) la medula del timo (continan madurando y adquiriendo receptores de membrana TCR y de Ag de superficie) linfocitos T1 (maduros); algunos linfocitos To pasan directamente de MO a los ganglios linfaticos y otros rganos linfoides 2os, asi se mantiene la inmunidad celular tras la atrofia del tipo (acontece en la pubertad); durante su maduracion el linfocito T solo se prepara para reconocer Ags extraos; si reconoce algun
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compuesto de complejo mayor de histocompatibilidad (MCH) o Ags propios ==> se autodestruye;

MCH => un grupo de genes en el brazo corto del cromosoma 6 que codifican la sintesis deAgs de histocompatibilidad/HLA (proteinas) o Ags de superficie de leucocitos humanos;HLA => intervienen en muchos procesos inmunes/el control de la respuesta inmune (interaccion entre celulas linfoides y entre los linfocitos y celulas presentadoras de Ags, etc.); reconocimiento de los Ags ==> Ags deben estar unidos a una molecula de MCH procedente de la celula presentadora de Ag; MCH se clasifican : - clase I: codifican Ags HLA de clase I (HLA A,B,C,G...en todas las celulas nucleadas, plaquetas y espermatozoides, excepto celulas del sistema nervioso); - clase II: codifican Ags HLA de clase II (HLA D, DR, DQ...en los macrofagos, linfocitos B, celulas epiteliales, celulas de Langerhans); - clase III: codifican proteinas del sistema del complemento (C2, C4...)

Tras su migracion hacia los organos linfoides 2os (bazo, ganglios linfaticos, organos/tejidos linfoides intestinales y respiratorios) + estimulacion antigenica ==> adquieren su plena capacidad inmunocompetente y se diferencian en: - linfocito Th o helper o auxiliador : interacciona con Ag presentado por el macrofago y estimula al linfocito B, para producir Acs y estimula al linfocito Tc (citotoxico); - linfocito Tc o citotoxico o killer : provocan lisis celular de diferentes celulas Ags. - linfocito Tm o de memoria: acelera la marcha la inmunidad celular; los Ags de superficie sirven para diferenciar los linfocitos T ==> todos tienen CD3; CD4 solo esta presente en los T helper; CD8 expresados en los T supresores y los T citotoxicos (morfologicamente todos son iguales).

Cinetica - Linfocitos B y T predominantes de los ganglios (tambien hay macrofagos y plasmocitos); salen y entran varias veces de la circulacion sanguinea (70% de total formula linfocitaria) hacia la linfa viceversa (tambien son celulas predominante de la linfa); la duracion de la vida media - los linfocitos To del timo son cortas 10-20 dias y los de los organos perifericos dura varios meses y puede alcanzar aos entre 2 mitosis; si las celulas no se encuentran en este tiempo el Ag correspondiente, esto permite la conservacion de la memoria inmunologica y la reaccion secundaria frente un Ag ya conocido aunque sea mucho tiempo antes; algunos se transforman tras los estimulos antigenicos, otros se pierden a traves del tracto respiratorio y digestivo; la mayor parte son fagocitados por macrofagos en los ganglios. Funcin - los LTm cuando entran nuevamente en contacto con el Ag, acelera la marcha de la respuesta inmunitaria celular; Los LTc - lisan las celulas dianal, cuya membrana esta el Ag; Los LTs inactivan a otros linfocitos; Los LTh reconocen los Ags extraos y ayudan a activar a los LTc y los LB; Los linfocitos T son los responsables de la inmunidad celular e intervienen en los siguentes procesos: - defensa contra los germenes intracelulares (brucelal, bacilo tuberculosos y virus) - lucha contra el desarollo de neoplasias - reacciones de rechazo a los transplantes (debido a HLA/ Ags de histocompatibilidad de superficie de leucocitos humanos); - hipersensibilidad tipo IV ==> reacciones inmunologicas exageradas frente a un Ag que produce lesiones en los tejidos de sujetos que lo padecen, mediado por clulas y retardadas en el tiempo, a diferencia de las otras hipersensibilidades (I, II, III y V que son mas
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inmediatas y mediadas por Acs). Formacin - linfocitos B: comienza en MO; celula madre pluripotencial => CFU-LM (se dividen y maduran) => pro-B + la interaccion de celulas estromales (celulas grandes con proyecciones) mediante IL y moleculas de superficie => division, diferenciacion y adquisicion de receptores de superficie de Ig => pre-B (codifican la sintesis de las cadenas pesadas y posteriormente las cadenas ligeras) => empieza la sintesis de las Igs y proteinas (Ig alfa y Ig beta); los Igs juntos avanzan hacia la superficie celular hasta colocarse en la membrana =>linfocito B inmaduro; durante la maduracion pre-B tambin adquieren otros receptores de membrana: - receptores para el fragmento Fc de algunas Igs (IgG) - receptores para algunos commponentes del complemento (C3) - receptores para los hematies del raton; ademas, en toda su superficie, Linfocitos B expresan moleculas de clase II del HLA (fundamental para reconocimiento del Ag); las celulas B tambien se suicidan para evitar las reacciones auto inmunes; a travs de este proceso se consigue una poblacin de Linfocitos B capacitada para reaccionar ante una amplsima gama de Ags; cuando las clulas B recin formadas interaccionan con el entorno y reconocen Ags propios (al reaccionar sus receptores con las clulas vecinas), reciben una seal y se suicidan (para evitar las reacciones auto inmunes); las clulas B que sobreviven a esta seleccin, maduran y dan lugar a clones de linfocitos B que pasan ==> sangre ==> los rganos linfoides 2os ubicndose en bazo y ganglios linfticos; all, los macrfagos existentes les presentan los Ags ==> se activan con ayuda de linfocitos Th; posteriormente linfocitos B pueden retornar a MO para una maduracin final (mutacin para que las Ig sintetizadas sean mucho mas especificas contra el Ag que provoque su activacin); cuando los linfocitos B se activan (inmunoblastos), pueden transformarse => clula plasmticas (formadoras de Acs) o => linfocitos de memoria (Bm) que tiene una vida media muy larga y ante un posterior estimulo antignico de la misma naturaleza que recibi anteriormente, son capaces de dividirse y diferenciarse con mucha rapidez => clulas plasmticas. Cintica - linfocitos B pasan desde los rganos linfoides hacia la sangre donde constituyen aproximadamente 30% de todos los linfocitos; re-circulan menos que los linfocito T y su vida media es tambin algo menor. Funcin - la principal es la formacin de los Acs, que tiene como funcin: neutralizar los Ags, marcaje de clulas extraas para que sean atacadas por otros leucocitos, destruccin de germenes extra celulares; a esta funcin se le domina inmunidad humoral. Morfologa de los linfocitos - los linfocitos suponen entre 25-40% de los leucocitos de la sangre (1000-5000/mm3); (1) morfolgicamente son indistinguibles entre ellos, y presentan las siguientes caractersticas: - son redondeados, tamao de los pequeos 7-8 u y de los grandes hasta 16u; LT algo mayor que LB; - ncleo redondeado, cromatina densa y homognea - citoplasma escaso en linfocitos pequeos y algo mas abundante en los grandes, basfilo ligero (azul claro) y sobre todo los T, pueden tener algunas granulaciones azurfilas sin actividad peroxidsica. (2)Cuando los linfocitos se activan por el contacto con el Ag ( linfocitos activados/inmunoblastos), sufren una transformacin que hace modificar su morfologa; esta activacin hace que haya una sntesis activa de DNA y protenas que origina multiplicacin por mitosis y desarrollo de un aparato funcional en citoplasma:
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- su tamao aumenta hasta los 15-25 micras - su ncleo es redondo y grande, con cromatina laxa y con nuclolos prominentes, excntrico - su citoplasma se torna abundante y muy basfilo (azul oscuro) sin grnulos, ademas se adapta a los hemates del entorno; los auto analizadores las agrupan bajo el termino de clulas LUC. (3)Tras mitosis sucesivas, el inmunoblastos de origen B dando lugar a clulas plasmticas o plasmocitos: - son redondeadas u ovaladas, tamao entre 15-25 micras - su ncleo es redondo u ovalado, pequeo y excntrico, cromatina agrupada en forma radial (imagen-rueda de carro), no contiene nuclolos - su citoplasma es abundante, muy basfilo y puede contener vacuolas pero no grnulos; el rea peri nuclear se tie dbilmente; estas clulas no se encuentran en sangre perifrica excepto en estados patolgicos (infecciones crnicas como TBC, alrgicas, miolema mltiple, sarampin y otras viriasis etc.); su emplazamiento son los rganos linfoides 2os; su funcin es la secrecin de Acs (el paso de linfocitos B => plasmocitos se debe a las estimulaciones anti gnicas en todos los rganos perifricos y MO; tras la secrecin de los Acs, plasmocitos son destruidos in situ. La manera de poder distinguir las diferentes poblaciones linfocitarias es por tcnicas inmunolgicas (poniendo en evidencia sus marcadores de superficie) y por algunas tcnicas citoqumicas. Regulacin de la actividad linfocitarias - existen muchos mecanismos de regulacin, pero el mas importante es la regulacin por citoquinas (polipptidos que actan como mensajeros intercelulares); cuando son producidas por los linfocitos => linfoquinas; los mas importantes son: - MIF factor inhibidor de los macrfagos (secretado por LT activados) promueven el acumulo de los macrfagos en el foco inflamatorio. - IFN interfern gamma (secretado por LT activados) aumenta la capacidad de los macrfagos para presentar el Ag a los LB. - Interleucina 1 (IL-1 generada por los macrfagos) interviene en la activacin de losLT y B - Interleucina 2 (IL-2 secretado por LThelper) potencia la divisin de los LT y B - Interleucina 4,5 y 6 (IL-4, IL-5 y IL-6 secretadas por los LT) estimulan la divisin de los LB, su diferenciacin hacia clulas plasmticas y la produccin de Acs. - Interleucina 7 (IL-7 secretada por clulas estromales de la MO) estimula la proliferacin de las clulas pro-B, pre-B y de los LT maduros activados.

Practica XXVII (recuento de leucocitos (WBC) Material: pipeta diluidota de Thoma para glbulos blancos Reactivos: el liquido de dilucin Turck; el acido actico que contiene produce la lisis de los eritrocitos sin alterar a los leucocictos; el violeta de genciana tie el ncleo de los leucocitos para que estos puedan observarse mejor; Muestra: la misma que en el RBC Tcnica: la misma que en el recuento de hemates, pero se cuentan los leucocitos presentes en los 4 cuadrados grandes de las esquinas del retculo (cada uno de ellos esta dividido a su vez en 16 cuadrados medianos); si los leucocitos se ven bien, se pueden contar con el objetivo de 10x.
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Lectura: se cuentan los leucocitos presentes en 4 cuadrados grandes y dividir por 4 (la media); longitud del espacio comprendido entre estos y el cubre es de 0,1 mm, hay que multiplicar por 10 el resultado anterior; previamente la sangre se diluye, hay que multiplicar el resultado anterior por 10 si la sangre se ha enrasado hasta el 1 o multiplicar por 20 si se ha enrasado hasta 0,5; la formula: WBC = (L / 4) x 10 x D (dilucin)

Prctica XXVIII (formula leucocitaria) La formula leucocitaria o recuente diferencial leucocitario (RDL): determinacin del porcentaje que representa cada uno de los tipos de leucocitos con respecto al total de ellos; Material: microscopio, papel y lpiz o registrador automtico de clulas (un apto que tiene unas teclas; cada tecla representa a un tipo d leucocito y hace anotacin cada vez que es presionada; cuando el numero de anotaciones llega a 100, suena una alarma). Reactivos: aceite de inmersin Muestra: extensin de sangre teida con un colorante de uso habitual (panptico) Tcnica: preparar el microscopio para que tenga el condensador alto y el diafragma abierto; enfocar la preparacin con el objetivo de 10x; comprobar que la preparacin es buena y elegir una zona en la que los hemates no estn superpuestos y los leucocitos se encuentren uniformemente distribuidos; enfocar esa zona de la preparacin con el objetivo de inmersin; observar esa zona mientras se descrie un recorrido en forma de almenas o de greca; simultneamente a esto, se clasifican y se cuentan los leucocitos que se van encontrando alo largo de ese recorrido; Lectura de resultados: solo se cuentan 100 leucocitos o mximo 200; si se conoce el WBC de la sangre, se puede calcular el numero de cada uno de los tipos de leucocitos que esta presente en 1 mm3 de sangre, con la formula: no TL = WBC x % TL 100 no TL= numero de un tipo de leucocito por mm3 de sangre (valor absoluto) WBC = recuento d leucocitos (numero de leucocitos por mm3 de sangre) %TL = porcentaje que representa ese tipo de leucocito con respecto al resto (valor relativo) Hay que tener en cuenta que hasta los 4 aos de vida se observa una inversin de la formula leucocitaria (mas linfocitos que neutrfilos); Total leucocitos (valor normales) 5.000 11.000 /mm3 Neutrfilos segmentados 3565 % (2.000 8.000 /mm3) Neutrfilos en cayado 05 % Eosinfilos 24 % (0 800 /mm3) Basfilos 01 % (0200 /mm3) Monocitos 36 % (1601.000 /mm3) Linfocitos (total) 20 45 % (1.000 5.000 /mm3) Linfocitos T 70 80 % de total linfocitos Linfocitos B 15 20 % de total linfocitos Clulas NK +/- 10% de total linfocitos

ndices Leucocitario
parmetros que sirven para evaluar el grado de madurez de los leucocitos en concreto de los neutrfilos en la sangre perifrica ; no se tienen en cuenta las formas juveniles y maduras de los eosinfilos y de los basfilos debido su menor presencia;
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Recuento de Schilling cuantificar el numero de formas juveniles y el de formas maduras de los neutrfilos en la sangre perifrica y relacionar ambos valores ; clasificacin de Schilling (2 grupos): formas juveniles (mielocitos 0%, metamielocitos 0-1% y neutrfilos en banda o en cayado 0-5%) y formas maduras (neutrfilos segmentados 35-65%); ante la duda, se incluye siempre en la categora mas madura; calculo: ndice de Schilling => % de formas juveniles (1/16) % de formas maduras valoracin normal del ndice de Schilling 1 forma juvenil = por cada 16 formas maduras de neutrfilos; cuando > % formas juveniles desviacin a la izquierda y cuando > % de formas maduras desviacin a la derecha. Recuento de Arneth contar el numero de lobulaciones que tiene una cantidad determinada de neutrfilos y calcular el numero de lbulos que hay por cada neutrfilo; suele hacerse con auto-analizadores (Indice de Lobularidad) ; clasificacin: tipo 1neutrfilos con ncleo no segmentado (sin lobulaciones), tipo 2,3,4,y5-neutrfilos con ncleo de 2 lbulos, 3,4,5 respectivamente; calculo: se calcula el numero de cada tipo de Arneth, por tanto es posible saber el numero de lbulos por neutrfilo; los modernos autoanalizadores hematolgicos proporcionan esta cifra (ndice de lobularidad (IL) =>no.de lbulos contados no. de neutrfilos observados (en este caso 100) Valoracin de IL normal: 1,9-3 (<1,9 => desviacin a la izquierda; >3 => desviacin a la derecha)

Tcnicas histoqumicas de identificacin leucocitaria

permiten la identificacin de ciertas sustancias presentes en la clula, detectar y localizar enzimas y sustancias inorgnicas, establecer con mayor exactitud el grado de maduracin y funcionalidad de las clulas, validas para el diagnostico de distintas leucemias y evaluar el tratamiento antileucmico; tres procesos fundamentales: fijacin, extensin, incubacin y tincin de contraste. Fijacin de la extensin evitar el deterioro celular e impedir la difusin de sustancias al medio extracelular; fijador: el metanol, el etanol, la acetona => coagulando las protenas celulares; formaldehdo y glutaraldehido => actan formando puentes intra e interproteicos; es importante eliminar bien los restos de fijador para evitar interacciones con el compuesto que deseamos analizar. Incubacin tiempo de reaccin que da lugar a un precipitado apreciable al microscopio ptico; en caso de identificacin de enzimas, debemos controlar bien el pH y la temperatura para optimizar la reaccin. Tincin de contraste facilitar la identificacin morfolgica de la clula en la que se ha producido la reaccin; en el caso de observadores muy experimentados se puede suprimir este tercer paso. Tipos de reacciones: 1-tincin del cido perydico de Schiff (PAS) se hacen mucho!! sirve parala identificacin de carbohidrato (el glucgeno, muco polisacridos, muco protenas, glucoproteinas y glucolpidos) en el citoplasma celular; da lugar a un precipitado de color
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rojo-prpura intenso (PAS positivas): (+) en polinucleares neutrfilos (negativa hasta el mielocito y dbilmente positiva en el metamielocito), (+) en basfilos; es til para el diagnostico de algunos tipos de LLA (formacin de mazacotes en los blastos) y eritroleucemia (positividad difusa en los eritroblastos). 2-tincin de la peroxidasa (el mas importante!!) detecta la presencia de la enzima peroxidasa en el citoplasma celular; da lugar a un precipitado rojo-marrn en los leucocitos que contienen peroxidasa; en los eosinfilos => amarillo-marrn (muy intenso); en base a la actividad peroxidasa de cada tipo leucocitario => formula leucocitaria tal como la hacen los auto-analizadores. linfocitos => clulas mas pequeas y carecen de actividad peroxidsica, monocitos => ligeramente mayores con mas peroxidasa, neutrfilos => son de menor tamao y ricos en peroxidasa, eosinfilos => de mayor tamao que neutrfilos y son muy cargados de peroxidasa, LUC (large unstained cells) => celulas de gran tamao, no teidas, presentes en la sangre +/- 4% y sin actividad peroxidasica: linfocitos hiperactivos, clulas patolgicas linfoblastos, mieloblastos etc.;

MPXI o IMPX (ndice de actividad peroxidsica media de la poblacin de neutrfilos): valor por de bajo de normal => patologa de la serie mieloide un dficit congnito o adquirido; valor por encima de normal => una gran presencia de cayados; la tincin de la peroxidasa - es til para clasificar los leucocitos y diferenciar los blastos de estirpe mieloide de los de estirpe linfoide en LMA; se tien bien los cuerpos de Auer de los blastos en LMA. Los basfilos tienen actividad peroxidasa baja, se cuentan mediante Indice Lobularidad poniendo un sulfactante en el medio que destruirn las membrana de citoplasma de las clulas a excepcin de los basfilos, as, se pueden contar el no.de basfilos que hay y ademas se puede determinar el no.de lbulos de las dems. 3-tincin de la fosfatasa alcalina leucocitaria (FAL) o granulocitaria (FAG) es una enzima en los grnulos secundarios de los leucocitos polimorfo nucleares (neutrfilos maduros o en banda); los basfilos y los eosinfilos no la poseen; es til en el diagnostico diferencial de algunos sndromes mieloproliferativos (en LMC el FAG es muy bajo y en policitemia vera el FAG es muy elevado); un resultado positivo (+) con esta tincin => cuando se aprecia la granulaciones de color marrn negruzco. 4-tincin del negro Sudan B sirve para identificar lpidos

ALTERACIONES DE LOS LEUCOCITOS

Alteraciones del nmero: Leucopenia o leucocitopenia cuando la cifra de total leucocitos < 4.000 /mm3 (descenso absoluto-numero total de ellos o relativo-% que representan con respecto al resto). Leucocitosis si la cifra 11.000 25.000 /mm3 (absoluto o relativo); cuando supera los 25.000 /mm3 se dice reaccin hiperleucocitosica y si adems se encuentran formas anormales (no blasticas), se dice reaccin leucemoide causado por recuperacin de la agranulocitosis (por muchos casos), mononucleosis infecciosa (vrica), linfocitosis aguda benigna.

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Agranulocitosis intensa disminucin incluso desaparicin de los granulocitos; idioptica o secundaria a infecciones (tuberculosis, sida), radiaciones y sustancias toxicas; suele acarrear infecciones con fiebre. Pancitopenia agranulocitosis acompaada por anemia y trombopenia, tpica de las a.aplsicas. Neutropenia disminucin de neutrfilos por causa de agranulocitosis, a.aplsicas/pancitopenia (falla la produccin en MO), a.megaloblstica y algunas infecciones intracelular (fiebre tifoidea, brucelosis, hepatitis vrica, etc.). Neutrofilia aumento de neutrfilos (>70%) en los casos: infecciones bacterianas(sepsis), terapias (corticoides o litio), fisiolgicamente => ejercicio fsico intenso y ansiedad. Eosinopenia disminucin de eosinfilo por causas: la mayora de infecciones (en fase de lucha), tratamiento (corticoides, adrenalina). Eosinofilia aumento de eosinfilos en circunstancias: infecciones agudas (escarlatina, sarampin) y crnicas (meningitis tuberculosa, lepra), infestaciones parasitarias (helmintos), alergias, situacin fisiolgica (menstruacin, embarazo, ejercicio intenso y corto). Basopenia disminucin de basfilos en casos: infecciones; Basofilia aumento de basfilos en circunstancias: infecciones vricas, asma. Monocitopenia disminucin de monocitos en casos: leucemia de clulas peludas (tricoleucemia), tratamiento con esteroides (corticoides). Monocitosis aumento de monocitos causados por: infecciones agudas (fase de recuperacin de muchas infecciones) infestaciones parasitarias. Linfopenia disminucin de linfocitos en casos: inmunodeficiencia congnitas o adquiridas => sida, tratamiento inmunosupresores antes de los transplantes, linfomas; Linfocitosis aumento de linfocitos causados por: infecciones vricas (paperas, varicela, sarampin, rubola, hepatitis), fisiolgica en nios de 0-5 aos, LLA/LLC. Plasmocitosis aparicin de clulas plasmticas en la sangre perifrica (no tienen que estar - son linfocitos B activado/clula efectora que se diferencia por el color de citoplasma); se produce en condiciones: infecciones (rubola, mononucleosis infecciosa), plasmocitoma(leucemia de clulas plasmticas). Alteraciones de la forma del ncleo: Linfocitos con ncleo hendido o mellado tpico de linfomas linfoctico en fase leucmica y LLC. Leucocitos con ncleo cerebriforme linfocitos Th morfolgicamente modificados /clulas Lutzner en sndrome de Sezary-fase leucmica de una micosis fungoide (linfoma de clulas T con erupcin pruriginosa crnica). Anomala de Pelger-Huet anomala hereditaria; se encuentran muchos neutrfilos en cayado o, predominantemente con 2 lbulos y cromatina densa (hiposegmentado); Neutrfilos hper segmentados neutrfilos grandes con ncleos hpersegmentados; en las anemias megaloblstica; Alteraciones de la forma del citoplasma:
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Clulas peludas linfocitos con proyecciones citoplasmticas y aspecto de pelos; tpicas de la leucemia de clulas peludas o tricoleucemia y leucemia linfoctica. Linfocitos hiperbasofilos incremento de la basofilia en su citoplasma; son linfocitos activados / inmunoblastos en las infecciones vricas. Neutrfilos con granulaciones toxica aumento del tamao y intensidad en la coloracin de los grnulos de neutrfilos + otros granulocitos; se produce en las infecciones bacterianas. Blastos con bastones de Auer - los bastones de Auer son agrupaciones de grnulos 1os anormales que adoptan forma de aguja, rojo violceo; en el citoplasma de los blastos LMA Clulas LE leucocitos que contienen un ncleo fagocitado con morfolgicas anormal (esta hialinizado); caractersticas del lupus eritematoso diseminado;

PATOLOGA LEUCOCITARIA I
Leucemias conjunto de neoplasias malignas que consisten en la proliferacin excesiva (leucocitosis) de clulas sanguneas inmaduras en la sangre perifrica de algn tipo de leucocito; el termino inventado por Virchow; algunos trastornos estn limitados a la medula sea (leucosis); causas desconocidas, pero hay factores genticos y ambientales; Las enfermedades preleucemicas : anemias sideroacresticas adquiridas, anemias aplasicas, anemias megaloblasticas refractarias al tratamiento, hemoglobinuria peroxistica nocturna y policitemia vera. Factores genticos : mayor incidencia con alteraciones cromosomitas, afectaciones ente gemelos univitelinos y ausencia de leucemia linftica crnica entre los japoneses; Los genes en el desarrollo de los tumores malignos: -los oncogenes -los genes tumor supresores o antioncogenes -los genes de supervivencia (inhiben la apoptosis) Factores ambientales : pueden ser fsicos, qumicos o vricos; fsicos exposicin a radiaciones ionizantes (explosiones nucleares); qumicos exposicin a productos cancerigenos (benceno); vricos la asociacin entre el virus linfotropico de clulas T humanas (HTLV-I) y algunas leucemias de linfocitos T; virus de Epstein-Barr relacionado con el linfoma de Burkitt; Patgenia: en leucemias, la expansin clonal maligna se origina en una sola clula hematopoytica precursora en la MO que da lugar a una progenie de clulas anormales con alteraciones cromosomitas; presentan un grado variable de inmadurez e indiferenciacion, crecimiento autnomo y perdida de sus funciones pasan a la sangre perifrica, se acumulan y permanecen mas tiempo de lo normal invaden rganos como hgado, bazo, ganglios linfticos, riones, testculos y meninges, se dividen y posteriormente retornar al torrente sanguneo. Manifestaciones clnicas: aumento de la celularidad en la MO produce dolor seo (ocupan el espacio medular y produce supresin de hematopoyesis normal que origina anemia, trombocitopenia, descenso de granulocitos normales); trombocitopenia produce
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hemorragias y granulocitopenia provoca eclosin de infecciones y fiebre; infiltracin de rganos manifiesta hepatomegalia, esplenomegalia y adenopatas; infiltracin de la meninges origina hipertensin intracraneal; el tratamiento produce un aumento de la destruccin celular que ocasiona hiperuricemia que puede producir clculos renales de acido rico; Tratamiento: radioterapia, quimioterapia (frmacos antineoplsicos), transplante de medula sea, medidas paliativas. Clasificacin leucemias: agudas (proliferan clulas muy inmaduras e indiferenciadas) y crnicas (proliferan clulas bastante maduras y diferenciadas); mieloide y linfoides. Las subclases depende de los criterios: morfolgicos, histoqumicos, inmunolgicos, genticos. Leucemias mieloide aguda / LMA mas frecuente en el adulto; hiato leucmico (presencia en la sangre perifrica de numerosos blastos leucmicos coexistiendo con escasos granulocitos maduros y ausencia de clulas intermedias = parada en la diferenciacin en etapa muy temprana); pueden contener bastones de Auer; suele cursar con anemia y trombocitopenia graves; puede originar esplenomegalia y linfadenopata; pronostico sombro (con tratamiento se obtienen remisiones y la curacin del 10-30% de los pacientes afectados). Los blastos de la LMA segn los criterios morfolgicos: M1 M7. Leucemia linfoide aguda / LLA frecuente en la infancia; se produce hiato leucmico; cursa con anemia y trombocitopenia graves, origina esplenomegalia y linfadenopata; afecta a las meninges; pronostico malo (con el tratamiento actual, se obtienen remisiones y la curacin en mas de 50% de los casos). Los blastos de la LLA segn las caractersticas morfolgicas: L1 L3. Leucemia mieloide crnica / LMC frecuente en el adulto joven; una gran leucocitosis con desviacin a la izquierda, basofilia, eosinofilia y anemia leve; Los hallazgos hematolgicos en la LMC dependen de la fase evolutiva (fase temprana, fase crnica, fase acelerada, fase final /crisis blastica); anomalas cromosomitas (presencia del cromosoma Filadelfia (Ph); cursa con esplenomegalia; pronostico malo (tratamiento paliativo con citostaticos busulfa e interfern o curativo = transplante de medula sea; suelen conducir a la muerte. Leucemia linfoide crnica / LLC frecuente en personas de edad avanzada; permanecer mucho tiempo asintomtico; leucocitosis muy intensa de linfocitos pequeos parcialmente hendido y frgiles dan lugar a las sombras nucleares de Gumprecht en las extensiones; presencia de clulas blastoides (parainmunoblastos), cursa con anemia leve, trombopenia, esplenomegalia, linfadenopata y hipogammaglobulinemia; pronostico bueno (el tratamiento corticoides prednisona asociados a citostaticos clorambucil); un tipo especial de LLC es leucemia de clulas peludas / tricoleucemia que se suele complicar con vasculitis, pronostico variable, se trata con esplenectomia e interfern. Mononucleosis Infecciosa / MNI originada por el virus de Epstein-Barr /EBV o VEB (es linfotropo, pertenece al grupo de los herpes) y tambin una infeccin por citomegalovirus (CMV); dos picos de incidencia (nios en guarderas y adolescentes); es poco contagiosa, alcanza la faringe (epitelio farngeo) a travs de la saliva clulas epiteliales (componente C3d del complemento) ganglios linfticos (infecta linfocitos B y destruirlos/infeccin ltica o incorporarse a su genoma/infeccin latente) divisin linfocitos B, transformarse Inmunoblastos B clulas

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plasmticas inmunoglobulinas activacin de linfocitos T linfocitos T CD8+ frenar el virus. Manifestaciones clnicas incubacin 4-8 semanas posteriormente prdromos con estado gripal: fiebre alta, faringitis con petequias, puntiformes en el paladar, adenopatas crvicooccipitales dolorosas, esplenomegalia, hepatomegalia; asociacin clara entre EBV y linfoma de Burkitt africano. Datos de laboratorio linfocitosis absoluta y relativa con 20% linfocitos atpicos (linfocitos T activados): tamao y afinidades tintoriales variables, ncleo oval, arrionado, lobulado, excntrico y con nucleolos, citoplasma contiene vacuolas con aspecto monocitoide; 2 tipos de anticuerpos: Ac heterofilos (IgM) en las 2 primeras semanas de la enfermedad + Ac especficos IgM anti VCA (viral capside antigen); despus 3 semanas y 3 meses aparecen IgG anti EBNA (Ebstein-Barr Nuclear Antigen); posteriormente aparecen IgG anti VCA y permanecen durante toda la vida del paciente. Pronostico enfermedad autolimitada, pero si se complica con rotura esplnica (requiere la extirpacin quirrgica del bazo) o pericarditis, puede conducir a la muerte. Tratamiento reposo y antitrmico (paracetamol), en casos complicados se administra corticoide o aciclovir. Linfomas neoplasias malignas que afectan al tejido linforreticular: enfermedad de Hodgkin y linfomas no Hodgkinianos (LNH). Enfermedad de Hodkin linfoma mas frecuente con etiologa desconocida; cuadro clnico: perdida de peso, prurito, sudoracin nocturna, Fiebre de Pel-Ebstein (alternando durante varios das o semanas temperatura corporal alta y otros es normal o baja); linfadenopata indoloras localizacin cervical y posteriormente supraclaviculares, los axilares, los mediastinitos e inguinales y por ultimo en zonas no accesibles; desencadenamiento de dolor por las bebidas alcohlicas; existe 4 subgrupos de enfermedad de Hodgkin segn la imagen histolgica (clasificacin de Rye) y 4 estadios segn su grado de extensin (estadio de Ann Arbor); clula caracterstica de Sternberg-Reed que se encuentra en los ganglios linfticos: seudpodos gruesos, gran tamao dimetro 25-50 u, ncleo grande y polilobulado, membrana nuclear irregular y espesa, cromatina nuclear reticulada con varios nucleolos, citoplasma abundante, carente de grnulos con vacuolas; cursa con anemia, leucocitosis y linfopenia; VSG (velocidad de sedimentacin globular) elevada; defectos en la inmunidad con frecuente infecciones; 70% de pacientes se curan con tratamiento de radioterapia combinada o no con citostaticos. Linfomas no Hodgkinianos (LNH) etiologa desconocida, pero clara asociacin con virus: Epstein-Barr (linfoma de Burkitt africano), HTLV-I (linfoma de clulas T de adulto), infeccin VIH; 90% son de tipo celular B con anomalas cromosomitas; cuadros clnico: puede producir sndromes compresivos (sndrome de la vena cava superior), pueden localizarse fuera de los ganglios linfticos (en MO o en el intestino); se clasifican en 4 estadios segn el grado de extensin; se caracterizas por destruccin de la estructura normal de los ganglios linfticos con invasin de su capsula y de la grasa adyacente por clulas neoplsicas (centroblastos, centrocitos o inmunoblastos y linfocitos hendidos en sangre perifrica); VSG elevada con hipogammaglobulinemia; menos de 30% se curan, radioterapia solo efectiva en el estadio I y el resto se basa en citostaticos; La micosis fungoide es un linfoma de clulas T que afecta la piel con fase leucmica (sndrome de Sezary).
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Neoplasias Malignas (discrasias) de Clulas Plasmticas conjunto de enfermedades de proliferacin excesiva de una familia o clon de clulas plasmticas, hper produccin anmala de una Ig o fraccin de una Ig que electroforeticamente a travs de protenas sericas, es homognea (Ig monoclonal/ uniformidad); la clase de Ig o del tipo de cadena hiperproducida en el suero (paraproteinemia) se aclara mediante inmuno electroforesis; hper produccin monoclonal de una Ig causa el descenso en la fabricacin del resto y mayor propensin al desarrollo de infecciones; se distinguen en 3 clases: mieloma mltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y la enfermedad de las cadenas pesadas; suelen aparecer en ancianos. Mieloma mltiple es un tumor de clulas plasmticas ubicado principalmente en la MO, se puede infiltrar a los rganos internos; hper produccin monoclonal de Ig completa (IgG, IgA o IgD) o/y de una cadena ligera aislada (kappa o lambda), se conoce como protena de Bence-Jones; Plasmocitoma: si las clulas plasmticas anormales constituyen una masa tumoral solitaria; sntoma clnico mas comn: dolor seo (osteoporosis difusa y lesiones osteoliticas) en la pelvis, vrtebras, costillas, huesos del crneo; las radiografas muestran lesiones lticas en sacabocados; hipercalcemia (> calcio serico); hiperproteine mia + viscosidad sangunea; crioglobulina (precipitacin a baja temperatura y sensibilidad especial al fro/ sndrome de Raynaud); aglutinacin de los hemates (lesiones en forma de salchichas en venas retinianas); proteinuria de Bence-Jones de cadenas ligeras de Ig atrofia de las clulas del epitelio tubular fibrosis intersticial insuficiencia renal; deposito de material amiloideo en los nervios; en la sangre perifrica: anemia moderada, hemates en pilas de monedas (seudoaglutinacion) y aumento VSG; en la MO: proliferacin de clulas plasmticas anmalas en nidos, ncleo inmaduro y nucleolos evidentes; tratamiento de corticoides (prednisona) y citostaticos alquilantes (ciclofosfamida), no se cura. Macroglobulinemia de Waldenstrom es un tumor de clulas linfoplasmocitoides asociada a linfadenopata y hepato-esplenomegalia con hper produccin monoclonal de IgM; intensa hiperviscosidad sangunea; precipitacin a baja temperatura o ataca IgG autloga (factor reumatoide) o ataca eritrocitos con el fro (crioaglutinina); en la sangre perifrica: anemia moderada, hemates en pilas de monedas, aumento VSG; en la MO: abundante los mastocitos histicos basfilos; pronostico benigno, tratamiento: reducir la viscosidad sangunea mediante plasmaferesis y citostaticos alquilantes.

HEMOSTASIA
FISIOLOGA PLAQUETARIA Trombopoyesis (estimulada por factor CSF-M) - el proceso total 4-5 das: Celula Madre Pluripotente =j> CFU-LM => CFU-S => BFU-EM CFU-MEG megacarioblasto (1a celula de morfologia reconocible; contorno desflecado y suelen tener plaquetas adheridas a su superficie diametro 25-40 micras; nucleo grande-ovalado-unico o 2-4 nucleos; cromatina laxa-homogenea con varios nucleolos que no suelen verse; citoplasma muy basofilo con granulos y seudopodos); se madura mediante divisiones mitoticas del nucleo/endomitosis/celulas poliploides gigantes/multilobulado, incremento del volumen y de la basofilia del citoplasma y aparicin de granulos, tubulos y microfilalmentos promegacariocito o megacariocito semimaduro o megacariocito basofilo (diametro 30-50 micras; nucleo gigante y multilobulado, cromatina densa sin nucleolos visibles; citoplasma basofilo, aspecto desflecado con plaquetas adheridas a su superficie megacariocito maduro o megacariocito acidofilo (forma redondeada,
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diametro 80-100 micras, nucleo multilobulado, algunos son pequeos/microcariocitos, cromatina densa, citoplasma abundante de color grisaceo repleto de granulos azurofilos; a veces se observan emperipolesis y membranas de demarcasion) =>metamegacariocitos (con la presencia de trombocitos en su interior apreciado) explosin citoplasmtica (los nucleos son fagocitados por SRE un megacariocito da lugar a miles de plaquetas o trombocitos: fragmentos del citoplasma de los megacariocitos; formacin plaquetas es activada por trombopoyetina, sintetizada por el rin y interleuquina e (IL3); factor inhibidor sintetizadas por las propias plaquetas y hormonas (estrgenos y corticosteroides).

Morfologas forma variable, tamao 1-4 u de dimetro, carecen de ncleo, citoplasma se tie de color rosa y contiene pequeos grnulos prpura en la rea central (granulmera o crommera) o perifrica (hialmera); citoplasma con tentculos (seudpodos); se adhieren (conglomerados plaquetarios) en el extremo final de las extensiones sanguneas.

Estructura interna: 1-Zona perifrica o pared celular capa exterior o glucocaliz (la estructura con la que se adhieren las plaquetas; gran avidez por proteinas externas/ interviene en la recepcion de estimulos => activacion); membrana celular, trilaminar: mantiene integridad celular (se encuentran: trombostenina de superficie, acido araquidnico y factor 3 plaquetario/f3p o tromboplastina plaquetaria); rea submembranosa: finos filamentos; participa en formacion y estabilizacion de tentaculos (mantener la forma);
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2-sol-gel o hialoplasma (zona periferica del citoplasma); con microscopio electronico se observan en su interior 2 elementos fibrosos: haz marginal de microtbulos (un anillo de microtubulos por debajo de la pared celular/ citoesqueleto de las plaquetas); microfilamentos (ubicados paralelamente a microtubulos; formados por protenas contrctiles: actina, miosina, actomiosina o trombostenina, troponina y tropomiosina; intervienen en cambios de forma y secrecion de sustancias ); 3-Zona de organelas mitocondrias (deposito de ATP y de calcio); lisosomas (contienen enzimas hidroliticas que intervienen en la lisis celular); grnulos densos (son escasos y tienen una funcion secretora); grnulos especficos (sintetizados por aparato de Golgi, son los mas numerosos, engloban protenas especificas : factor de von Willebran, f4p, betatromboglobulina, factor de crecimiento y protenas no especificas : fibronectina,fibringeno) se vacan al exterior cuando se activan; masas de glucgeno (acumulo de esta); 4-Sistemas membranosos aparato de Golgi; sistema tubular denso; sistema canalicular abierto;

Cintica plaquetaria 2/3 partes de la masa plaquetaria circulan por la sangre y la 1/3 restante se deposita en el bazo con intercambio libre y bidireccional entre ellos; valor normal en la sangre 150.000 y 400.000; la vida media 8 12 das; destruidas en el hgado, bazo y sistema mononuclear fagoctico SMF o SRE; Funciones de las plaquetas hemostasia primaria mediante formacin del trombo blanco plaquetario (3 fases: adhesin plaquetaria con la pared del vaso daado, activacin de los trombocitos y interaccion/agregacin plaquetaria) y produccin de algunos factores de la coagulacion. 1-Adhesin de las plaquetas (1-2 segundos) tras la lesiones, se adhieren las plaquetas a los componentes internos de la pared vascular; al colgeno rpida y irreversible, no precisa la presencia de proteina plasmatica/factor; a las microfibrillas y membrana basal requiere calcio y factor de von Willebrand; el contacto entre trombocitos y la pared del vaso liberacin de adenosindifosfato (ADP) y desencadena su activacin; 2-Activacin de los trombocitos al activarse cambios morfolgicos (metamorfosis viscosa): transformacin de forma y aumento de seudpodos; alteraciones de la membrana: aumentan la tendencia de las plaquetas a pegarse entre si; se estimula el
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sistema enzimtica de sntesis de los trombocitos; desgranulacion: contraccion de microtubulos, acumulo de sus granulos en el centro liberacin a travs del canalicular abierto de sus contenidos. 3-Agregacin de las plaquetas la activacin la unin de las plaquetas entre si (trombo blanco: inestable y reversible, se descompone si cesa el estimulo; puede ser irreversible y estable mediante la accion trombostenina plaquetaria;

Almacenamiento de produccin de factores sustancias que intervienen en la coagulacin del plasma sanguneo (factores plaquetarios de la coagulacin): -factor 1 plaquetario f1p: factor plasmtico V que se encuentra en las plaquetas -factor 2 plaquetario f2p -factor 3 plaquetario f3p: la activacin de va intrnseca de coagulacin junto a tromboplastina plaquetaria (factor III) activacin de protrombina trombina -factor 4 plaquetario f4p -fibringeno o factor plasmtico I de la coagulacin (se encuentra en el plasma y pequea parte en grnulos alfa de las plaquetas y su superficie) -factor de von Willebrand: protena plasmtica (en parte se encuentra en grnulos alfa), contribuye a la adhesin y mantener niveles plasmticos del factor VIII-C de la coagulacin; factor VIII tiene 3 fracciones: 1.f.plaquetaria (f-vW) 2.f.coagulante (VIII-C) 3.f.antigenico pero sin efecto anticoagulante; -factor plasmtico V (FV): de sntesis heptica, 25% almacenado en los grnulos (f1p). -factor plasmtico XIII (F XIII): se encuentra 30-50% en las plaquetas -trombostenina: protena contrctil que interviene en la retraccin de los agregados plaquetarios y del coagulo de fibrina. ndices plaquetarios: 1-plaquetocrito PTC o PCT: relacin entre el volumen ocupado por trombocitos y el ocupado por la sangre total en porcentaje; valor normal = 0,12 0,36% 2-volumen plaquetario medio VPM o MPV: valor medio del volumen de las plaquetas; valor normal = 7,2 11,1 fl (femtolitros) 3-anchura de la distribucin plaquetaria PDW o ndice de distribucin de las plaquetas IDP: Valor normal = 25 65%; indica el grado de variabilidad existente entre los volmenes de los trombocitos; Prctica XXXIV (recuente de plaquetas en frotis sanguneos)
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Fundamento - determinacin del numero de trombocitos presentes en 1 mm3 que ademas, permite el estudio de morfologa de los trombocitos. Material - para hacer frotis Reactivo - tincin panptico rpido Muestra - frotis/ extensin de la sangre problema Tcnica - observar frotis con objetivo de inmersin del microscopio, contar el numero de plaquetas presentes en 4-5 campos microscpicos; al mismo tiempo, contar los hemates hasta llegar a 1000; Comprueba el recuento con regla de 3: RBC (coulter) => Plq (coulter); RBC (frotis) => Plq (frotis); la proporcin tiene que ser la misma o con un error de +/- 50.000 plaquetas. Interpretacin clnica - cuando el numero de plaquetas por mm3 de sangre es < a 150.000 => trombocitopenia o trombopenia o plaquetopenia; y cuando es > a 400.000 => trombocitosis (puede causar trombosis/embolia y necesitara tratamiento con heparina o dicumarino para mantener el fluidez); la clnica solo empieza si la cifra esta entre 50.000 80.000. Prctica XXXV (recuento de plaquetas con hemocitmetro) Fundamento - para el recuento de plaquetas en cmara, se diluye la sangre problema en un liquido apropiado y posteriormente, se deposita en la cmara de recuento, donde se cuentan las clulas presentes en algunos de los cuadrados de uno de los hemates. Material - cmara de Neubauer mejorado, tubo de ensayo, pipeta automtica, cubreobjetos, microscopio, placa Petri y papel de filtro. Reactivos - agua destilada; preparado de reactivo en tubo (normalmente estn compuestos por oxalato amoniaco + azida sdica 0,2% que se utiliza como conservante) Muestra - sangre venosa recogida en un tubo con EDTA Tcnica - al tubo reactivo (comercial) de 2 ml se aade 10 lambdas de sangre (1:200) o 20 lambdas de sangre (1:100); colocar la cmara de recuento cargada en el interior de una cmara hmeda para evitar que se seque la dilucin en la cmara (placa Petri + un papel de filtro embebido en agua); dejar reposar 15 minutos (asegurar la sedimentacin completa de todas las plaquetas); enfocar el cuadrado grande en el medio con el objetivo de 40x (se visualizan mejor con el condensador ligeramente bajo); contar la totalidad de los 5 cuadrados medianos; Comprueba el resultado del recuento con el resultado de coulter (+/50.000 margen de error) Lectura - los trombocitos se observan como corpsculos redondeados u ovalados, de tamao muy pequeo y muy refringentes; para calcular el numero de plaquetas por mm3 de sangre: Plaquetas x 5 (total 25 cuadrados medianos) x Correccin de Volumen (10) x Correccin de Dilucin (100 o 200)

ALTERACIONES DE LAS PLAQUETAS

Alteraciones morfolgicas: 1-megatrombocitosis plaquetas gigantes en la sangre perifrica mas del 3%; indica la presencia de plaquetas inmaduras; se encuentra en: ausencia de bazo, prpura trombocitopenica idioptica, sndromes mieloproliferativos, sndrome de Bernard Soulier, enfermedad de May-Hegglin y sndrome de Chediak-Higashi. 2-microtrombocitosis plaquetas pequeas en la sangre perifrica (trombocitos viejos); 3-Anisocitosis trombocitaria distintos tamaos de plaquetas en la sangre perifrica; frecuente e in-especfica; 4-Hipogranulacin trombocitaria - se observa citoplasma grisceo y pobre en grnulos.

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Artefactos plaquetarios: 1-superposicin deposito de una plaqueta sobre un eritrocito (se aprecia un halo alrededor de ella; 2-agregacin formacin de acmulos de plaquetas ; se debe a ala presencia de aglutininas contra ellas (aglutininas dependientes del EDTA); se observa en los bordes de las extensiones sanguneas; para diferenciar de una plaquetopenia, se realiza la prueba de triple extraccin: dividir la sangre problema en 3 alcuotas y anticoagular la primera con EDTA, la segunda con citrato y la tercera con heparina; 3-satelitismo adhesin de plaquetas a los neutrfilos; causas desconocidas Alteraciones del nmero: 1-trombocitopenia, trombopenia o plaquetopenia disminucin de la concentracin de las plaquetas por de bajo de 150.000 /mm3 por causas: a.disminucin de la trombopoyesis (pancitopenia, anemia mielotisica) b.trombopoyesis ineficaz (trombopenias hereditarias / enfermedad de May-Hegglin, hemoglobinuria paroxstica nocturna, dficit de acido flico o de vitamina B12) c.aumento de la destruccin de las plaquetas (prpura trombocitopenica idioptica, prpura trombotica trombocitopenica, secuestro esplnico / hiperesplenismo, infecciones sepsis, coagulacin intravascular diseminada). 2-trombocitosis aumento de la concentracin de las plaquetas por encima de 400.000 /mm3 (400mil - 1 milln/mm3) por causas: a.primarios/causas desconocidas (trombocitemia esencial, otros sndromes mieloproliferativos: LMC, policitemia vera) b.secundarios de enfermedades (esplenectomia, infecciones con formacin de depsito purulentos en empiema pleural, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, neoplasias malignas) Alteraciones de la funcin (trombopatias): 1-hereditarias 2-adquiridas

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PATOLOGIA TROMBOCITARIA Trombopatias congenitas: 1-sndrome de Bernard-Soulier trastorno gentico muy infrecuente de un defecto de la adhesin de los trombocitos al subendotelio vascular; ausencia del factor de von Willebrand; alteracin en la glucoproteina I que contiene acido sialico; cursa con hemorragias graves debido el tiempo de sangra alargado; 2-trombastenia de Glanzmann enfermedad congnita de un defecto bioqumica de las plaquetas que da lugar a dificultad en la agregacin de las plaquetas; a los enfermos no se produce la retraccin del coagulo, la agregacin esta disminuida y origina mltiples hemorragias; causas: a.anomalia de las protenas presentes en la membrana de los trombocitos (dficit de glucoproteina II, disminucin en el fibringeno plaquetario o defecto en su capacidad funcional); b.trastorno enzimtica (disminucin de la fosfogliceraldehido deshidrogenasa o de la piruvatocinasa); Trombopenias: 1-prpura trombocitopenica idioptica (PTI) inmunotrombopenia (de la infancia o de la edad adulta) o enfermedad de Werlhof; PTI de la infancia aparece tras infeccin vrica, de una forma aguda y autolimitada (no requiere tratamiento); PTI del adulto causado por la accin de autoanticuerpos contra los trombocitos de forma crnica; manifestaciones clnicas: ditesis hemorrgica (<20.000), esplenomegalia, prpura y petequias; los trombocitos no tienden a agruparse, son gigantes, citoplasma basfilo y pocos grnulos (inmaduros /la salida prematura de la medula sea); en la MO los megacariocitos maduran con dificultad debido al ataque de los autoanticuerpos, con ncleo poco lobulado, citoplasma basfilo, poco granuloso y vacuolado (trombopoyesis ineficaz); tiempos de sangra y de retraccin del coagulo alargados y la fragilidad capilar aumentada mediante la prueba de Rumple-Leede; se trata con: corticoides (prednisona), inmunosupresores, andrgenos sintticos (danazol) y esplenectomia (para evitar el secuestro de las plaquetas sensibilizadas por los autoanticuerpos). 2-prpura trombotica trombocitopenica PTT o sndrome hemoltico urmico formacin de trombos blandos de plaquetas-fibrina que obstruyen la luz de los vasos pequeos, da lugar a lesiones isqumicas que afecta los riones y al sistema nervioso central; deposito endotelial trombohialino produce destruccin de glbulos rojos, da lugar a anemia hemoltica microangiopata; manifestaciones clnicas: fiebre, anemia, ictericia, hemorragias, uremia y signos neurolgicos; trombocitopenia y datos de hemlisis (esquistocitosis, reticulocitosis etc.); en la MO proliferacin reactiva de megacariocitos,
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hiperplasia eritroide; es mortal si no se trata con corticoides, antiagregantes plaquetarios (aspirina) y recambios plasmticos. Trombocitemia primaria o esencial (TE) dentro de los sndromes mieloproliferativos, se de be a la expansin clonal de clula hematopoytica pluripotencial que afecta fundamentalmente a trombocitaria; estimulo idioptico de la trombopoyesis hper produccin de plaquetas anormales grado variable de disfuncin destruidas por el bazo; manifestaciones clnicas: propensin a las hemorragias, trombosis, esplenomegalia, hepatomegalia; recuento de plaquetas 750.000 1.000.000 /mm3 y mayor; agregados de plaquetas, trombocitos gigantes y plaquetas hipogranulosas en las extensiones ; en la MO se observa hiperplasia megacariocitica y gran liberacin de plaquetas; se trata con frmacos mielosupresores (hidroxiurea 32P) y plaquetoferesis.

GENERALIDADES SOBRE LA HEMOSTASIA

Hemostasia: hemo = sangre y stasis = parada (conjunto de mecanismo que el organismo pone en marcha para cohibir las hemorragias); es una reaccin en cadena/cascada de coagulacin (un factor activa al otro); 3 componentes: tisulares (vasos sanguneos y factores tisulares de la coagulacin/tromboplastina tisular), plaquetarios (trombocitos y factores plaquetarios), plasmticos (factores que activan o inhiben la coagulacin y fibrinolisis).

Fases:1-hemostasia primaria (dura 3-5 minutos): lesin vascular vasoconstriccin refleja (enlentecimiento de la circulacin de la sangre) las plaquetas se trasladan desde el centro hacia la periferia del vaso y reactivan sustancias serotonina / 5-hidroxitriptamina (vasoconstrictoras) los trombocitos se adhieren al subendotelio vascular + agregarse entre si trombo blanco plaquetario (hemostasia provisional para una ruptura pequea); si la lesin es mayor: el trombo blanco + red de fibrina se consolida y es capaz de parar la hemorragia definitivamente;

2-coagulacin (dura 5-10 minutos desde el momento de la lesin) es el proceso que conduce a un cambio en el estado fsico del plasma ( gelificacion): transformacin de fibringeno (protena soluble) fibrina (insoluble, en forma de red que consolida el agregado plaquetario) coagulo (el punto final de una reaccin en
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cadena/ activacin sucesivas de un factor a otro mediante un proceso de retroalimentacion; interrelacion entre vias intrinseca y extrnseca de coagulacion que se puede ser activada o inhibida a distintos niveles por el organismo trombo sanguneo: un coagulo de sangre adherido a la pared de un vaso; embolo sanguneo: un trombo desprendido de la pared vascular y arrastrado por la corriente sangunea; las sustancias intervenidos en esta fase factores de la coagulacin; 3-fibrinolisis (dura 2-3 das) el proceso de la disolucin del coagulo de fibrina, despus de que este ha cumplido su funcin hemosttica => destruccin de la fibrina (degradacin enzimtica mediante plasmina); finalidad: permite un libre transito de la sangre; durante el tiempo que transcurre, se produce una reparacin de la integridad vascular/ angiognesis => la rotura/lesin estimulo angiogenico migracin y proliferacin de las clulas endotelias, mitosis (neovascularizacion): produccin de proteasas y movimientos quimiotcticos; Queloides : factor gentico de mal curacin de la cicatriz se forma un bulto.

FACTORES DE LA COAGULACIN
F. Activadores de la Coagulacin estimulan el proceso de la coagulacin o constituyen el soporte estructural de esta; se nombran con nmeros romanos o con su nombre propio o de la persona que lo descubri y letra "a" minscula cuando esta activado clasificacin: 1-segn su naturaleza qumica: proteicos (glucoproteina, la mayora), lipdicos (tromboplastina tisular, f3p) y metlicos (el ion calcio o Ca++). 2-segn su procedencia donde son sintetizados: a-tisulares (tromboplastina tisular, colgeno y parte de factor VIII); b-plaquetarios (un grupo menor: f3p); c-plasmticos (la mayor parte: el factor VII, el IX, el X, el XI, el XII, el XIII, la precalicreina y el quininogeno de alto peso molecular); d-hepticos (muchos de los factores plasmticos se sintetizan en el hgado: el factor I, el II, el V el VII, el VIII-C, el IX, el X, el XI, el LXIII, la PK y HMWK). algunos son producidos en 2 lugares (f-VIII) o no se conoce con total seguridad el lugar de su sntesis (f-XII) 3-segn las influencias a las que son sensibles: a-los factores vitamina K dependientes : el factor II, el VII, el IX y el X (aminocido) sirve para fijar el Ca++ durante el proceso del coagulo; estos factores pierden su actividad en el dficit de vitamina K o hay accin antagonista de los anticoagulantes orales; vitamina K obtenida de los vegetales y de las bacterias intestinales; b-los factores sensibles a la trombina: el factor I, el II, el V, el VII, el VIII y el XIII) activados directamente por la trombina; 4-segn su funcin: a-los factores desencadenantes (tromboplastina tisular y f3p) ponen en marcha a alguna de las vas de la coagulacin fijando sobre su superficie a otros factores activadores para que no se diseminen y alcancen la lesin vascular en una concentracin que sobrepase la accin de los factores inhibidores; b-los factores de contacto (el factor XI, el XII, la precalicreina y el quininogeno de alto peso molecular) solo actan en el inicio de la va intrnseca y en el proceso de la fibrinolisis; necesitan Ca++ para ejercer su accin; c-los factores enzimticos (muchos son serinproteasas) necesitan un cofactor metlico (Ca++) u orgnico (factor V, VIII y quininogeno de alto peso molecular) para desarrollar su accin; d-el nico factor estructural es el fibringeno capaz de al fraccionarse, dar lugar al coagula de fibrina.
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Fac 1 Nat Pr R.I No

2 Pr No No

3 L No No Pq Te No D No No

4 Mt No Si A No Cf No No

5 Pr Si No H No Cf No Si

7 Pr No Si H CR Si S No Si

8 Pr Si No

9 Pr No Si

10 Pr No Si H Si S No No

11 Pr No Si H No S Si No

12 Pr No Si H? No S Si No

13 Pr No Si

PK Pr No Si

H Pr No Si H No Cf Si No

Sue No

Pro H H Mg VK No Fu E Si S No Si

H H Mg No Df F No Si Si S No No

H H Mg No Tr No No No S Si No

F.C No STr Si

Factor I o Fibringeno glucoproteina (3-5% de hidratos de carbono y 3 pares cadenas polipeptdicas: A alfa, B beta y gamma A alfa y B beta son atacadas por trombina y gamma - resistentes); se encuentra la mayor parte en el plasma Fpm (el suero carece de fibringeno), es de sntesis heptica ; la minora en la superficie y intraplaquetario (FIPq) formados por los megacariocitos; su vida media es de 4-6 das; mecanismo: trombina + cadenas A alfa y B beta del fibringeno se desprende fibrinopeptido A + fibrinopeptido B fibringeno de cadenas peptidicas alfa, beta y gamma monmeros de fibrina se polimeriza forman la estructura del coagulo; reptilasa (venenos de serpientes) tambin hidrolizar el fibringeno inducir la coagulacin; la concentracin de fibringeno en el plasma 150-450 mg/dl, disminuye en: hepatopatias graves, coagulacin intravascular diseminada; aumenta en: embarazo, enfermedades autoinmunes, inflamaciones (como reactante de fase aguda). Factor II o Protrombina/ PT glucoproteina (10% de hidratos de carbono y 1 cadena polipeptdica); se encuentra en el plasma y ausente en el suero, su vida media es 4-6 das; es de sntesis heptica y vitamina K dependiente; activada por protrombinasa (fXa, fVa + Ca++) trombina (T): serinproteasa que hidroliza la molcula de fibringeno, protrombina y activa los factores V, VII, VIII y XIII; ademas, facilita agregacin trombocitaria; la trombina es inhibida por el fibrinopeptido A, liberado en la hidrlisis del fibringeno y por las antitrombina; mal funcin de protrombina por dficit de vitamina K (mala absorcin o obstruccin biliar o terapia de antagonistas dicumarinos/sintron). Factor III o tromboplastina tisular o histica /TH y el f3p f3p es un fosfolpidos acido y TH es una lipoprotena (la porcin lipdica constituida por fosfolpidos); f3p ubicado en la membrana de las plaquetas, tromboplastina tisular se encuentra en el tejido: vascular, renal, heptico, pulmonar, cerebral, placentario; se libera al plasma cuando hay una rotura de los vasos; f3p interviene en la va intrnseca en activar factor IX (junto con el factor XIa y el Ca++) y en la activacin factor X (junto con el factor IXa, el VIIIa y el Ca++); TH interviene en la va extrnseca en activar factor X (junto con el factor VIIa y el Ca++) tambin puede intervenir en la activacin del factor IX; el factor III interviene junto con la protrombinasa en la activacin de la protrombina.
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Factor IV o calcio inico (Ca++) 50% de la cantidad del calcio presente en la sangre; los anticoagulantes realizan su funcin debido a su accin quelante del calcio (oxalato sdico, citrato sdico y EDTA); Factor IV interviene como cofactor en las etapas de la coagulacin; solo se necesita poca cantidad de Ca++ para la coagulacin (no causa hemorragias en hipocalcemia). Factor V o factor labil o proacelerina glucoproteina en el plasma y ausente en el suero (25% almacenado en los grnulos plaquetarios); es de sntesis heptica, activado por la trombina, su vida media es de 12-20 horas; es cofactor y forma parte de la protrombinasa en activar protrombina; el factor Va es inhibido por la protena C; disminuido en pacientes con hepatopatia grave. Factor VI es el factor V activado (no existe!!) Factor VII o factor estable o proconvertina glucoproteina de cadena nica, se encuentra en el plasma y suero, sintetizada por el hgado y clulas renales; su vida media es de 4-6 horas/tiempo de Quick; es vitamina K dependiente; activado por la trombina y por el factor Xa, IXa y XIIa; activada como serinproteasa e interviene en la va extrnseca activando el factor X junto con la tromboplastina tisular y el Ca++; ademas juntos pueden activar factor IX; el factor VIIa es inhibido por la AT III; su concentracin aumenta en las mujeres que toman anovulatorios de estrgenos y embarazadas. Factor VIII o antihemoflico A glucoproteina en el plasma (ausente en el suero);2 fracciones: F.VIII-vW (inductora de la adhesin de las plaquetas) o de von Willebrand, fabricada por las clulas endotelias de los vasos y por los megacariocitos y F-VIII-C, mas pequea (capacidad coagulante), sintetizado en el hgado; activado por la trombina, la fraccin VIII-C cofactor en la va intrnseca (la activacin del factor X por el factor IXa, el Ca++ y el f3p; la fraccin VIII-vW (4 funciones) 1).facilita la agregacin de los trombocitos, 2).contribuye a la adhesin de las plaquetas, 3).ayuda a mantener niveles plasmticos de la fraccin VIII-C, 4).protege la fraccin VIII-C que no sea inactivada por enzimas proteo lticas. El dficit de la fraccin VIII-C causa hemofilia A o clsica, y el dficit de VIII-vW, origina la enfermedad de von Willebrand; aumenta en las mujeres que toman anovulatorios (sufre trombosis) y las embarazadas. Factor IX o Christmas o antihemoflico B glucoproteina que se encuentra en el plasma y suero; es de sintetiza heptica y es vitamina K dependiente; activado por la va intrnseca por el factor XIa, Ca++ y f3p y por la va extrnseca por el factor X, VIIa, el Ca++ y la TH; activado como serinproteasa e interviene en la va intrnseca en la activacin del factor X junto con el factor VIII-Ca, el Ca++ y el f3p; el factor IXa es inhibido por la AT III; dficit del factor IX produce la hemofilia B o enfermedad de Christmas; la concentracin aumenta en las embarazadas. Factor X o de Stuart-Prower glucoproteina que se encuentra en plasma y suero; sintetizado por el hgado y es vitamina K dependiente; activado por la va intrnseca por los factores IXa, VIII-Ca, Ca++ y f3p o por la va extrnseca por los factores VIIa, Ca++ y TH; activado como serinproteasa y forma parte de la protrombinasa que activa la protrombina; el factor Xa es inhibido por la AT III y por la alfa2antiplasmina; aumentada en las mujeres que toman anovulatorios y las embarazadas.

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Factor XI o antecedente plasmtico de la tromboplastina glucoproteina, se encuentra en el plasma y suero; es de sntesis heptica y el factor de contacto; se activa por el factor XIIa junto con el quininogeno de alto peso molecular; activado como serinproteasa e interviene en la va intrnseca al activar el factor IX junto con Ca++ y f3p; el factor Xia es inhibido por la AT III, la alfa1-antitripsina y el C1 inhibidor; desciende durante el embarazo y origina enfermedad hemorrgica en su dficit. Factor XII o Hageman glucoproteina, se encuentra en el plasma y suero; es de sntesis desconocido y es factor de contacto; activado en 2 maneras: por el contacto con superficies de cargas elctricas negativas (cristal, colgeno y cidos grasos) y por la accin proteolitica de enzimas (tripsina, plasmina y calicreina); activada como serinproteasa y es capas de activar (junto con el quininogeno de alto peso molecular): al factor XI y a la precalicreina; XIIa es inhibido por la AT III y el C1 inhibidor. Factor XIII o estabilizante de la fibrina glucoproteina, se encuentra en el plasma y suero; es sintetizado por el hgado y los megacariocitos; 30-50% se ubica en las plaquetas; activado por la trombina en presencia de Ca++ acta sobre los polmeros de fibrina, estabilizando el coagulo de fibrina lo hace mas insoluble y resistente a la accin destructora de la plasmina. Precalicreina (PK) o factor Fletcher glucoproteina, se encuentra en el plasma y el suero; es de sntesis heptica y es un factor de contacto; activado por el factor XIIa, el quininogeno de alto peso molecular; activado como calicreina, es serinproteasa que activa factor XII y inhibida por la alfa2-macroglobulina, la alfa2-antiplasmina y el C1 inhibidor. Quininogeno de alto peso molecular (HMWK) o factor Fitzgerald glucoproteina, se encuentra en el plasma y suero; es de sntesis heptica y es un factor de contacto; como cofactor en la activacin del factor XI de la precalicreina Factores inhibidores de la coagulacin mantener el equilibrio de la coagulacin; el grado de extensin de la coagulacin es una confluencia entre los mecanismos de activacin y inhibicin que actan obre ella; la coagulacin se limita a la zona vascular lesionada como consecuencia de 2 mecanismos: 1).capacidad diluidora del flujo normal de sangre => conduce las formas activadas de los factores de la coagulacin circulen hasta el hgado para ser destruidas; 2).la presencia en el plasma de sustancias inhibidoras que neutralizan las formas activadas. Protena C protena plasmtica de sntesis heptica y es vitamina K dependiente; circulan como cimgeno/precursor inactivo que se activa por la trombina; Protena S protena plasmtica de sntesis heptica y vitamina K dependiente; puede que funcione como cofactor de la protena C. Antitrombina III (AT III) glucoproteica plasmtica; inactiva a la trombina y los factores VIIa, IXa, Xa, XIa y XIIa; antitrombina mas potente; la heparina acta como cofactor de la AT III (potencia su funcin inhibidora); su dficit congnito origina tromboticos; Alfa2-macroglobulina glucoproteina que inactiva a la trombina y a la calicreina. Alfa1-antitripsina inhibe a la trombina, la calicreina y factor XIa. Alfa2-antiplasmina inactiva a la trombina, a la calicreina y al factor Xa.

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C1 inhibidor Inhibidores patolgicos aparecen en determinadas patologas

DINMICA DE LA COAGULACIN
Vas no comunes intrnseca o endgena: un sistema exclusivamente sanguneo; extrnseca o exgena : requiere intervencin de sustancias procoagulantes procedentes de los tejidos daados + factor tisulares; ambas vas pueden desarrollarse a la vez y se interrelacin entre ellas;

Va Intrnseca: 1. Activacin del factor XII 1er fase => contacto con cargas elctricas negativas (colgeno o vidrio) f XII se hace + sensible a la accin proteoltica posterior; 2nd fase f XII pre-activado + K => fXIIa + PK con ayuda de HMWK K (se activan entre si). 2. Activacin del factor XI se activa por la accin proteolitica del fXIIa + colaboracin del quininogeno de alto peso molecular (HMWK) fXIa. 3. Activacin del factor IX debido a la accin proteolitica del factor XIa + colaboracin del Ca++ y del f3p f IXa. 4. Activacin del factor X por la va intrnseca, debido a la accin proteolitica del factor IXa + colaboracin del factor VIII-Ca, del Ca++ y del f3p fXa; f VIII-C se activa por la trombina fVIII-Ca (su funcin es del cofactor). Va Extrnseca: 1. Activacin del factor VII fVII se activa por la accin de la TH al daarse los tejidos, tambin puede ser activado por la accin proteolotica del f Xa o de la trombina fVIIa.

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2. Activacin del factor X por la va extrnseca debido la accin proteolitica del factor VIIa + colaboracin del Ca++ y TH (tromboplastina tisular) fXa. Interrelaciones entre las dos vas (una de ellas puede intervenir en la activacin de la otra) fXIIa y IXa puede activar fVII y fVIIa con la colaboracin de Ca++ y TH, puede activar al fIX. Va comn: 1-formacin de trombina: protrombinasa (la unin entre factor Va, Ca++, fXa) fijada sobre fIII (TH+f3p) activa a protrombina (fII) trombina + factor V fVa (activacin en circulo); fVa es cofactor del factor proteoltico Xa 2-formacin del coagulo de fibrina: a-degradacin del fibringeno por la trombina rompe las cadenas Aalfa, Bbeta de fibringeno se desprenden fibrinopeptidos A y B monmeros de fibrina (cadenas peptdicas alfa+beta+gamma). b-polimerizacin de los monmeros de fibrina formacin de enlaces de hidrogeno entre los monmeros cordones/red de fibrina o coagulo (soluble-reversible). c-estabilizacin de la fibrina llevada a cabo por el factor XIIIa estabiliza el coagulo de fibrina (lo hace mas insoluble y resistente a la plasmina); fXIII es activado por la trombina con la colaboracin de Ca++ y tambin fibringeno como cofactor. d-retraccin del coagulo: coagulo estabilizado de fibrina + trombostenina plaquetaria (proteina contrctil) coagulo retrado engloba clulas sanguneas + exudacin de suero.

Fibrinolisis

Fibrinolisis destruccin del coagulo de fibrina es llevada a cabo por plasmina que es formada por la activacin del plasmingeno; se produce tras la reparacin de la pared del vaso daado para la reanulacin del flujo sanguneo a travs de la luz vascular; permite la disolucin de los depsitos de fibrina que pueden aparecer espontneamente y
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repermeabilizacion de los vasos trombosados; los restos que quedan tras la fibrinolisis son captados por macrfagos; Factores activadores del plasmingeno (PA): Endogenos fXIIa, K , HMWK, fIIa, protena C, activador tisular Atp, uroquinasa y la trombina; factores plasmticos; las clulas endoteliales vasculares producen un activador del plasmingeno (protena C); los tejidos uterino, prosttico, pulmonar, cardaco y renal produce una proteasa (AtP activador tisular); la orina humana normal contiene un potente activador (urocinasa o uroquinasa) que se emplea en tratamiento de trombosis y embolia pulmonar. Exgenos bacterianos (estreptocinasa o estreptoquinasa) producidas por estreptococos bhemolticos y estafilocinasa, Varidasa empleado para procesos inflamatorios con hematoma.

Plasmingeno (PLG) protena de cadena nica, se encuentra en plasma y suero, de sntesis heptica; transformado en plasmina (irreversible) por los activadores del plasmingeno /PA. Plasmina protena de dos cadenas, es serinproteasa, acta sobre la fibrina y degrada fibringeno productos de degradacin del fibringeno/fibrina (PDF); tambin degrada fV, FVII y fVIII y al complemento; retirada de la circulacin por SRE (macrfagos). Factores inhibidores (antifibrinolisis): acta contra los activadores del plasmingeno y contra plasmina; alfa1-antitripsina, alfa2-macroglobulina y alfa2-anti-plasmina; Actuacin de la plasmina sobre la fibrina y fibringeno destruir los cogulos de fibrina y fibringeno nativo; 3 fases: 1) acta sobre la cadena gamma fragmentos X (todava capaces de coagularse) + pequeos pptidos; 2) acta sobre las cadenas A,B y gama: plasmina + fragmentos X fragmentos D e Y (ya no son capaces de coagularse); 3) acta sobre las cadenas alfa, beta y gamma: plasmina + fragmentos Y fragmentos E y nuevos fragmentos D;

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productos de degradacin del fibringeno/fibrina PDF => son fragmentos originados en esta destruccin que ejerce un efecto antihemosttico => inhiben la polimerizacin de los monmeros de fibrina, inhiben la agregacin plaquetaria (trombo blanco) y ademas, una funcin antitrombnica (inhibe la activacin/ formacin de trombina); los PDF X e Y se llaman PDF precoces / de alto peso molcula; PDF D y E se denominan PDF tardo / bajo peso molecular; Actuacin de plasmina sobre otros factores - como una enzima poco especifica, tambin ataca a otros factores de la coagulacin GENERALIDADES SOBRE LAS PRUEBAS DE HEMOSTASIA Toma de muestra preparacin del paciente: estar en ayunas o al menos no haber ingerido alimentos grasos en las horas inmediatamente precedentes a la extraccion (plasmas lipmicos da problema a la deteccin fotomtrica del coagulo); Extraccin de la muestra: 1. con menor estasis circulatorio posible (el tiempo de tener el smarch puesto) 2. dao mnimo a los tejidos circundantes para no contaminar la sangre con tromboplastina tisular 3. rechazar los primeros ml de sangre extrados de los restos de tromboplastina tisular (echar el primer tubo de extraccin mltiple con vaco interno Venoject o Vacutainer); no insertar primero el tubo destinado a la recogida de sangre para pruebas de hemostasia. Anticoagulacin de la muestra: sustancia elegida es citrato trisdico 3,8% (1:9 para pruebas de coagulacin y 1:4 para VSG) conserva mejor los factores de la coagulacin; mezclar inmediatamente con movimiento de suave inversin => evitar formacin de espuma y rotura de hemates (ricos en tromboplastina tisular); se mezcla 1 parte de citrato trisdico con 9 partes de sangre venosa; Procesamiento de la muestra : en algunas ocasiones, se procesa la sangre anticoagulada con la aspiracin de obtener un plasma carente de algunos factores. Obtencin de Plasma Rico en Plaqueta (PRP): mediante centrifugacin suave 1000 rpm durante 10 minutos, se retira el sobrenadante rpidamente del resto y se transfiere a un tubo adecuado estudio plaquetarios (hay + plaquetas). Obtencin de plasma Pobre en Plaquetas (PPP): mediante centrifugacin intensa de 3.000 rpm durante 10 minutos; se retira el sobrenadante rpidamente del resto y se transfiere a un tubo adecuado pruebas de coagulacin.
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Obtencin de suero: la sangre no anticoagulada se extrae en un tubo especial de sistemas Vacutainer y Venoject (tubo amarillo), se deja coagular a temperatura ambiente durante 510 minutos, centrifugar el tubo a 3.000 rpm 10 minutos; decantar el sobrenadante (el suero) con pipeta Pasteur; Conservacin de la muestra : se procesa lo antes posible (menos de 30 minutos desde la extraccin); si se retrasa se conserva en la nevera a 5 para evitar la perdida de factores; el plasma conseguida debe ser utilizado antes de 4 primeras horas desde la extraccin; si se retrasa, se conserva a 5 durante 12 horas o durante 1 mes a -20.

Coagulmetro: - la mezcla de plasma+reactivos en temperatura optima de reaccin, se deposita en una cubeta de coagulmetro con un trocito de acero; - la cubeta situada entre un diodo emisor de luz ultravioleta y un fotodetector; - cuando se aade a la mezcla el reactivo desencadenante (cloruro clcico), se pone en marcha un magnetoagitador y comienza la lectura; - el magnetoagitador provoca la rotacin del trocito de acero, que impide la sedimentacin de los reactivos, facilita el mezclado homogneo de la mezcla, y posibilita un posicionamiento perfecto del coagulo en el paso ptico del fotodetector; - a medida que aumenta la opacidad de la mezcla, llega menos luz al fotodetector y, por lo tanto, disminuye la tensin de salida de este; - la tensin analgica de salida del fotodetector es amplificada y transformada, por un convertidor analgico digital, en seales digitales que son recogidas por un microprocesador; - al formarse el coagulo de fibrina, la opacidad de la mezcla se incrementa bruscamente y la reduccin en las seales que llegan al microprocesador hace que este finalice la lectura y pare el cronometro; - el dato de tiempo registrado por el cronometro es ofrecido al analista en una pantalla o/y es imprimido - los coagulmetro consta de una placa calefactora que puede ser utilizada para realizar las incubaciones necesarias para la ejecucin de estas pruebas;

Pruebas que investigan la hemostasia primaria

Pruebas que estudian la fragilidad vascular : Prueba de Rumpel-Leede evaluar la resistencia que ofrecen las paredes capilares al aumento de la presin intra capilar y a la anoxia se traza un circulo de unos 5 cm de dimetro y se marca los puntos que se puede confundir con el resultado en la cara anterior del antebrazo y se traza un circulo a cm de la flexin del codo; se aplica un esfigmomanometro en un brazo con la presin media de la tensin arterial, durante 5 minutos; esto origina un incremento en la presin intracapilar y una anoxia responsables de
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la produccin de extravasaciones sanguneas visibles en forma de petequias (puntitos rojos que no se van al presionar la zona); resultado dudoso entre 10-20 petequias y se considera positiva => mas de 20 petequias en la cara anterior del antebrazo; ascenso de la fragilidad capilar en trombocitopenia, enfermedad de von Willebrand y las prpuras vasculares. Pruebas que estudian la funcionalidad plaquetaria: 1.Prueba de retraccin del coagulo capacidad de retraccin del coagulo depende de la aptitud de las plaquetas para liberar trombostenina => situar 2 ml de sangre no anticoagulada en un tubo de vidrio graduado; se espera a que coagula la sangre, dejndola a 37C durante 1 hora / temperatura ambiente durante 3 horas; normalmente el coagulo comienza a retraerse desde la 1 hora, pero sigue siendo soluble durante las primeras 3-4 horas; se valora la adherencia del coagulo formando a las paredes del tubo (al retraerse, queda adherido y fundamentalmente, a nivel de su extremo superior) y el volumen de suero exprimido del coagulo durante la retraccin de este (equivale aproximadamente a la mitad del volumen inicial de sangre); el sedimento de hemates expulsados del coagulo, presente en el fondo del tubo, es escaso (< 5 mm de grosor). 2.Tiempo de hemorragia o de sangra (TS) el tiempo que transcurre desde la seccin de un grupo de capilares hasta la formacin del trombo blanco plaquetario e indica la capacidad constrictora de los capilares y el numero aptitud adherente y agregante de las plaquetas => se determina efectuando una pequea herida en la piel (una puncin con una lanceta en el lbulo de la oreja/tcnica de Duke o un par de cortes en el antebrazo con un aparato especial /tcnica de Ivy que es mas exacta que de Duke) y seguidamente poner en marcha el cronometro, midiendo el tiempo (cada 30 segundos) que tarda en cesar de manar sangre a travs de esa herida (recogiendo las gotas de sangre con un papel de filtro sin presionar la herida); el tiempo de hemorragia normal con tcnica de Duke 3-5 minutos y con tcnica de Ivy 1-7 minutos; ;TS alargado en trombocitopenia, trombopatias congnitas, enfermedad de von Willebrand y sujetos que toman aspirina.

Tiempo de hemorragia (tcnica de Ivy) - colocar el esfigmomanometro en el brazo del paciente a 40 mmHg, mantenemos as durante toda la prueba; limpiamos con alcohol la cara del antebrazo; con una lanceta hacer 3 punciones separadas de 3 mm de largo por 3 mm de profundidad; ponemos en marcha el cronometro y cada 30 segundos recogemos la sangre con el papel de filtro hasta que todas las punciones dejen de sangrar; interpretacin clnica = tcnica de Duke.

PRUEBAS QUE INVESTIGAN LA COAGULACION

Pruebas que estudian globalmente la coagulacin: Tiempo de coagulacin (tiempo de Lee White) el tiempo que tarda en generarse un coagulo en una muestra de sangre no anticoagulada, que se pone en contacto con una superficie de vidrio; permite detectar los trastornos relacionados con la va intrnseca o con la va comn de la coagulacin => se sita la muestra 2 ml en el tubo de ensayo y se incuba a 37C (tiempo de coagulacin transcurre desde el deposito de la sangre en el tubo hasta la aparicin de un coagulo en el interior del mismo); el tiempo de coagulacin depende varios factores (el volumen de muestra y la superficie del tubo); VN 5-12 minutos; el tiempo esaumentado en dficit de factores de via intrnseca (hemofilia), afibrinogenemia y fibrinolisis excesiva y terapias con heparina; esta prueba es poco sensible, ya que no detecta dficit ligeros de factores por lo que esta en desuso.

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Pruebas que estudian la va intrnseca: 1.Tiempo de tromboplastina parcial (TTP/PTT) o tiempo cefalina: el tiempo que se necesita para que coagule un PPP tras su recalcificacin (adicin de cloruro clcico/CaCl2) y en presencia de un sustituto del f3p (suspensin de fosfolpidos obtenida de cerebros de conejos/cefalina que vienen liofilizados); la adicin de cefalina evita que el tiempo que tarda en generarse el coagulo de fibrina depende del numero de plaquetas que estn presentes en el plasma (para que no intervengan las plaquetas y solo los factores de la va intrnseca). 2.Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA/APTT) similar que TTP, pero adems, incorpora una sustancia activadora de los factores de contacto (es ms rpida que PTT); como activador de los factores de contacto se pueden utilizar varias sustancias, pero lo que usamos es cido elgico; VN de APTT 30-40 segundos; tambin se puede expresar su resultado en forma de relacin o cociente entre el umero de segundos que tarda en coagular el plasma del paciente y el numero de segundos que tarda en coagular un plasma CN; cuanto mas alto es este cociente,mayor es el dficit coagulatorio =>Tpaciente/Tcontrol normal = tendencia de hipo/hiper coagulabilidad; VN de ratio APTT 1-1,2 (>1,2 es falta de coagulabilidad); tanto PTT como APTT sirven para explorar el estado de la va intrnseca y de la va comn de la coagulacin y permiten detectar dficit de los factores que intervienen en ellas y para el control de los tratamientos con anti-coagulantes, en concreto con heparina. Pruebas que estudian la va extrnseca Tiempo de protrombina (TP/PT) tiempo de Quick: el tiempo que tarda en coagular un PPP cuando se pone en contacto con un exceso de calcio y de tromboplastina hstica; sirve para explorar el estado de la va comn y sobre todo va extrnseca de la coagulacin (fII, fV, fVII y fX); se emplea para (1) detectar el dficit de factores de la va extrnseca (2) para el control de pacientes sometidos a terapias con dicumarinas (3) para la vigilancia de la evolucin de enfermos con algunos trastornos hepticos; TH se prepara a base de extractos de cerebro o de pulmn de hombre o de animales (conejo o vaca); TH fabricadas no tienen la misma sensibilidad, por lo que hay que comparar con TH de referencia internacional => ISI (indice de sensibilidad internacional = 1,0) cuanto mas cercano a ISI, mayor es su concordancia con el patrn primario; el reactivo que se utiliza es una mezcla de TH y de Ca => tromboplastina clcica; VN de PT: 11-13 segundos (corresponde al 70-100% de actividad); los resultados tambin se expresa en % de actividad (indice de Quick); por ello se prepara una batera de diluciones a partir de un plasma CN y se mide el PT del plasma CN no diluido/puro (100%) y de cada una de las diluciones preparadas (con sus correspondiente %); con los datos obtenidos, se traza una curva de calibrado (curva de actividad de la protrombina) anotando en el eje de ordenadas los valores en segundos del PT del plasma CN no diluido + cada una de sus diluciones y en el eje de abscisas, el % de actividad asignado a cada uno de ellos; finalmente el valor en segundos del PT del plasma problema,se interpola en la grfica y se halla el porcentaje de actividad de la protrombina que le corresponde a este; los resultados se pueden expresar en forma de proporcin (ratio) entre valor en segundos del PT plasma problema y del PT plasma CN no diluido; en un control de anti-coagulacin, se calcula el cociente corregido con el ISI para evitar el error que implica el uso de diferentes TH; el cociente corregido permite relacionar los resultados obtenidos con distintos reactivos comerciales (INR-international normalized ratio) se calcula: INR = (TP del plasma de paciente) isi (TP del plasma CN) la ratio de protrombina normal: 0,9 y 1,15 Un correcto tratamiento con anti-coagulante orales (anti-vitaminas K o dicumarinas), INR debe fluctuar entre 1,5 y 4,5; el paciente con < 1,5 => escasamente anti-coagulado y el paciente > 4,5 => excesivamente anti-coagulado
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Pruebas que estudian la va comn Cuantificacin de fibringeno el tiempo que tarda en originarse el coagulo de fibrinadepende, exclusivamente de la cantidad inicial de fibringeno y es inversamente proporcional a la concentracin de esta en la muestra; sirve para explorar ademas de va comn, la fase de la fibrinolisis; son pruebas caras, sensible, que deben hacerse en laboratorio especficos (de inmunolgia); el fibringeno plasmtico se cuantifica mediantediferentes mtodos; actualmente solo se usan aquellos que exploran sus capacidades antignicas; se basan en la medicin del tiempo que tarda un exceso de trombina en degradar el fibringeno presente en PPP diluido a fibrina => formar coagulo; la trombina empleada esta a una concentracin muy alta (100 U NIH/ml) => poco o nada influenciadas por los inhibidores de ese factor (plasmina); los mtodos inmunolgicos => detectar la presencia en el plasma, del fibringeno, mediante Acs dirigidos contra el; VN de fibringeno en el plasma (fibrinogenemia) : 150-450 mg/dl; disminuida => trastornos congnitos (afibrinogenemia congnita) o adquiridos (hepatopatas); aumentada => procesos inflamatorios (inespecficos) por ser reactante de fase aguda y en estrs, embarazo y tto anovulatorios; mtodos inmunolgicos => determinan la concentracin normal de fibringeno plasmticos; mtodos funcionales => determinan la concentracin anormalmente baja de fibringeno plasmtico, ya que una parte es incapaz de degradarse con normalidad. Practica - Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (TTPA/APTT) Fundamento - APTT es el tiempo que tarda en coagular un PPP tras su recalcificacin y e presencia de un sustituto de f3p y de un activador de los factores de contacto (el cido elgico) => se realiza mediante la adicin de cloruro clcico (Ca Cl2); el sustituto del f3p es una suspensin de fosfolpidos obtenida a partir de cerebros de conejos (cefalina); se aade con la cefalina un factor de contacto el cido elgico; Material necesario - gradilla, 3 cubetas o pocillos de coagulmetro, trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas, rotulador de vidrio de punta afina, pipeta automtica 100 lambdas, puntas de pipeta automtica adecuada, coagulmetro, bao mara 37C, tubos de ensayo de plstico. Reactivos - solucin de cloruro clcico y cefalina activada de casa grifols, plasma CN; reactivo que se necesita: cefalina activada y cloruro clcico (CaCl2) 100 lambdas (cada reactivo) x 3 cubetas; Muestra - PPP correctamente preparado Tcnica - homogeneizar los reactivos y la muestra suavemente; depositar el volumen total que se va a necesitar de cada uno de los reactivos y el de la muestra en tubos de ensayo de plstico, adecuadamente rotulados; atemperar los reactivos y la muestra a 37 5-15 minutos; introducir un trocito de acero en 3 cubetas del coagulmetro (CN,CP y M); rotular el extremo superior de una cubeta del coagulmetro con letra M, CN, CP; verter 100 lambdas de muestras en cada cubeta anterior, aadir 100 lambdas a lo anterior de cefalina activada (cefalina+ cido elgico); mezclar bien el contenido de cada cubeta; incubar la mezcla a 37C durante 3 minutos en la placa calefactora del coagulmetro; colocar uno por uno de las 3 cubetas en la celda de medida del coagulmetro, y agregar 100 lambdas de CaCl2; al agregar el CaCl2, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulmetro y comienza la lectura de este; cuando se forma el coagulo, el coagulmetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adicin del CaCl2. Lectura de resultados - APTT es el tiempo transcurrido desde la adicin del CaCl2 hasta la formacin del coagulo de fibrina; VN de APTT 30-40/45 segundos y para pacientes que toman dicumarinos 1,5-2 veces mas que VN; se considera anormal APTT de la muestra
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superior en mas de 8 segundos al del CN; APTT en forma de cociente o proporcin (ratio) entre el tiempo de paciente y el tiempo de CN => 1-1,2; cuanto mas alto es este cociente, mayor es el dficit coagulatorio. Interpretacin clnica - cuando APTT elevado se asocia a un tiempo de Quick normal (o como mucho ligeramente alterado), estaremos ante un dficit de uno de los factores de la va intrnseca de VIII / IX o bien ante un tratamiento con heparina; Hay que recordar que la actividad anti-coagulante de la heparina se debe a que al unirse como cofactor de la anti-trombina III (ATIII) inhiben a la trombina y a los factores IX, X, XI, XII plasmina y Calicreina ademas de interferir en la actividad plaquetaria ; por tanto, solo se vera afectada la va intrnseca y la comn, pero no la va extrnseca; cuando APTT elevado se asocia a un Quick tambin elevado, pensaremos en la posibilidad de una insuficiencia heptica, coagulopatia de consumo (coagulacion intravascular diseminada) o bien con anti-coagulante oral circulante; hay que recordar que los anti-coagulante orales son anti-vitamina K dependientes => fII, fVII, fIX, fX por lo que se ve alterada la va intrnseca, extrinseca y la va comn; el APTT en los pacientes que toman anticoagulante es de 1,5-2 veces mas del valor normal. Practica - Tiempo de Protrombina (TP/PT) Fundamento - PT es el tiempo que tarda en coagular un PPP, cuando se pone en contacto con un exceso de calcio y de tromboplastina hstica; el reactivo en esta prueba es una mezcla de TH y Ca => tromboplastina clcica; la TH procede de extractos de cerebro o de pulmn de hombre o de animales (conejo o vaca). Material necesario - gradilla, 3 cubetas de coagulmetro (M,CNyCP), trocitos de acero especial para depositar en el interior de la cubeta, un rotulador de vidrio de punta fina, pipeta automtica de 100 y 200 lambdas, puntas de pipeta automtica adecuada, coagulmetro, bao mara a 37C, tubos de ensayo de plstico. Reactivos - tromboplastina clcica de la casa grifols, se reconstituye con 5 ml de agua destilada; se necesita 200 lambdas x 3 cubetas Muestra - PPP correctamente preparado Tcnica - homogeneizar la tromboplastina clcica hidratada suavemente; depositar el volumen total de tromboplastina clcica que se va a necesitar en un tubo de ensayo de plstico, adecuadamente rotulado; atemperar la tromboplastina clcica a 37C en un bao de agua a 37C entre 5-15 minutos; introducir un trocito de acero en cada cubeta de coagulmetro; rotular el extremo superior de las cubetas con M,CNyCP; pipeteamos en cada cubeta 200 lambdas de reactivo atemperado; metemos las cubeta en el pocillo calefactor de coagulmetro; apretamos 200 + start (tericamente seala 120 segundos) y se pone en marcha el cronometro regresivo; cuando suena la alarma, metemos las cubetas (uno por uno) en la posicin de lectura; tapamos con el capuchn y esperamos 5 segundos y pulsamos reset para poner al 0 el cronometro y aadimos 100 lambdas de plasma de manera enrgica. Lectura de resultados - PT es el tiempo transcurrido desde la adicin de la tromboplastina clcica hasta la formacin del coagulo de fibrina; el resultado tambin se expresa en forma de % de actividad de la protrombina => se interpola en la curva de actividad de la indice de Quick previamente preparada y se halla el % de actividad de la protrombina que le corresponde a este; ademas se puede expresar en forma de cociente o proporcin (ratio) entre PT de la muestra y PT de CN no diluido (100% de actividad); VN del PT 11-13 segundos (70-100%); la ratio de protrombina normal (INR) => 0,9 - 1,5; en paciente que toman anti-coagulante es de 2-3.

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Interpretable clnica - en pacientes que toman anti-coagulantes orales el indice de Quick normalmente 25-35% y el INR 2-3 (depende de la casa comercial); en estos casos ademas del Quick tambin es aconsejable hacer un APTT al inicio del tto y este APTT debe fluctuar entre 1,5-2 veces mas del VN; encontraremos valores aumentado en T-Quick => en la enfermedad hemorragica del recin nacido, en la insuficiencia heptica, en la avitaminosis K, en el CID (coagulacion intravascular diseminada), anti-coagulante orales, y cuando haya deficiencia de algunos factores de complejo protrombinico (protrombinasa). Practica - Preparacin de una curva de actividad de la Protrombina Fundamento - los resultados de PT se pueden expresar en forma de porcentaje de actividad (indice de Quick) => se prepara una curva de actividad de la protrombina y posteriormente interpolar en la grfica trazada el valor en segundos del PT determinado en el plasma problema; para construir la curva => se prepara una batera de diluciones a partir de un plasma control normal, y se mide el PT del plasma control normal no diluido (se asigna 100%) y de cada una de las diluciones preparadas (con sus % correspondientes); con los datos de los resultados, se traza una curva de calibrado (de actividad de la protrombina) anotando en el eje de ordenadas/vertical el PT del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones; en el eje de abscisas/horizontal, el% de actividad asignado a cada uno de ellos. Material - 8 tubos de ensayo de plstico, rotulador de vidrio de punta fina, pipeta automtica (de 1000 lambdas y 50 lambdas) con sus puntas, 5 cubetas de coagulmetro, bao de agua a 37C, bolgrafo, regla, hoja de papel milimetrado (papel Quick-Graph), gradilla. Reactivo - suero fisiolgico o tampn de Michaelis; tromboplastina clcica; plasma CN; a partir del plasma CN se prepara una batera de diluciones de la siguiente manera:

Tcnica - homogeneizar la tromboplastina clcica y las diluciones de plasma CN suavemente; depositar el volumen total de TH clcica que se va a necesitar en un tubo de ensayo de plstico (200 lambdas x 5 tubos => preparamos 1,5 ml); atemperar la TH clcica a 37C en un bao de agua 5-15 minutos; introducir un trocito de acero en cada una de las 5 cubetas de coagulmetro; rotular el extremo superior de las cubetas con % que corresponde (100, 50, 33, 25 y 10); incubar 200 lambdas de reactivo durante 2 minutos en la placa calefactora del coagulmetro; marca 200+start => dejar el cronometro siga su regresin cuando llega a 0, suena la alarma, apretamos reset y aadimos de manera enrgica 100 lambdas del CN o de la dilucin (se hace una por una); al agregar el CN, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulmetro y comienza la lectura de este; cuando se forma el coagulo, el coagulmetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adicin de la TH clcica. Lectura de resultados - PT es el tiempo transcurrido desde la adicin de la TH clcica hasta la formacin del coagulo de fibrina; con los datos de los resultados construimos la curva de calibrado o de referencia; se sealan en la grfica los puntos en que confluyen cada uno de
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PT con su % de actividad correspondiente, se dibuja la linea que mejor une los 5 puntos; si la grfica se traza en un papel milimetrado normal, se obtiene una curva;el indice de Quick normal para paciente que toman dicumarinos 25-35%. Practica - Determinacin Funcional de Fibringeno Fundamento - el fibringeno plasmtico puede ser cuantificado mediante diferentes mtodos; sin embargo, se suelen utilizar aquellos que exploran sus capacidades funcionales o antignicas; la determinacin cronomtrica de fibringeno, segn el mtodo de von Clauss, se basa en la medicin del tiempo que tarda un exceso de trombina en degradar a fibrina el fibringeno presente en un PPP diluido y por tanto en formar un coagulo => depende exclusivamente de la cantidad inicial de fibringeno y es inversamente proporcional a la concentracin de este en el plasma estudiado (fibrinogenemia); cuanto mas tiempo tarda, menos concentracin fibrinogenemia; e.j.(1) 7" => 500 mg/dl; 5" => x mg/dl; x = 7/5 x 500 = 700 mg/dl;(2) 7" => 500 mg/dl; x" => 350; x = 7 x 500/350 = 10" Material necesario - gradilla, 5 tubos de ensayo de plstico, pipeta automtica 1000 lambdas y de 50 lambdas, puntas de pipeta automtica, rotulador de vidrio de punta fina, 5 cubetas de coagulmetro, trocitos de acero, coagulmetro, bolgrafo, hoja de papel de tipo logartmico o Fibri-Graph. Reactivo - fibringeno-Kit de la casa Grifol => trombina bovina (viene liofilizado - hay que diluir con agua destilada); tampn de Owren para diluir plasma calibrador y la muestra; plasma calibrador o de referencia; agua destilada. Muestra - PPP correctamente preparado

Tcnica - homogeneizar los reactivos suavemente; diluir el plasma calibrador y la muestra de la manera que se indica en el siguiente cuadro; depositar el volumen total de trombina bovina que se va a necesitar, en un tubo de ensayo de plstico, adecuadamente rotulado (100 lambdas x 5 tubos = 500 lambdas => cogemos 700 lambdas para estar seguro); atemperar la trombina bovina a temperatura ambiente (20-25C); introducir un trocito de acero en las 5 cubetas de coagulmetro; rotular el extremo superior de 4 cubetas con (Cx2, C, C/2, C/3) y de otra cubeta con M; verter 200 lambdas de cada una de las diluciones de plasma calibrador y de la muestra en sus cubetas correspondientes ; incubar las diluciones del plasma calibrador y la muestra, contenidas en las cubetas a 37C durante 2 minutos en la celda calefactora del coagulmetro; agregar 100 lambdas de trombina bovina; al agregar la trombina, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulmetro y comienza la lectura de este; cuando se forma el coagulo, el coagulmetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adicin de la trombina. Lectura de resultados - si el resultado final determinado en la muestra es < 7 segundos, la fibrinogenemia es muy alta, por lo que se ha de repetir la determinacin, pero partiendo de una dilucin de 1/20 (25 microlitro de muestra + 475 microlitro de tampn Owren) y el
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resultado nuevo se debe multiplicar por 2; si el resultado final es > 40 segundos, la fibrinogenemia es muy baja, por lo que se ha de repetir la determinacin, partiendo de la dilucin de 1/5 (50 lambdas de muestra + 200 lambdas de tampon Owren) y el resultado nuevo se debe dividir entre 2; para establecer la fibrinogenemia de la muestra se ha de trazar previamente en papel bilogaritmico una curva de referencia o de calibracin; en el eje de ordenadas/vertical => el tiempo en segundos de coagulacion de cada una de las diluciones y en el eje de abscisas/horizontal => las concentraciones de fibringeno que corresponden; posteriormente, se sealan en la grfica los puntos en que confluyen cada valor de tiempo de coagulacion con su fibrinogenemia correspondiente y se dibuja la recta que mejor une los 4 puntos; finalmente el valor en segundos del tiempo de coagulacion determinado en la muestra, se interpola en la curva de calibracin, previamente preparada y se halla la concentracin de fibringeno que le corresponde a este; VN de fibrinogenemia => 150-450 mg/dl.

Interpretacin clnica - la formacin de fibringeno y por tanto su concentracin plasmtica puede estar disminuida por trastornos congnitos (afibrinogenemia congnita) o adquiridos (hepatopatas) y tambin en trastornos como fibrinolisis patolgica; la fibrinogenemia asciende de una forma inespecifica en procesos inflamatorios, debido a que es un reactante de fase aguda.

Pruebas que estudian la fibrinolisis

Pruebas globales Tiempo de lisis de coagulo de sangre total (tiempo de Lee White) Es el tiempo que tarda en lisarse, "in vitro", un coagulo formado a partir de sangre total; se mide situando un tubo de vidrio con sangre coagulada en un bao de agua a 37C, observando seguidamente a las 8, 24, 48 y 72 horas, el momento en el que se lisa el coagulo. La lisis del coagulo se aprecia como una disolucion del mismo, que conduce a la organizacin de la sangre en el tubo en 2 fases, una inferior constituida constituida por clulas y otra superior de naturaleza liquida. El tiempo de lisis del coagulo es el transcurrido desde el inicio de la incubacin de la sangre coagulada hasta el momento en que se constata la destruccin del coagulo preexistente. Normalmente igual o superior a 72 horas; si es inferior => paciente padece probablemente un proceso de hiper-fibrinolisis. Pruebas parciales Cuantificacin del fibringeno La cuantificacin del fibringeno circulante tambin es imprescindible cuando se pretende estudiar el estado de la fibrinolisis. Esto se debe, en primer lugar a que una baja concentracin plasmtica de fibringeno conduce a la formacin de un coagulo pequeo y quebradizo, que no permite una adecuada medicin del tiempo que arda este en lisarse. En segundo lugar, una cada brusca de la concentracin plasmatica de fibringeno confirma la sospecha de la existencia de un proceso de hiperfibrinolisis o sndrome de desfibrinacin y CID sepsis, originado por meningococo gram (-) que causa hematoma. Determinacin de PDF Los PDF pueden determinarse en suero, plasma y orina. Es preferible que la muestra sea un PPP, ya que pueden producirse interacciones entre el coagulo formado durante la obtencin del suero y los PDF precoces. Los PDF se detectan mediante tcnicas inmunolgicas (inhibicin de la hemaglutinacin, aglutinacin indirecta) que se basan en el enfrentamiento de los PDF contenido en la muestra con un reactivo a
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base de Ac especficamente dirigidos contra ellos. Una vez detectados los PDF, el calculo de la concentracin a la que estn presentes en la muestra se lleva a cabo mediante procedimientos semicuantitativos (determinando su titulo). La concentracin normal de PDF en el plasma => 2-8 micro-gramos/ml; patolgicos: > 10 micro-gramos/ml. Se encuentran concentraciones sricas excesivas de PDF en todos los sndromes de desfibrinacin. Una prueba mas especifica consiste en la deteccin inmunologica de dmeros *D. Esta mayor especificidad se debe a que, mientras que la fibrinogenolisis genera PDF normales, la fibrinolisis origina tambin una cantidad apreciable de otros PDF que son los dmeros D. Por lo que, si se detecta un exceso de estos en el plasma, se deduce que se han formado cogulos de fibrina en el interior de los vasos, que posteriormente han sido degradados (tpico de la coagulacion intravascular diseminada /CID y de la trombo-embolia venosa); la concentracin normal de dmeros De en el plasma => 0,25 micro-gramos/ml.

Sistema diagnostica de los trastornos hemostticos

Pruebas para el control de la terapia con anti-coagulantes Los medicamentos utilizados para la terapia antitrombtica, actan a diferentes niveles: a)-Medicamentos para prevenir/inhibir la formacin del coagulo de fibrina son los anticoagulantes. b)-Medicamentos que impiden la adhesin y agregacin plaquetarias son los antiagregantes. c)-Medicamentos trombolticos, es decir, que rompen el coagulo de fibrina: son los fibrinolticos. a)-El tratamiento con anti-coagulantes requiere un control estrecho, ya que la diferencia entre una dosis teraputica, ineficaz o toxica es muy pequea. Ademas existen variaciones interpersonales que no pueden preverse de forma estndar. El control de dicho tratamiento se efecta en el laboratorio, no midiendo el nivel de frmaco administrado, sino midiendo su efecto mediante el alargamiento de algunas pruebas de coagulacion. El tipo de anticoagulante administrado condiciona el tipo de prueba a realizar. La prueba ideal es aquella que depende de los factores de coagulacion afectados por el anti-coagulante, aunque en realidad no haya una prueba ideal. a.1.)- Pruebas para el control de la terapia con heparina : La heparina (y los anti-coagulantes orales), como ya se ha dicho, no disuelven el coagulo, pero impiden su formacin o bien que se extienda. La heparina es un frmaco que no se absorbe va intestinal, por lo que ha de ser administrada por va parenteral (va venosacontinua o intermitente o por va subcutnea). Su mecanismo de actuacin es a traves de la antitrombina III, bloqueando la activacin de la trombina y tambin los factores VIIa, IXa, Xa, XIa y XIIa; heparina acta como cofactor de AT-III (potenciar su mecanismo de accin) Se utilizaran para su control aquellos test que exploren la va intrnseca y comn de la coagulacion. - Prueba de lee White (ya no utilizada) - PTT /aPTT: es la mejor prueba. Ha de estandarizarse para cada laboratorio como se ha comentado anteriormente. Se considera el PTT dentro del rango teraputico cuando da valores entre 1,5 y 2 con respeto al valor control. - Tiempo de Trombina: esta prueba permite valorar el tratamiento heparnico cuando se administran otros tipos de frmacos que puedan afectar a la coagulacion ( e.j. los dicumarnicos), o que haya niveles alterados de los factores de la coagulacion por otras causas. Una vez establecida la terapia, el control debe ser diario. Si la terapia con heparina
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no es continua, sino que es intermitente, la prueba ha de hacerse 30 minutos antes de que se haya de administrar la siguiente dosis. a.2.)- Pruebas a realizar en el tratamiento con anti-coagulantes dicumarnicos : Son los anti-coagulantes orales o anti-vitaminas K. Se utilizan en la profilaxis y tratamiento de la trombosis. Su accin se debe al bloqueo de la sntesis hepatica de los factores vitamina K dependientes (II, VII, IX y X) y de las protenas C y S que tambin son vitamina K dependientes (en realidad estos factores se forman, pero no son coagulantes y se les llama PIVKA). Se administran va oral, absorbindose en el intestino y son transportados en sangre fundamentalmente por la albumina. Es importante saber quesu accin antitrombtica tarda entre 1-3 das a partir del inicio del tratamiento, por lo que normalmente al inicio del tratamiento se combina su administracin con heparina, suprimindose esta de manera gradual hasta que comienzan a actuar los dicumarnicos. Las pruebas a realizar para este tipo de terapia pueden ser las que exploran la va extrinsecay tambin la va intrnseca de la coagulacion, aunque es mas sencilla y especifica la prueba que explora la va extrinseca (T.de protrombina), ya que el factor VII es el que tiene menor vida media (4-6 horas) y es por tanto mas sensible: - T. de protrombina o T. de Quick: los valores normales oscilaran entre un 25-35% la ratio, entre 2-4 y el INR entre 2-3 (para los pacientes que toman dicumarnicos. - aPTT: los valores normales oscilaran entre un 1,5-2 veces el tiempo de valor control, aunque como no detecta el factor VII (que es entre los factores vitamina K dependiente sel de menor vida media), no se recomienda su uso. b)- Tratamiento con antiagregantes Los antiagregantes evitan la adhesin de las plaquetas al tejido subendotelial de los vasos, inhibiendo su agregacin e impidiendo su desgranulacin. Los frmacos aparecidos con esta funcin se utilizan fundamentalmente como preventivos de la trombosis arterial. Entre ellos el mas utilizado es el AAS (acido acetil saliclico), comercialmente llamado Aspirina, dado en pequeas dosis (alrededor de 100 mgr diarios). Debido a su mecanismo de accin, prolonga el T. de sangra (Duke) c)- tratamiento con fibrinolticos El objetivo de la terapia con frmacos fibrinolticos es la activacin del plasmingeno contenido en el trombo para su transformacin en plasmina y as destruir la fibrina y por tanto, lisar el trombo. Los frmacos utilizados son laestreptokinasa y la urokinasa y sus derivados (llamados rTPA), y se utilizan sobre todo en el tratamiento precoz del infarto de miocardio, pues al intentar disolver el coagulo se evita la necrosis del musculo cardaco. Para hacer el seguimiento con esta terapia se utilizan varias pruebas: - Tiempo de trombina (se deber mantener entre 1,5-5 veces el tiempo de valor control) - Medicin de plasmingeno Sobre todo: - Determinacin del fibringeno - Determinacin de los PDF

Inmunohematologa - Banco de sangre I

En 1900 Karl Landsteiner, forense del Instituto de Anatoma Patolgica Viena, descubre el sist. ABO.

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Seleccin de los donantes La seleccin de los donantes es un paso previo fundamental, dado el gran numero de enfermedad que se pueden transmitir va sangunea => historia clnica donde figuran los datos de identificacin del donante, y una serie de preguntas sobre enfermedades padecidas, tratamientos en curso, vacunaciones, viajes a pases tropicales, etc. para determinar si esa persona es aceptable o no como donante. Se debe hacer un examen fsico del donante => tensin arterial y pulso con valores normales y observacin de su estado fsico si hay signos de debilitamiento, desnutricin, anemia, ictericia, cianosis, disnea, inestabilidad mental o intoxicacin por alcohol, drogas u otros productos. Criterios de exclusin que se aplican a los donantes: (1)- definitivamente => personas que padezcan bronquitis crnica, diabetes con tratamiento de insulina, enfermedades auto-inmune, enfermedad cardaca y vascular, enfermedad de Creutzfelt/Jakob (la vaca loca), epilepsia, fiebre reumtica con secuelas cardacas crnicas, hipertensin, bebesiosis y leishmaniosis (parsitos), infeccin VIH y SIDA, enfermedades malignas, policitemia vera, nefritis crnica pielonefritis. (2)- temporalmente => mujeres embarazadas (hasta 9 meses despus del parto y durante la lactancia), individuos alrgicos o que padecen asma leve, portadores heterocigticos de beta-talasemia, ciruga mayor o menor (3-6 meses), fiebre >38C y sndrome gripal, antecedentes de ictericia o hepatitis pueden donar a criterio del medico responsable. (3)- personas con periodo de cuarentena => brucelosis 2 aos tras la recuperacin completa; tuberculosis 2 aos; osteomielitis 2 aos; osteomielitis 2 aos; glomerulonefritis aguda 5 aos; malaria 3 aos; en caso de enfermedad infecciosas, el medico responsable de la unidad de extraccin establecer la naturaleza de la exposicin y el tiempo de rechazo. (4)- otras exclusin temporal => personas vacunadas 48 horas y 3 meses si la inmunizacin de sueros animal; personas transfundidas de sangre o hemoderivados 1 ao. Requisitos que se pide a los donantes en el da de la donacin: - se encuentra bien y declara los medicamentos que se toma; examen fsico - tiene mas de 18 aos y menos de 70 aos - pesa mas de 50 kgs (se extrae 450 ml => +/- 10% del peso corporal) - intervalo mnimo entre donaciones estndar 2 meses (4 x al ao para los varones y 3 x para mujeres) y 1 mes entre donacin de sangre total y aferesis. - el pulso debe ser regular (entre 50-110 pulsaciones/minuto); tensin arterial sistlica max 180 mm de Hg y diastlica max 100 mm de Hg; no debe estar hipotenso; temperatura oral max 37,5C; valores de Hb mnimos 12,5 g/dl en mujeres y 13,5 g/dl en varones; beber abundante cantidad de agua y no beber alcohol pasta 6 horas despus de la donacin. Pruebas de comprobacin analtica de la sangre (establecidas por el consejo de Europea) 1- Grupo ABO y Rh (tipificacin de la sangre) 2- Determinacin Acs anti-HIV 1 y 2 => debe ser negativo 3- Determinacin de Ags de hepatitis B (HBsAg) => debe ser negativo 4- Determinacin de Acs anti-hepatitis B => debe ser negativo 5- Determinacin de Acs anti-hepatitis C (VHC) => debe ser negativo 6- Deteccin de reaginas (Acs) para la sfilis => debe ser negativo
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7- Deteccin de Acs anti-citomegalovirus (CMV) => debe ser negativo 8- Deteccin de Acs anti-virus linfotrpico de clulas T humanas (HTLV) => debe ser negativo 9- Deteccin de alanina amino-transferasa (GPT) => debe ser dentro de los valores normales 10- Hb mnimo 45g/unidad (se analizan 4 unidades al mes) 11- Hemlisis al final de la conservacin => debe ser < 0,8%

Banco de sangre II
Extraccin de sangre total: - Se utiliza triple bolsas de extraccin con aguja y anti-coagulante incorporado (para hacer aferesis de los diferentes componentes) - Anti-coagulante => citrato sdico con sustancias conservantes (mantener viabilidad de los hemates durante 12 das => as, se puede establecer el periodo de caducidad en 42 das) - Mezclas de anti-coagulante => CPD-adenina (cido ctrico, citrato sdico, fosfato sdico y dextrosa) o CPD-SAG-manitol (solucin salina, adenina y glucosa) - El volumen de sangre extrado no bebe superar lo 450 ml => controlado por una balanza digital con plataforma (sistema de balanceo para mezclar suavemente la sangre permitiendo que se mezcle) que de forma automtica se produce el pinzamiento del tubo colector al alcanzar el peso de sangre deseado, finalizando as la extraccin. - Se le hace un bucle, se puede cortar y hacer de ella la sangre para hacer los grupos y dispensar las en diferentes tubos para hacer las pruebas. Extraccin de hemoderivados - Para obtener alguno de los componentes de la sangre (tcnica de afresis) => separar los distintos componentes de la sangre para obtener los hemoderivados; citafresis => separacin celular; eritrafresis => separacin de eritrocitos; leucofresis => separacin de leucocitos; plaquetafresis => separacin de plaquetas (cuando la plaquetafresis se hace manual, se utilizan las plaquetas de 6 donantes diferentes, se meten en la misma bolsa con un poco de plasma y se mantienen en agitacin continua a 22C durante max 5 das a partir de las cuales pierden su actividad; cuando la extraccin se hace en automtica, se utilizan las plaquetas del mismo donante); plasmafresis => cuando se desea coger solo plasma. - Existen aparatos que realizan la afresis automticamente => separando los componentes necesarios y devolviendo el resto al donante; ventajas => rapidez y condiciones optimas de asepsia; desventajas => el elevado coste de aparataje, se necesita personal especializado para manipularlo y ademas dura 60 minutos. - Mas frecuentemente la separacin se realiza a partir de bolsas de sangre total con bolsas satlite incorporadas que recogen el componente que nos interesa sin perder la esterilidad => la primera bolsa con CPD se centrifuga quedando separadas sus componentes (abajo los hemates, en medio los leucocitos + plaquetas y arriba el plasma); mediante un sistema de prensado, el plasma se recoge en una bolsa, los hemates en otra y los leucocitos + plaquetas con un poquito de plasma se quedan en la primera bolsa. Componentes sanguneos Sangre total: - Extrada de un donante adecuado y recogida en una bolsa estril y libre de pirgenos (microbios) => contiene un anti-coagulante apropiado (CPD-A); mantiene todas sus propiedades durante un periodo de tiempo limitado; se produce un rpido deterioro de los leucocitos de las plaquetas y de algunos factores de la coagulacin (sobre todo F.VIII). - Transporte => a una temperatura entre 2-6C; para la preparacin de plaquetas debe ser
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mantenida a 20C mediante placas de butanodiol. - Almacenamiento => a temperatura entre 2-6C; si el anticoagulante es CPD-A se conserva max 35 das - Indicaciones => dficit de glbulos rojos y dficit de volumen sanguneo Concentrado de hemates: - Se obtiene mediante la separacin del plasma de la sangre total, tras la sedimentacin espontanea de los hemates o la centrifugacin de la sangre total y tambin mediante un procedimiento de afresis. - Transporte => a una temperatura 2-6C - Almacenamiento => a temperatura entre 2-6C max 35 das - Indicaciones => la reposicin de hemates en casos de perdida de sangre; el tratamiento de las anemias. - Contra-indicaciones => aloinmunizacin contra Ags leucocitarios; intolerancia al plasma. Hemates lavados: - Es una suspensin de hemates obtenida a partir de una unidad de sangre total tras la separacin del plasma y el lavado con una solucin isotonica; objetivo => eliminar Acs que hayan en el superficie de los hemates. - Preparacin => se centrifuga la sangre total y se separa el plasma y la capa leucoplaquetaria; se procesa mediante la adicin secuencial de solucin salina isotnica (a +4C) y centrifugacin. - Transporte => a una temperatura 2-6 C - Almacenamiento => a temperatura entre 2-6C; si la preparacin se ha llevado a cabo a temperatura ambiente, el periodo de conservacin es de 6 horas como mximo y si se prepara a +4C, el periodo de conservacin es de 24 horas como mximo. - Indicaciones => sustitucin o reposicin de glbulos rojos en pacientes con Acs a protenas plasmaticas, especialmente anti-IgA; sustitucin o reposicin de glbulos rojos en pacientes que han mostrado reacciones alrgicas graves asociadas a la transfusin de productos sanguneos. Plaquetas : - Un concentrado de plaquetas se obtiene a partir de sangre total mediante centrifugacin de plasma rico en plaquetas o a partir de la capa leucoplaquetaria; para obtener una unidad estndar de plaquetas (manualmente) se debe partir de 4-6 unidades de sangre total; la concentracin de plaquetas en este componente ha de estar entre 45-85 x 10(9) plaquetas por 50-70 ml de plasma; el anticoagulante -conservante mas apropiado para las plaquetas es SAG-manitol. - Transporte => a temperatura igual que en el almacenamiento - Almacenamiento => a temperatura de 22C (+/- 2 C); garantizar la disponibilidad de oxigeno a las plaquetas (bolsas permeables a los gases); las plaquetas deben ser sometidas a una agitacin suficientemente eficaz y delicada; un volumen de plasma suficiente para garantizar pH entre 6,5-7,4; no se almacena mas de 5 das. - Indicaciones => trombocitopenia grave con hemorragias importantes y dficit de plaquetas (<50.000). Plaquetas - afresis - Es un concentrado de plaquetas obtenido por afresis, a partir de un donante unico, utilizando un equipo automatizado de separacin celular; una unidad estndar de plaquetas, lograda por afresis equivale a las plaquetas obtenidas a partir de 5 o mas unidades de sangre total; la maquina de afresis extrae sangre total del pacientes, recoge las plaquetas y devuelve los restantes componentes sanguneos al donante; el
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proceso de afresis incluye un paso adicional de centrifugacin o filtracin para reducir el numero de leucocitos contaminantes. - Transporte => a la misma temperatura que el almacenamiento - Almacenamiento => a una temperatura de 22C (+/- 2C); se debe garantizar la disponibilidad de O2 a las plaquetas (bolsas suficientemente permeables a los gases); las plaquetas deben ser sometidas a una agitacin suficientemente eficaz y delicada; un volumen de plasma suficiente para garantizar pH entre 6,5-7,4; no se almacena mas de 5 das. - Indicaciones => trombocitopenia grave con hemorragias importantes y dficit de plaquetas; con la afresis se reduce el riesgo de aloinmunizacin HLA y el riesgo de transmisin viral al disminuir el numero de donantes por unidad de plaquetas a 1. Plasma fresco congelado - Se obtiene (se separa) a partir de sangre total mediante centrifugacin intensa o de un PRP, antes de las 6 horas desde la extraccin y nunca tras 18horas; debe contener los niveles normales de albumina, inmunoglobulinas, factores de la coagulacion estables; tambin ha de contener como mnimo 70% de factor VIII y otros factores lbiles de la coagulacion; tambin se puede obtener plasma mediante procedimiento de afresis que dura 45' y con el se logra el equivalente a lo obtenido a partir de 3 unidades de sangre; la congelacin del plasma se debe realizar en 1 hora a una temperatura < -30C. - Transporte => mantener la temperatura de almacenamiento - Almacenamiento => es estable: 24 meses a < -40C; 12 meses => entre -30C y -40C; 6 meses => entre -25C y -30C; 3 meses =J> entre 18C y -25C. - Indicaciones => alteracin de la coagulacion sobre todo, cuando existe un dficit multiple de factores; tratamiento de la purpura trombtica trombocitopnica (PTT); grandes quemados; como materia prima para el fraccionamiento de los factores de coagulacion. Crioprecipitado: - Es la fraccin crioglobulnica del plasma con una porcin importante de factor VIII-C, factor Von Willebrand, fibringeno, Factor XIII y fibronectina; se obtiene a partir de plasma fresco congelado que se deja descongelar lentamente, a temperatura de 26C, despus se centrifuga y se recoge el Crioprecipitado con 7-10 ml de plasma sobrenadante; el producto obtenido se vuelve a congelar. - Transporte => mantener la temperatura de almacenamiento. - Almacenamiento => es estable: 24 meses a < -40C; 12 meses => entre -30C y -40C; 6 meses => entre -25C y -30C; 3 meses =J> entre 18C y -25C. - Indicaciones => coagulacion intravascular diseminada (CID), defectos del fibringeno; carencia de factor VIII. Granulocitos : - Es un componente compuesto por granulocitos suspendidos en plasma; se prepara mediante maquinas separadoras de clulas (leucofresis) tras ser obtenidos deben ser sometidos a una dosis adecuada de radiacin ionizante; - Transporte => mantener la temperatura de almacenamiento - Almacenamiento => no es apto para su almacenamiento y ha de ser transfundido lo antes posible, tas su recogida; si es inevitable, debe estar mximo 24 horas a 22+/-2C - Indicaciones => pacientes con neutropenia severa y sepsis (inmunodeficiencia) Clulas progenitoras hematopoyticas (CPH) - Son clulas pluripotentes /clulas madres (stemcells) con capacidad de autorenovacin, diferenciacin y maduracin hacia todas las estirpes hematopoyticas (en
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laboratorio especiales). - Se encuentra entre => las clulas de la MO; las clulas mononucleares de la sangre circulante /LUC; las clulas de la sangre del cordn umbilical. - Se reconocen por => formar colonias en cultivos celulares in vitro y poseer el marcador de membrana CD34. - Pueden proceder de => (1)- propio paciente (trasplante autlogo) mediante tcnicas de reduccin/ eliminacin de la contaminacin por clulas malignas; es necesaria la criopreservacin que se realiza de siguiente manera: - las clulas a trasplantar se suspenden en un medio proteico (una mezcla de plasma autlogo y albumina) que contiene el criopreotector; la suspensin de CPH se guarda en criobolsas y se congela en un dispositivo de nitrgeno liquido, en fase de vapor; a la hora de ser usados, se descongelan en un bao con agua a 37C y se transfunden inmediatamente. (2)- donante apropiado (trasplante algeno) => seleccin del donante tras tipaje completo HLA; someter el producto a tcnicas de reduccin/ eliminacin de la contaminacin por linfocitos T (minimizar el rechazo); se obtiene a partir de: - aspiracin MO, se filtra para retirar los fragmentos de hueso y se centrifuga para recoger una capa leucoplaquetaria de la que se aslan las CPH; - sangre perifrica => el donante ha de ser tratado previamente con factores de crecimiento y las CPH son recogidas, como clulas mononucleares, mediante citafresis; - cordn umbilical => se recogen como clulas mononucleares, a partir de sangre procedente de la vena del cordn umbilical. Almacenamiento => congelacin entre los -80 y los -196C Transporte => a una temperatura < -120C en un recipiente adecuado que contenga, claramente legible, la direccin del receptor del producto y las siguientes etiquetas: no pasar por rayos X; mantener congelado; material lbil de trasplante humano nico, transporte urgente. Indicaciones => aplasia del tejido hematopoytico debida a patologa primaria; una dosis elevada de quimioterapia y/o radioterapia; leucemias. Tipaje de la sangre y hemoderivados - Son fundamentales la determinacin del grupo ABO, Rh, prueba de Coombs directo y deteccin de Ac irregulares para reducir al mximo las reacciones post-transfusionales por incompatibilidad sangunea entre donante y receptor. Pruebas a hacer a todas las bolsas de sangre: 1. Grupo ABO, Ags he maticos y Acs plasmticos y de grupos sanguneos menores (se hace en paneles) 2. Determinacin del grupo Rh con fenotipo completo (el mas importante es anti-A y anti-B al 1/50 por debajo se puede donar). 3.a. Titulo de hemolisinas /Ac con capacidad de hemlisis a los donantes del grupo O. 3.b. Titulacin de aglutininas anti -A y anti-B a los donantes del grupo O. 4. Serologa de les / sfilis, hepatitis B, C, VIH, CMV, GPT. 5. Hemograma completo y un estndar de Bioqumica => glucosa, urea, creatinina. 6. Escrutinio de Ac irregulares (EAI) en el receptor (Rh grupo menor). 7. Pruebas cruzadas (PPCC) mayor => enfrentar hemates del donante con suero del receptor PPC menor => enfrentar hemates del receptor con plasma del donante (el contrario).

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Inmunohematologa y grupos sanguneos

Inmunohematologa - parte de la hematologa que se ocupa de las reacciones inmunolgicas relacionadas con todos los componentes de la sangre. Alo Ac => Acs que reconocen Ags que no pertenecen al individuo que los ha producido Auto-Ac => Acs que reaccionan contra Ags propios Iso Ac => Acs que reaccionan con Ags de los que carece el sujeto Iso Ag => Ags que los poseen todos los individuos de la misma especie (Agh) Alo Ag => Ags que solo los poseen algunos individuos (AgA o AgB del sistema ABO) Antgeno (Ag) o inmungeno - moleculas de gran tamao capaces de inducir una respuesta inmune, pudiendo reaccionar con los Ac formados; generalmente de estructura proteica o glucoproteica, con varios eptopes o fragmentos que son reconocidos por los Acs. Anticuerpo (Ac) o inmunoglobulinas - glucoprotenas que forma el organismo como respuesta al contacto con un Ag y que reaccionan especficamente contra el; en la electroforesis migran junto a otras globulinas; formadas por 4 cadenas polipeptdica (2 ligeras y 2 pesadas) unidas entre si por enlaces covalentes y puentes disulfuro intercatenarios; las variaciones (isotpicas) de las cadenas pesadas dan lugar a los 5 tipos de Ig (IgG - IgM - IgA - IgD - IgE); tambin hay 2 isotipos de cadena ligeras Kappa y Lambda que pueden estar asociadas a cualquiera de los isotipos de las cadenas pesadas; los Ac se sintetiza en el linfocitos B que al entrar en contacto con el Ag se activan transformndose en clulas plasmaticas (productoras de Ac). Reaccin Ag-Ac => Ac en contacto con Ag (in vivo o in vitro) => forma el complejo AgAc (una unin no covalente y reversible) => hemlisis y aglutinacin. Hemlisis => destruccin de los hemates por la unin de Ag con Ac en presencia del complemento (sangre roja => rosada) Aglutinacin => agrupamiento de una suspensin de partculas al reaccionar el Ag presente en la superficie de estas con sus Ac especficos; in vivo estas partculas son hemates; in vitro pueden ser hemates o partculas inertes (sangre roja => se forman grupitos / grumitos) Grupos sanguineos - conjunto de sustancias de naturaleza protenica compleja que se encuentran, fundamentalmente, en la membrana de las clulas hemticas con carcter antignico => existen Ac contra ellos; cada individuo posee unos determinados Ags que le son transmitidos genticamente segn las leyes de Mendel; sistema de grupo sanguneo son alotpicos (propios de un grupo de individuos dentro de una especie, permanecen estables y constantes toda la vida); su importancia en medicina legal => identificar o excluir a un individuo en pruebas de paternidad y en actos delictivos con manchas de sangre o secreciones (saliva y semen). Los Acs capaces de reaccionar con estos Ags son de procedencias natural o adquirida por inmunidad; Ac naturales => inmunoglobulinas que aparecen independientemente de cualquier tipo de estimulacin y generalmente son IgM (aglutininas completas por su gran tamao no atraviesan la barrera placentaria); Los IgM que reaccionan entre 4-20C tienen escasa importancia clnica, pero tambin las hay que reaccionan a 37C que pueden ocasionar complicaciones (e.j. IgM anti-A o anti-B). Ac inmunes => aparecen despus de una estimulacin antigenica, y suelen ser IgG (aglutininas incompletas o bloqueantes, de menor tamao y atraviesan sin dificultad la barrera placentaria, no provocan hemlisis / aglutinacin. Ac completos IgM => son multivalentes, capaces de formar puentes entre 2 o mas hemates para dar lugar a la aglutinacin, tambin son capaces de fijar al complemento con lo que tambin puede provocar hemlisis intravascular;
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Ac incompletos IgG => son bivalentes y solo son bloqueantes, no generan hemlisis intravascular rpida como los completos, sino que es extra vascular, destruyendo los hemates sensibilizados en el bazo y higado por el sistema mononuclear fagoctico. Grupos sanguneos eritrocitarios Ags eritrocitarios - la mayor parte estn presentes en la membrana de los hemates (mosaico fluido compuesto por doble capa lipdica donde se insertan protenas globulares de tamao variable; algunos estn sintetizados por clulas mucosas en forma de glucoprotenas se encuentran en el plasma y secreciones; cada uno de estos Ags eritrocitarios es producto de un gen, expresado directamente (sistema Rh) o indirectamente (sistema ABO). Acs eritrocitarios - suelen ser del tipo IgG e IgM y alguna vez IgA y son de procedencia natural o adquirida; hetero Acs => proceden otras especies animales o vegetales; alo Acs => proceden de la misma especie pero de distintos individuos; Iso Acs => Acs que reaccionan con Ags de los que carece el sujeto; Auto Acs => Acs que reaccionan con Ags presentes en los propios hemates del individuo; Acs regulares => presentes siempre aunque no existe el Ags correspondiente; Acs irregulares => no siempre se encuentran en ausencia del Ags; Acs aglutinantes (completos) => no hace falta modificar el medio in vitro para que se produzca la aglutinacin; Acs sensibilizantes/ bloqueantes (incompletos) => se necesita modificar el potencial zeta eritrocitario para que puedan aglutinar; Patologas relacionadas con los grupos sanguneos eritrocitarios - los principales son: - Reacciones hemolticas postransfusionales => se producen al reaccionar los Acs presentes en el suero del receptor con los Ags de los hemates del donante; pueden serinmediata o retardada y segn su gravedad => hemoltica moderada o cuadro de shock con fracaso renal; - Enfermedad hemoltica del recin nacido (EHRN) => una inmunizacin de la madre frente a los hemates del feto; puede ocurre en el curso de un embarazo, parto, o aborto; los Acs (IgG) son capaces de atravesar la barrera placentaria y producen hemlisis en el feto con mayor o menor gravedad clinica segn la intensidad de la inmunizacin. - Anemia hemoltica autoinmune => el individuo genera Acs frente a sus propios Ags de la membrana de sus propios hemates que produce hemlisis. Grupos sanguneos leucocitarios son grupo de molcula (protenas) con carcter antignico que se encuentran en la superficie de los leucocitos; no se determinan en la practica diaria transfusional, pero sien los trasplantes de rganos y tejidos y en las pruebas de identificacin de individuos (pruebas de paternidad). Ags leucocitarios - algunos estn presentes en la membrana leucocitaria y otros en clulas y tejidos (conforman el sistema HLA - Human Leucocyte Antigens o Ags de histocompatibilidad); su sntesis esta codificada por genes que se encuentran en el brazo corto de cromosoma 6; es muy importante para realizar un trasplante de tejidos=> los injertos de tejido HLA idnticos son aceptados con mayor facilidad y requieren menor cantidad de frmacos inmunosupresores para impedir el rechazo; existe 3 clases : - Molculas de clase I: glucoprotenas localizadas en la membrana plasmtica de todas las clulas nucleadas del organismo (excepto las del sistema nervioso) => se domina A, B, C. - Molculas de clase II: glucoprotenas formadas por 2 cadenas alfa y beta unidas de mono no covalente localizadas en la membrana celular de los linfocitos B, monocitos y
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precursores eritrocitarios => se domina seri D: DP, DQ, DR. - Molculas de clase III: protenas que forman parte del sistema del complemento => C4, C2 y factor B. Grupos sanguneos plaquetarios - Ags presentes en la membrana de las plaquetas; pertenecientes al sistema HLA; los mas importantes => PLA, PLE, Ko, DUZO y Bak.

Sistema ABO
Descubierto por Karl Landsteiner en 1900. Distribucin geogrfica del grupo ABO => Espaa O-47%, A-40%, B-8%, AB-5%; en la raza blanca predominante A-44%, O-43%, B-9%, AB-4%; en la raza negra O-48%, A-27%, B-21%, Ab-4%. Ags del sistema ABO (Ag A + Ag B) - estn ampliamente distribuidos no solo en los hemates sino tambin en las clulas epiteliales, secreciones, endoteliales; establecen 4 grupos sanguneos (uno de ellos, ambos o ninguno); determinada genticamente y se hereda segn las leyes de Mendel; su sntesis esta codificada por genes ABO en el cromosoma 9 => existe genotipo AA, AB, BB, AO, BO, OO que origina fenotipos de grupo sanguneo A, B, AB, O. Grupo sanguneo ABO comienzan a formarse en el 3er mes de gestacin, pero no adquieren su plena competencia inmungena hasta los 18-22 semanas tras el parto, esto se debe a que en numero de veces que se replica el Ags en la membrana del hemate, al principio es reducido y luego va aumentando hasta repetirse 1 milln de veces; los Acs no se encuentran totalmente desarrollados en el recin nacido; los Acs naturales aparecen a los 2/3 meses del nacimiento, estando totalmente establecidos aproximadamente hacia los 10 aos.

Estos genes productores de Ag estn relacionados con el sistema Hh con 2 alelos; el gen H es mas frecuente (esta situado en la cromosoma 19) en la poblacin mundial y el gen h, amorfo o nulo. En la membrana de los hemates existen 2 sustancias precursoras => la I y II; la sustancia II (cadenas de oligosacridos) independientes o que forman parte de las glucoprotenas/ glucolpidos de los hemates es la sustancia precursora sobre la que actuaran los genes que conforman sistema ABO. Los genotipos HH y Hh son capaces de sintetizar una enzima transferasas, formando as la sustancia H; su relacin con sistema ABO => - El gen A codifica la sntesis de otra enzima transferasa + sust. H => se transforma en sust. A (Ag A) - El gen B codifica la sntesis de otra transferasa + sustancia H => se transforma en sustancia B (Ag B)
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- El gen O es amorfo/ nulo no codifica transferasas y no altera la estructura de la sustancia H. Resumen => existen moleculas de glucolpidos sobre la membrana de los hemates que tienen una cadena de oligosacridos en su superficie (sustancia II); segn cual sea el azucar en su extremo terminal tendremos sustancia H, sustancia A o sustancia B; tener en cuenta que no toda la sustancia H se transforma en A o B, por lo que siempre encontraremos sustancia H en los hemates; por tanto, existen sustancias en hemates H, HyA, HyB, HAyB => grupo sanguneo O, A, B y AB. Los individuos con genotipo hh (nulo) son incapaces de producir sustancia H; sus hemates carecen de Ags del sistema ABO aunque en su dotacin gentica existe los genes A y B => grupo Bombay (1er sitio donde se descubri); este grupo tiene una frecuencia muy baja; estos individuos tienen Acs anti-H, anti-A y anti-B de modo natural; los Acs de este grupo son muy activos a 37 y hemolisan cualquier hemates que no sean del grupo Bombay(solo se transfunden de su grupo). El gen A tiene 2 alelos A1 y A2 => 80% de las personas del grupo A son A1 y 20% son A2; existen mas variacin del gen A y tambin hay variacin del gen B (A1, A2, Ax, Am); el grupo AB tambin tienen 2 sub grupos (A1B y A2B); hay que tener cuidado con A2B porque a su vez como el Ag A2 es dbil podemos catalogar-les como solo del grupo B. Sistema secretor - existe un gen secretor (Se) que da lugar a las mismas sustancias antignicas que hay en los hemates; los individuos con genotipo SeSe y Sese (80%) presentaran sustancias H, A y/o B en las secreciones (semen o saliva); los homocigotos sese (el gen se es nulo /amorfo) no las tendrn; este sistema es importante cuando la deteccin del grupo srico y hemtico no es concluyente. Acs del sistema ABO - son Acs naturales (no puede precisarse que Ag lo desencadena); son regulares (aparecen siempre); actan entre los 4-37C y son capaces de activar al complemento y de provocar hemlisis intravascular al primer contacto; otros sistemas de grupo sanguneo debe producirse una inmunizacin previa, por embarazo o transfusin, para que se formen en el organismo los Acs frente a los nuevos Ags; los Acs del sistema ABOsuelen ser del tipo IgG e IgM (el IgG sobre todo se encuentran de manera natural en el grupo O y puede provocar enfermedades hemoltica del recin nacido (HRN) por incompatibilidad materna-fetal de madre grupo O con hijos de grupo A, B o AB); IgG =>bivalente, bloqueante, temperatura optima de reaccin 37C, atraviesa la placenta; IgM => multivalentes, aglutinante, temperatura optima de reaccin 4C, no atraviesa la placenta.

Ademas de estos Ac, se puede encontrar un Ac anti-H en los individuos de los grupos A1,
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b o A1B; pero es un Ac dbil y tiene poca significacin clnica; si es importante el Ac antiH que en los del grupo Bombay, ya que puede dar lugar a hemlisis y aglutinacin eritrocitaria (son muy activos a 37C); en las personas del grupo O se encuentra Acs anti-A1B, anti-A y anti-B individualizados => son muy tiles para detectar Ags A y B dbiles. Ac anti-A1 se encuentra 1-2% de los individuos A2 y en un 25% delos individuos A2B (normalmente no tiene significacin clnica). Practica LV - Determinacin celular en porta Fundamento - la deteccin celular del grupo ABO mediante una tecnica en porta; los hematies problema, que contienen sustancias antignicas (aglutinogenos) del sistema ABO, se enfrentan con anti-sueros (algutininas) dirigidos contra esos Ags; el resultado final consiste en la aglutinacion directa de los eritrocitos cuando reaccionan contra el antisuero que les corresponde; es importante mencionar que todas estas determinacin deben hacerse a temperatura ambiente, ya que la aplicacion de calor puede afectar a los hemates impidiendo observar una posible aglutinacin; observaremos la aglutinacin de los hemates enfrentados a una serie de anti-sueros conocidos y de reconocida eficacia para determinar el grupo ABO del individuo. Material - portaobjetos o tarjeta visualizadora de fondo blanco; rotulador de vidrio; pipeta pasteur desechable; palillos mezcladores; un reloj; reactivos => suero anti-A (azul); suero anti-B (amarillo); suero anti-AB (transparente); suero anti-A1/anti-H (transparente); albumina bovina como control negativo; muestra => sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA. Tcnica - dividir 2 portaobjetos en dos secciones cada uno con el rotulador de vidrio, marcar letra A, en otra con letra B, siguiente con letra AB y al final con letra A1/H; depositar una gota de cada suero en cada secciones correspondientes; situar una pequea gota de sangre (la mitad del volumen usado de anti-suero junto a la gota de anti-suero; mezclar ambas gotas en cada seccin utilizando un palillo distinto den cada una de ellas, formando un circulo de 2-2,5 cm de dimetro; hacer oscilar suavemente el portaobjetos hacia delante y hacia detrs durante unos segundos, observa la presencia o ausencia de aglutinacin. Lectura de resultados - hay aglutinacin cuando aparecen unos grumos rojos que flotan en un liquido claro; en el caso contrario, los hemates permanecen en forma de suspensin homognea de color rojizo; la presencia o ausencia de aglutinacin puede confirmarse mediante examen microscpico de las mezclas;

Practica LVI - Determinacin celular en tubo

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Fundamento - los hemates problema contienen las sustancias antignicas del sistema ABO y se enfrentan a sueros conocidos que poseen Acs frente a esos Ags; el resultado final es la presencia o no de aglutinacin en los hemates reaccionantes. Material - tubos de centrifuga / hemlisis, rotulador de vidrio, pipetas Pasteur, centrifuga, gradillas; reactivos => suero anti-A, anti-B, anti-AB, anti-A1/H, albumina bovina como control (albumina + hemates => negativo = no debe aglutinarse); muestra => sangre total anti-coagulada (botn de hemates) Tcnica - lavado de los hemates problema => en cada uno de los 4 tubos verter 3 gotas de la muestra de sangre (150 lambdas) + solucin salina para completar el tubo, agitar y centrifugar 1' a 3000 rpm, decantamos el sobrenadante (repetir 3x); a los hemates de los tubos aadimos solucin salida para obtener una suspensin al 2% o dejarlos como un botn de hemates; rotular 4 tubos de ensayo con letras A, B, AB y A1/H; aadir a cada tubo 2 gotas de suero anti-A en el tubo A, 2 gotas de anti-B en el tubo B, 2 gotas de anti-AB en el tubo AB y 2 gotas de anti-A1/H en el tubo A1/H; centrifugar 1' a 1000 rpm o 30" a 3.400 rpm (centrifuga de inmunohematologa). Lectura de resultados - despus de centrifugar, golpeamos suavemente el fondo de cada tubo para desprender el sedimento y observar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin; reaccin negativa => los hemates se resuspenden homogeneamente; reaccin positiva => se observa un botn de hemates que permanecen unidos una vez desprendido el sedimento. Interpretacin clnica de los resultados - 2 fenmenos que se pueden evitar con el lavado previo de los hemates problema: aglutinacin no especifica => se debe a la presencia de acido hialurnico en la sangre, procedente de la gelatina de Wharton del cordn umbilical, y se elimina aadiendo una gota de hialuronidasa a la suspensin de hemates; fenmeno de Rouleaux => agrupacin no especifica de hemates que adoptan una imagen de pilas de monedas; las sustancias que mas frecuentemente originan este fenmeno => el fibringeno, las gammaglobulinas, el dextrano y la polivinilpirrolidona.

Sistema Rh
Se descubri 40 aos mas tarde que el sistema ABO por 2 investigaciones independientes => por un lado Levine y Stetson en 1939 y mas tarde por Landsteiner y Wiener en 1940 que trabajaron con los monos; el 1er Ag humano del sistema Rh que se descubri es el D; los individuos que poseen este Ag en la superficie de los hemates => Rh+ y aquellos que no lo poseen => Rh-; existen 2 teoras acerca de la herencia del sistema Rh: Teora de Fisher-Race (inglesa) - Fisher, trabajando con los datos serolgicos de Race, postulo la existencia de 3 locus/loci muy cercanos entre si en el cromosoma 1 que se transmiten conjuntamente; estos locus se denominaron D, C y E y cada uno de ellos tiene 1 alelo denominado d, e y e; el gen en cada locus da lugar a la produccin de un Ag en la superficie del hemate; el gen d es silencioso o nulo y no da lugar a la formacin de ningn Ag (no se ha encontrado el Ac contra el Ag d); genotipo de DCE/dce => fenotipo (Ag) de DCE/ce; Nomenclatura del sistema Rh de Fisher-Race - 3 loci del cromosoma => D, C y E y sus alelos => d, c y e; en cada gen hay 2 posibles alelos => Dd, Cc, Ee; sin embargo, al referirnos a su fenotipo (los Ags presentes en los hemates), no se menciona la letra d, ya que es un gen nulo que no da lugar a ningn Ag; el Ag D es el mas antignico de los 5,
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luego C (20x menos que el D), E, e, c; ejemplos : Genotipo DCe/dce => fenotipo DCcee => Rh+ Genotipo dCE/dCE => fenotipo CECE => RhTeora de Wiener (americana) - Wiener propuso un modelo gentico diferente, en el que, en lugar de existir 3 loci separados, hay una sola regin gentica en el cromosoma 1 con muchos alelos codominantes; alelo => una forma de gen que ocupa el mismo locus/ lugar en un determinado cromosoma => genes gemelos que proviene 1 de madre y otra del padre , ocupa el mismo lugar en cada cromosoma; cada uno de estos alelos es responsable de la produccin de un Ag en la superficie del hemate, que a su vez posee varios determinantes antignicas reconocidos por Acs especficos.

Ags del sistema Rh - no esta bien definido su proceso de formacin, parece ser que sobre una sustancia precursora, actuaran las enzimas controlado genticamente, que daran lugar a los Ag del sistema; se considera que son lipoprotena presentes en la membrana eritrocitaria y puede participar en el funcionamiento de esta membrana, ya que los individuos que no poseen Ags Rh en los hemates presentan anemia hemoltica por fragilidad de los eritrocitos; estos Ags no aparecen en otras clulas o secreciones; la complejidad del sistema Rh => gran polimorfismo de sus Ags (mltiples variantes de los Ags correspondientes a los locus D, C y E; la mayora de estas variantes son muy poco frecuentes; los que tienen inters en la practica clnica: Ag Du - es un alelo dbil del Ag D, que se pone manifiesto usando Ac anti-D mas potentes que los habituales o mediante tcnicas que facilitan la aglutinacin de los hemates previamente sensibilizados (prueba de Coombs); importante => un donante Du+ puede sensibilizar a un receptor D-; si no se detecta en la sangre del donante, la clasificaremos errneamente como Rh negativo; a todos Rh- hay que hacer prueba de Coombs, para asegurar si tiene Ag Du que se comporta como Rh- => como donante acta Rh+, como receptor acta Rh-, as que hay que donarle siempre Rh-, si no se producir Ac anti-D. Ags D parciales - Ag D es un mosaico de subunidades que se encuentra presente en su totalidad o ausente si el paciente es Rh-; en ocasiones, una persona es D positivo, pero le falta alguna parte de ese mosaico => se inmuniza contra esa parte en caso de recibir una transfusin o por contacto feto-materno => se producirn Acs capaces de reaccionar
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contra los hemates del donante y dar falsa impresin de auto-anticuerpo anti-D. Ac del sistema Rh - a diferencia del sistema ABO, los Acs que se producen frente a los Ags del sistema Rh son de carcter inmune (necesita una estimulacin revia para su aparicin en la sangre) por transfusin o por contacto feto-materno; suelen ser tipo IgG y se empleapara su deteccin la prueba de la anti-globulina humana (test de Coombs)debido a que reaccionan mejor en medio albuminoso; tambin se emplea enzimas, como la papaina, ficina y tripsina para favorecer la aglutinacin de los hemates con los anti-sueros anti-Rh; Ag con mayor poder inmungeno es el D y encontraremos con mayor frecuencia el Ac antiD, aunque tambin tienen importancia los otros Acs (Ac anti-e suele estar implicado en la mayor parte de los casos de anemia hemoltica autoinmune). Practica LIX - Determinacin del grupo Rh en porta Fundamento - podemos determinar el grupo Rh tanto en porta como en tubo; en la prueba en porta, la aglutinacin se favorece por el calor, de manera que es necesario disponer de un visualizador que permita tanto calentar el porta como observar mejor el resultado de la reaccin (porque IgG reacciona en una temperatura 37C); la tcnica esta basada en la deteccin del Ag D sobre la superficie de los hemates problema, empleando como reactivo un suero monoclonal humano que contiene Acs anti-D; en el caso de que los hemates contengan el Ag D, se producir una aglutinacin que puede observarse a simple vista; Material - portaobjetos, pipetas Pasteur, rotulador de vidrio, palillos agitadores, visualizador luminoso; reactivos => suero anti-D, albumina bovina al 30% como control negativo;muestra => sangre total anti-coagulada con EDTA. Tcnica - dividir el portaobjetos en 2 secciones con el rotulador de vidrio y marcar una con letra S (suero) y otra con letra A (albumina); en la seccin S colocamos 1 gota del suero anti-D, y en la seccin A ponemos 1 gota de albumina bovina; depositamos 1 gota de sangre en cada una de las secciones y mezclamos con palillos distintos; colocamos el porta sobre el visualizador previamente calentado, y lo balanceamos para favorecer la mezcla de sangre y reactivos; Lectura de resultados - esperamos unos segundos antes de dar el resultado de la prueba; aglutinacin positiva => aparicin de grumos rojos sobre un fondo claro (no confundir con pequeos cogulos de fibrina presentes en la muestra / puntitos finos); aglutinacin negativa => la mezcla da lugar a una suspensin homogenea de los hemates; la mezcla de sangre con albumina bovina debe dar siempre aglutinacin negativa. Practica LX - Determinacin del grupo Rh en tubo Fundamento - para esta tcnica, empleamos unos sueros anti-D que pueden ser de 2 tipos: salino o albuminoideo (son mas utilizados - preparados en medio enriquecido con albumina) porque favorece aglutinacin los hemates pueden revestirse in vivo de Ac o protenas plasmticas anormales y en presencia de albumina producir una agregacin que dara la idea de una aglutinacin positiva; por ello empleamos un control de albumina, de manera que si aparece aglutinacin en este tubo debemos repetir la prueba, pero usando un suero anti-D en medio salio o haciendo lavado de hemates; intentamos poner de manifiesto la presencia del Ag D en la superficie de los hemates mediante su enfrentamiento a un suero anti-D; Material - tubo de hemlisis, rotulador de vidrio, gradilla, pipetas Pasteur,
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centrifuga;reactivos => suero anti-D, albumina bovina al 30%, solucin salina fisiolgica (0,9%);muestra => suspensin de hemates o botn de hem ates preparado (que se obtiene a traves de lavado de hemates) Tcnica - rotulamos 2 tubos limpios con letras D y A; en el tubo D aadimos 2 gotas de suero anti-D y el tubo A ponemos 2 gotas de albumina bovina al 30%; a cada tubo le aadimos 1 gota de la suspensin de hemates a 5% o el botn de hemates; se agita suavemente para mezclar; centrifuga 1' a 3000 rpm o 30" a 3.500 rpm. Lectura de resultados - con el pulpejo de los dedos medio y anular golpeamos suavemente el fondo de los tubos para despegar el botn hemtico; se considera aglutinacin positiva si se forman grumos de color rojo en un liquido claro; por el contrario, si se resuspenden homogneamente los hemates, decimos que la aglutinacin es negativa; el tubo con albumina es un control negativo => debe dar siempre ausencia de aglutinacin, sino la prueba no es valido. Interpretacin clnica de los resultados obtenidos - si el tubo D presenta aglutinacin y el tubo A no, decimos que el paciente es Rh positivo; si no se produce aglutinacin en ninguno de los dos tubos procedemos a incubar ambos a 37C durante media hora; posteriormente centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto y observamos si existe o no aglutinacin; en el caso de persistir negativo, comprobaremos que el paciente no posee un Du (D dbil) mediante la prueba de Coombs indirecta); despus de todos estos pasos, si el resultado es la no aglutinacin, informaremos que el paciente es Rh-. Practica LXII - Determinacin de un Du Introduccin - en algunos casos, los Acs tipo IgG (incompletos) son incapaces de producir la aglutinacin de los hemates por si solos; pero si, de adherirse a su superficie tanto in vivo como in vitro y decimos que han sensibilizado a los hemates; tambin son capaces de fijar el complemento, sin llegar a producir la hemlisis de los eritrocitos; estos Acs tipo IgG pueden reaccionar con un suero de conejo en el que existen Acs anti-globulina humana del tipo IgM (completos); el resultado de esta reaccin es una aglutinacin de los hemates; este suero anti-globulina humana es lo que llamamos suero de Coombs, puede ser de 2 tipos : - poliespecfico => si esta dirigido contra la IgG y contra el componente C3d del complemento. - monoespecfico => si esta dirigido solo contra la IgG o solo contra alguno de los componentes del complemento; La prueba de Coombs o de la anti-globulina humana puede realizarse de 2 modos: - prueba directa => intentamos detectar Acs incompletos que han sensibilizado a los hemates in vivo; para esto los enfrentamos directamente al suero de Coombs y observamos si existe o no, aglutinacin; - prueba indirecta (PAI) => se realiza el paso previo (la sensibilizacin) de los eritrocitos in vitro, para posteriormente hacerlos reaccionar con el suero de Coombs; buscamos Acs incompletos libres en el suero o poner de manifiesto la presencia de Ags dbiles en la membrana de los hemates Fundamento - el Du es un Ag D dbil que no pone de manifiesto en las pruebas normales de determinacin de Rh; por ello debemos sensibilizar previamente los hemates problema con un suero que contiene Acs anti-D y posteriormente enfrentarlos al suero de Coombs; si existe el Ag Du en la superficie de los eritrocitos, se producir la unin de los Acs anti-D a sus receptores de membrana y en la segunda fase darn lugar a la aglutinacin en presencia del suero anti-globulina humana (es una prueba de Coombs indirecta)

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Material - tubo de hemlisis, centrifuga, pipetas Pasteur, gradilla, bao de agua, reloj;reactivos => suero anti-D humano, suero anti-globulina humana de conejo (suero de Coombs) - color verde, solucin salina fisiolgica; muestra => hemates de sangre problema previamente lavados 3 x en solucin salina fisiolgica y suspendidos al 5% en dicha solucin o botn de hemates. Tcnica - en tubo de hemlisis colocamos 2 gota de suero anti-D y 1 gota de botn de hemates; mezclamos suavemente e incubamos a 37C durante 30'45'; despus de incubar, lavamos los hemates en solucin salina fisiolgica 3x consecutivas; aadimos sobre el sedimento hemtico 2 gotas de suero de Coombs y mezclamos suavemente; centrifugar el tubo 1000 rpm durante 1'. Lectura de resultados - observamos la aparicin o no de aglutinacin, mediante golpes suaves en el fondo del tubo; en caso de duda, observamos al microscopio entre porta y cubre con el objetivo de 40x; Interpretacin clnica de los resultados obtenidos - si existe aglutinacin, el resultado es +, indica que en la membrana de los hemates hay Ag Du y se clasifica la sangre como Rh+ variante Du; en el caso de no existir aglutinacin se clasificara la sangre como Rh-;

Otros sistemas de grupo sanguneo

Se conocen mas de 600 Ags agrupados en 21 sistemas / grupos, la mayora de estos grupos se encuentran en todas las personas, aunque hay algunos que solo existe en algunas personas; estos Ags, eritrocitarios o no, capaces de producir Acs especficos que tienen cierta importancia en las reacciones transfusionales.

Sistema Kell - Estos Ags estn presentes en un gran numero de personas de raza blanca y aquellos individuos que no poseen ninguno de sus Ags suelen presentar anomalas morfolgicas acompaadas de anemia hemoltica en bajo grado; los Acs son capaces de producir la enfermedad hemoltica del recin nacido; Sistema Duffy - los genes de este sistema se encuentran localizadas en el cromosoma 1; su presencia en los individuos negros se ha relacionado con su resistencia natural a contraer el paludismo; esto parece indicar que los Ags del sistema Duffy son los receptores para el plasmodium o que al menos contribuyen a la infeccin; los Acs que se forman contra los antgenos del sistema Duffy tienen poco inters transfusional, ya que los Ags tienen poco poder inmungeno; Sistema Lutheran
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Sistema Kidd Sistema MNSs - se considera que este sistema consta de 2 loci en el cromosoma, y posee cuatro alelos => M, N, S y s que tienen inters transfusional y su importancia radica en su relacin con la estructura de la membrana eritrocitaria; los Acs formados contra los Ags de este sistema pueden ser naturales o inmunes; los mas interesantes son los anti-M inmunes, que son del tipo IgM y a 37C pueden activarse dando lugar a reacciones transfusionales; son muy poco frecuentes en la poblacin; Sistema Lewis - fue descubierto 1946 y esta muy relacionados con sistema ABO; sus Ags tienen la misma sustancia precursora tipo I del sistema ABO en las secreciones, ya que en la formacin de los Ag de este sistema, interviene el gen secretor Se del sistema ABO; los Ags de este sistema no se encuentran en la membrana del hemate por ser sintetizados en los precursores hemticos, sino que estn en el plasma y de ah se incorporan a la membrana eritrocitaria; tambin encontramos sustancias de este sistema en la saliva aunque su composicin bioqumica no es exactamente igual; los Acs anti-Lewis pueden ser naturales que actan a 22C (tipo IgM por ello no atraviesan la placenta) y no intervienen en las reacciones transfusionales; sin embargo, si existen algunos activos a 37C que pueden tener poder hemolizante. Sistema Ii - el inters de estos Ags no es transfusional, sino que se ha observado un aumento del Ag i en hemopatas malignas, acompaado de una disminucin del Ag I. Sistema P - tienen poco inters transfusional Sistema Xg => el nico inters en que su gen se encuentra localizado en el cromosoma X. Practica LXIII - Deteccin de Acs irregulares Introduccin - Acs irregulares => se producen frente a Ags distintos a los del sistema ABO; generalmente aparecen por una inmunizacin, transfusional o fetomaterna y pueden producir reacciones postransfusionales; la identificacin de los Acs irregulares es de gran importancia en el diagnostico y tratamiento de la enfermedad hemoltica del recin nacido y de ciertos trastornos hemticos, as como en la prevencin de reacciones transfusionales y en estudios durante el embarazo; la deteccin de los Acs se realiza enfrentando el suero del paciente a una serie de hemates tipado (como reactivos), de los cuales se conocen con exactitud los Ags presentes en su membrana; el resultado positivo => la aglutinacin de los hemates; se puede llevar a cabo mediante 3 tipos de tecnicas: test de Coombs indirecto; tcnica enzimtica; tcnica a 4C; - Test de Coombs indirecto => incubacin previa del suero y los hemates tipados para conseguir la sensibilizacin de estos hemates, es decir que los Acs presentes en el suero se adhieran a la superficie eritrocitaria; posteriormente se aade el suero de Coombs (antiglobulina humana) para poner de manifiesto la presencia o no de esos Acs mediante la aglutinacin de los hemates. - Tcnica enzimtica => tratar previamente los hemates tipados con una enzima, para facilitar la aglutinacin de los hemates; se suelen emplear la tripsina, papaina, ficina o bromelina (porque agrupa a los otros Ags de los hemates y disminuye la carga (-) superficial de los mismos). - Tcnica a 4C (detectar las crioaglutininas o Acs que reaccionan mejor a baja temperatura) => incubar el suero y los hemates a 4C para posteriormente centrifugar y observar la presencia o no de aglutinacin; Se recomienda utilizar al menos 2 de estas tcnicas para obtener buenos resultados en la deteccin de Acs irregulares.
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Metdica - la tcnica se desarrolla con el empleo de un panel de hemates humanos pertenecientes a una casa comercial (no tenemos); el panel de hemates consiste en una suspensin al 0,8% de hemates de grupo O tanto +como-, procedentes de 11 donantes distintos; estos hemates difieren en su configuracin antignica y son elegidos para contribuir a la identificacin de la mayora de Acs con significacin clnica que aparecen con mas frecuencia; un Ac reaccionara de forma especifica con el antgeno dque estimulo su produccin; de esta manera, el Ac podr identificarse segn su esquema de reactividad frente a un panel de eritrocitos de configuracin antignica conocida; mediante un test de Coombs indirecta pondremos en evidencia la existencia o no de Acs irregulares en el suero del paciente. Como se har en clase: Material - tubos de hemlisis, gradilla, rotulador de vidrio, centrifuga, micropipeta, pipeta de Pasteur, bao de agua; reactivos => sangre/botn hematies O Rh+ lavados; sangre/botn de hemates del paciente Rh- para autocontrol, solucin salina fisiolgica al 0,9% (SSF); muestra => plasma/suero fresco (PR) Rh- procedente de sangre anticoagulada con EDTA; Tcnica - lavar los hemates del paciente (Rh-) y obtener un botn para el tubo autocontrol; rotular el tubo PR y dispensar 1 gota (50 lambdas) de hemates Rh+ lavados; aadir 2 gotas del suero/plasma PR al tubo PR y 2 gotas al autocontrol; incubar 60' a 37C en bao de agua; lavar 3x con SSF y dejar el botn (en cada tubo); aadir 1 gota de suero de Coombs; centrifugar 1' a 1000 rpm. Lectura de resultados - con el pulpejo de los dedos, soltar el botn y observar la presencia o no de aglutinacin; el autocontrol ha de ser siempre (-).

Reacciones transfusionales
Terapia transfusional /transfusin sangunea - implica riesgo a pesar de las precauciones que se toman, aun existe la posibilidad de efectos indeseables que en algunos casos son fatales; normalmente en la transfusin se utilizan los componentes sanguneos obtenidos mediante fraccionamiento, para disminuir el riesgo de reacciones adversas debido a la presencia de Acs del donante o por sobrecarga circulatoria; una transfusin sangunea esta
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indicada cuando Hb es < de 8 g/dl o HCT es < o = al 20%. Componentes sanguneos: - concentrado de hemates - concentrado de plaquetas - plasma fresco congelado - crioprecipitado - albumina y fraccin proteica del plasma (FPP) - otros hemoderivados (los factores de coagulacion) => F VIII, F IX, Inmunoglobulinas, Antitrombina III y Fibringeno Administracin del hemoderivado - medidas de seguridad imprescindibles : - Comprobar la identidad del paciente => preguntar al paciente su nombre y fecha de nacimiento o leyendo datos en la pulsera identificativa que lleva. - Comprobar la coincidencia entre el grupo sanguneo del paciente y el indicado en la etiqueta de la unidad de sangre. - Comprobar que la fecha de caducidad de la unidad de sangre no ha sido excedida. - La transfusin rpida de sangre fra puede ser en si misma peligrosa, por lo que se debe controlar cualquier aparato destinado a calentar la sangre. - No debe aadirse ningn frmaco o solucin teraputica a la sangre, a menos que se haya demostrado que la adicin no produce daos en los componentes sanguneos. No deben aadirse a la sangre soluciones de calcio o glucosa concentrada. Una vez comprobados estos datos, el ATS que realiza la transfusin tomara las constantes vitales del paciente y proceder a la transfusin, observando al paciente durante los primeros 5-10 minutos, por si aparecen reacciones adversas; la duracin normal es de 90 minutos; un sistema de transfusin no debe utilizarse > de 6 horas; todos los hemoderivados se deben administrar con filtros que retienen los macroagregados; Reacciones transfusionales - efectos no deseables que pueden aparecer en el paciente durante o despus de la transfusin; suelen manifestarse con dolor de espalda, escalofros, fiebre, dificultades respiratorias, hipotensin e incluso shock; implican una suspensin de la transfusin y una comprobacin de la compatibilidad y la ausencia de contaminacin bacteriana; pueden ser inmediatas o retardadas (despus de das, semanas o meses de la transfusin); pueden ser inmunolgicas o no inmunolgicas: Reacciones inmunolgicas: - Reacciones hemolticas (error importante de grupos sanguneos) => hemlisis o destruccin de los hemates del donante por los Acs del receptor; la gravedad mas o menos segn el tipo de Acs; el mas grave cursa con hemlisis intravascular, producida por incompatibilidad del sistema ABO (identificacin incorrecta); aparece de forma inmediata (basta con pocos ml para que aparezcan los sintomas del shock transfusional) => sensacin de quemadura en la vena de perfusin, dolor lumbar (de los riones), cefaleas, escalofros, hipotensin y taquicardia; los Acs responsables suelen ser anti-A, anti-B y anti-AB; en otros casos, la hemlisis aparece al cabo de unos das de la transfusin (escalofros, fiebre y anemia) originado por Acs que aparecen despus de la transfusin, con una posible inmunizacin previa por embarazos o transfusiones anteriores; - Reacciones febriles, no hemolticas (se evita con concentracin de hemates) => se manifiesta con hipertermia y escalofros, suelen intervenir Acs anti-leucocitos y antiplaquetarios; - Reacciones alrgicas => urticaria (picor, escozor) originado por Acs frente a las protenas plasmticas del donante; aparecen de forma inmediata durante la transfusin y
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no suelen ser graves; se evita administrando anti histamnicos antes o durante la transfusin; - Reacciones anafilcticas (se evita transfundiendo concentrado de hemates lavados, totalmente libres de plasma) => aparecen en raras ocasiones y de forma inmediata; ocurre en pacientes con deficiencia congnita de IgA y que poseen Acs anti-IgA; al administrarle plasma que contiene IgA, desarrollan una reaccin anafilctica muy grave que puede ser mortal; Reacciones no inmunolgicas: - Septicemia => por contaminacin del hemoderivado durante el almacenamiento; es mas frecuente en los concentrados de plaquetas (por mantenerse a 22C para conservar su viabilidad); puede ocasionar shock endotoxmico que se manifiesta con sensacin de fri, cefaleas, dolor abdominal, vmitos y diarreas; es una complicacin grave que exige tratamiento con antibiticos endovenosa inmediato; - Transmisin de enfermedades => es imposible descartar el riesgo de transmisin de ciertas enfermedades: Hepatitis C con un riesgo post-transfusional de 0,5-1%; Hepatitis B 0,2%; VIH 0,2%, Sfilis casi nulo; Citomegalovirus el riesgo se reduce a los pacientes inmunodeprimidos o transplantados; virus de Epstein-Barr no tiene demasiada importancia clnica (evolucionar espontneamente hacia la curacin); plasmodium muy escasa. - Sobrecarga circulatoria => una expansin del volumen sanguneo rapida y de larga duracin; aparece en pacientes con alteracin cardiolgicas en los que se transfunde demasiado volumen o en muy poco tiempo; puede causar insuficiencia cardaca y edema pulmonar; - Hemosiderosis => acumulacin de grandes cantidades de Fe en pacientes politransfundidos; en estos pacientes se aconseja el empleo de quelantes frricos como la desferroxiamina y limitar el numero de transfusiones al mnimo; - Complicaciones por transfusin masiva => aparecen en pacientes a os que se administra mas de 10 unidades de sangre en 24 horas; - Embolia producida por burbujas de aire => se puede producir si el que efecta la transfusin no es suficientemente cuidadoso y hbil (presencia de aire en las venas a traves del sistema del goteo por negligencia); Auto-transfusin - refundir cualquier componente sanguneo al mismo individuo que, previamente, lo haba donado siempre que haya previsin de una intervencin de un paciente aparentemente sano, cuando la situacin lo permita. Practica LXIV - Prueba cruzada mayor Introduccin - el objetivo de las pruebas pre-transfusionales es detectar las posibles reacciones Ag-Ac entre la sangre del donante y del receptor, antes de la transfusin; por ello es imprescindible realizar una serie de determinaciones: 1. Tipaje correcta del grupo ABo y Rh del donante y del receptor => se intenta transfundir sangre del mismo grupo del receptor y si no es posible, se usara una sangre compatible (O-). 2. Escrutinio de los Acs irregulares en el receptor => si se detectan Acs irregulares, deberan ser identificados para administrar sangre que carezca de los Ags correspondientes; no es imprescindible realizar esta determinacin en la sangre del donante, ya que el volumen de plasma transfundido es pequeo en comparacin con el plasma del receptor, pero si es conveniente hacerla par evitar todo tipo de riesgo; 3. Prueba cruzada mayor => determinar la incompatibilidad entre la sangre enfrentando el suero del receptor con los hemates del donante; Otras pruebas que tambin pueden realizarse => la prueba cruzada menor (enfrentar el suero del donante con los hemates del receptor) y un autocontrol, donde se buscan autoAcs mediante el enfrentamiento entre el suero del receptor y sus propios hemates; la prueba
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cruzada menor solo se realiza cuando se transfunde una gran cantidad de plasma, ya que en este caso, la presencia de Acs en la sangre del donante puede ser peligrosa; el empleo de concentrados de hemates hace innecesaria la realizacin de esta prueba; todas las pruebas deben realizarse en medio salio y en medio albuminoso para detectar todos los Acs presentes; Fundamento - enfrentar el suero del receptor con los hemates del donante, primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso, y por ultimo frente al suero antiglobulina de Coombs; con este ultimo paso detectaremos los Acs que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria; es importante respetar los tiempos de incubacin par evitar posibles errores en la tcnica; Material - tubos de hemlisis, centrifuga, bao de agua, pipetas Pasteur, gradilla, reloj;reactivos => SSF, albumina bovina al 30% (facilitar la aglutinacin de los hemates porque disminuye el potencial zeta y proporciona...), suero antiglobulina de Coombs; muestra => suero del receptor, obtenido de sangre coagulada y libre de hemlisis; debe ser fresco (menos de 24 horas) y conservado a 4C; hemates del donante previamente lavados 3x en SSF y re-suspendidos o dejarlos como un botn de hemates; Tcnica - en un tubo de hemlisis, depositar 1 gota del botn hematies del donante y 2 gotas del suero del receptor, mezclamos suavemente, y dejamos a temperatura ambiente 2'3', centrifugar 3.500 rpm durante 30", leemos el resultado obtenido en medio salino (si es + paramos); aadir al tubo 3 gotas de albumina bovina al 30%, mezclar bien e incubar a 37C durante 30'-45'; centrifugamos a 3.500 rpm durante 30" y leer el resultado obtenido en medio albuminoso (si es + paramos); lavamos 3x los hemates con solucin salina para eliminar los Acs que no se han fijado a los eritrocitos, retirar bien todo el sobrenadante del ultimo lavado; aadir la tubo 1 gota del suero antiglobulina humana de Coombs, mezclar bien y centrifugamos a 1000 rpm durante 2", leemos el resultado; Lectura de resultados - la lectura de los resultados se realiza resuspendiendo el botn hemtico con suavidad despus de cada una de las centrifugaciones; en caso de reacciones dbiles positivas, conviene observa al microscopio entre porta y cubre con objetivo de 40x. Interpretacin clnica de los resultados obtenidos - la ausencia de aglutinacin en todos los pasos indica que las sangres son compatibles y por tanto, la transfusin es posible; la aglutinacin en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad; si se observa hemlisis en cualquiera de los pasos, tambin es signo de incompatibilidad (color rosado);

Anemias inmunohemolticas
Anemia hemoltica autoinmune (anemia inmunohemoltica) - un grupo de enfermedades, causadas por la formacin de auto Acs contra los propios eritrocitos del paciente; estn dentro de las enfermedades autoinmunes; 2 tipos de Acs posibles : - Acs calientes => actan a la temperatura normal 37C del organismo y suelen ser de tipo IgG - Acs fros => actan a bajas temperaturas de 0-10C, y suelen ser del tipo IgM Anemia inmunohemoltica por Acs calientes - es mas comn en mujeres adultas y en ancianos; se manifiesta con anemia leve crnica y esplenomegalia; existe varios tipos de enfermedades:
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- Idioptica => manifestacin primaria de causa desconocida - Secundaria => aparece en 25% de los pacientes como una manifestacin secundaria de una enfermedad que afecta al sistema inmunitario, las mas frecuentes son la leucemia linfoctica crnica (LLC), el linfoma de tipo no Hodgkin y el lupus eritematoso sistmico (LES). - Inducida por frmacos => se produce en pacientes sometidos a terapia con ciertos frmacos (3 tipos) 1. frmacos que inducen la formacin de Acs calientes por una deficiencia de linfocitos T supresores (alfa metildopa) 2. frmacos que se adhieren a la superficie de los eritrocitos, induciendo la formacin de Acs contra ese complejo frmaco-eritrocito (penicilina) 3. frmacos que forman un complejo con las protenas del plasma contra el cual se forman los Acs; la unin del complejo protenas-frmaco-Acs se realiza en la superficie de los eritrocitos y es la causa de su hemlisis (quinidina) Anemia inmunohemoltica por Acs fros - las aglutininas fras producen 2 enfermedades clnicas distintas: - la enfermedad de las hemaglutininas fras (EHF) => la mas comn - la hemoglobinuria paroxstica fra (HPF) Practica LXV - Test de Coombs directo Introduccin - esta tcnica pone de manifiesto la presencia de Acs completos o incompletos, fijados a la membrana eritrocitaria que causa la hemlisis "in vivo"; esta indicada siempre que se sospeche que la causa de la hemlisis obedece a un mecanismo inmune: anemia hemoltica autoinmune, medicamentosa, enfermedad hemoltica del recin nacido o reaccin hemoltica postransfusional; es importante saber que tipo de Ac es el que se ha fijado a la membrana eritrocitaria, IgG o IgM o si a causa es la presencia de complemento; por ello no se utiliza un suero antiglobulina de Coombs polivalente, sino sueros especificos: suero anti-IgG y suero anti-C3-C4; dado que los Acs IgM actual en fri, no se suele usar suero anti-IgM en esta tcnica; existen tcnicas especificas para su determinacin Fundamento - enfrentar los hemates del paciente al suero de Coombs especifico para determinar si existen o no auto-Acs fijados en la membrana eritrocitaria; su presencia se manifiesta por la aglutinacin de los hemates en el fondo del tubo; es importante realizar el control del suero de Coombs con hemates previamente preparados, esto nos permitir saber en que condiciones se encuentra y si los resultados obtenidos son validos.

Material - tubos de hemlisis, centrifuga, pipetas Pasteur, bao de agua, gradilla, rotulador de vidrio; reactivos => SSF, suero de Coombs, suero anti-D incompleto (no
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tenemos); botn de hemates Rh- que actuaran como control (-); botn de hemates Rh+ que actuaran como control (+) cuando las sensibilicemos con suero antiD; muestra=> hemates del paciente lavados 3 veces con SSF (botn) Tcnica: a)- preparacin del control (-) => lavar la sangre Rh- 3x con SSF para obtener botn b)- preparacin del control (+) => lavar la sangre Rh+ 3x con SSF para obtener botn; aadir 2 gotas de anti D incompleto e incubar 1 hora a 37C, luego lavar 3x con SSF para obtener el botn sensibilizado c)- preparacin de los PR => ja lo hemos hecho previamente Rotulamos los 3 tubos de hemlisis con las letras C(-), C(+) y PR; en el tubo C(-), aadir al botn 1 gota de suero de Coombs; dem para el tubo C(+) y PR; centrifugar todos los tubos 45" a 3000 rpm Lectura de resultados - tras la centrifugacin, golpear suavemente con el pulpejo de los dedos para despegar el botn; los tubos de PR que presenten aglutinacin => resultado (+), es decir indica presencia de Acs sobre la membrana eritrocitaria; el tubo C(-) siempre ha de ser (-) y el C(+), siempre ha de dar (+); si no es as, los resultados no son validos.

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