Tema 1 - Medida de los analitos por fotometra y espectrofotometra

1. Espectro electromagntico: distribucin energtica del conjunto de la radiacin electromagntica.

Interaccin de la energa radiante con la materia La energa radiante (radiacin electromagntica) puede manifestarse como movimiento ondulatorio (radiacin electromagntica) o como si estuviese integrada por un flujo de partculas discretas o paquetes ondulatorios energticos denominados fotones, es decir presentando propiedades electromagnticas y energticas. Ambos modelos son complementarios.

2.

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2.1.

Parmetros ondulatorios:

Amplitud(A): longitud del vector elctrico mximo en la onda. Longitud de onda (): distancia entre dos puntos que se encuentran en el mismo punto de vibracin. Perodo (T): tiempo en segundos (s) que tarda una partcula en realizar una vibracin completa. Frecuencia (v): nmero de oscilaciones completas que una partcula realiza en una unidad de tiempo, generalmente un segundo.

3. Comportamiento de la materia ante electromagntica La materia est constituida por tomos, iones o molculas.

la

radiacin

En los tomos los electrones se disponen en orbitales ms o menos alejados del ncleo adoptando una configuracin caracterstica. En las molculas los enlaces covalentes entre tomos se forman porque los electrones que los constituyen se localizan alrededor de los dos centros atmicos, de tal manera que se minimizan las fuerzas de repulsin. Las zonas interatmicas, ocupadas por electrones enlazantes, se conocen como orbitales moleculares y se pueden considerar como la superposicin de orbitales atmicos. Cuando se incide sobre la materia con una energa radiante, tienen lugar determinadas transiciones electrnicas desde unos orbitales a otros. Estas transiciones electrnicas determinan cambios en el estado energtico de tomos o molculas, cambios que son caractersticos de cada especie atmica o molcula, por ello cada tomo o molcula absorbe una energa radiante de caractersticas definidas. En base a este comportamiento, se aplican las tcnicas analticas espectroscpicas para identificar y/o cuantificar en muestras biolgicas los parmetros indicadores de estados fisiolgicos o patolgicos 3.1. Absorcin atmica: en los tomos, los electrones ocupan alrededor del ncleo determinados niveles energticos que definen orbitales caractersticos para cada tipo de tomo. En estas condiciones, un tomo, se encuentra en su estado fundamental o de menor energa, su configuracin electrnica es estable y tiende a mantenerla o a recuperarla si sta ha sido alterada, por incidir sobre ella radiacin 3.2. Absorcin molecular: los espectros de absorcin de las molculas poliatmicas son ms complejos que los espectros atmicos al presentar un mayor nmero de transiciones entre sus numerosos estados, esto supone una gran cantidad de lneas espectrales, tantas que se superponen entre ellas dando lugar a los espectros de bandas que abarcan un intervalo considerable de longitudes de onda. Emisin: proceso que se produce cuando la materia se relaja y cede su exceso de energa en forma de fotones.

3.3.

4.

Ley de Lambert-Beer 2/161

Ley que indica la relacin directamente proporcional que existe entre la absorbancia de una muestra y su concentracin, al ser constantes los valores del trayecto ptico, la longitud de onda de la radiacin incidente, la absortividad (cantidad de luz absorbida por una solucin. La relacin directamente proporcional entre la absorcin de la radiacin por parte del analito y su concentracin en la muestra no es lineal en cualquier situacin. Existen una serie de condiciones limitantes o desviaciones de esta ley que dependen de determinadas caractersticas del analito o que tienen un origen instrumental o qumico, en las que la relacin no presenta linealidad. Estas desviaciones son:

Dependientes de las caractersticas del analito Limitaciones qumicas Limitaciones instrumentales

La Ley de Lambert-Beer se cumple para un trayecto ptico de 1 cm (cubeta estandarizada).

4.1. Curva de calibracin: representacin grfica en un eje de coordenadas de absorbancia (ordenadas) frente a concentracin (abscisas). Para construir la curva de calibracin (que debe ser una recta) se ensayan varias soluciones de concentraciones conocidas y se determinan sus absorbancias, luego se representan grficamente sus concentraciones frente a sus absorbancias. La concentracin de la muestra a analizar se obtiene por interpolacin de su absorbancia en la curva de calibracin. 4.2. Linealidad: en las determinaciones fotomtricas se debe conocer la linealidad, que es el intervalo de concentraciones del cromgeno entre las cuales existe una relacin lineal entre concentracin y absorbancia.

5. Conceptos Fotometra: medida de las magnitudes relativas a las radiaciones, evaluadas segn la impresin visual producida por stas y basndose en ciertas convenciones.
Fotmetro: instrumento que sirve para medir la intensidad de una fuente luminosa. Espectrmetro: aparato utilizado para medir la distribucin de una radiacin compleja en funcin de la longitud de onda o de la frecuencia si se trata de ondas y de la masa o de la energa de las partculas individuales si se trata de partculas. 3/161

Espectrofotometra: en qumica analtica es una tcnica de medicin que asocia el anlisis espectral de la espectroscopia a la medicin de magnitudes fotomtricas relativas, en la mayora de los casos relacionados con las propiedades de la materia. Permite aislar, en la radiacin compleja emitida por una fuente, una radiacin casi monocromtica que caracteriza cualitativa y cuantitativamente la materia que ha atravesado. En el rango de concentraciones adecuado las leyes de absorcin de Lambert-Beer permiten un anlisis cuantitativo.

6. Tcnicas espectroscpicas analticas Cada tipo de radicacin afecta a un nivel diferente de la estructura atmica y molecular, esto nos permite clasificar diferentes tipos de tcnicas espectroscpicas.

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7. Sistemas pticos espectroscpicos Espectrofotmetro: instrumento que combina las propiedades del espectrmetro y del fotmetro y permite la determinacin de intensidades relativas de radiaciones simples, elegidas a voluntad entre las muestras dadas.
Un espectrofotmetro consta de: Fuente de radiacin: es el origen de la emisin energtica en forma de radiacin electromagntica lo suficientemente potente y estable para que sea posible su deteccin y su medida una vez que ha atravesado la muestra. Sistema de depsito de la muestra biolgica Selector de longitud de onda: tiene la funcin de seleccionar o discriminar una banda estrecha de longitud de onda de las procedentes de la fuente de radiacin con la finalidad de aumentar la sensibilidad de la medida de absorbancia.

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Detectores: sistemas que amplifican y transforman la energa radiante no absorbida por la muestra en energa elctrica y la convierten en una seal elctrica y cuantificable. Sistemas de registro y presentacin de datos.

Los sistemas pticos utilizados en espectrofotometra tienen su base en stos cuatro fenmenos:

1. Absorcin 2. Emisin 3. Dispersin 4. Luminiscencia-fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia. Aplicaciones clnicas Muchos de los mtodos analticos espectrofotomtricos resultan de la aplicacin de la ley de Lambert-Beer. La selectividad en la absorcin o emisin de energa por parte de la materia, ha hecho posible el desarrollo de mtodos analticos cuya finalidad es la deteccin en fluidos y tejidos biolgicos de:

Ausencia o presencia de parmetros analticos. Cuantificacin de la concentracin de estos parmetros. La actividad de numerosas enzimas.

Estos parmetros son indicadores de determinados estados tanto fisiolgicos como patolgicos y, junto a otras pruebas, permiten la prevencin, el diagnstico, el tratamiento o la evaluacin del seguimiento del tratamiento de estos estados de salud.

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TEMA 2 - ESPECTROFOTOMETRA UV-VISIBLE

1) Definicin y fundamentos: La espectroscopia ultravioleta-visible o espectrofotometra ultravioleta-visible (UV/VIS) es una espectroscopia (estudio de la interaccin entre la radiacin electromagntica y la materia) de fotones y una espectrofotometra. Utiliza radiacin electromagntica (luz) de las regiones visible, ultravioleta cercana (UV) e infrarroja cercana (NIR) del espectro electromagntico. La radiacin absorbida por las molculas desde esta regin del espectro provoca transiciones electrnicas que pueden ser cuantificadas.

Todas las sustancias pueden absorber energa radiante. La absorcin de las radiaciones UV, visibles e IR depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. El color de las sustancias se debe a que absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y slo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida. Esta espectrofotometra utiliza radiaciones del campo UV de 80 a 400 nm, principalmente de 200 a 400 nm (UV cercano) y de luz visible de 400 a 800 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar las soluciones en la regin ultravioleta-visible del espectro. Se rige por una ley muy importante: la ecuacin de Beer-Lambert.

1.1. Fuentes de radiacin:

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Lmparas descarga de Deuterio e Hidrgeno. La excitacin elctrica a presin reducida de estos elementos genera una radiacin continua en la banda espectral correspondiente al UV Lmparas de filamentos de Tungsteno. Origina radiacin de la regin visible e infrarrojo cercano del espectro entre 350-2.500nm Lmparas de arco de Xenn. La excitacin elctrica de una atmsfera de Xenn genera una radiacin continua en la banda espectral de 250 a 600 nm

2) Finalidad diagnstica: La espectrometra UV/Visible se utiliza habitualmente en la determinacin cuantitativa de soluciones de iones metlicos de transicin y compuestos orgnicos muy conjugados . Soluciones de iones metlicos de transicin Las soluciones de iones metlicos de transicin pueden ser coloreadas (es decir, absorben la luz visible) debido a que los electrones en los tomos de metal se pueden excitar desde un estado electrnico a otro. El color de las soluciones de iones metlicos se ve muy afectado por la presencia de otras especies, como algunos aniones o ligandos. Compuestos orgnicos Los compuestos orgnicos, especialmente aquellos con un alto grado de tambin absorben luz en las regiones del espectro electromagntico visible o ultravioleta. Los disolventes para estas determinaciones son a menudo el agua para los compuestos solubles en agua, o el etanol para compuestos orgnicos solubles. Los disolventes orgnicos pueden tener una significativa absorcin de UV, por lo que no todos los disolventes son adecuados para su uso en espectrometra UV. El etanol absorbe muy dbilmente en la mayora de longitudes de onda. La polaridad y el pH del disolvente pueden afectar la absorcin del espectro de un compuesto orgnico. Aunque los complejos de transferencia de carga tambin dan lugar a colores, stos son a menudo demasiado intensos para ser usados en mediciones cuantitativas. El espectrofotmetro UV/Vis puede utilizarse como detector para la Cromatografa Lquida de Alta Resolucin HPLC. La presencia de un analito da una respuesta que puede ser proporcional a la concentracin. Para resultados precisos, la respuesta del instrumento al analito debe compararse con la respuesta a un estndar, lo que es muy similar al uso de curvas de calibracin. La respuesta para una concentracin particular se conoce como factor de respuesta. 3) Ventajas e inconvenientes: 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) Ventajas : Rapidez Uso fcil Precisin extrema Versatilidad Eficiencia en el costo Sensibilidad Anlisis de superficies irregulares y materiales duros Preparacin mnima de la muestra
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- Inconvenientes : 1) En aquellas muestras que requieren disolucin es necesario que esta se lleve a cabo en el disolvente adecuado; y si estamos utilizando una celda de paso fijo es necesario asegurarse que la distancia no vare para anlisis cuantitativo. 2) Los problemas asociados con dichas celdas incluyen la aparicin de burbujas que dan lugar a bandas errneas. 3) Suele aparecer la banda del disolvente, pudiendo llegar a interferir. 4) Las ventanas de las clulas no estn completamente paralelas. 5) En slidos, hay problemas a la hora de tomar la misma cantidad de muestra.

Tema 3. Nefelometra y turbidimetra

DEFINICIN: QU ES?

Nefelometra y / o Turbidimetra son mtodos analticos basados en la dispersin de partculas suspendidas en lquidos.

-Turbidimetra: es la medicin de la luz transmitida a travs de una suspensin, tiene la ventaja de permitir la valorizacin cuantitativa, sin separar el producto de la solucin . Las mediciones, pueden efectuarse con cualquier espectrofotmetro. -Nefelometra: mide la luz dispersada en direccin distinta a la luz emitida (generalmente con ngulos que oscilan entre 15 y 90). Utiliza como instrumento el nefelmetro (en el que el detector se ubica con un ngulo que oscila entre 15 y 90 ej. a 90). Se suele utilizar para concentraciones ms diluidas. Permite mayor sensibilidad con concentraciones menores de partculas suspendidas. Constituye un mtodo ms exacto para la medida de la opacidad.

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FUNDAMENTO: EN QU SE BASA?
Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensin de partculas slidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia.

La turbidez es la propiedad ptica de una muestra que hace que la radiacin sea dispersada y absorbida ms que transmitida en lnea recta a travs de la muestra. Es ocasionada por la presencia de materia suspendida en un lquido. Y para medirla utilizamos ambos mtodos. La dispersin no supone la prdida neta de potencia radiante, slo es afectada la direccin de la propagacin, la intensidad de la radiacin es la misma en cualquier ngulo. En la turbidimetra se compara la intensidad del rayo de luz que emerge con la del que llega a la disolucin. En cambio, en la nefelometra la medida de la intensidad de luz se hace con un ngulo de 90 con respecto a la radiacin incidente.

El instrumento usado en la nefelometra, el nefelmetro en cambio en turbidimetra se utiliza el turbidmetro que es un fotmetro de filtro.
El procedimiento de la nefelometra generalmente es emprico y slo se consideran 3 factores: 10/161

1. La concentracin: Mayor sea el nmero de partculas, mayor es la dispersin. 2. Tamao de la partcula: Factores como el pH, la velocidad y orden de la mezcla, concentracin de los reactivos y la fuerza inica. 3. Longitud de onda: Generalmente las muestras se iluminan con luz blanca, pero si estn coloreadas, se debe escoger una porcin del espectro electromagntico en la que la absorcin del medio se reduzca al mnimo

Diferencias turbidimetria y nefelometra La nefelometra se basa en la medicin de radiacin dispersa, en cambio la turbidimetra en la medicin de la intensidad de un haz disminuido. Factores para la eleccin entre turbidimetra y nefelometra :

- Intensidad de la radiacin transmitida o dispersada con la intensidad de la radiacin procedente de la fuente. La mejor eleccin cuando la muestra contiene pocas partculas dispersantes es la nefelometra. La turbidimetra es buena cuando las muestras contienen grandes concentraciones de partculas dispersantes. - Tamao de las partculas dispersantes. En la nefelometra la intensidad de la radiacin dispersada a 90 es mayor si las partculas son bastante pequeas para que se produzca una dispersin Rayleigh. Si las partculas son mayores la intensidad de la dispersin disminuir. En turbidimetra la seal consiste en la disminucin relativa de la radiacin transmitida, por lo que el tamao de las partculas dispersantes es menos importante.

FINALIDADES: PARA QU SE UTILIZA? Se utilizan normalmente en el anlisis de la calidad qumica del agua, para determinar la claridad y para el control de los procesos de tratamiento. Tambin para la determinacin de iones sulfato.

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Turbidimetra: -Se utiliza para el anlisis de fibringeno, triglicridos, complejos Ag-Ac y otras sustancias. - Aplicable cuando la dispersin es suficientemente grande (concentracin alta de partculas). Nefelometra: - Preferible para concentraciones bajas de partculas, ya que la dispersin es menor y la disminucin de intensidad del haz incidente es pequea. - Se suele utilizar para medir concentraciones especficas de colonias de bacterias en algn medio de cultivo, o de muchas protenas utilizando el principio de dispersin luminosa molecular.

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TEMA 4 - FLUORIMETRA Y QUIMIOLUMINISCENCIA

FLUORESCENCIA, FOSFORESCENCIA Y QUIMIOLUMINISCENCIA Dentro de los fenmeno llamado luminiscencia se encuentran el de fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia. FLUORESCENCIA Definicin y fundamento Es la luminiscencia causada nica y exclusivamente por rayos ultravioleta. El trmino fluorescencia proviene del mineral que presenta este fenmeno por naturaleza, la fluorita. La fluorescencia se produce cuando una molcula absorbe luz de una determinada longitud de onda(energa), y emite luz de una longitud de onda superior (menor energa). Cuando una molcula es excitada por un haz de luz de una intensidad y energa determinadas, absorbe energa y se produce el paso de sus electrones de un estado basal a un estado excitado, liberando esta energa en forma de luz, resultando en una emisin fluorescente o fluorescencia.

Fluorimetra
La fluorimetra combina la fotometra con la alta sensibilidad y especificidad del fenmeno fluorescente. Para la medida de la fluorescencia se usan: - Fluormetros que usan filtros interferenciales o filtros de vidrio. - Espectrofluormetros que usan prismas o redes de difraccin. Los componentes bsicos de estos aparatos son: 1. Fuente de luz de excitacin (energa radiante): Se pueden emplear lmparas de arco de xenn o lmparas de mercurio 2. Rendijas de excitacin y emisin: Son iguales a las del espectrofotmetro(orientan el haz de luz). 3. Monocromadores (de excitacin y de emisin): - Monocromadores de excitacin: para seleccionar la longitud de onda de excitacin deseada. - Monocromadores de emisin: para eliminar las longitudes de onda emitidas no deseadas 4. Cubetas: De slice o cuarzo. Las de plstico pueden causar fluorescencia adicional con prdida de sensibilidad. 5. Detector: Fototubos multiplicadores capaces de cuantificar la pequea seal fluorescente. Los fluormetros estn diseados en ngulo recto para que la luz procedente de la lmpara (de excitacin) no llegue al monocromador de emisin y al detector.
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La mayor ventaja de la fluorimetra => su enorme sensibilidad (respecto a las tcnicas colorimtricas) por el aumento de la intensidad de la radiacin de excitacin y la sensibilidad del dispositivo de deteccin. La seal fluorescente depender => del solvente, pH, temperatura, de la absorbancia de luz por la solucin, de interferentes que aporten fluorescencia no deseada, de compuestos que atrapan luz (atenan la fluorescencia que se pierde en forma de calor). Aplicaciones En bioqumica: - anlisis de alimentos y frmacos. En bioqumica clnica: - muestras biolgicas de iones, enzimas, coenzimas, vitaminas, algunos medicamentos, etc. Su gran aplicacin es el fluoroinmunoanlisis que utiliza Ac marcados con una sustancia fluorescente, especficos de la sustancia a estudiar.

FOSFORESCENCIA Definicin La fosforescencia es un fenmeno en el cual ciertas sustancias tienen la propiedad de absorber energa y almacenarla, para despus emitirla gradualmente en forma de luz . El principio fsico en el que se basa la fosforescencia es el mismo que el de la fluorescencia, la principal diferencia radica en la forma de emitir la luz absorbida. En la fluorescencia es casi simultnea, y en la fosforescencia es retardada.

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En la fosforescencia, los tomos poseen estados metastables donde se pueden almacenar energa durante un tiempo relativamente largo. Y, emiten esta energa absorbida (con longitud de onda bastante mas larga que la de absorcin) de forma gradual, durante minutos, horas e incluso das.

Fosforimetra
Tcnica espectroscpica luminiscente basada en la deteccin y anlisis de la emisin de radiaciones electromagnticas de una especie excitada por absorcin de fotones. Los mtodos fosforescentes y fluorescentes se complementan, ya que los compuestos fuertemente fluorescentes presentan una dbil fosforescencia y viceversa Ventajas (con respecto a la fluorescencia) - Ms tiempo de vida - Ms sensibilidad - Ms selectividad - Ms linealidad de la respuesta - Posibilidad de utilizar concentraciones de < ng/ml Inconvenientes - Necesidad de utilizar bajas temperaturas (nitrgeno lquido). - Imprecisin en las medidas. - Cierta dificultar experimental. Tipo de luz utilizada: - Ultravioleta - Visible - Infrarrojo prximo Aplicaciones - Presencia de frmacos en sangre - Presencia de frmacos en orina (til para control de dopaje) - Presencia de Uranio en orina, suelo, agua, vegetales, filtros,... - Determinacin de cidos nucleicos, aminocidos, pirina, pirimidina, enzimas, hidrocarburos del petrleo, vitaminas, pesticidas,... Aparatos utilizados en fosforimetra Se utiliza el fosformetro o espectrofosformetro, este aparato presenta dos componentes adicionales al fluormetro: Fosforoscopio, u obturados rotatorio. ste alterna la irradiacin de la muestra y la medicin de la intensidad de fosforescencia, despus de un tiempo determinado. Un compartimento especfico, para la muestra, que permita mantener la muestra a la temperatura adecuada (Nitrgeno lquido). Suele ser con ventanas de cuarzo.

QUIMIOLUMINISCENCIA
Definicin Fenmeno que en algunas reacciones qumicas, la energa liberada no slo se emite en forma de calor o de energa qumica sino en forma de luz.
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Fundamento Normalmente, en estas reacciones de quimioluminiscencia se liberan molculas con estado excitado que al bajar a su estado emiten la diferencia de energa en forma de luz. A medida que progresa la reaccin, los cambios de la composicin qumica y la luz, disminuyen hasta desvanecerse por completo como resultado de la conversin. Generalmente la quimioluminiscencia es muy breve. Relacionado con la quimioluminiscencia: Bioluminiscencia: fenmeno producido por reacciones qumicas de origen biolgico, uno de los casos ms conocidos es la luz emitida por las lucirnagas, tambin algunas bacterias, hongos, insectos...

Tipos de quimioluminiscencia: Quimioluminiscencia directa: marcaje de sustancias slidas con ster de acridina (quimioluminiscente) recubiertas por Acs especficos contra la sustancia a analizar. Cuando se oxida la sustancia empleada para el marcaje se emite luz. Quimioluminiscencia indirecta : emplea como marcaje una enzima y produce una fuerte emisin de luz. Permite hacer numerosas lecturas y aumentar la precisin.

Ventajas - Alta sensibilidad y especificidad. - Alta precisin. - No emplea radioactividad. - No genera riesgo contaminante ni ruido de fondo. - Equipo automatizado y fcil manejo. - Los resultados obtenidos son equiparables con Radioinmunoanlisis.

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Aplicaciones - No es muy usada en la clnica. - Anlisis medioambientales (restos de impurezas en el aire, contaminantes atmosfricos...) - Clnica forense (para la determinacin de rastros de sangre) Diferencia entre fosforescencia, fluorescencia y quimioluminiscencia: el el fenmeno fosforescencia es el mismo que el de la fluorescencia, la principal diferencia radica en la forma de emitir la luz absorbida. En la fluorescencia es casi simultnea, y en la fosforescencia es retardada, y en la quimioluminiscencia se basa a partir de reacciones qumicas liberando energa en forma de luz que se va apagando a medida que cesa la reaccin.

Tema 5 Espectrofotometra de absorcin atmica y fotometra de llama

ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN ATMICA Es una tcnica para determinar la concentracin de un elemento metlico determinado en una muestra. Puede utilizarse para analizar la concentracin de ms de 62 metales diferentes en una solucin. Los elementos a analizar se encuentran en forma de vapor de tomos. Ahora bien, en absorcin atmica existe una fuente independiente de luz monocromtica, especfica para cada elemento a analizar y que se hace pasar a travs del vapor de tomos, midindose posteriormente la radiacin absorbida. Para poder analizar la muestra es imprescindible tenerla atomizada utilizando un flujo de gas oxidante mezclado con gas combustible, es decir, que mediante un
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flujo la muestra lquida o en disolucin va a ser aspirada por un capilar; Cuando la solucin sale del capilar el gas la dispersa en forma de fina niebla. Para que la precisin de los anlisis sea buena hay que poder reproducirlas en todas las medidas: el flujo de los gases y el tamao de gota.

En esta atomizacin se dan 3 fases: DESOLVATADA El liquido disolventes evapora y la muestra permanece seca. VAPORIZACIN La muestra slida se evapora a gas. ATOMIZACIN Los compuestos de la muestra se dividen en tomos libres.

En un espectrofotmetro de AA es necesario utilizar una llama aunque esta tambin la podemos sustituir por un horno de grafito. Las llamas utilizadas en la AA son similares a la tcnica de emisin de llama Llama de aire-hidrocarburos Llama de aire acetileno Llama de oxido nitroso-acetileno La temperatura de la llama es lo suficientemente baja como para no excitar los tomos de la muestra de su estado basal. Segn la temperatura encontramos tres tipos de llamas: llamas fras.
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llamas calientes. llamas mas calientes. La ms utilizada en analtica clnica es la Llama caliente ya que puede atomizar hasta 30 elementos. COMPONENTES: Fuente de luz: lmpara de ctodo hueco que consiste en un nodo de wolframio y un ctodo cilndrico cerrados hermticamente en un tubo de vidrio lleno de nen/argn, y el ctodo est constituido con el metal cuyo espectro se desea obtener Quemador: es un mechero en el cual se dan dos procesos; Nebulizacin y Atomizacin de la muestra para obtener una mayor sensibilidad.

Monocromador: son prismas o redes de difraccin que sirven para hacer pasar la luz atreves del sistema ptico. Detector: el sistema de deteccin puede estar formado por foto celdas, fotomultiplicador, etc. Que reciben la energa lumnica proveniente de la muestra y la convierte en una seal elctrica proporcional a la energa recibida.

NOTA: Las cubetas a utilizar pueden ser de cristal o de plstico, macrocubetas o microcubetas.

APLICACIONES En qumica analtica se emplea para medir las concentraciones de elementos metlicos en los lquidos biolgicos, los principales metales que se miden son: Aluminio- arsnico-bario cadmio- calcio- cobre- cromo- hierro-litio-magnesiomanganeso-mercurio-nquel plata-platino- plomo -selenio y zinc.

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FOTOMETRIA DE LLAMA
Es una tcnica de emisin que utiliza una llama como fuente de excitacin y un fotodetector electrnico como dispositivo de medida . Se pueden realizar anlisis monoelementales o multielementales, en este segundo caso se emplean sistemas selectores entre la muestra y el detector que son capaces de discriminar en un periodo de tiempo corto varias longitudes de onda de emisin de los diferentes elementos que se pretenden analizar en la muestra.

En la fotometra de llama se pueden realizar 2 tipos de anlisis: ANALISIS CUALITATIVO Identifica los componentes de una muestra y examina las longitudes de onda del espectro de emisin (la muestra debe estar disuelta) ANALISIS CUANTITATIVO Es ms sencillo y preciso, sirve para detectar metales alcalinos o alcalino trreos tambindetermina la cantidad de sustancias en una muestra. El equipo de llama se compone de: MONOCROMADOR: Prismas

FOTODETECTOR: Dispositivo encargado de captar la seal ptica proveniente del monocromador y transformarlo en una seal electrnica capaz de ser convertida en un valor legible. MEDIDOR: Se encarga de tomar la D.O de la muestra. REGISTRADOR: convierte un resultado en valor numrico. La llama en el espectrofotmetro durante el anlisis requiere combustible y oxidante, tpicamente en forma de iones.

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Estos mtodos a menudo son capaces de analizar elementos metlicos en ppm, billones e incluso hasta rangos ms bajos de concentracin. Se debe controlar las etapas necesarias de los tomos que constituyen una muestra hasta su estado fundamental, para ello; hay que sustituir la llama por una cmara de grafito y con esto aumenta tambin la sensibilidad. Es esencial que la temperatura de la llama se mantenga constante, para lo cual se precisan reguladores.

ATOMIZADORES CON LLAMA Su funcin es convertir los tomos combinados de la muestra en tomos en estado fundamental, para ello es necesario suministrar a las muestras una cantidad de energa suficiente para disociar las molculas y romper sus enlaces. FUNCIONES BASICAS DE LA LLAMA: Permite pasar la muestras a analizar de estado liquido a gaseoso. Descompone los compuestos moleculares en tomos individuales o molculas sencillas. Excita estos tomos o molculas. Las condiciones que debe cumplir una llama deben de ser, que tenga la temperatura adecuada y que en ella se forme un ambiente gaseoso que permita las funciones mencionadas. Adems el ruido de fondo de la llama no debe interferir en las observaciones. APLICACIN: Es una tcnica aplicable para la cuantificacin de diversos componentes como los elementos alcalinos o alcalinotrreos, aunque en realidad solo se miden concentraciones de sodio (Na) potasio (K) y litio (Li) , pero suele utilizarse otras tcnicas para esta medicin ya que resulta ms econmicas; Las muestras habitualmente utilizadas son lquidos biolgicos que deben de estar en solucin acuosa con determinados diluyentes y estossuelen contener litio o cesio.

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 Cono interno: hay una combustin parcial es decir sin equilibrio trmico en esta se forman productos de oxidacin intermedios, se produce una gran emisin de luz (proviene del combustible, no de la muestra), es muy poco utilizada en el trabajo analtico Zona interconal: o llamada parte caliente de la llama y en ella tiene lugar una combustin completa. Es la ms utilizada en anlisis Cono externo: es la zona de combustin secundaria. Se enfra por el aire circundante y es una zona poco til.

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Tema 6 - Refractometra y Reflectancia

REFRACTOMETRIA
Es una tcnica analtica que consiste en la medida del indice de refraccin de un lquido con objeto de investigar su composicin si se trata de una disolucin o de su pureza si es un compuesto nico. La medida continua en una columna cromatogrfica puede indicar la composicin o pureza del eluyente.

Principios bsicos

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La refractometra de la luz es un fenmeno de desvo que experimenta el haz incidente al atravesar una solucin, ocasionado por la diferente naturaleza del aire y de la solucin sobre la que incide. El ngulo de desvo se denomina ngulo de refraccin.

Se conoce como ndice de refraccin (n) de una solucin a la relacin entre la velocidad de la luz en el aire y la velocidad de la luz a su paso por esta solucin. Su valor es directamente proporcional a la cantidad de sustancias disueltas en la misma. Esta relacin vara dependiendo de caractersticas como la concentracin de sustancias disueltas, el tipo de disolvente, etc. Se puede calcular la concentracin de solutos en una solucin midiendo su ndice de refraccin. En suero y plasma, el indice de refraccin depende fundamentalmente de la protena mayoritaria, la albmina.

Refractmetro clnico
Son instrumentos basados en el fenmeno de la refraccin de la luz para medir la concetracin de sustancias disueltas en una solucin acuosa. Las determinaciones se realizan gracias a la refraccin entre el prisma, de ndice de refraccin elevado y la muestra. En el caso de muestras de baja concentraccin, la diferencia entre los ndices de refraccin de la muestra y el prisma es elevada y el ngulo de refraccin es amplio . Cuando las muestras presentan una concentracin de solutos elevada, la diferencia entre los ndices es menor y, por lo tanto el ngulo de refraccin es tambien menor . En el laboratorio de anlisis clnicos se emplea el refractmetro para la medicin de la concentracin de solutos tales como la albmina en muestras sricas y/o plasmticas , y la medida del peso especfico en orina.

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REFRACTMETRO Medida
-Colocar sobre el prisma una (s) gota (s) de la solucin a analizar y cerrar la placa. -Dejar un tiempo para que la solucin problema fluya sobre la superficie del prisma. -Dirigir el refractmetro hacia la luz para obtener un buen contraste luz-sombra. -Rotar el ocular hasta enfocar la escala. -Mirar por el ocular leyendo directamente en la escala de concentracin . -Corregir la medida si la temperatura es diferente a la de calibracin del refractmetro.

Utilizacin
En la actualidad se emplea poco ya que sus medidas estn incluidas en otros sistemas analticos ms sencillos, rpidos (como la tira reactiva) y automatizados (auto-analizadores que incluyen tanto el peso especfico como la concentracin de albmina).

Donde se emplea
-en la industria vitivincola: para determinar los azcares totales de un mosto y a partir de alli poder hacer una estimacion del grado alcoholico -en la industria alimenticia: en los laboratorios de bromatologia -en veterinaria.

REFLECTOMETRA

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ESPECTROFOTOMETRIA DE REFLEXION

1. TIPOS DE REFLEXIN
Cuando un haz de luz incide sobre una superficie, la luz es reflejada por esta superficie, producindose a la vez dos tipos de reflexin: --Una reflexin especular, en donde la luz es reflejada como lo hara en un espejo. --Una reflexin difusa (reflectancia), que consiste en la reflexin producida al penetrar la luz en las capas internas de la superficie iluminada. Dentro de la fase solida, la luz sufre una serie de fenmenos de absorcin y dispersin. Este tipo de reflexin es de inters para las mediciones que se realizan con las tcnicas de qumica seca.

2. ESPECTROFOTMETRO DE REFLEXION

La fotometra de reflectancia implica la medida de la intensidad de la luz que es reflejada por una fase slida, tras iluminar sta con un haz de luz de una longitud de onda que es absorbida por los productos de inters. Los espectrofotmetros de reflexin miden la reflectancia y la relacionan con la concentracin del analito de inters. Sus componentes son: a. Fuente de luz: se emplean dos tipos de lmparas, que pueden ser de haluro de tungsteno o de xenn. b. Sistemas pticos: consisten en combinaciones de lentes, espejos y filtros. c. Reactivos de fase slida: aqu radica una de las diferencias fundamentales con la fotometra de absorcin. La muestra se situa en los reactivos de fase solida (tiras reactivas, reactivos multicapa). Todos los componentes necesarios para que se produzca la reaccin se encuentran impregnados en estas unidades, en las que tiene lugar la reaccin y la lectura. d. Detector y procesador de datos e. Lectura: se puede hacer de dos formas

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Lectura sobre la superficie

La muestra se aplica sobre la superficie del reactivo, difunde y se produce la reaccin. El color resultante se determina midiendo la reflectancia sobre la superficie. Este mtodo se emplea en los sistemas que utilizan tiras reactivas.

Lectura por el reverso de la superficie

La muestra se aplica sobre la superficie del reactivo, difunde y se produce la reaccin. La lectura se hace por el reverso de la superficie de la muestra. Este mtodo se emplea en los sistemas que utilizan reactivos multicapas o slides.

3. REACTIVOS PARA QUMICA SECA

Los reactivos de qumica seca constituyen la manera de introducir la muestra en los fotmetros de reflexin. Son unidades de reaccin con una slida: poseen en forma deshidratada, todos los componentes que se necesitan para la identificacin de un analito determinado. Modo de empleo: la muestra que contiene el analito a determinar (suero, plasma, sangre total, orina) se aplica sobre la superficie del reactivo en fase slida, y a partir de esta difunde a la matriz, disolviendo los componentes de reaccin que contiene; cuando los reactivos se disuelven se produce la reaccin, que se cuantificara por fotometra de reflectancia. Todos los sistemas constan de tres partes:

Parte soporte

Est constituida por una lamina de plstico, sobre la cual se construye el reactivo de fase solida.

Parte reflectante Parte reactiva

Su funcin es reflejar la luz; est hecha de materiales reflectantes como metales, o materiales fibrosos como el papel. Contiene, en forma deshidratada todos los reactivos y sustancias auxiliares necesarias para que se produzca una reaccin. Los reactivos son reconstituidos mediante rehidratacin por el agua de la muestra A veces se aaden otras capas con funciones complementarias como una capa difusora (con lo cual la muestra difunde rpidamente hacia los laterales y se distribuye uniformemente) o una capa separadora de plasma (la utilizan los sistemas preparados para trabajar con sangre total, su funcin es retener las clulas y permitir el paso del plasma hacia la matriz del reactivo). La estructura de las capas depende del sistema reactivo de fase solida que se trate, variando de unos a Otros.

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4. SISTEMAS REACTIVOS

Los reactivos de fase slida empleados en la qumica seca se engloban en dos tipos: las tiras reactivas y las pelculas multicapa.

Tiras reactivas
Se utilizan para: -anlisis de orina -autocontrol de la glucemia -en sistemas de diagnstico rpido en la consulta mdica y a la cabecera del enfermo. Consisten, bsicamente en un soporte de plstico que sirve de soporte a una matriz de celulosa que contiene los reactivos secos necesarios para que se produzca una reaccin con el componente a estudiar. Tira reactiva del sistema Seralyzer (Ames): consiste en una matriz de celulosa impregnada de reactivos secos que se unen a una lamina soporte de plstico; sobre ella lleva una franja cdigo, que tiene como finalidad ser leda cuando se la inserta en el instrumento. Tira reactiva del sistema Reflotron (Boheringer Mannheim): consta de una lmina soporte al cual se le adhiere el sistema reactivo separado en dos zonas: -una est unida a la lamina. Incluye una serie de capas destinadas a la preparacin de la muestra. -la otra se encuentra inicialmente separada de la lmina soporte, y se pone en contacto con ella por simple presin cuando se desea que el plasma entre en contacto con los reactivos
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para desencadenar la reaccin; esta zona lleva en su superficie una laminilla transparente a travs de la cual se realizara la lectura. La disposicin en dos bloques hace posible que la parte destinada a la preparacin de la muestra se puedan llevar a cabo etapas de preincubacin o eliminacin de interferentes . Esta tira incorpora tambin una capa separadora de fibra de vidrio para la obtencin de plasma, con lo cual evitamos la centrifugacin previa al anlisis. Ventajas de las tiras: al mantener los reactivos deshidratados aportan una prolongada estabilidad al sistema, que puede ser de meses e incluso de uno o dos aos.

Pelculas multicapa o slides

Estn constituidas por diferentes capas muy finas, a travs de las cuales se van produciendo todas las etapas necesarias para la determinacin cuantitativa del analito. Tiene la apariencia de una diapositiva y est constituido por cuatro capas (que incluyen todos los componentes del sistema). El sistema de ms amplia implantacin es el Ektachem (Kodak).

Capa difusora: sobre ella se deposita la muestra. Lleva sustancias capaces de reflejar
la luz, es la superficie reflectante. Homogeneza la muestra antes de que llegue a la capa reactiva, distribuyndola por toda la superficie. Retiene clulas, cristales y pequeas y grandes molculas, as la muestra se convierte en un filtrado libre de protenas, eliminndose las interferencias.

Capa reactiva: pueden ser una o varias, son las que Capa soporte: est

contienen los reactivos.

hecha de plstico transparente y sobre ella se depositan todas las dems capas una tras otra. Tiene doble funcin: servir de soporte y dejar pasar la luz, ya que la lectura se hace por la parte inferior (la opuesta a la de la aplicacin de la muestra).

5. INSTRUMENTOS DE MEDIDA PARA BIOQUIMICA SANGUNEA

Son tres los sistemas que se emplean actualmente. Dos de ellos trabajan con tiras reactivas: Seralyzer y Reflotron; el tercero trabaja con slides o reactivos multicapa.
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Seralyzer (Ames)
Emplea tiras reactivas. Tras aplicarle la muestra de suero se coloca la tira en una plataforma termostatizada a 37 que se introduce en el aparato. All es irradiado por un haz de luz que incide sobre la zona reactiva de la tira; all se produce la reflexin. Los valores de reflectancia son convertidos en valores de concentracin.

Reflotron
-Emplea tiras reactivas. Se puede trabajar con sangre total, suero o plasma; ya que incorpora una capa separadora, que consigue la separacin de los eritrocitos del plasma. -Despus de aplicar la muestra, la tira reactiva se introduce en el aparato. El plasma pasa al reservorio situado en la parte inferior de la tira; la reaccin comienza cuando (por accin del aparato) se presiona la capa reactiva sobre la capa reservorio del plasma. -La luz reflejada por la zona de reaccin se recoge en un detector de medida, que convierte los valores de reflectancia en valores de concentracin.

Ektachem
Emplea los slides. Ofrecen medianos y grandes analizadores, cuya finalidad es ser utilizados en el laboratorio clnico. La muestra de suero se aplica en la superficie del slide por el autoanalizador, luego es transferida a una cmara de incubacin. La muestra se difunde a travs de las capas, producindose la reaccin. La lectura se produce por irradiacin que incide en la cara inferior del slide. La luz reflejada es recogida por un detector.

6. SISTEMAS PARA ANLISIS DE ORINA

Los dos sistemas ms difundidos para anlisis de orina son: Sistema Clinitek y Sistema Urotron. Ambos incluyen las tiras reactivas y los lectores de tira de orina. Estructura de las tiras reactivas: -un soporte (lamina de plstico blanca). -zonas de papel impregnando con los reactivos, que van fijados al soporte.
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-cada zona reactiva tiene impregnados reactivos distintos, de manera que cada uno tomara una coloracin diferente cuya intensidad depender de la concentracin del componente en la orina.

Modo de empleo:
1. Sumergir la tira reactiva en la orina 2. Eliminar el exceso de orina 3. Leer el resultado. Se puede hacer visualmente sobre una carta de colores o empleando un fotmetro de reflexin.

Sistema Clinitek
Se emplea la tira reactiva Multistix-10-SG. Est preparada para la determinacin de diez parmetros: Glucosa Bilirrubina Cuerpos cetnicos densidad sangre pH protenas urobilingeno nitritos leucocitos. Esta tira aporta la ventaja de poder hacer la determinacin de densidad de la orina sobre una de las zonas reactivas.

Sistema Urotron
Se emplea la tira reactiva COMBUR-9-TEST. Est preparada para la determinacin de nueve parmetros: glucosa bilirrubina cuerpos cetnicos angre pH protenas
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urobilingeno nitritos leucocitos.

7. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA QUIMICA SECA

VENTAJAS:
el usuario solo necesita aplicar la muestra al reactivo en fase slida para iniciar el anlisis, que tiene lugar en unos minutos no se precisa preparacin previa de los reactivos. Son nicos para cada parmetro y desechables. Tienen larga estabilidad Son fciles de almacenar.

DESVENTAJAS:
Su costo es ms elevado que el de la qumica convencional No es prctico para laboratorios con gran carga de trabajo, ya que por cada tira solo se puede realizar la determinacin de un analito.

UTILIDADES DE LA QUMICA SECA

Se pueden hacer todo tipo de determinaciones bioqumicas, electrolitos, enzimas, perfil lipdico y pruebas derivadas. En los laboratorios clnicos de hoy en da, se emplea esta tcnica para el anlisis de orina, mediante el uso de la tira reactiva. CUADRO RESUMEN DE LOS TEMAS 1-6

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Tema 7 - CENTRIFUGACIN
Fundamentos de las tcnicas de centrifugacin - es una tcnica de separacin de particulas que se basa en la distinta velocidad de desplazamiento de las partculas en un medio lquido al ser sometidas a un campo centrifugo; cuando se centrifuga una solucin => se rompe la homogeneidad y se produce la separacin de solvente y soluto y las 1s partculas en sedimentar son las de mayor masa. Velocidad de sedimentacin - es proporcional a la masa de la partcula y esta propiedad nos permite separar partculas de diferente masa => a (+) masa => (+) velocidad de sedimentacin. ge (gravedad efectiva) - es el tiempo que provoca la sedimentacin forzada cuando se acelera; para acelerar la sedimentacin se puede aumentar la W (velocidad angular); a (+) W => (+) velocidad de sedimentacin; la velocidad de sedimentacin es util para caracterizar partculas y en concreto se usa un valor que llamamos coeficiente de sedimentacin, que es una caracterstica de todas las partculas que nos da informacin de dicha partcula; conocerlo, nos facilita conocer => tamao, densidad y forma de las partculas y adems nos permite disear mtodos de aislamiento de partculas.

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Tipos de centrifugas : 1)- de sobre mesa o baja velocidad o "clnicas": son de pequeo tamao, no necesitan refrigeracin, max.velocidad hasta 10.000 rpm, tiles para partculas grandes (clulas, precipitados,...) 2)- microfugas: son una variante de la anterior; tubos cortos para volmenes muy pequeos, no necesitan refrigeracin, velocidad mas de 10.000 rpm, para volmenes pequeos, se usan en biologia molcular. 3)- alta velocidad : velocidad entre 18.000 y 25.000 rpm, necesitan refrigeracin, algunas tienen sistema de vacio, tiles para separar fracciones celulares (membranas, orgnulos) pero no sirven para virus ni ribosomas o macromolculas. 4)- ultra-centrifugas : velocidad a partir de 50.000 rpm, necesitan refrigeracin, sistema de vacio; hay 2 tipos => 1.analticas (analizan las propiedades de la sedimentacin, tienen detectores, determinan la concentracin de parametros mediante la DO) 2.preparativas(preparar la muestra para luego analizar => aislar virus, macromolculas)

Tipos de rotores: a)- flotantes o basculantes : posicin de 90 con el eje, los tubos utilizados estn unidos al brazo del rotor por su parte superior; se usan para volmenes pequeos de muestra; se utiliza en biologa molecular. b)- de ngulo fijo/angulares: en ngulo fijo (+ o - entre 20-30 con el eje); son paravolmenes mas grandes y se usan en clnica habitualmente; c)- rotores verticales : se produce en vertical (ngulo 0); para volmenes muy grandes; se consigue un "pellet" (sedimento muy poco concentrado); gradiente de densidad isopcnica.
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Centrifugacin analtica - con esta se pretende estimar propiedades fsicas de alguna partcula en concreto, es decir, sus propiedades hidrodinmicas; para esto se tiene que cumplir: - aplicacin en sustancias, en mezclas lo + puras posibles y no a grandes mezclas - se pueden aplicar velocidades elevadas de giro sin que repercute en la muestra - rotor utilizado: deben permitir alinear el tubo con los sistemas pticos que miden la sedimentacin en cada momento. Caractersticas : - poco volumen de muestra - pureza elevada - velocidad de giro elevada - en BQ se utiliza para determinar el coeficiente de sedimentacin y saber que particulas, que composicin tiene la muestra - los sistemas pticos miden la DO de la muestra Aplicaciones : - averiguar la pureza de un compuesto - determinar la proporcin relativa de sus componentes - en investigacin => para conocer e interpretar las estructuras moleculares de diferentes compuestos.
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Centrifugacin preparativa - a diferencia de la anterior, es la tcnica que nos permite preparar o adecuar la muestra para su posterior anlisis; hay 2 mtodos: A)- Centrifugacin preparativa diferencial; es el mtodo mas comn de separacin que nos permite separar las partculas en funcin de su velocidad de sedimentacin (e.j.sangre); el resultado es la obtencin de un sobrenadante y un "pellet" (material sedimentado); es inespecfico, ya que a priori, no se conoce en que fraccin va a quedar cada partcula; muy til para separar clulas y orgnulos sub. celulares. B)- Centrifugacin preparativa en gradiente de densidad: es mas compleja que la anterior; presenta muchas ventajas ya que permite la separacin de varios o todos los componentes de la muestra; en los tubos hay un fluido que de arriba abajo va de menos a mas denso; esto permite separar la muestra por gradiente; la muestra se va colando segn su masa y densidad; esto implica la utilizacin de un soporte fluido cuya densidad aumenta de la parte superior hacia la parte inferior; las caractersticas de este gradientes del fluido son : - material inerte (no altera la muestra) - que no se vea alterado por cambios de temperatura (resistente) - que no absorba radiacin UV (no interfiera en la medicin) - ser isoosmotico (ni hipo ni hiper respecto a la muestra) - no ser corrosivo, inflamable - ser asptico - el intervalo de densidad debe ser suficiente - re-utilizable Ejemplos de fluidos gradientes que pueden separar las partculas de inters:
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- Sacarosa (alta viscosidad => para estudio de protenas) - Ficoll (polisacrido de alto peso molcula; menos viscoso que la anterior; para separacin de clulas y orgnulos subcelulares) - Percoll (menos viscoso que las anteriores; para estudios de fisiologa vegetal (microalgas) y en investigacin. Hay 2 tipos de fluidos - zonal (masa) y isopcnica (densidad) Zonal - se lleva a cabo mediante un gradiente de densidad y las partculas se separan en funcin de su masa; a (+) masa (+) velocidad de sedimentacin (+) abajo; para protenas, macro-molculas, y estructuras subcelulares; caractersticas => si parte de la muestra tiene poco peso no podr con la centrifugacin atravesar las zonas mas densas del fluido; cuanto (+) grande => se sedimentara (+) abajo (atravesar las zonas mas densas); la densidad mxima del soporte tiene que ser inferior o como mucho igual a la de densidad mxima de la muestra, porque si es muy denso no podrn atravesar, pero si es muy bajo quedarn apelotonados todas abajo. Isopcnica - cada partcula se quedar (se coloca) donde encuentra su propia densidad ; para lipoprotenas (LDL) segn su densidades; caractersticas => la densidad mxima del soporte fluido tiene que ser mayor a la densidad mxima de la muestra (porque si la muestra tiene componentes de 15 de densidad y el liquido solo 10, cuando centrifugamos los de 15, 13, 11... quedarn abajo sin separarse).

Definicin de gradiente de densidad - es la distribucin no homognea de un fluido en la que concentracin del mismo va de menos a mas (columna) consiguindose as una distribucin gradual de densidad.

Tema 8 - CROMATOGRAFIA
La cromatografia - agrupa un importante y diverso conjunto de mtodos que permiten separar componentes que estn estrechamente relacionados en muestras complejas ; la muestra a trabajar se disuelve en FM (fase mvil) que puede ser gas o liquido y este FM se
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hace pasar a travs de FE (fase estacionaria) que esta incluida en un soporte que puede ser una columna o una superficie solida; las 2 fases (FM y FE) se eligen de manera que los componentes de la muestra se distribuyen de forma distinta entre ambas; los componentes que se unan fuertemente a la FE se mueven (+) lentamente con el flujo de la FM; los componentes de la muestra dbilmente unidos a la FE se movern rpidamente al ser arrastrados por la FM; Conclusin: la diferente movilidad de los diferentes componentes de la muestra hacen posible la separacin de los mismos y esto permite un estudio tanto cualitativo como cuantitativo de la muestra. MUESTRA (diferentes componentes) => disuelto en FM (fase mvil) de forma gas o liquido => pasar por FE (fase estacionaria) con soporte (columna o superficie solida) => SEPARACIN: componentes con (-) afinidad (movilidad RPIDA) y componentes con (+) afinidad (movilidad LENTA) => Resultado en BANDAS para su anlisis cualitativo y cuantitativo de la MUESTRA. Ventajas de la cromatografia - son mtodos rpidos, simples, tienen un moderado coste, un amplio campo de aplicacin como mtodo de separacin y ademas, la posibilidad de llevar a cabo un anlisis cuantitativo, una vez que se han separado los componentes (cualitativo) en bandas. Clasificacin de los mtodos Cromatogrficas

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Cromatografia de ADSORCIN - es la mas antigua (la que se hizo); FE es solida, FM es liquido o gas; la separacin depende de la polaridad (segn las cargas +/- de las molculas) de las molculas de la muestra (soluto); se suelen hacer en columna; las sustancias a separar (muestra) se colocan disueltas en la parte superior de la columna; los distintos disolventes que van pasando por la columna, separar los componentes por la diferente solubilidad de cada uno en el lquido disolvente; tras la cromatografia cada componente eluye en momentos diferentes y as son separados y cuantificados; adsorbentes (FE) => e.j. carbonato clcico;disolventes (FM) e.j. acetona, metanol, agua. Utilidad => se usa para la separacin de diversas sustancias en orina.

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Cromatografia de REPARTO - FE suele ser liquido y FM liquido o gas (+ soluble + acuosa); se puede hacer en columna o plana; Rf (factor de retencin) => d1 o d2 o d3/ d (es la distancia recorrida proporcionalmente por dicha sustancia d1/d2/d3 dividido entre el frente cromatogrfico/ d); permite separar la sustancia segn su solubilidad.

Cromatografia de INTERCAMBIO INICO Las sustancias se separan por el intercambio de iones; se basa en la interaccin inica del soluto con la FE que tiene grupos funcionales cargados; FM suele ser liquido FE solido; se hacen en columna; el soporte (FE) suele ser una resina cargada positivamente o negativamente; si su carga (del soporte) es positiva => la elucin (lo que sale de la columna) cargada positivamente y si la columna es negativa => el eluyente sera negativo; para conseguir separar las otras cargas retenidas en la columna, se introduce un tampn de ph adecuado en la columna para que las cargas retenidas se eluyan. Utilidad => en BQ para separar amino cido, pptidos, protenas, nucletidos y todos los compuesto de naturaleza inica (Hb, isoenzimas).

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Cromatografia de PENETRABILIDAD o exclusin MOLECULAR (exclusin por tamao) Llamada filtracin de geles; se lleva a cabo en gel (como FE) de forma esferas que estn llenos de poros que pueden ser de mayor o menor tamao segn la sustancia utilizada para fabricar el gel; separa sustancia en funcin de su tamao y forma (no afecta el eluyente, el pH ni la fuerza inica); los de mayor tamao no caben en el poro y pasan por entre las esferas y llegan los primeros; una vez introducidas en el gel, las molculas mas pequeas tardaran mas en salir de la red porosa; quedaran retenidas (+) tiempo ; Las de mayor tamao, al no caber en el poro, pasan entre las esferas y eluyen las primeras; a (+) tamao => (+) velocidad; a (-) tamao => (-) velocidad (son los ltimos en salir, porque se retienen en los poros); Fe es solida (gel) y FM es liquida (puede ser agua o solucin electroltica); la elucin solo depende de la forma y tamao de la partcula.Utilidad => separar sustancias de gran peso molecular (pptidos, protenas, polisacridos, cidos nucleicos, purificacin de ciertas sustancias, etc.).

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Para realizar estudios - Cromatografia de AFINIDAD FE es solida (gel) y FM es liquida; Gel recubierto de Ac anti algo (hormonas, enzimas...); metemos la muestra con distinta composicin, tenemos Ac anti alguno de sus componentes; los dems componentes eluirn a travs de la columna; quedara el Ag y estos podrn salir modificando el ph de la unin. Utilidad => para saber si hay algunas enzimas, hormonas, vitaminas... (para enfermedades que buscan una de las enzimas o hormonas y que cantidad hay).

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Anlisis cualitativo (identificacin) Si comparamos la informacin de la espectroscopia de masas o RMN con la cromatografia, este es limitada; la cromatografia nos da datos del tiempo de retencin y de la posicin de la sustancia en la FE tras la elucin (extraccin de una sustancia del medio que le ha adsorbido); los datos de inters se obtienen a partir de cromatogramas obtenidos de una misma sustancia problema, con diferentes FM y a diversas temperaturas de elucin; es una tcnica muy utilizada para detectar la presencia o ausencia, de determinados componentes en mezclas de las que se conoce su identidad; si en la cromatogrfica no aparece el pico de una determinada sustancia, significa que este ausente ( o a concentracin inferior); se utiliza para favorecer anlisis espectroscpicos posteriores de muestra muy compleja; separacin previa para un estudio posterior de las diferentes bandas igual no siempre ha de ser propio al cuantitativo (solo se sabe si hay o no hay estos componentes); CROMATOGRAMA

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Anlisis cuantitativo (cuantificar) Segn las tcnicas : - en la cromatografia plana => el rea cubierta por las sustancias separadas, las bandas, se recortan, diluyen y en una cubeta se mide la concentracin espectrofotometricamente. - en la cromatografia en columna => la altura o el rea de los diferentes picos obtenidos nos dar la informacin cualitativa al compararlos con determinados patrones. Para esto se realizan cromatogramas de distintos patrones , obtenidos con diluciones de un patrn cuya composicin es similar a la de la muestra problema y se representan grficamente las alturas o reas de pico segn la concentracin; la representacin dar una linea recta, luego se comparan los datos de nuestra muestra con la grfica; los anlisis cuantitativos estn basados en la grfica as obtenida.

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Cromatografia plana - FE se encuentra extendida en una superficie plana y FM es liquida y se desplaza por capilaridad o por adsorcin; 2 tipos => 1)- Cromatografia en papel (PC) - FE generalmente es liquida, se encuentra adsorbida entre las fibras de una tira de papel; tambin interviene un proceso de adsorcin sobre el soporte solido (cromatografia de reparto); tcnica: - colocar en una tira de papel de filtro una gota de solucin de la muestra con un capilar o micro-pipeta (el dimetro no > 5 mm) - dejar secar - colocar la tira en una cubeta de vidrio cerrada con eluyente liquido; el proceso puede tener lugar de 2 formas => ascendente (el eluyente sube por el soporte de papel apoyando en el fondo del recipiente) o descendente (el papel se mantiene colgado de la parte superior del recipiente y el eluyente va descendiendo); el descendente es mas rpido, pero no obtienen buenas separaciones; - dejar que este fluya por la tira de papel (desarrollo del cromatograma) - al finalizar, sacar la tira de la cubeta sealando el nivel exacto alcanzado por el liquido, secar y proceder al revelado. Rf = distancia recorrido por la sustancia (d1/d2/d3) distancia recorrido por el liquido de desarrollo El valor de Rf esta condicionado por factores => la composicin del liquido de desarrollo, la temperatura de realizacin de tcnica, las caractersticas del soporte (grosor, tamao de poro etc.); para considerar el valor de Rf como caracterstico de cada sustancia, es necesario especificar las condiciones en que se ha realizado la medicin; es imprescindible estandarizar las condiciones (Ta, pH, etc.) Revelado con procedimientos fsicos => pulverizar una sustancia fluorescente (e.j.fluoresceina) sobre el soporte de papel y al iluminarlo con fuente de luz ultravioleta, se observan las distintas manchas oscuras sobre un fondo fluorescente. Revelado con procedimientos qumicos => pulverizar el soporte de papel con agentes reveladores que den reacciones coloreadas con los distintos componentes de la muestra problema.
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La determinacin cuantitativa de cada componente se hace mediante fotometra (medida del color de las distintas manchas obtenidas tras el revelado) o someter una mezcla de patrn al mismo desarrollo cromatogrfico del problema y comparar los resultados.

2)- Cromatografia en capa fina (TLC) - tcnica de reparto liquido-liquido que tambin interviene un proceso de adsorcin; el soporte de FE es un material poroso, pulverulento, extendido sobre una superficie de vidrio, plstico o metal (e.j.celulosa, gel de silice/oxido de aluminio/silicato magnesico, poliamida); FM fluye por capilaridad; es una tcnica mas rpida, mas sensible y fiable que PC. Utilidad => separacin de sustancias de bajo peso molecular (amino cidos, lpidos, hidratos de carbono, etc.); se suele hacer de forma ascendente (semejante al PC) y frecuentemente se utiliza la tcnica bidimensional, combinando 2 sistemas distintos de disolventes; la elucin se realiza mediante el raspado de las distintas manchas en el soporte y posterior extraccin con disolventes adecuados; una vez extrados, se procede la identificacin (anlisis cualitativo) y su cuantificacin (anlisis cuantitativo); Drogas => en papel.

Cromatografia en columna - se realiza el transporte de una sustancia a travs de una columna por la adicin continuada de FM (puede ser liquido o gas); el desplazamiento (por presin o por gravedad) de los distintos componentes de la muestra es decir, su velocidad de migracin, depende del tiempo que permanezcan en la FM; el 1er eluyente que sale de la columna es el que tiene (-) afinidad con la FE; FE se encuentra en el interior de la columna; la diferencia de velocidad de los distintos componentes al atravesar la columna permite su separacin; el tiempo que pasa desde que se inyecta la muestra en la columna hasta que el pico alcanza el detector => tiempo de retencin (tR); el proceso sera mas
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efectivo cuanto mas separadas aparezcan unas bandas de otras; ensanchamiento de bandas => este efecto no deseable se puede producir durante la separacin cromatogrfica, lo que disminuye la resolucin de la tcnica que es la capacidad de una columna para separar 2 sustancias; se produce una difuminacin (solapamiento), se mezclan los componentes de las bandas; para evitar, se utiliza columnas de desarrollo suficientemente largas que van a incrementar el grado de resolucin cromatogrfica y as obtener el mximo rendimiento del proceso(optimizacin: conseguir que los distintos componentes de una mezcla se separen totalmente y en el menor tiempo posible); tcnica => (1)- se inyecta la muestra en la columna (2)- adicin continuada de FM (3)- desplazamiento de los distintos componentes de la muestra (4)- aislamiento de las distintas sustancias que hayan podido separadas (pasar suficientemente FM a travs de la columna) hasta que las diferentes fracciones individuales salgan y detectadas por el detector o recogidas (5)- a la salida de la columna, un detector identificara cada una de las fracciones (6)- con la seal recogida por el detector se obtiene una grfica donde aparecen una serie de picos (cromatogrfico) que se utiliza para el anlisis cualitativo y cuantitativo. Aplicacin => determinacin de Hb-glicosilada; separacin de sustancia en orina, en BQ => separacin de amino cidos, pptidos, protenas, nucletidos, Hb, isoenzimas, polisacridos; purificacin de sustancias, muestras orgnicas complejas, compuestos rgano-metlico.

Cromatografia de gases La muestra se volatiza y luego se inyecta en una columna cromatogrfica; este proceso se lleva a cabo por la accin de un gas inerte (FM) cuya funcin es la de transportar la muestra a travs de la columna; la mas utilizada es la cromatografia de gas-liquido (GLC) con FM gaseosa y FE liquida retenida sobre la superficie de un solido inerte. Componentes bsicos: (1)- Gas portador (FM): qumicamente ha de ser inerte, a la presin adecuada y sin agua e impurezas (puede ser => He, N, H, CO2) (2)- Sistema de inyeccin de la muestra: volatiliza la muestra; el sistema mas utilizado para la inyeccin de la muestra es con una micro-jeringa aplicada en la cabeza de la columna (3)- Columnas de desarrollo: hay 2 tipos => de relleno (empaquetadas) y capilares (tubulares abiertas); hoy en da se utilizan las capilares por su gran rapidez y eficacia (4)- Sistema de deteccin: el detector ideal debera tener adecuada sensibilidad, buena estabilidad, gran reproductibilidad, amplio margen de temperaturas, reducido tiempo de respuestas, alta fiabilidad, fcil manejo, no destruir la muestra; los mas usados=> ionizacin de llama, conductividad trmica, termoinicos, captura electrnica, emisin atmica.
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Aplicacin => para anlisis cualitativo, recurrir a => los tiempos o volmenes de retencin de las sustancias analizadas; para el cuantitativo, se utilizan => los picos o reas del cromatograma obtenido; las aplicaciones mas importantes son: - mtodo de separacin inmejorable para muestras orgnicas complejas, compuestos rgano-metlicos y sistemas bioqumicos; - proporcionar un medio adecuado que puede llevar a cabo anlisis mas complejos.

Cromatografia de lquidos de alta resolucin (HPLC) Son mtodos mas utilizados en la actualidad, que se caracterizan por => - permite estudiar lquidos utilizando columnas capilares (+) largas, (-) tiempo para (+) resolucin - su gran sensibilidad - su capacidad para proporcionar determinaciones cuantitativas exactas - su gran utilidad a la hora de separar sustancias no voltiles o termo-lbiles - poder ser utilizados para sustancias de gran inters en la industria en muchos campos de la ciencia Esta tcnica puede ser utilizada para separar => plaguicidas, hidrocarburos, aminocidos, protenas, cidos nucleicos, azucares, drogas, terpenoides (molcula vegetal) Los componentes bsicos: (1)- sistema impulsor de la FM: debe estar libre de vibraciones para no afectar el flujo (2)- inyector: en actualidad es un dispositivo que evita las interferencias en la corriente de disolvente (3)- formador de gradiente (no es indispensable): actualmente con una sola bomba (4)- columna: material plstico compresible que elimina los espacios muertos de la columna (5)- detector: 3 sistemas bsicos (la absorbancia, el indice de refraccin, la fluorescencia (6)- registro-integrador: se obtiene una grfica en forma de picos (cromatograma) que identifica las sustancias analizadas y se puede calcular para el anlisis cuantitativo.

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Tema 9 - ELECTROFORESIS
Electroforesis - proceso de la separacin de las especies cargadas de iones o partculas coloidales en funcin de su distinta velocidad de migracin, cuando estn sometidas a la accin de un campo elctrico; velocidad de migracin (movilidad electrofortica: unidad /tiempo) => la velocidad de desplazamiento de las diferentes sustancias durante el transcurso de la electroforesis; el desarrollo de la tcnica electrofortica, depende de la densidad de carga y condicionada por una serie de parmetros (pH, fuerza ionica, diferencia de potencial del campo elctrico aplicado, la naturaleza de la muestra, interacciones entre la muestra y soporte elegido); es una herramienta practica para el analisis de compuestos biologicos y un metodo analtico/preparativo => separa macromoleculas en una mezcla para la posterior tecnicas mas complejas; la sustancia se desplaza en funcin de su carga y que depende de: (1) la carga de la sustancia (2) el voltaje del campo elctrico creado (3) el coeficiente de friccion/rozamiento entre el soporte y la sustancia => sustancias (+) se dirigen hacia el polo negativo (ctodo) y las (-) hacia el polo positivo (nodo);

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Los componentes bsicos de un equipo de electroforesis - Fuente de alimentacin elctrica: su intensidad en funcin de las necesidades de la separacin de muestras; el voltaje aplicado influye en el resultado de la electroforesis; el calentamiento que se puede generar del aumento del voltaje se soluciona con un sistema de refrigeracin. - Cubeta: donde se coloca la solucin tampn; tiene que garantizarse su correcta limpieza - Puente salino: tiene que estar en contacto con el tampn utilizado, depositado en la cubeta; sobre el colocaremos nuestro soporte - Tampn amortiguador: fijar pH adecuado => proporciona una fuerza inica que permite el movimiento de cargas; no se ha de utilizar el tampn para mas de 2 o 3 separaciones; a + concentracin del tampn - migracin (lenta) => peor separacin y resolucin. - Soporte: sobre el donde se coloca/se aplica la muestra con un aplicador y donde aparecen las bandas con las sustancias separadas tras el proceso electrofortico; se puede realizar directamente en una solucin tamponada (electroforesis libre) o sobre un soporte que permita que las fracciones quedan permanentemente separadas y hacer su cuantificacin (electroforesis zonal); la eleccin del tipo de soporte depende del objetivo del anlisis. - Producto de transparentado (para el acetato de celulosa) - Cubeta de tincin - Equipo de revelado - Peine Las cmaras de electroforesis preferibles son aquellas cuyo tamao es reducido, porque => - presentan una menor superficie de evaporacin - las diferencias de temperatura se minimizan entre un compartimento y otro - permiten una reduccin del tamao de las aplicaciones y pueden procesar mas muestras al mismo tiempo Factores que intervienen en el desarrollo electrofortico (condicionan su utilidad en el laboratorio): (1)- carga neta de la sustancia en migracin (es el grado de ionizacin) de las distintas sustancias en la muestra sometida a electroforesis, depende de pH del medio en el que se lleva a cabo todo el proceso (se determina por la utilizacin del tampn adecuado); es importante en sustancias como protenas que tienen un carcter anftero => puede ser (+) o (-); punto isoelctrico (pi) => valor pH con cargas (+) y (-) es = 0 (cargas neta nula) => sustancia no migra (permanece inmvil en el punto de aplicacin; si pH final > pi => esta cargada (-), la sustancia migrara hacia el polo (+)/nodo y si pH final < pi => esta cargada (+), migrara hacia el polo (-)/ctodo;

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(2)- fuerza inica del medio - tambin depende del tampn; la corriente elctrica es transportada por todos los iones presentes en la muestra y en el tampn; cuando masconcentrado el tampn, mas corriente transportada por los iones de el y menos sera la transportada por la muestra (migra mas despacio); la concentracin del tampn debe ser suficiente para mantener constante pH adecuado y proporcionar fuerza inica que permita el movimiento de cargas => si es > a la requerida => la migracin de las sustancias en la muestra sera mas lenta (no se consigue la separacin deseada) (3)- estructura y el tamao de la sustancia - es importante en aquel proceso electrofortica que selecciona las molculas en funcin de su tamao => retiene las partculas mas grandes y deja pasar la pequeas. (4)- potencial del campo elctrico aplicado durante el proceso- cuantomas potencial elctrico aplicado => mas la movilidad electrofortica de una sustancia; aun as, aumentar el voltaje para acelerar el proceso electrofortico puede tambin aumentar la temperatura y puede causar => alteracin debidas al calor (las protenas plasmticas se desnaturaliza por el calor) y evaporacin del tampn utilizado (queda + concentrado y aumenta su fuerza inica => dificulta el desarrollo electrofortico)

(5)- soporte - se emplea en electroforesis zonal => al final del proceso las fracciones quedan permanentemente separadas y sea fcil proceder a su cuantificacin (electroforesis libre => se realiza directamente en una solucin tamponada); tipos de soporte (depende del objetivo del anlisis) => no restrictivos: acetato de celulosa y gel de agarosa (se usa en diagnsticos clnicos); su separacin electrofortica solo se hace en funcin de su carga elctrica (aun as, las sustancias con elevado peso molecular se ven frenadas o no se desplazan totalmente); restrictivos: gel de almidn y gel de acrilamida/ poliacrilamida(ofrecen alguna resistencia en proceso que depende del tamao de los poros
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del soporte, del tamao y caractersticas estructurales de la sustancia muestra); proporcionan buenas separaciones de las fracciones. -Acetato de celulosa: su estructura deja gran cantidad de huecos de aire; cuando se sumerge en el tampon estos huecos se llenan y el tampn es el encargado de transportar la corriente elctrica por el soporte y se produce la electroforesis; "el cellogel" es el mas usado;ventajas => fcil manipulacin, rapidez de ejecucin, elevada productividad, fcil lectura;desventaja => es material opaco y puede hacer desaparecer las bandas mas dbiles al transparentar-lo; no es del todo uniforme en su porosidad; puede producir distorsiones en el trazada electrofortica; puede producir efectos hipercrmicos (no debidos a la muestra); -Gel de agarosa: tiene elevado tamao de poro, formado por agarosa; ventajas => mayor solucin (por la uniformidad de los poros que favorece la misma velocidad del desplazamiento => banda homognea y ntida), ausencia de efectos cromatogrficos (adsorcin/ intercambio inico), no reacciona qumicamente con la muestra, transparencia completa (contiene mucha agua) que evita la distorsin en el trazado y resultados errneos por efectos hipercrmicos que producen otros medios opacos; carece de cargas elctricas; no presenta problemas de endosmosis; es adecuados para la cuantificacin por densitometra; inconveniente => solo separa en funcin de las cargas, por su elevado tamao de poro; -Gel de almidn: es difcil de preparar (considerable dificultad para obtener un soporte de espesor y porosidad uniforme) y es de preparacin extempornea => desventaja; ventaja=> proporciona un mayor numero de fracciones de la muestra a separar que otros soportes. -Geles de poliacrilamida, ventajas => proporcionan mayor n de fracciones y mejor resolucin en las bandas por lo que se usan en investigacin; el tamao del poro puede variarse segn la composicin del gel, por lo que pueden separar las sustancias segn su carga y tamao; son qumicamente inertes.

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(6)- la intensidad y caractersticas generales de la corriente elctrica aplicada - el voltaje aplicado es muy decisivo: mayor voltaje => mejor es la resolucin; pero esto puede generar el calor y la evaporacin de parte del agua contenida en el soporte y puede deteriorar la muestra; electroforesis convencional sobre gel de agarosa, no tiene este problema, dada la breve duracin del proceso (20 minutos y el moderado voltaje; en cambio, los sistemas que utilizan voltajes elevados deben llevar dispositivos de refrigeracin que mantiene la temperatura durante todo el proceso. (7)- el revelado - se puede recurrir a diversos procedimientos, en funcin de la sustancia y de la sensibilidad requerida; electroforesis de protenas plasmticas => utilizan el colorante azul de coomasie que proporcionan mayor sensibilidad y capaz de detectar desde 1/2 microgramo de protena; la utilizacin de sustancias fluorescentes como la fluoresceina aumenta la sensibilidad hasta 1 nanogramo; la tincin de plata mejora unas 100 x la sensibilidad obtenida con el colorante de coomasie.

Electroforesis de Protenas Su realizacin es posible, porque tienen diferente masa, tamao, peso molecular (a mas peso molecular (pm) => menos movilidad electrofortica), estructura y carcter anftero (pueden estar cargadas positivo (+) o negativo (-), lo que conseguimos con la influencia de pH). Se utiliza tampn Veronal (pH 8,6) => todas las fracciones proteicas del suero se encuentran cargadas (-) => aplicando a muestra en el ctodo, migraran hacia el nodo /el polo (+);procedimiento: (a)- sumergir 10 minutos las tiras de acetato de celulosa en el tampn (b)- colocar las tiras en el puente de la cubeta de electroforesis, una vez eliminado el exceso de humedad (c)- proceder al deposito individual de la muestra sobre el soporte, mediante "el aplicador" (micro o macro) (d)- introducir el puente de la cubeta, en contacto con el tampn depositado en la misma
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(e)- tapar la cubeta, conectar todo el dispositivo a una fuente de corriente continua ajustando la intensidad de corriente en funcin de las necesidades (f)- transcurrido el tiempo adecuado de migracin, desconectar el equipo y revelar las tiras mediante la tincin adecuada que se fije especficamente a la muestra procesada; si la muestra es plasma, saldr una banda mas (fibringeno); si el soporte es de acetato de celulosa, la muestra de suero obtiene 5 bandas => albumina (la que mas migra), alfa-1, alfa-2, beta (cuando el soporte es gel de agarosa, esta banda se divide en 2: beta-1 y beta2),gamma (es la que menos se desplaza en suero no patolgicos/la banda mas ancha). (g)- proceder a la cuantificacin de cada una de las fracciones obtenidas => se puede utilizar el aparato espectrofotometra o densitometra.

Espectrofotometra => recortar cuidadosamente cada una de las bandas obtenidas; introducir cada banda en un tubo con una sustancia capaz de disolverla completamente; realiza la lectura del color (la DO obtenida de cada banda es proporcional a la concentracin de la sustancia incluida)

Densitometra => transparentar el fondo de tira mediante una sustancia transparentadora adecuada (importante conseguir el punto optimo de transparentado de las tiras); introducir la tira en un densitmetro, se obtiene una grfica, en el que aparecen cuantificadas cada una de las fracciones presentes en la sustancia sometida a la separacin electrofortica; densitmetro (el aparato) produce proteinograma;albumina: la mas abundante y la que migra mas lejos (peso molecular inferior => queda menos retenida); gamma globulina: la banda es mas ancha y la de mayor peso molecular=> menos se desplaza; alfa-1globulina: es la menos abundante con peso molecular menos que

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albumina; si es patolgico se ve una alteracin en alguna de las bandas; beta globulina: tiene menos peso molecular que alfa-1 y alfa2.

Precauciones generales (durante el proceso electrofortico) - sumergir completamente las tiras (gel de agarosa o de acetato de celulosa) para evitar burbujas que podran dar lugar a manchas opacas sobre la tira; - aplicar la muestra en forma de linea fina, mediante un capilar o un aplicador para evitar el exceso que podra dar lugar a distorsin en el trazado; - no utilizar el tampn para mas de 2 o 3 procesos electroforticos - asegurar el contacto con los electrodos (preferentemente de grafito) - garantizar la correcta limpieza de la cubeta y de todos los recipientes utilizados - mantener un estado de hidratacin de las tiras (ni demasiada humedad para evitar la difusin de las bandas, ni demasiada sequedad que podra propiciar el deposito de protenas en exceso) Otras aplicaciones - de forma semejante a la electroforesis de protena, tambin se realiza con frecuencia en el laboratorio, la de otras sustancias de gran inters clnico => lipoprotenas, hemoglobina y otras susceptibles de ionizacin en funcin del pH.

Electroforesis de muestras de orina - la deteccin de la protena de BenceJones =>aparece como 1 o 2 bandas en la zona beta-gamma y mas raramente en la zona de alfa-2 o alfa-1; el mtodo electrofortico es el procedimiento mas seguro para su deteccin, ya que el llamado "test de calor" para la bsqueda de esta protena proporciona aproximadamente 2/3 de falsos negativos y 1/5 de falsos positivos y las tiras reactivas que detectan protenas en orina no son tiles para el hallazgo de protena de Bence-Jones.

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Interpretacin de los distintos trazados electroforticos - la mayora se realiza por una persona experta, es suficiente para obtener una interpretacin; frecuentemente, se proporciona mayor informacin sobre la relacin entre los distintos trazados o patrones electroforticos y ciertas patologas; dichos patrones proporcionan informacin acerca de lo que ocurre en el organismo durante determinados procesos; las enfermedades tienen patrones predominantes, sin embargo, al no ser especficos, no permiten por si solos llevar a cabo el diagnostico.

Electroforesis capilar y su diferencia con la convencional Electroforesis convencional (explicado anteriormente) => ha sido utilizado durante muchos aos para separar especies complejas de elevado peso molecular de inters biolgico y bioqumico; se puede utilizar un sistema de refrigeracin para evitar el calentamiento (efecto Joule) que se produce al aumentar el potencial elctrico (as conseguir mas velocidad) que puede afectar negativamente a la calidad de la separacin y resolucin); el soporte es papel o gel. Electroforesis capilar => es una tcnica alternativa para paliar la dificultad del calentamiento que se produce (efecto "Joule" => la dependencia directa entre velocidad/resolucin y campo elctrico); se utiliza como soporte un tubo capilar con un dimetro interno < a 0,1 mm y longitud entre 50 cm - 1 m; el soporte de la tecnologa utilizada ofrecen separaciones con volmenes de muestra extraordinariamente pequeos (0,1 - 10 nL), con una elevada resolucin y rapidez y los resultados son mas fiables; no hay manipulacin => todo esta automatizado y digitalizado; se puede aumentar
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el campo elctrico sin peligro; la tecnologa de la electroforesis capilar permite evaluar de forma cuantitativa cualquier parmetro estable incluido en una muestra liquida; Utilidad=> anlisis de protenas, vitaminas, grasas, carbohidratos, pesticidas, anlisis gentico, iones.

Tema 10 - BIOLOGA MOLECULAR

Las tcnicas de biologa molecular - se aplican en el laboratorio clnico (microbiologia, bioquimica, hematologa etc.) para el diagnostico de patologas de origen genetico de las que es conocido el gen causante; se basan en la capacidad de los acidos nucleicos de autoreconorse => detectar y unirse unica y exclusivamente a su secuencia complementaria ; capacidad de auto-duplicarse; se usan en tcnicas de transferencia de Southern Blot y de Northern Blot y las tcnicas de ampliacin de cidos nucleicos mediante RCP/PCR para el diagnostico de enfermedad infecciosas, anlisis de paternidad y un patrn de huellas de ADN;

ADN /acido desoxirribonucleico => una larga molcula nica de doble cadena(bicatenario /dicatenario) formada por la unin de 2 cadenas helicoidales de polinucletidos enrollados a lo largo de un eje comn; las cadenas corren en direcciones
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opuestas; esta en el ncleo; esta formado por cadenas nucletidos en los que el azcar (pentosa) es la desoxiribosa y las bases nitrogenadas son la purnicas (adenina, guanina) y pirimidnicas (citocina, timina); situado en el ncleo y forma cromosoma; esdonde se guarda la informacin necesaria para fabricar protenas; es un cdigo que se traducir en amino cidos y luego protenas.

ARN /acido ribonucleico => es una molcula (con variaciones ARNn, ARNt, ARNr, etc.) formada por una nica cadena (monocatenario) helicoidal compuesta de una sucesin de nucletidos; sale del ncleo (esta en el citoplasma); es la sucesin de nucletidos, donde el azucar/pentosa es la ribosa y las bases nitrogenada son purnicas (adenina, guanina) y pirimidnicas (citocina y uracilo); no forma cromosoma; es el encargado de transmitir la informacin que guarda el ADN (intermediario para la sntesis protenas).

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Hibridacin de cidos nucleicos - consiste en la fijacin "in vitro" de ADN o ARN marcada (en la mayora con un isotopo radioactivo, sustancia qumica o enzimas) a su correspondiente cadena complementaria procedente de la muestra biolgica perteneciente al paciente; esta tcnica se basa en la capacidad de los cidos nucleicos de autorreconocerse => detectar y unirse nica y exclusivamente a su secuencia complementaria; reactivos necesarios: (1) acido nucleico diana de la muestra (2) sondas de hibridacin =>fragmentos de cidos nucleicos marcados, se elaboran en el laboratorio y su secuencia de bases es complementaria a la secuencia genmica del ADN diana .

Los sistemas de marcaje de sonda o sistemas indicadores - sistema mediante los cuales se marca la secuencia gnica => para poder visualizar una secuencia de ADN/ARN conocida y facilitar el posterior sistema de deteccin de la enfermedad determinada y lectura de resultados; esta secuencia de ADN es la que se busca en la muestra del paciente, son especificos porque contienen una secuencia de bases que es complimentaria a la secuencia genmica del DNA diana; tipos de sonda: a. Qumico - la sonda se une a sustancias qumicas b. Radioactivo - se incorporan a la estructura molecular de la sonda isotopos radiactivos
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c. Enzimtico - se une la enzima y la secuencia de acido nucleico mediante una cadena carbonada d. Antignico - se dota a la secuencia de la sonda de capacidad antignica modificando alguno de sus nucletidos e. Colorimtrico - se une la sonda a compuestos coloreados o capaces de formar compuestos coloreados; Bromuro de Etidio => se usa como marcador rpido de ADN, que tiene la capacidad de intercalarse en las cadenas de ADN, y al incidir con luz UV emite una luz rojiza anaranjada que es mayor cuando este unido el ADN (sirve para detectar el ADN).

Tcnicas de hibridacin (1) Extraccin del acido nucleico/ purificacin de cidos nucleicos (tcnica del fenolcloroformo) => se dispone en el mercado de sistemas de aislamiento de ADN a partir de sangre perifrica o de clulas en suspensin (leucocitos) para la obtencin de ADN puro; tcnica de extraccin: - lisis celular => romper la membrana celular y nuclear con solucin de lisis celular (mediante la accin del reactivo y incubacin) - desproteinizacin => quitar todo lo que no sea material gentico con la tcnica de fenolcloroformo; las protenas parcialmente degradadas, se eliminan de la disolucin mediante una extraccin con fenol-cloroformo (mediante aplicacin de reactivo, centrifugacin y decantacin repetitivo) - comprobacin de la efectividad de la desproteinizacin (mediante lectura de absorbancia por espectrofotometra) => se calcula la relacin de absorbencias a las 2 ondas y la relacin optima oscila entre 1,6 (260) y 2 (280); es para comprobar si la muestra es pura. Aplicacin => diagnostico de leucemia mieloide crnica (LMC) y talasemias (2) Tcnica de Southern Blot - fases: - purificacin de cidos nucleicos con tcnica de fenol-cloroformo => obtener ADN puro - digestin del ADN por EdR: incubacin de ADN o ARN de la muestra con EdR (endonucleasas de restriccin => enzimas que seccionan la cadena); objetivo: romper el ADN en diversos fragmentos; se incuba la EdR con el ARN a 37oC y se comprueba la efectividad del proceso, disolviendo una pequea cantidad de ADN en azul de bromofenol y realizar una electroforesis en un minigel de agarosa => se observan sus fragmentos bajo la luz UV (se obtienen diferentes fragmentos de ADN con regiones diana); - separacin de los fragmentos de ADN: disolver el gel de agarosa; - desnaturalizacin del gel: mezclar el gel de agarosa con diferentes soluciones de desnaturalizacin, centrifugar y decantar el sobrenadante hasta que quede limpio; desnaturalizacin del ADN => separar las dos hebras de ADN para poder juntarse
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con el hbrido (en un medio astringente para que no se unan entre ellas) mediante calor (alerta: no fundir el gel porque se estropea el ADN). - electroforesis (para separar los fragmentos por tamao); en gel de agarosa o poliacrilamida. - transferencia a un filtro de nitrocelulosa: hacer pasar el gel por una batera de solucin de elevada fuerza inica => afinidad por el ADN; fija las bandas a un soporte mas estable antes de la hibridacin; Por absorcin, por capilaridad, ascienden las bandas al papel de nitrocelulosa que es muy resistente y manejable (fijadas para siempre). - prehibridacin e hibridacin de cidos nucleicos: la unin de las sondas marcadas (con isotopos radiactivos) con el ADN diana desnaturalizado (para marcar la secuencia gnica, si esta o no); se realiza en una cmara de hibridacin con condiciones controladas de temperatura a 42C, pH, humedad, concentracin de sales, medio astringente etc; se uniran a la sonda, no entre ellos; - lavado y revelado: una vez acabado el proceso de hibridacin, se elimina el exceso de radiactividad con un lavado de filtros (para quitar el exceso de radiacividad), se procede el secado, se pone en contacto con la pelicula radiografica; unos dias despues revelar la pelicula y lectura de resultados segun el metodo de marcaje usado. Presencia o ausencia del fragmento de acido nucleico responsable de la enfermedad genetica y se realiza la lectura de los resultados. La deteccin /lectura de los resultados: - marcaje qumico => mediante quimioluminiscencia (se mide la luz emitida por las sondas de la muestra con espectroscopia de luminiscencia) - marcaje radiactivo => autorradiografa recuento de centelleo (medir la cantidad de radiactividad emitida por la muestra; p.e. isotopos 32P, 125I) - marcaje enzimtico => espectroscopia (se aade al medio un sustrato cromgeno que al reaccionar se convierte en producto coloreado; a mas color, mas cantidad de muestra; el color es lo que se busca) - marcaje antignico => espectroscopia y microscopia (Ac contra ese Ag que esta marcada la sonda; el Ac estar marcado con fluorescencia) - marcaje colorimtrico => espectroscopia (lectura de la DO absorbida por la muestra) Aplicacin => deteccin de talasemias alfa, reordenamiento de genes, varias patologas. Astringencia => el grado de inters o afinidad de la sonda por su acido nucleico diana;cuando las condiciones del ensayo son optimas => aumenta su nivel. Digoxigenina => es una sustancia capaz de reaccionar qumicamente y formar compuestos coloreados; se une a la sonda de marcaje; es un marcador antignico, qumico y colorimtrico. Bromuro de etidio => es un marcador rpido de cidos nucleicos; es mutagnico y cancergeno; tiene la capacidad de intercalarse en el ADN cuando se expone a la luz UV, emite un color naranja, rojizo que es mayor cuando este unido al ADN; sirve para detectar el ADN. Azul de bromofenol => es un indicador de pH, se disuelve en el gel; es usado como frente electrofortico, para poder ver (azul) como corre el gel y asegurarnos que las bandas no se salgan (tiene menos peso que el ADN y corre mas). Western Blot => la misma tcnica pero para el estudio de las protenas; sntesis de determinadas protenas (enfermedades); se hacen con marcadores Ac anti esa protena.

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EdR (endonucleasas de restriccin) => son enzimas (hay + de 100 diferentes) queseccionan una cadena de ADN tras reconocer una secuencia especifica constituida entre 4-8 pares de bases nitrogenadas que delimitan las denominadas zonas de restriccin; estos fragmentos se podran separar y reconocer por electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida y van a ser utilizadas de secuencias de ADN (y ARN) para cortar trozos grandes de ADN en fragmentos mas pequeos; el ARN no se corta porque ya lo encontramos de diferentes tamaos; con la electroforesis los separaremos por tamao son extrados de microorganismos; pueden ser romos o cohesivos; en la tcnica Northern Blot no se necesitan (no hace falta cortar) ya que el ARN son copias pequeas de ADN. Tcnica de Northern Blot - es similar a la tcnica de Southern Blot; la diferencia es que se utiliza ARN; la composicin y estructura del acido nucleico es diferente por lo que las tcnicas sern similares desde el momento de la desnaturalizacin del ADN en la tcnica de Southern Blot; muchas veces se trabaja con el ARN porque no se rompe / no se ha de desnaturalizar => son trozos pequeos, no necesitan endonucleasas de restriccin.

Ampliacin de cidos nucleicos mediante PCR/RCP (reaccin en cadena de la polimerasa) PCR => es un proceso de amplificacin selectiva y enzimtica "in vitro" de una secuencia de ADN de hasta 3 kb; es una tcnica de gran especificad y sensibilidad, pero puede dar un falso negativo si la muestra esta contaminado; el proceso del termociclador: 1- extraccin y purificacin de la molcula de ADN de la muestra problema (lisis celular, desproteinizacin para obtener ADN puro y comprobacin de la efectividad de la desproteinizacin); ADN diana o target ADN => pocillo 2- desnaturalizacin de la doble hlice de ADN, mediante la aplicacin de calor (se produce la separacin de las 2 hebras) para favorecer la unin de los cebadores; el termociclador la desnaturaliza a 90-95 - 20"; se aaden cebadores en exceso; pocillo => ADN 3- hibridacin de las cadenas por separado con los cebadores /primers (40-60 - 20"), que son cadenas de 15 o 20 nucletidos que se van a unir al ADN por los extremos opuestos de las cadenas complementarias; son necesarios 2 por PCR, cada uno complementario a una cadena del ADN, se encuentran en exceso de concentracin para favorecer el proceso; se obtienen mediante sintetizadores de ADN, una vez conocida la secuencia del ADN diana; pocillo => primers 4- extensin del complejo cebador-ADN mediante la accin de la polimerasa (70-75C 30"); se obtiene a partir de la bacteria termus aquaticus (Taq-P) que es resistente al calor a pesar de ser una proteica; se aaden desoxinucletidos (dNTP) para ir uniendo y copiando la diana y la Taq-Polimerasa que va a catalizar la reaccin de elongacin de un cebador

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fijado en el extremo 3' a una cadena molde de ADN; para ello, une dNTP al extremo 3' del cebador en direccin al extremo 5' del ADN molde; pocillo => Taq-polimerasa + dNTP 5- renaturalizacin => se baja un poco la temperatura para facilitar la unin/ que se enrosquen (unin de la copia con el ADN diana 45-60) 6- repeticin de los ciclos de extensin hasta que se alcance la dimensin que se haba pautado. 7- deteccin del ADN amplificado por electroforesis o hibridacin de ADN. En los pocillos => ADN diana, primers o cebadores, desoxinucletidos (dNTP), Taqpolimerasa, tampn y otros reactivos. Ventajas de la tcnica => - necesita menor cantidad de muestra y es capaz de detectar cantidades de acido nucleicos muy pequea del orden nanogramos; - permite amplificar de manera selectiva y enzimtica "in vitro" un fragmento de acido nucleico (ADN/ARN) y hacer copias en un tiempo muy corto; - permite la deteccin de una sola molcula de ADN en la muestra problema a pesar de estar mezclada con otras molculas de ADN diferentes, se consigue fabricar mltiple copias de una secuencia de 1 ADN Aplicacin: Hibridacin cidos nucleicos => LMC, deteccin de talasemias, hemofilia, fibrosis qustica; Genticas => diagnostico de enfermedad infecciosa (bacilo de Koch, clamidia, meningitis); Investigacin => enfermedad oncolgica (han abierto un gran abanico y avance en el estudio de muchas enfermedades; pruebas de paternidad;Conocimiento y tipaje vricas y bacterianas; las tres tcnicas van unidas en la PCR; un patrn de huellas de ADN, VIH en fase de incubacin, para las donaciones de sangre, paleontologia, antropologia, ciencias forenses, criminologia.

Cebadores - son oligonucletidos que hibridan con el ADN desnaturalizado que se pretende amplificar en extremos opuestos de las cadenas complementarias; son necesarios 2 cebadores/RCP cada complementario a una cadena del ADN; siempre se encuentran en exceso de concentracin para favorecer el proceso; se obtienen mediante sintetizadores de ADN, una vez conocida la secuencia del ADN diana; se seleccionan de manera emprica. Oligonucletido - secuencia corta de ADN (grupo de 15-30 nucletidos) Nuclesido - es molcula formada por la unin de 1 pentosa con 1 base nitrogenada con enlace covalente Nucletido - es la unin de un nuclesido con acido fosfrico (pentosa + base nitrogenada + fosfrico)
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Sonda - fragmento de acido nucleicos marcados y formados por entre 15100 nucletidos; se elaboran en el laboratorio y su secuencia de bases es complementaria a la secuencia genmica del ADN diana.

Tema 11 - Estudio general del metabolismo de las protenas

Protenas son macro-molculas de masa molecular elevada, formadas por aminocidos unidos mediante enlaces peptdicos; pueden estar formadas por una o varias cadenas; son biomolculas formadas bsicamente por C - H - O y N; suelen ademas contener azufre y algunas contienen ademas fsforo, hierro, magnesio o cobre entre otros elementos;son las mas abundantes de las biomolculas => 50% del peso seco de las clulas; son sustancias muy verstiles; se forman en el ribosoma a partir de la informacin suministrada por los genes; la unin de aminocidos da lugar a: - oligopptido: numero de aminocidos < 10 - polipptido: numero de aminocidos > 10 - protena: numero de aminocidos > 100

"En los enlaces peptdicos, el grupo carbxilo se une al grupo amino de otro AA y libera una molcula de H2O (agua)".

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AAs son compuestos anfteros (anfolitos) => puede comportarse como cidos o como bases; cada AA posee un punto isoelctrico (Pi) caracterstico; al pH de su Pi tienen carcter neutro=> no presentan carga neta alguna; a pH fisiologico, el grupo amino se encuentra protonado (-NH3+) y el carboxilo sin protonar (-COO-) => zuitterion; los alfa-aminocidos pueden representarse por NH2-CHR-COOH, siendo R un radical o cadena lateral caractersticas de cada aminocido; grupos R son muy variados qumicamente;20 aminocidos forman protenas (aminocidos proteicos => esen cial/proviene de la dieta y no esencial/sintetizados por el organismo), mientras otros nunca se encuentran en ellas; AA esencial => arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptfano y valina; todas las protenas son cadenas lineales compuestas de algunos de estos 20 aminocidos;

Clasificacin de los aminocidos - segn lo que poseen la cadena lateral - aminocidos alifticos => cadena hidrocarbonada (glicina, alanina, valina, leucina isoleucina) - aminocidos aromticos => posee un anillo aromtico (prolina, fenilalanina, tirosina, triptfano) - aminocidos azufrados => poseen tomos de azufre (cisteina y metionina) - aminocidos hidroxilados => cadenas alifticas hidroxiladas /mas hidrofilicos y reactivos (serina, treonina) - aminocidos cidos y sus amidas => de naturaleza cida y sus amidas (cido asprtico, asparragina, cido glutmico, glutamina) - aminocidos bsicos => muy polares (lisina, arginina, histidina) Alteraciones de aminocidos: - aminoacidopatas: errores metablicos congnitos

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- dficit enzimtico: fenilcetonuria (falta de fenilalanina hidroxilasa), trastornos del ciclo de urea/hiperamoniemia, albinismo (falta de tirosinasa) - fallos en el transporte de aminocidos: cistinuria (fallo en la reabsorcin renal o fallo en la absorcin intestinal)

Catabolismo de aminocidos AA endgeno y exgeno se cataliza mediante transaminacin o por desaminacin oxidativa, tiene lugar en el higado y en el musculo; cuando se necesitan, AA se utilizan para la sntesis de protenas/proteognesis (transaminacin) y otros productos biolgicos; el destino de la cadena hidrocarbonada es => formacin de Acetil CoA para: la sntesis de glucosa (gluconeognesis), el ingreso en el ciclo de Krebs para la obtencin de energa o para la sintesis de grasas/lipogenesis; el grupo amino => cuando no es utilizado para la transaminacin es degradado hasta amoniaco (desaminacin oxidativa) que el higado transforma en urea (ciclo de la urea) y glutamina; algunos AA son utilizados en la sntesis de productos de gran inters biolgico (hormonas, neurotransmisores, enzimas, nucletidos, etc).

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Estructura de las protenas: - la estructura primaria: determinada por la secuencia de AA en la cadena proteica (el numero de AA presentes y el orden en que estn enlazados); - la estructura secundaria: es el plegamiento que la cadena polipeptdica adopta gracias a la formacin de puntes de hidrgeno entre los tomos que forman el enlace peptdico; se distingue varios tipos de conformaciones => conformacin al azar, hlice alfa, hoja beta, giros beta, conformacin del colgeno, estructuras supersecundarias; - la estructura terciaria es la disposicin tridimensional de todos los tomos que componen la protena; es la responsable directa de sus propiedades biolgicas; esta determinada por la secuencia de AA (estructura primaria); - la estructura cuaternaria: protenas con mas de una cadena polipeptdica (oligomrica).

Clasificacin de las protenas (1) segn su composicin: simples => solo aminocidos (albumina); conjugadas => ademas de AA posee un componente no proteico (nucleoprotenas => acido nucleicos, fosforoprotenas, cromoprotenas/ colorante, glucoprotenas/ hidrato de carbono, lipoprotenas/ lpidos)

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(2) segn su disposicin espacial: fibrosas => cadenas polipeptdicas en paralelo a un eje unidos por puentes di-S e H (colgenos); globulares => una o mas hlices alfa enrolladas sobre si mismas en estructura compacta (hormonas, enzimas, anticuerpos) (3) segn su funcin biolgica: estructurales (colgeno); transporte (albumina, hemoglobina, transcobalamina); catalizadores biolgicos (enzimas);mensajeros qumicos (hormonas); def ensa inmunolgica (anticuerpos); (4) segn su localizacin: hsticas/tejidos; hemticas/en el plasma. Protenas plasmticas - existe mas de 125 distintas, forman parte de un sistema metablicamente dinmico; funciones: - fuente de nutricin para los tejidos (sobretodo la albumina) - mantenimiento del equilibrio osmtico (adecuada distribucin hdrica en los diferentes compartimentos del organismo) - amortiguadores o tampones fisiolgicos (regular pH) - transporte de diversas sustancias (iones, bilirrubina, cidos grasos, hormonas, frmacos) - funciones defensivas (gammaglobulinas/ inmunoglobulina/ anticuerpos) - otras funciones => factores de coagulacion, inhibidores enzimticos, pro-enzimas, enzimas, etc. Protenas totales => la suma de las concentraciones de todas y cada una de las protenas presentes en el plasma; VN 6-8 g/dl; el aumento => disminucin relativa del volumen de liquido plasmtica (hipovolemia o deshidratacin); la cantidad no varia, sino la proporcin entre estas y el nivel hdrico del organismo; la disminucin => aumento del volumen plasmtico (retencin de lquidos), disminucin en la sntesis de albumina (alteracin heptica, desnutricin), descenso en la produccin (hipogammaglobulemias) o aumento de las perdidas (quemaduras internas, sndrome nefrtico) de la fraccin de las gammaglobulinas (hipoproteinemia). Estudio de las diferentes fracciones de protenas plasmticas: - electroforesis => separa fsica-qumicamente y cuantifica las fracciones mas importantes de protenas plasmticas obteniendo el patrn electrofortica (en acetato de celulosa : albmina, alfa1, alfa2, beta y gamma globulinas); en cada fraccin hay protenas con movilidad semejante aunque muy distintas en estructura y funcin; por eso, para obtener mas especificidad usamos la inmunoelectroforesis; - inmunoelectroforesis => combina la separacin electrofortica con la provocacin de reacciones inmunolgicas entre las protenas y Acs especficos frente a ellas (complejos Ag-Ac); las fracciones proteicas se detectan mediante la aparicin de arcos de precipitacin; importante cualitativamente por detectar un gran numero de fracciones y detectar inmunoglobulinas anmalas; - inmunodifusin radial (proteinograma sola no se puede usar para diagnostico, hay que hacer serologia completa) => es una tcnica de tipo inmunolgico, consiste en colocar el suero a analizar en un pocillo practicado en una placa de agar, impregnada de Ac contra la protena que se desea valorar (por adsorcin cada protena queda atrapada con su Ac); la reaccin entre los dos forma un anillo de precipitacin cuyo dimetro es proporcional a la cantidad de protena presente en la muestra; se cuantifica usando patrones.

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Fracciones de protenas en el plasma Prealbmina => la informacin/el indicador de la nutricin proteica, sobre todo en bebes y prematuros; transporta la vitamina A; no aparece en electroforesis. Albmina => 55% de total; esencial en la nutricin; contiene todos los AA esenciales ; responsable de presin osmtica (retiene agua); regula equilibrio cido-bsico (tampn pH); transportar sustancias; se une a lpidos formando lipoprotenas; su vida media 15 das. Globulinas => grupo heterogneo, formados por protenas y protenas conjugados (glucoprotena, lipoprotena); se separan (mediante electroforesis) en 3 grupos alfa, beta y gamma; - alfa => 14-15% de total; tienden a aumentar cuando hay un dao hstico activo; aparece en muchos procesos/ es inespecifica: traumatismo, procesos malignos, inflamacin); de divide en alfa1 (subfraccin: alfa1-antitripsina, alfa1-lipoprotenas, transcobalamina, protrombina) y alfa 2 (subfraccin: ceruloplasmina, haptoglobina, alfa2-lipoprotenas, eritropoyetina, alfafetoproteina); - beta => 12-14% de total; es estable, no suele aparecer alterada; - gamma => 17% de total; son las inmunoglobulina (IgG,IgA,IgM,IgD,IgE)/ Acs de inmunidad humoral; su movilidad electrofortica es muy variada (banda ancha en proteinograma); protena C: reactante de fase aguda (altamente sensible); utilidad de de la protena C reactiva (PCR) en suero => aunque no sirve como prueba diagnostica, pero ayuda a establecer el diagnostico de inflamaciones agudas, necrosis hsticas (es inespecifica);es fcilmente alterable por un gran numero de enfermedades; nos sirve como
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complementaria para el seguimiento de enfermedades y ver la efectividad de un tratamiento. Fibringeno => en una electroforesis, migra entre beta y gammaglobulinas; es un reactante de fase aguda; es un precursor de la fibrina (coagulacion).

Alteraciones de las protenas plasmticas (1) disproteinemias => alteraciones en la distribucin de las fracciones obtenidas tras una electroforesis - hipoalbuminemia => por sntesis insuficiente (malnutricin/dficit de determinados AA y insuficiencia heptica/fallo en la sntesis de albumina);por eliminacin y degradacin excesiva (sndrome nefrtico/se pierde albmina por la orina, alteraciones gastrointestinales/perdida por heces, quemaduras extensas /se pierde por la piel); - hipo-gamma-globulinemia => disminucin de las gamma-globulinas, por deficiencias en el sistema inmunitario; - hiperglobulinemia (alfa, beta y gamma) => aumento de las alfa-globulinas (en inflamaciones agudas, tumores y necrosis de tejidos); aumento de las alfa y beta globulinas (caracterstico del sndrome nefrtico/enfermedad renal); aumento de las gamma-globulinas (en inflamaciones, hepatopatas, enfermedades de colgeno/artritis reumatoides, esclerodermia/acumulacin de colageno/tejido conjuntivo en la piel y otros rganos) (2) paraproteinemias => presencia en el plasma de alguna Ig anormal y/o de alguno de sus fragmentos; son el producto de una actividad espontanea y excesiva de un "clon" proliferante de linfocitos B (gammapatas monoclonales) que suele ocurrir en: mieloma multiple/ tumor de las clulas plasmticas, leucemias y linfomas; y tambin como consecuencia de ditesis hemorragica, lesiones renales, sndrome de hiperviscosidad; (3) crioglobulinemias => circulacin en plasma de Ig que precipitan al descender la temperatura; causas: trastornos circulatorios en las regiones distales de las extremidades y por inflamaciones de los vasos/vasculitis; (4) alteraciones de alguna banda (defectos aislados de alguna fraccin) => defectos de las protenas plasmticas debidos a trastornos de la propia sntesis proteica (hereditario/adquiridos); (5) alteraciones de la proteinemia total => hiperproteinemia autentica (no causado por hemo-concentracin /suele ser debida a un aumento de globulina alfa, beta o gamma; la mas frecuente es de gamma-globulinas; hipoproteinemia => disminucin de las 2 fracciones importantes (albumia y gamma-globulinas) Mtodos generales de determinacin de protenas - cuantificacin de protenas en suero y en orina Protenas totales => se utiliza el mtodo de Biuret; es determinacin colorimtrico directo "in vitro" de protenas en suero o plasma; fundamento => en disolucin alcalina, las protenas forman con los iones cobre (Cu2+) un complejo coloreado de gran estabilidad,
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cuantificable espectrofotomtricamente; el reactivo contiene CuSO4 (sulfato de cobre) en solucin acuosa alcalina; la reaccin se produce en los pptidos y las protenas por la destruccin de su enlace peptdico (liberando los aminocidos); la reaccin se basa en la formacin de un compuesto de color violeta (intensidad de color = la concentracin de protenas) debido a la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos; mtodo => 20 lambdas de muestra (suero o plasma) o solucin de protenas + 1 ml de reactivo (mezclar) => dejar reaccionar 10 minutos a temperatura ambiente => medir la absorbancia a 540 nm; reaccin de Biuret => complejo de coordinacin formado en solucin alcalina entre los iones cpricos y los tomos nitrgeno nuclefilos de cuatro moleculas de Biuret.

Determinacin de albumina (metodos de fijacin de colorantes) - fundamento => a un pH acido, la albumina (nicamente) se combina especficamente con el verde de bromocresol para forma un complejo coloreado que se determina fotomtricamente; es un metodo colorimtrico; - determinar a la vez albumina y protenas totales es fundamental para el estudio del metabolismo proteico; - detectar las alteraciones del nivel de albumina (protena mayora) tienen un inters clnico muy significativo. Determinacin de protenas totales en orina (metodos turbidimtricos) - el mas utilizado es el del acido tricloroactico ; es de gran exactitud y precisin; fundamento => determinan espectroscopicamente, la turbidez debida a la presencia de protenas.

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Proteinograma de algunas enfermedades: - Cirrosis heptica => la fraccin albumina desciende por hepatopata e insuficiencia heptica y la fraccin de gamma globulina aumenta por la cirrosis. - Sndrome nefrtico (B) => disminucin de la albmina por enfermedad renal (se pierde en orina); hay aumento de las globulinas alfa2 porque se producen mas protenas para compensar la perdida de protena renal; descienden las gamma globulina. - Respuesta inflamatoria crnica (C) => aumento de alfa 2 por los reactantes de fase aguda y de gamma por produccin continuada de inmunoglobulinas; disminuye albumina al aumentar las gamma en proporcin (pero no por perdidas)

Tema 12 - Estudio general del metabolismo de los lpidos

Lpidos - conjunto de molculas orgnicas, compuestas principalmente por C , H y O, tambin pueden contener fsforo(P), azufre(S) y N; se caracteriza por ser hidrofbicas o insolubles en agua y solubles en disolventes orgnicos (bencina, alcohol, benceno y cloroformo); existen => (1) molculas esenciales (fuente exgeno), (2) molculas querequieren ciertas modificaciones para ser funcionales y (3) moleculas no esenciales (se sintetizan sobretodo en el hgado). Clasificacin de lpidos: 1- saponificable => contiene acido graso (AG) como unidades bsicas; su molcula formada por una larga cadena hidrocarbonada y un grupo carbxilo terminal; AG se dividen en saturados e insaturados; AG esenciales no pueden ser sintetizados por el organismo (acido linoleico, acido linolnico y acido araquidnico) => se obtiene por la dieta. (a) simples (solo contienen C,H y O); acilglicridos => esteres (unin) de AG con glicerol/glicerina mediante una esterificacin; 1 molcula de glicerol puede reaccionar con 1-3 moleculas de AG (mono, di o tri-acilglicridos); tiene forma solido (grasas) y lquidos (aceites) a temperatura ambiente.

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(b) complejos/lpidos de membrana => contiene ademas de C,H y O, tambin N,P,S o otra biomolculas (glcido); fosfolpidos => todas las membranas activas de las clulas poseen una bicapa de fosfolpidos (fosfoglicrido, fosfoesfingolpidos); glucolpidos=> forman parte de la bicapa lipdica de la membrana celular como glicoclix: reconocimiento celular y receptores antignicos (cerebrsidos, ganglisidos).

2- insaponificables (no tienen AG) (a) terpenos/terpenoides/isoprenoides => aceites esenciales, el fitol (clorofila),vitaminas A,K y E, carotenoides (pigmentos fotosintticos) y el caucho; (b) esteroides => cidos biliares, hormonas sexuales, corticosteroides, vitamina D y colesterol (componente de las membranas celulares); (c) eicosanoides/icosanoides => prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos(mediadores del sistema nervioso central, procesos de inflamacin y respuesta inmune)

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Funciones de lpidos: - Fuente energtica - Principal forma de almacenamiento de energa a largo plazo en forma de triacilglicridos(en todas las clulas, sobretodo en los adipocitos => funcin lipognesis y liplisis) - Componentes estructurales de las membranas celulares y de las lipoprotenas plasmticas - Agentes emulsionantes - Participan en la regulacin del metabolismo mediante sus funciones de segundos mensajeros, transportadores, cofactores, hormonas, vitaminas, prostaglandinas, etc. - Precursores de otras moleculas como hormonas - Involucradas en respuesta inmunolgica

Triglicridos (TG) - compuestos formados por la esterificacin de la glicerina/glicerol con 3 AG; funcin principal => trasportar la energa hasta los rganos de deposito y su destino final es que sus cidos grasos sean almacenados o utilizados como fuente de energa; lpidos almacenados como TG constituyen la principal reserva energtica del organismo; son depsitos condensados de energa metablica; en estado inanicin, fri,
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ejercicio etc., se produce una rpida movilizacin de los TG que se hidrolizan/liplisis => el glicerol y AG formados pasan a sangre; TG endognos : producidos por la sntesis en el higado mediante los AG disponibles y mediante la transformacin de los hidratos de carbono;TG exgenos : producidos por la absorcin intestinal de las grasas digeridas de la dieta; VN de TG en suero => < 160 mg/dl. Lipognesis - se produce en las clulas, sobretodo las adiposas (adipocitos) => especializados en la sntesis y almacenamiento de lpidos; AG procedentes de la ingesta son esterificados con glicerol para formar triglicridos; este proceso es estimulada por la insulina => impide la movilizacin de cidos grasos al inhibir la accin de las lipasas, favoreciendo la acumulacin de triglicridos. Liplisis - consiste en la movilizacin de los triglicridos (almacenados en el tejido adiposo) cuando son requeridos como combustible; mediante la lipasa, TG se transforman en AG + glicerol; los AG liberados difunden por la sangre, unidos a la albumina para ser transportados a los rganos diana donde se utilizaran como fuente de energa => ruta catablica de beta-oxidacin (se lleva a cabo en las mitocondrias: AG => acetil CoA => entrar al ciclo de Krebs para obtener ATP) ; las hormonas implicadas que estimulan la liplisis => adrenalina, noradrenalina, glucagn, GH (hormona de crecimiento) y adrenocorticotropa.

Colesterol - es un lpido insaponificable; englobado dentro de los esteroides; se transporta en plasma unido a protenas (formando parte de las lipoprotenas LDL, HDL, IDL, VLDL); funcin => (1) componente estructural fundamental de las membranas celulares (2) precursor de hormonas sexuales y de las hormonas de la corteza suprarrenal (3) participa en la sntesis de cidos biliares; fuentes exgenos/de alimentacin => supone la 1/3 parte del colesterol del organismo y se encuentra en su mayor parte libre;fuente endgeno => sintetizado en el higado y en el intestino; supone las 2/3 partes del colesterol del organismo.

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Lipoprotenas - son complejos macromolculas esfricos formadas por un ncleo que contiene lpidos apolares (colesterol esterificado y triglicridos) y una capa externapolar formada por fosfolpidos, colesterol libre y protenas (apolipoprotenas); sintetizadas en el hgado y en el intestino y posteriormente sufren transformaciones en la sangre y en los tejidos; funcin => permite la solubilizacin de los lpidos que posean y los transporta de un lugar a otro en el organismo, para su sntesis, almacenamiento y consumo;los mas importantes cuantitativamente son las lipoprotenas encargadas del transporte de colesterol, TG y fosfolpidos; la proporcin de cada uno de sus componentes determina la propiedades fsica -qumica de las lipoprotenas; Quilomicrones => partculas mas grandes y no presentan movilidad electrofortica;sintetizadas en el intestino a partir de TG, C y fosfolipidos; vida media < 30 minutos; funcin principal: transportar TG exgenos a los tejidos para su catabolismo(utilizados o almacenados); residuos de Quilomicrones /remanente/ desgastados => eliminados por el higado. VLDL => movilidad electrofortica entre gamma y beta-globulina; sintetizada en el higado e intestino a partir de los lpidos exgenos y endognos (fruto del catabolismo de hidrato de carbono); funcin: transportar TG endognos ; degradados por lipoprotein-lipasa =>forman IDL y retiradas de la circulacin o utilizadas para la sntesis de LDL. LDL => movilidad electrofortica en el grupo beta-globulina; producto metablico de la degradacin de VLDL; sintetizada en el higado e intestino a partir de colesterol libre, fosfolipidos y apoprotenas CyE; funcin => transportar 80% del colesterol circulante hacia las clulas de los tejidos (que poseen receptores especficos para las LDL)=> utilizado para la sntesis de las membranas celulares y hormonas esteroideas; LDL son metabolizadas en los lisosomas => originan colesterol libre que inhibe la sntesis endgena de colesterol, impide la entrada de colesterol a las clulas, estimula el proceso de esterificacin del colesterol libre del citoplasma; HDL => movilidad electrofortica en el grupo alfa-globulina; sintetizada en el higado e intestino; funcin => captan el colesterol libre de las clulas de los tejidos perifricos por la accin de la enzima LCAT (lecitin-colesterol-aciltransferasa);

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Propiedades fsico-qumica y funcionales de las LP (la cantidad del contenido) Lpidos: Q > VLDL > LDL > HDL (de mas a menos) TG: Q > VLDL > LDL > HDL (de mas a menos) Protenas: Q < VLDL < LDL < HDL (de menos a mas) Colesterol: Q < VLDL < LDL < HDL (de menos a mas) Fosfolpidos: Q < VLDL < LDL < HDL (de menos a mas) se clasifican segn su densidad (a mayor densidad menor contenido en lpidos) => - quilomicrones < 0,95 g/ml - lipoprotenas de muy baja densidad /VLDL 0,940 - 1,006 g/ml - lipoprotenas de densidad intermedia /IDL 1,006 - 1,019 g/ml - lipoprotenas de baja densidad /LDL 1,019 - 1,063 g/ml - lipoprotenas de alta densidad /HDL 1,063 - 1,21 g/ml Lipoprotena => parte lipdica + parte proteica (apoprotena); funcin de apoprotena => como componente estructurales de las LP (contribuyen a la solubilizacin de los lpidos); como cofactores de diversas enzimas; permiten que las LP sean reconocidas por receptores de la superficie celular.

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Metabolismo de las lipoprotenas: Tras la ingestin de grasas, una vez absorbidas, las clulas intestinales forman losQuilomicrones (TG, colesterol y fosfolpidos); su funcin sera la de transportar losTG exgenos a los tejidos a travs de los capilares donde por la accin de la lipoprotein-lipasa sern hidrolizados dando glicerol y cidos grasos; el glicerol sera utilizado para la sntesis de glucosa (glucognesis) y los AG sern almacenados en los adipocitos o sern transportados por la albumina, (ya que no van unidos a lipoprotenas), a travs del proceso B-oxidacin para obtener acetil CoA, ingresara en el ciclo de Krebs para obtencin de energa; Los residuos de los Q (sin TG) se eliminan va heptica; lasVLDL son sintetizadas sobretodo en higado y su funcin ser la de transportar losTG endognos que tambin son degradados por la lipoprotein-lipasa en los capilares, repitindose el ciclo explicado anteriormente y va a quedar un remanente rico en colesterol que son las IDL que o bien son retirados al higado o utilizados para la sntesis de LDL. Las LDL formadas se originan por la degradacin de VLDL; su funcin principal es la de transportar el colesterol circulante hacia las clulas de los tejidos perifricos que poseen receptores especficos para las LDL; Las LDL son metabolizadas y darn colesterol libre que las HDL (sintetizadas en el higado e intestino) van a ir captando de los tejidos perifricos y acumulando en su interior para ser transportado al higado para su degradacin o hacia las glndulas endocrinas para la sntesis de hormona esteroides; si hay exceso de LDL, se acumulara en las arterias produciendo ateromas. Beta-oxidacin => constituye una ruta catablica de los AG en la cual se produce la eliminacin secuencial de unidades de 2 tomos de carbono, de manera que se va degradando el AG activado hasta transformarse en Acetil CoA, que entrara en el ciclo de Krebs para la obtencin de energa (objetivo); tiene lugar fundamentalmente en las mitocondrias.

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Cuerpos cetnicos => se forman en la mitocondria del higado (hepatocitos)/cetognesis a partir de acetil CoA; su concentracin en sangre es baja, su aumento puede ocasionar disminucin del pH sanguneo (acidosis/cetoacidosis); funcin => en situaciones especiales (ayuno prolongado y diabetes mellitus) es suministrar energa al corazn y cerebro; Recorrido del transporte de lpidos Va exgena => colesterol y triglicridos (cidos grasos + glicerol) que proviene de la dieta => forman quilomicrones => pasa a la sangre hasta los capilares del tejido adiposo y muscular => degradados por lipoprotein-lipasa => mono y diglicridos => entran a la clula; el resto del quilomicron se une a las HDL y captados por el higado; el remanente puede formar ateromas en los vasos sanguneos; Va endgena => VLDL (sintetizada por el higado) ricas en triglicridos, degradadas por la lipoprotein-lipasa, en estado de ayuno los transporta hasta los tejidos; el remanente es captada por las fracciones de HDL; remanente de VLDL (IDL) tiene un potencial aterognico y un 50% captado por el higado a travs de receptores LDL; el LDL altamente aterognic contiene principalmente colesterol y la funcin de transporta-lo a los tejidos que lo requieren (gnadas, glndulas adrenales, clulas alta tasa de divisin); Hgado tambin tiene la funcin de remover estas LDL a travs del receptor LDL. 2/3 de la LDL se remueven de esta forma y el resto en las clulas de Kupffer, las clulas musculares lisas y los macrfagos, sin mediar ningn receptor; esta ultima va se cree que participa en el proceso aterognico.

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Clasificacin de las hiperlipoproteinemias - una de las clasificaciones mas utilizadas es la de Fredrickson, modificada posteriormente por la OMS (incluyendo 1 tipo mas); es nicamente descriptiva y no refleja lo ocurrido con la HDL. Tipo I => aumentado Quilomicrones, Colesterol plasmtico y TG plasmtico; aspecto desuero turbio/cremoso (reposar en la nevera => se forma una capa cremosa en la superficie y el resto se aclara; significa que hay un exceso de Quilomicrones, as como un aumento de colesterol total y TG) Tipo IIa => aumentado LDL, Colesterol plasmtico; aspecto de suero claro Tipo IIb => aumentado VLDL, LDL, Colesterol y TG plasmtico; suero turbio (no forma costra) Tipo III => aumentado IDL, Colesterol y TG plasmtico; suero turbio (no forma costra) Tipo IV => aumentado VLDL, Colesterol y TG plasmtico; suero turbio (no forma costra) Tipo V => aumentado Quilomicrones, VLDL, Colesterol y TG plasmtico; suero turbio/ lechoso (reposar en la nevera => se forma una capa cremosa en la superficie y el resto no se aclara; significa que hay un exceso de Quilomicrones y de VLDL, as como un aumento de colesterol total y de TG).

Estudio del metabolismo lipdico

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A-Alteraciones de las fracciones lipdicas circulantes - relacionada fundamentalmente con la aterosclerosis, ocasionadas por: 1- aumento de las fracciones lipdicas circulantes /hiperlipemias (la mas importante) =>hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, aumento de las HDL y incremento plasmtico de los AG libres. 2- disminucin de las fracciones lipdicas /hipolipemias (menos frecuente); se producen como consecuencia de (1) una disminucin en el aporte o en la absorcin de nutrientes =>malnutridas o sndromes de mal-absorcin (2) una sntesis insuficiente de apoprotenas => enfermedad gentica (3) un aumento de la degradacin de las lipoprotenas => trastornos hormonales/enzimticos; la abetalipoproteinemia: trastorno hereditario poco frecuente => no pueden sintetizar la apo-B => no se pueden sintetizar las LP que la contienen (quilomicrones, LDL y VLDL) => descenso plasmtico de colesterol y triglicridos; un aumento de catabolismo de un tipo de LP => las fracciones lipdicas que transportan esta LP en sangre, disminuye (e.j.catabolismo acelerado de LDL => causa una hipocolesterolemia); 3- aparicin de LP de estructura anormal en sangre / dislipoproteinemias B-Estudio de los trastornos por el deposito anormal de los lpidos en el organismo (no circulante!!) - en las neuronas puede dar lugar amanifestaciones neurolgicas diversas y deficiencia mental y en los rganos, aumenta su volumen. - lipodistrofias: atrofias localizadas del tejido adiposo => reducida respuesta de la insulina (SIDA) - hgado graso o esteatosis: la sntesis de TG supera la capacidad de transformarlos en VLDL => se acumula exageradamente en el higado (diabetes, alcoholismo); - lipoidosis : raras enfermedades hereditarias de tipo metablico => dficit de algunas enzimas encargadas de la degradacin lipidica (acumulo de lpidos en los tejidos);

Hiperlipemias - clasificacin: (1) Hipertrigliceridemia - el aumento de TG a consecuencia de una elevacin de la sntesis o de un descenso en la degradacin - en general puede estar causada por => dieta inadecuadas, trastornos hereditarios, manifestacin secundaria de otras enfermedades; - causadas por aumento de la sntesis => aporte calrico, alcoholismo, diabetes/dficit de insulina activa la lipasa, trastornos (mecanismos de actuacin complejos - no precisados); debidos a la disminucin de la degradacin => diabetes, trastornos (fallo en

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mecanismos del catabolismo de TG); consecuencias => hepatoesplenomegalia, formacin de xantomas.

dolor

abdominal,

(2) Hipercolesterolemia - el aumento de los niveles de colesterol causado por aumento de la sntesis o a un defecto de la degradacin de las lipoprotenas que se ocupan de su transporte (la mayoritariamente un aumento de colesterol de las LDL); - en general puede estar causadas por => dietas poco equilibradas, herencia, manifestacin secundaria de otras enfermedades; - causadas por el aumento de la sntesis => sndrome nefrtico (estimula la accin de lipoprotein-lipasa), aumento de la sntesis de LDL y ciertas enfermedades hereditarias;debidos a la disminucin de la degradacin => dietas ricas en cidos grasos insaturados y colesterol, dficit de hormonas tiroideas, trastornos hereditarios/gentico;consecuencias => aterosclerosis, otras (alteraciones corneales, formacin de ndulos o placas en parpados y la piel /xantomas) por el aumento de macrfagos cargados de Colesterol. (3) Aumento de HDL - causados por hiper-alfa-hiperproteinemia familiar, ejercicio fsico regular, consumo de alcohol moderado, mujeres (cantidad de estrgenos);consecuencias => aumento de HDL protege el desarrollo de la aterosclerosis (HDL retiran el colesterol de los tejidos y la pared arterial hasta el hgado para su eliminacin). (4) Aumentado de los cidos grasos libres - AG libre son transportados por la albumina; aumentan cuando hay hiper-secrecin de hormonas /catecolaminas => activan la lipasa => liplisis en el tejido adiposo; causas => situaciones de estrs (aumentan las catecolaminas/produce AG), neoplasia de la mdula adrenal con secrecin de catecolaminas, ayunas y diabetes; consecuencias => AG libres son captados por el hgado => aumentar la produccin de cuerpos cetnicos y VLDL; Valor normal de colesterol total < 200 mg/dl (leve 200-249, moderada 250-299, grave >299) Valor normal de c-HDL en hombres > 37 mg/dl; en mujer > 47 mg/dl Valor normal de c-LDL optimo < 100 mg/dl; aceptable 100-129 mg/dl Valor normal de TG/triglicridos < 160 mg/dl (limite de alto riesgo 160-199, alto riesgo 200-499) Investigacin en el laboratorio de las dislipemias Dislipemias - conjunto de alteraciones patolgicas que afectan al metabolismo de los lpidos, caracterizadas por alteracin de los niveles normales de lpidos circulantes; Metodos de exploracin selectiva - estudio de aquellas personas que: - son consideradas de alto riesgo, en base a sus antecedentes familiares de enfermedades cardiovasculares o a la presencia de hipercolesterolemia en un familiar en primer grado; - presentan una gran probabilidad de sufrir una hiperlipemia, asociada a otras alteraciones metablicas (hipertensin, diabetes, enfermedad renal crnica, etc.) Fuentes de error que podran impedir un diagnostico correcto => un tratamiento inadecuado: - Biolgicas: existen diferencias apreciables en los niveles lipdicos en funcin del sexo, la edad, la raza. - Socio-ambientales: dieta, obesidad, consumo de sustancias toxicas (tabaco, alcohol), ejercicio fsico. - Manipulacin de la muestra: ayuno previo a la recogida, anti-coagulantes, almacenaje, transporte
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- De tipo clnico: tratamiento farmacolgico, embarazo, enfermedades concurrentes. Condiciones pre-analticas en un estudio de lpidos Condiciones pre-analticas (previas a la extraccin) - ayuno mnimo 12 horas - durante 2/3 semanas el paciente ha de mantener su dieta y estilo de vida normal - evitar el ejercicio intenso 3 horas antes - suspender cualquier medicacin como estrgenos, anticonceptivos orales, salicilatos (al menos 1 mes antes) - si el paciente ha tenido una enfermedad leve retrasar la extraccin 3 semanas - si el paciente ha tenido una enfermedad grave retrasar la extraccin 3 meses - confirmar el diagnostico, repitiendo la prueba 2/3 x durante 2/3 semanas Condiciones de la muestra - utilizar siempre suero, si usamos plasma que sea con EDTA - tras 48 horas realizar la determinacin de triglicridos y colesterol??? - si queremos separar lipoprotenas, aadir una solucin conservante a la muestra y se tiene que determinar 3/4 das despus de la extraccin??? - conservar la muestras refrigeradas a 4oC

Metodos diagnsticos para el estudio de los lpidos A- Metodos generales : el objetivo es determinar las alteraciones orgnicas generales de una dislipemias. En laboratorio general: (1) Anlisis del colesterol y los TG totales => mediante metodos enzimticos (2) Anlisis del colesterol HDL => se determina tras la precipitacin del resto de las lipoprotenas (que contienen apo-B) con reactivo policatinicos; el HDL se determina en el sobrenadante, por metodos enzimticos. (3) Deteccin de quilomicrones => se determina por el aspecto lechoso y opalescente del mismo; en estos casos se confirma su presencia dejando el suero toda la noche a 4C de manera que forman una capa cremosa flotante. (4) Anlisis del colesterol-LDL => estimar el c-LDL (disponiendo de los datos de colesterol total, triglicridos y c-HDL) mediante la formula de Friedelwald, siempre que las cifras de TG sean inferiores a 200 mg/dl (cuando TG > 200mg/dl, la aplicacin de esta formula implica importantes errores de valoracin); la formula => c-LDL = colesterol total - TG/5 - c-HDL (5) Determinacin de apoprotenas AI y B => esta prueba se ha incluido recientemente, debido a que existe una fuerte relacin entre la presencia de estas apoprotenas y las enfermedades cardiovasculares; aumento de la apo-B => aumenta el riesgo de enfermedad cardiovascular; disminucin de la apo-AI => factor de riesgo de cardiopata isqumica. En laboratorio especializado - se realiza mediante la separacin de las distintas fracciones de lipoprotena (por cualquier metodos) => se determina Colesterol, TG, fosfolipidos y protenas; metodos de separacin => 1-mtodo combinado, 2-ultracentrifugacin
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secuencial, 3-ultracentrifugacin en gradiente de densidad => se lleva a cabo en un nico ciclo de ultracentrifugacin, gracias a un gradiente continuo de densidad, a lo largo del tubo; cada LP flota a la altura correspondiente a su densidad.

B- Metodos especficos - el objetivo es el diagnostico origen gentico de las dislipemias primarias (estudio gentico): muy especificas, encaminadas al diagnostico de una dislipemia concreta (determinacin de apo-B => ante niveles de LDL disminuidos y TG normales o disminuidos, se deben determinar los niveles de apo-B para descartar una hipo o abetalipoproteinemia.

Tema 13 - Estudio general del metabolismo de los hidratos de carbono

Concepto de metabolismo y ruta metablica (anablica - catablica) Metabolismo - conjunto de todas las transformaciones qumicas que se producen en una clula o en un organismo; rutas metablicas => reacciones catalizables enzimticamente que convierte un precursor (sustrato inicial) en producto final (para utilizar o desechar) a travs de diversos intermediarios metablicos/ metabolitos; reacciones catablicas => degradan biomolculas y obtienen energa que sera usada en las reacciones anablicas para sintetizar/fabricar biomolculas; todos los procesos transcurren de manera conjunta en el espacio (la mitocondria) y en el tiempo, comparten en muchas ocasiones intermediarios y mantienen un equilibrio dinmico entre las 2 rutas para mantener la estructura y las funciones del organismo.

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Rutas anablicas (divergentes) => reacciones qumicas para sintetizar molculas grandes y complejas (polisacridos, protenas) a partir de precursores sencillos (amino cidos o glucosa) con un gasto de energa/intercambio protones (en forma de hidrlisis de ATP o consumo de poder reductor/ oxidado); la utilizacin del ATP es termodinamicamente desfavorables; estas reacciones se aceleran en cuatro ocasiones => durante periodos de exceso relativo de energa, en periodos en que hay una gran asequibilidad de molculas precursoras, en periodos de crecimiento y regeneracin de material celular.

Rutas catablicas (convergentes) => reacciones qumicas que rompen/degradan de manera secuencial los combustibles ingeridos o almacenados como glcidos lpidos o protenas y los convierten en molculas mas pequeas (CO2 y H2O en ultimo termino), que producen energa en forma de ATP y poder reductor que es almacenable o consumible (en este proceso consumen frecuentemente oxigeno - son

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procesos de degradacin oxidativa); este tipo de procesos se aceleran en los periodos de falta de combustible o de estrs en un organismo; se dividen en 3 etapas : (1) Hidrlisis de las macro-molculas (polisacridos, lpidos, protenas) => se obtienen los monmeros o las subunidades (monosacridos, disacridos, cidos grasos y glicerol, aminocidos) que los constituyen. (2) Catabolismo de los monmeros o subunidades (se realiza en las mitocondrias) => los convierten en/ se produce acetil coenzima A (acetil CoA). (3) Oxidacin total => formada por 2 rutas metablicas: (1)-ciclo de acido ctrico / ciclo de Krebs (produce NADH + oxida el acetilCoA => CO2); (2)-fosforilacin oxidativa (produce ATP que se regenera en => NAD+) y transporte de electrones reduce el O2 => H2O; producto desecho => CO2 + H2O + NH3 (amoniaco - va al rion en forma de urea => transformado en el higado). Las rutas de biosntesis/ anablicas no son las inversas (son irreversibles) de las rutas catablicas.

Metabolismo energtico - las 2/3 partes del oxigeno que inspiramos, se utilizan en los procesos oxidativos mitocondriales (respiracin celular); funcin de Acetil CoA en el metabolismo => es la forma en que el ciclo de Krebs acepta la mayora del combustible aportado, aunque pueda seguir otros destinos (como precursor en biosntesis); formacin de Acetil CoA (en la mitocondria): (1) Polisacridos (dieta) o Glucgeno (reserva en hgado/musculo) + gluclisis/ glucogenlisis (va glucoltica) => glucosa => piruvato + oxidacin => acetil CoA

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(2) Lpidos (dieta) o triacilgliceroles/ triglicridos (reserva en higado/tejido adiposo) + liplisis => cidos grasos libres + beta oxidacin => acetil CoA (3) Protenas (dieta) + protelisis => aminocidos + transaminacin/ desaminacin y oxidacin => acetil CoA. Destinos de acetil CoA: - en la mitocondria => oxidacin completa del grupo acetil en el ciclo de Krebs => energa - en el hgado => sntesis de cuerpos cetnicos (acetona, acetoacetato y betahidroxibutirato),cuando el ciclo de Krebs esta saturado - en el citoplasma => la transferencia de las unidades acetil (como precursor de las molculas) y la posterior biosntesis de esteroles, cidos grasos, aminocidos, acetil colina, colesterol, gluconeognesis.

Hidratos de carbono/ carbohidratos/ glcidos/ sacridos/ azucares =>compuestos orgnicos formados por C, O, e H; su formula emprica es (CH2O)n;se clasifican segn su numero de molcula: (a) monosacridos => contienen 1 nica molcula de azucar e.j. glucosa/dextrosa C6H12O6 (azucar de uva), fructosa (azucar de caa o de remolacha), galactosa (azucar de leche); en solida es blanco; muy solubles en agua e insolubles en disolventes no polares; la mayora son dulce; puede ser => aldosas y cetosas (aldehido o cetona), formas D y L, formas alfa y beta; disacridos => compuestos por 2 molculas de azucar sencillo por enlace glucosdico en el que se desprende una molcula de agua; sacarosa (azucar de mesa) se obtiene de glucosa y fructosa; lactosa (azucar de leche) se obtiene de glucosa y galactosa; maltosa (producto de degradacin almidn + amilasa) se encuentra en la cerveza; (b) oligosacridos => formados por entre 3-10 molculas de azucar sencillo (c) polisacridos => formados por la unin de 11 a cientos de miles de azucar sencillo

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Clasificacin segn su funcin biolgica: (1) polisacridos de reserva => almidn (vegetales) o glucgeno (animales) (2) polisacridos estructurales => celulosa (vegetales) y quitina (hongos / artrpodos) (3) otras funciones => reconocimiento celular (MHC), proteccin frente a condiciones adversas (capsulas en microorganismos) y adhesin a superficies (biopelculas) como pegamento Clasificacin segn su composicin: - homopolisacridos => repeticin de un monoscarido - heteropoliscaridos => repeticin ordenada de un disacrido formado por 2 monosacridos distintos (alternancia de 2 monosacridos); algunos participan junto a polipptidos (peptidoglucanos, muco-polisacridos o proteoglucanos); Fuentes de glcidos en el organismo: Dieta => ingeridos en forma de polisacridos (almidn) y disacridos (sacarosa, fructosa), una vez digeridos, son absorbidos en forma de monosacridos; los que son absorbidos diferentes a la glucosa, se transforman en glucosa en el hgado . Sntesis endgena => gluconeognesis (formacin de glucosa a partir de precursores no glucdicos => a partir de aminocidos, acido lctico, piruvato y glicerol) tiene lugar en el hgado (90%) y en el rin (10%) y necesita enzimas especficos mitocondriales y citoplasmticos y suministro energtico en forma de ATP y GTP (ruta anablica); es esencial para regular la glucemia (el cerebro utiliza 20% del gasto de glucosa del todo el cuerpo). GLUCONEOGNESIS

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VA DEL SORBITOL

Funciones de los hidratos de carbono : (1) Fuente de energa (la mas importante) - obtenida de la degradacin de molculas de glucosa => monosacridos, mediante diferentes vas metablicas : - va de gluclisis en citoplasma (la ruta mas importante cuantitativamente): degradacin de 1 molcula de glucosa (por la accin de enzima glucoltica) => se obtiene 2 molculas de piruvato + oxidacin => acetil CoA que entra al ciclo de Krebs (aerobiosis) => da lugar a 36 molculas de ATP; en el proceso anaerobiosis el piruvato => cuerpos cetnicos; - va de las pentosas fosfato: se obtiene ribosa (fundamental en la sntesis de cidos nucleicos/ruta anablica) y tambin NADPH/poder reductor(molcula necesaria en muchos procesos metablicos del organismo). - va del sorbitol: se obtiene fructosa (exceso de glucosa entrar a las clulas ricas en aldosa reductasa e.j. cristalino, clulas de Schwann, clulas endoteliales => se transforma en polialcohol/ sorbitol (toxico) + enzima sorbitol deshidrogenasa => fructosa); (2) Reserva energtica esta funcin la desempea el glucgeno mediante el procesoglucogenognesis por el exceso del aporte glucosa/ aumento de glucemia; este tiene lugar en el hgado (en el proceso glucogenlisis => se obtiene energa para todo el organismo) y en el musculo (el proceso glucogenlisis => se obtiene energa solo para los msculos); en el proceso de glucogenlisis, se necesita fundamentalmente => enzima glucgeno fosforilasa y enzima desramificador; (3) Servir de base para la sntesis de estructuras como cidos nucleicos (a partir de ribosa que se obtiene por la va de las pentosas fosfato). VA DE PENTOSAS FOSFATO

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Metabolismo de la Glucosa - es importante la homeostasis de glucosa en la sangre/ glucemia a travs de rutas catablicas (gluclisis y glucogenlisis) y rutas anablicas(gluconeognesis a partir de las protenas y glucogenognesis). - glucemia en ayunas (VN) => 60-100 mg/dl, tras la ingerida (postprandial) se elevan a 120150 mg/dl o mas; en persona normal este nivel descienden rpidamente y vuelve a alcanzar el nivel basal; glucemia no se debe dejar por debajo de 50-60 mg/dl; - con una funcin renal normal, aparece glucosuria cuando la glucemia es > 160 mg/dl (umbral renal para glucosa); si el tbulo renal esta daado, puede aparecer glucosuria con glucemia normales; en condicin normales, el tbulo renal reabsorbe la glucosa en su totalidad (no tiene que haber glucosuria); - el metabolismo de la glucosa se regula mediante la insulina y un conjunto de sustancias de accin antagnica/ contra-insulares (glucagn, glucocorticoides, catecolaminas y hormona del crecimiento); el hgado almacena unos 100 gr de glucgeno para la necesidad del organismo durante 4 horas; funcin de insulina (hormona hipoglucemiante): el aumento de glucemia => estimula la produccin de insulina que a su vez estimula => captacin de glucosa por las clulas del musculo esqueltico y las adiposas => se utilizara como combustible o
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reserva glucgeno (glucogenognesis a nivel heptico y muscular); insulina tambin disminuye gluconeognesis del cidos grasos (estimula el almacenamiento en el tejido adiposo/ lipognesis => acumulo de triglicridos) y aminocidos (promueve sntesis de protena/ proteognesis a nivel muscular); funcin de glucagn: promueve glucogenlisis (degradacin de glucgeno),gluconeognesi s (moviliza cidos grasos y aminocidos como combustible) y cetognesis (sntesis de cuerpos cetnicos); moviliza cidos grasos (liplisis), aminocidos (protelisis) y glucosa (gluclisis) como combustible; *** la secrecin de insulina y de glucagn (por parte de pncreas) esta controlada por el nivel de la glucemia; glucocorticoides (cortisol) : sustancia contra-insular (antagnica a la insulina); son compuestos esteroides sintetizados por la corteza suprarrenal;estimulan gluconeognesis y liplisis; catecolaminas (adrenalina): compuestos contra-insular (adrenalina y noradrenalina)estimula glucogenlisis, liplisis y inhibe la secrecin de insulina; GH/ somatotropina (hormona del crecimiento): genera la resistencia a la accin de la insulina; estimula liplisis; su antagonista es somatostatina (inhibidora de GH)

Alteraciones en el metabolismo de los hidratos de carbono - el metabolismo de la glucosa es defectuoso en 2 enfermedades importantes en la practica clnica => la obesidad y la diabetes que se puede desarrollar hacia => arteriosclerosis, hiper-tensin, las enfermedades de vasos capilares, del rin y la ceguera.

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(a)- Hipoglucemia => glucemia < 45-50 mg/dl acompaada o no de signos clnicos; desequilibrio causado por el consumo de glucosa por los tejidos; manifestaciones clnicas =>aumento de liberacin de adrenalina (grupo catecolaminas) y disfuncin del sistema nervioso central (es importante que estos remiten cuando se corrige la hipoglucemia); 2 tipos de hipoglucemia => por causa del ayuno y postprandial (ver cuadro 11.4 libro). - desencadenada por el ayuno: menos secrecin de las glndulas productoras de hormonas hiperglucemiantes (la corteza suprarrenal y hipfisis anterior);insuficiencia heptica grave => no se produce glucogenlisis ni gluconeognesis; exceso de alcohol => aumento NADH (inhibicin de la gluconeognesis); tumores pancreticos => segregan insulina en exceso y desordenada; otro tumores de metabolismo hiperactivo => utiliza gran cantidad de glucosa; - postprandial: perdida parte del estomago => absorcin brusca de glucosa (hiperglucemia) seguida de secrecin excesiva de insulina (hipoglucemia); idioptica. HIPOGLUCEMIA

(b)- Hiperglucemia => elevacin anormal de la glucemia que conduce a "diabetes" (> a 100 mg/dl en ayunas y > a 150 mg/dl en postprandial); causas: - deficiencia absoluta de secrecin de insulina o relativa como consecuencia del efecto de hormonas antagonistas; - secrecin excesiva de esteroides glucognicos (glucocorticoides) - secrecin excesiva de ACTH (hormona adrenocorticotropa) como en sndrome de Cushing - secrecin excesiva de hormona del crecimiento - secrecin de catecolaminas - hipertiroidismo y ayuno simple => la glucemia aumentan a niveles excesivamente elevados despus de la administracin oral de hidratos de carbono

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Diabetes (diabetes mellitus) => una metabolopata compleja, crnica que afecta al sistema vascular; causas: - dficit de la insulina absoluto: la secrecin de insulina es insuficiente para un funcionamiento normal del metabolismo de los hidratos de carbono - relativo: la secrecin es normal (o superior a lo normal), pero por estar aumentadas las necesidades, resulta insuficiente para cubrirlas; Consecuencia directa de dficit de insulina => alteracin en el metabolismo de los 3 principios inmediatos : - metabolismo glucdico: hiperglucemia y glucosuria, debido a que => (1) se reduce el consumo de glucosa por parte del musculo y tejido adiposo, (2) disminuye la sntesis de glucgeno (3) se estimula la glucogenlisis y la gluconeognesis; - metabolismo lipdico: aumento de la liplisis y se generan gran cantidad de AG /cidos grasos => cidos grasos en el higado se usan para sntesis de cuerpos cetnicos (cetognesis) => pasan a la sangre y se acumulan (hipercetonemia) y se eliminan por la orina (cetonuria); el metabolismo de las lipoprotenas tambin se ve alterado. - metabolismo proteico: aumento de la liberacin de los aminocidos a la sangre(protelisis) por parte de las proteinas musculares (catabolismo proteico) => favorece gluconeognesis en el higado. Clasificacin de la diabetes : (a)- diabetes primaria o esencial => el dficit de insulina es idioptico o gentico (defectos de los receptores de la insulina o reacciones autoinmunes); 2 tipos => ver cuadro 11.5 libro; - tipo I (insulino dependiente o juvenil) : edades tempranas < 30 aos; consecuencia de la desaparicin de clulas beta (productor de insulina); cursa con cetosis (aumento de cuerpos cetnicos en tejidos o fluidos orgnicos); peso corporal normal o inferior;frecuentemente se detectan Ac anti-islotes de Langerhans (autoinmune); presencia de ciertosAgs del sistema HLA;
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- tipo II (no insulino dependiente) : se manifiesta en la madurez > 40 aos; disfuncin de las clulas beta (responden de forma tarda y dbil a la glucosa); resistencia a la accin de insulina debida a defectos del receptor; forma mas frecuente (90%) de los casos; es hereditaria; peso corporal supera lo normal; - diabetes qumica o latente (tolerancia anormal/ patolgica a la glucosa): los pacientes tienen una cifra < a la de los diabticos; son personas con problemas de obesidad; se detecta una glucemia en ayunas < a 140 mg/dl y tras la prueba de tolerancia doral a la glucosa, a las 2 horas > o igual a 140 e inferior a 200 mg/dl, pero con algn otro valor superior a 200 mg/dl; prevencin => reduccin de la ingesta calrica y corregir el exceso de peso; - diabetes gestacional /del embarazo: se reconoce por primera vez durante el embarazo; las que padecen => mayor riesgo y morbilidad y mortalidad perinatal, as como de padecer diabetes o intolerancia a la glucosa al cabo de unos aos; se diagnostica mediantela prueba de la tolerancia oral de glucosa (PTOG) (b)- diabetes secundaria o sintomtica => el dficit de insulina esta originado por una enfermedad (eje. lesiones externas del pncreas, inflamaciones, hiperfuncin de las glndulas secretoras de hormonas contra-insulares, frmacos, etc)

Diagnostico de la diabetes - las mas utilizadas se basan en la demostracin de unatolerancia anormal a la glucosa; tolerancia disminuida => al padecer hiperglucemia y glucosuria en ayunas; VN 70-105 mg/dl en adultos y 80-115 mg/dl en mayores de 60 aos; cabe
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posibilidad de realizar una prueba de tolerancia a la glucosa; para considerar una persona como diabtica: - aumento de glucemia > a 198 mg/dl y presencia de sntomas tpicos (sed excesiva/polidipsia, emisiones excesiva de orina/poliuria, hambre excesiva/polifagia, disminucin de peso corporal); - una glucemia en ayunas > a 139 mg/dl, obtenida en 2 ocasiones - una glucemia en ayunas menor de 140 mg/dl y 2 pruebas de PTOG con un nivel de glucosa a las 2 horas > a 198 mg/dl y al menos otro valor puntual tambin > a 198 mg/dl. Las pruebas mas utilizadas para el diagnostico de la diabetes : - las que determinan la glucosuria (supera el umbral renal 160 mg/dl) - las que determinan la glucemia en ayunas, postprandial, prueba de sobrecarga de glucosa/PTOG (oral, intravenosa, sensibilizada con cortisol) ver cuadro 11.6 libro. Pruebas de tolerancia oral de glucosa (PTOG) - durante 3 das inmediatamente anteriores a la prueba, ingerir una dieta rica en carbohidratos - se realiza por las maanas (variacin de la tolerancia mayor) - administracin de la glucosa 75 g en ayunas - extraccin cada 30 minutos durante 2 horas (venosa o capilar) - a veces se tolera mal (vmitos => se debe anotar); la tolerancia a la glucosa disminuye con la edad; Indicada para: - pacientes con glucosuria, sin sntomas clnicos de diabetes y con glucemia normal tanto en ayunas y postprandial - pacientes con sntomas de diabetes, sin glucosuria y con glucemia normales en ayunas; - personas que tengan antecedentes familiares de diabetes mellitus - mujeres que han dado a luz nios con peso excesivo (4-5 kg) - embarazadas que presenten glucosuria Interpretacin de los resultados - en funcin de la glucemia frente al tiempo transcurrido, si la glucemia no desciende a las 2 horas => posibilidad de padecer diabetes; segn la curva, el diagnostico puede ser => glucosuria renal, retraso del almacenamiento, diabetes leve o diabetes grave; Esquema:

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La diabetes gestacional o del embarazo - es una prueba para el diagnostico de la diabetes gestacional; se desencadena en el embarazo y desaparece despus del parto; puede traer consecuencias graves para el feto si no es detectada a tiempo; las pruebas son: (1) test O'Sullivan => *glucemia basal (en ayunas), *beber una solucin de glucosa (50 g) y *glucemia despus de 60 minutos; no es necesario realizar-lo a las gestantes < 25 aos, peso corporal normal, no antecedentes familiares de diabetes, no pertenencia a grupo tnico con alta prevalencia de diabetes; en el resto de mujeres se indica a las 24-28 semanas de gestacin (cuando tienen lugar los cambios hormonales que afectan a la produccin de insulina) y a las 32-34 semanas, siempre que el test de diagnostico no sea positivo; un valor de glucemia superior o igual a 140 mg/dl es positivo => se hace curva de glucosa. (2) curva de glucosa => se evala la capacidad de la paciente para tolerar una sobre carga oral de glucosa estndar (100 g) y se determina: *glucemia basal (en ayunas), *glucemia a los 30 minutos (despus de la sobrecarga), 60 minutos, 120 minutos, 180 minutos; existe
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diabetes gestacional: 2 o mas resultados superan cifras => glucemia en ayunas 150 mg/dl, glucemia a la hora 190 mg/dl, a las 2 horas 165 mg/dl, a las 3 horas 145 mg/dl;

Cosas a tener en cuenta al realizar ambas pruebas => una ingesta alimentaria de carbohidratos 3 das antes de la prueba y estar en ayunas 12 horas antes del anlisis, evitando frmacos que puedan interferir; desde la primera extraccin (glucemia basal) hasta que finalice la prueba, no fumar, tomar caf o te o comer nada, pero se debe beber abundante agua (ningn otro liquido); las manifestaciones como mareo, sudoracin y debilidad son transitorias; no se debe caminar o realizar otro ejercicio fsico.

Determinacin para valorar el funcionamiento del metabolismo de los hidratos de carbono - los mas importante son (ver cuadro 11.7 libro):
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- determinaciones de la glucemia basal (mira mas abajo!!) - determinaciones de la glucosuria; - determinacin de cuerpos cetnicos en sangre (cetonemia) y en orina (cetonuria); - prueba de la sobrecarga oral de glucosa - det. de hormonas (insulina, glucagn, glucocorticoides, GH, adrenalina), sobre todo la insulinemia; - determinacin de enzimas sustratos hidrocarbonados en clulas y tejidos (hemoglobina glicosilada) - micro-albuminuria - determinaciones inmunolgicas - determinacin de receptores Determinacin de la glucemia basal por mtodos enzimticos : Glucosa-oxidasa => es una enzima que cataliza la reaccin de la glucosa presente en la muestra; el mtodo mas usado para cuantificar los resultados esla determinacin del perxido de hidrgeno /Trinder; es un mtodo colorimtrico e enzimtico para determinacin "in vitro" de la concentracin de glucosa en suero o plasma; el color sera proporcional a la concentracin de glucosa; la tcnica se basa en la oxidacin de la glucosa presente en la muestra catalizada por la GOD (glucosa oxidasas) => se forma perxido de hidrgeno que reacciona con un compuesto coloreado (Ac glucnico) => se forma producto coloreado que es proporcional a la concentracin de glucosa y se mide con espectrofotometra; fundamento de la determinacin => (1) Glucosa + H2O + O2 + GOD/glucosa oxidasa => acido glucnico + H2O2 (perxido de hidrgeno); (2) H2O2 + cromgeno => compuesto coloreado; si la lectura se realiza con el espectrofotmetro manual, habr que hacer los clculos oportunos para pasar la absorbancia (DO) obtenida a concentracin de glucosa, basndose en la concentracin del estndar; con el espectrofotmetro semiautomtico y el autoanalizador la concentracin nos sera dada directamente. Hexoquinasa => enzima puede fosforilar a cualquier hexosa (un monosacrido -azcarcomo la glucosa o fructosa), por tanto, es una enzima de baja especificidad (fosforilacin); proporciona el grado mximo de especificidad a la hora determinar la glucosa presente en la muestra (mtodo de referencia); primer paso: Glucosa + ATP + hexoquinasa => glucosa-6-fosfato + ADP; segundo paso: Glucosa-6fosfato + NADP => NADPH (se mide en el espectrofotmetro a 340 nm); el resultado es directamente proporcional a la concentracin de glucosa. Determinaciones del metabolismo de los hidratos de carbono : Glucosa en orina => valores normales de glucosuria es negativa; solo se detecta cuando se supera el umbral renal (glucemia > 160-180 mg/dl). Cuerpos cetnicos => la determinacin se lleva a cabo en sangre y orina; los cuerpos cetnicos son derivados de los cidos grasos y la variacin de sus niveles en sangre(cetonemia) y orina (cetonuria) informa indirectamente acerca del metabolismo hidrocarbonado. Sobrecarga oral de glucosa => permite distinguir entre diversas alteraciones del metabolismo hidrocarbonado: (a) cuando uno de los valores > 200 mg/dl y el obtenido a las 2 horas esta entre 140-200 mg/dl => intolerancia a la glucosa (b) cuando en 2 momentos de la prueba (1 de ellos debe ser el obtenido a las 2 horas) la glucemia es > a 200 mg/dl => diabetes. Hormonas insulina => se determina insulinemia y las hormonas contrainsulares (glucagn); en ocasiones, se determina el pptido C mediante RIA o ELISA (para

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averiguar si es hiper-insulinemia endgeno o exgeno => insulina de preparados comerciales no llevan pptido C). Hemoglobina glicosilada => es una fraccin de la hemoglobina A, unida de forma irreversible (mediante enlaces covalentes) a glucosa; su aparicin es proporcional a los niveles de glucosa en sangre; no es util para el diagnostico de la diabetes; es una tcnica muy especifica, pero su sensibilidad es escasa (la obtencin de Hb glicosilada anormal, no excluye una diabetes); mtodos mas utilizados: HPLC => cromatografia de intercambio inico, cromatografia de afinidad, etc; inmunolgicos => la lectura se realiza por turbidimetra. Microalbuminuria => excrecin de pequeas cantidades de protenas en orina que no pueden ser detectadas por los mtodos habituales de determinacin de protenas en orina (tiras reactivas); sirven para controlar diabetes; una deteccin precoz puede evitar complicacin; mtodo => inmunoqumicos (buena sensibilidad y especificidad y es automatizables); la cuantificacin se realiza mediante turbidimetra o nefelometra. Determinaciones inmunolgicas => se utilizan para determinar la presencia de Acs especficos contra la insulina o contra las clulas pancreticas beta; mtodos => enzimoinmunoanalisis (ELISA) y la inmunofluorescencia indirecta (FIA). Determinacin de receptores => la cantidad de receptores para la insulina determina en muchos casos la afectividad de su accin como hormona hipoglucemiante.

Tema 14 - Enzimologa Diagnstica

Enzimas (biocatalizadores) - protenas biologicas especializadas en la catlisis (acelera catabolismo) de reacciones orgnicas; composicin: las holoenzimas pueden contener fraccin proteica (apoenzima) y no proteica /peso molecular menor(cofactores) que a su vez puede ser => (1) iones metlicos (activadores enzimticos => ayudan a captar el sustrato para conseguir el producto; no se modifican durante la catlisis) o (2) moleculas orgnicas (grupos prostticos - se unen permanentemente; coenzimas - se unen solo durante la reaccin);

Mecanismo de accin enzimatica - la funcin de biocatalizadores orgnicos (enzimas) esacelerar la velocidad de las reacciones al disminuir la energa de activacin y la obtencin mas rpida de los productos. Reaccin enzimatica: enzima + sustrato = enzima-sustrato = enzima-producto = enzima + producto - reaccin sin catalizar (gasta mas energa): estado inicial A+B + energa de activacin => estado de transicin estable => estado final C+D - reaccin catalizada (gasta menor energa): estado inicial A+B + energa de activacin => estado de transicin altamente energtico e inestable => estado final C+D

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Formas en las que pueden aparecer las enzimas: - isoenzimas (isozimas) => formas mltiples de una determinada enzima y catalizan la misma reaccin; tienen pequeas diferencias en cuanto a sus propiedades fsico-qumicas, tamao, estructura, PM, solubilidad, comportamiento cataltico, etc.; LDH (lactato deshidrogenasa) aparece en 5 formas isoenzimticas que catalizan la reaccin reversible => LD-5:M4 (msculos/ higado), LD-4:M3H, LD-3:M2H2, LD-2:MH3, LD-1:H4 (corazn); CK (creatn quinasa/cinasa) tiene 3 formas isoenzimticas => CK-BB (cerebro), CK-MB (miocardio), CK-MM (musculo esqueltico); - complejos multienzimticos => son asociaciones de enzimas que catalizan reacciones consecutivas; - proenzimas => precursores inactivas de las enzimas proteolticas que catalizan la hidrlisis de enlaces peptdicos; el paso de pro-enzima a enzima supone la ruptura de un enlace peptdico.

Fenmenos catalitico: (1) Interaccin enzima-sustrato (E-S) => tiene lugar en centro activo en forma de puentes de hidrgeno, interacciones electrostticas, fuerzas de Van der Waals y covalente. (2) Conformacin del centro activo (CA) => hiptesis de llave-cerradura (rgida/estructura complementaria); hiptesis del acoplamiento inducido (no rgida/ el sustrato induce un cambio en la estructura de la enzima para acoplarse). (3) Especificad enzimtica => absoluto (solo con un sustrato); de reaccin (acta con diferentes sustratos de caracterstica comn); estreo-especfica (acta sobre sustrato con determinada configuracin espacial) (4) Factores que influyen en la actividad enzimtica: - concentracin de sustrato: cuanto mas sustrato, mas velocidad => proporcional hasta un punto mximo / constante de Michaelis Menten/ km; grficamente se observa => cintica de primer orden: cuando la velocidad directamente proporcional a la concentracin de sustrato y cintica de orden cero: cuando se alcanza la velocidad mxima ya no depende de la concentracin de sustrato - la velocidad no aumenta (la enzima esta saturada); en las determinaciones analticas de la AE

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(actividad enzimtica) => se trabaja en la zona cintica de orden cero, por eso, los reactivos comerciales se preparan con exceso de sustrato; - pH: se trabaja en las condiciones optimas de pH (se emplea disolucin tampn que lo mantiene); variaciones de pH pueden alterar la estructura proteica; - temperatura: a mas temperatura mas AE, siempre que no se supere el punto que la estructura proteica se desnaturalice, se elimine o disminuya esta actividad (37C); - presencia de inhibidores /activadores : son sustancias que inhiben o aumentan la velocidad de la reaccin; los activadores suelen ser iones metlicos o moleculas de pequeo tamao.

(5) nomenclatura (clasificacin de enzimas) - xido-reductasas => catalizan reacciones de oxidacin-reduccin (deshidrogenasas, oxidasas, reductasas); A + B => A reducido + B oxidado - transferasas => catalizan reacciones de transferencia de grupos funcionales, partes de moleculas, de un donador a un aceptor (transaminasas); A-B + C => A + B-C - hidrolasas => catalizan reacciones de hidrlisis de enlaces al aadir una molcula de agua (lipasas, amilasa, peptidasas); A-B + H2O => A-H + B-OH - liasas => catalizan reacciones de eliminacin o adicin de alguna molcula, grupo funcional etc (descarboxilasa); A-Co2 => A + CO2 - isomerasas => catalizan reacciones de isomerizacin (epimerasas, mutarotasas); A => A* - ligasas => catalizan reacciones de condensacin de 2 moleculas por formacin de un enlace a costa de la hidrlisis de un trifosfato (sintetasas); A+B + NTP (ATP) => A-B + NDP (ADP) + Pi (fosfato)

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Enzimas analizadas en diagnstico clnico : 1- Transaminasa glutmico oxalactica (GOT) o aspartato aminotransferasa (AST) transaminasas - se localiza en mitocondrias y citoplasma de tejido cardaco, heptico, muscular, hemates, tejido esqueltico, renal y uretral => marcador srico en patologas hepatopatias, miopas, procesos cardacos. 2- Transaminasa glutmico pirvica (GPT) o alanino aminotransferasa (ALT) transaminasas - se encuentra en citoplasma del tejido heptico, muscular, renal y cardaco => marcador srico en patologas hepatopatias, miopatas. 3- Lactato deshidrogenasa (LDH) - xido-reductasas - se localiza en los tejidos cardaco, muscular, renal heptico cerebral y hemates => es un marcador srico en patologas hepatopatas, procesos cardacos y miopatas. 4- Creatn fosfoquinasa (CPK) - transferasas se encuentra en musculo esqueltico, cardaco y cerebro => es un marcador srico en patologa miopatias, procesos cardacos. 5- gamma-Glutamiltranspeptidasa (GGT) - transferasas - se localiza en citoplasma de celulas hepticas, rin, intestino y pncreas => marcador srico en patologas hepatopatas, pancreticas. 6- alfa-amilasa - hidrolasas - se encuentra en glndulas salivares y pncreas exocrino => enfermedades del pncreas 7- lipasa - hidrolasas - su localizacin es pancretica => enfermedades del pncreas 8- fosfatasa alcalina (ALP) - hidrolasa - se localiza en hueso, hgado, rin, intestino, glndula mamaria y placenta => marcador srico en enfermedades oseas (actividad osteoblstica), hepatopatas/ colesttica (con elevacin de transaminasas); se distinguen ambas mirando sus isoenzimas; 9- fosfatasa cida - hidrolasa - se encuentra en la prstata, el higado, hemates, plaquetas y hueso => es un marcador srico en carcinoma prosttico (sintetiza psa/antgeno prosttico especifico glucoprotena - como marcador de prstata).

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Diagnostico de laboratorio del infarto agudo de miocardio (IAM): I. La principal isoenzima que se determina por estar localizada en clulas cardiacas es CKMB (1) la CK-MB (creatn fosfoquinasa-miocardio, mas especifica de lesin muscular cardaca); en el IAM pueden pasar hasta 3-6 horas antes de que se detecta una elevacin de la CM-MB, luego aumentan rpidamente (hasta 10-20% de la CK total - su VN 3-6%) alcanzando su mximo a las 24 horas y luego desciende rpidamente en 1-4 das; (2) LDH1y2 (lactato deshidrogenasa-heart) => su incremento es mas lento que CK - a las 12 horas y alcanzan su mximo a las 36-72 horas y su normalizacin en 1-2 semanas; VN = 120-240 U/L (25C) (3) GOT o AST (glutmico oxalactica o aspartato aminotransferasa) => no es especifica del IAM, pero una concentracin normal de GPT y aumentada del GOT, nos puede relacionar con IAM; su elevacin ocurre a las 6-8 horas con punto mximo a las 18-24 horas y puede persistir hasta 5 das despus del IAM (nos puede ayudar a saber cuando ocurri el IAM), segn sea mayor o menor su aumento nos orientara en el mejor o peor pronostico; suVN 5-35 UI/L II. Marcadores cardiopata precoces, aparecen a las pocas horas: MIOGLOBINA (protena cardiaca) => es mas especifica que las enzimas para valorar el dao miocardio; se eleva rpidamente (entre 3-6 y de forma breve en sangre por lo que es muy buen marcador para diagnosticar IAM entre las 3-6 horas despus de los sntomas; TROPONINA (subunidades I y T - cardacas) => son muy sensibles y especificas en el diagnsticos del IAM cuando su concentracin aumenta en el plasma; son liberadas por las clulas lesionadasentre 3-12 horas despus del IAM y permanecen elevadas bastante mas tiempo que CK-MB; permiten diferenciar en dao miocrdico reversible del irreversible, diagnostico de infartos en procesos quirrgicos cadenas ligeras y pesadas de miosina=> permanece hasta 15 das (la I); la accin combinada de troponina T y CK-MB permite confirmar o no un IAM en las primeras 3-6 horas; la troponina I permite un diagnostico temprano del IAM (a las 4 horas de los sntomas). III. Electrocardiograma - aunque el patrn del IAM puede no aparecer hasta 24 horas despus del infarto; varan segn el tamao y lugar de la lesin.

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Determinacin analitica de la actividad enzimtica - no se mide la cantidad de enzimas en el suero, porque su concentracin es baja; sin embargo dada su elevada capacidad cataltica, es posible determinar su actividad con fiabilidad y se presupone que por lo general la actividad es proporcional a la concentracin; a- Es necesario conocer: - la estequiometra de la reaccin que cataliza - si necesita o no cofactor y cual es - la concentracin minima de sustrato y cofactor para alcanzar la mxima velocidad de reaccin - las condiciones optimas de medida => pH, tiempo de incubacin, procesado de la muestra biolgica y los reactivos (se debe procesar de inmediato para evitar la hemlisis - si la muestra esta hemolizada, se recomienda una nueva extraccin porque los hemates tienen muchas enzimas e interfieren; los frmacos tambien pueden alterar la concentracin de enzimas), temperatura, posibles activadores e inhibidores endognos y exgenos de la muestra; - las caractersticas de la tcnica analitica para esa muestra biolgica b- Debidos a la presencia de la enzima en la muestra y a su actividad especifica, se puede determinar la actividad enzimtica (AE) analizando como parmetro: - la aparicin de algn producto - la desaparicin del sustrato - la variacin del cofactor o de algn componente de la reaccin en el transcurso de la misma c- Tcnica analitica mas empleada => espectrofotometra ultravioleta-visible (UV-V) d- Fase de retardo - se debe medir la absorbancia en esta fase; el tiempo de retardo esta indicado por los protocolos comerciales. e- Fase lineal => se determina la actividad enzimtica, porque la velocidad de formacin del producto es constante. f- La velocidad comienza a disminuir debido a => agotamiento de sustrato, variaciones de pH que no han podido ser amortiguadas por el tampn, efectos de inhibicin de la enzima, etc. g- AE se mide en UI-ml => unidad internacional como la cantidad de enzima que transforma un micromol de sustrato en un minuto en condiciones estndar previamente establecidas (en cada unidad se define la unidad de actividad y sus unidades.

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Metodos analticos de determinacin de actividad enzimtica - no es importante un dato puntual de absorbancia sino la variacin de la absorbancia por unidad de tiempo ocasionada por la AE. (1) Metodos a punto final => no es frecuente; se supone que la reaccin es lineal y la cintica de orden cero no ocurre siempre; pasos: se ponen en contacto los reactivos (que aportan el sustrato) y la muestra biolgica (aporta la enzima) y tras un periodo de incubacin que supere el periodo de retardo, se mide la absorbancia; al cabo de un tiempo establecido se detiene la reaccin y se vuelve a medir la absorbancia; (2) Metodos cinticos => medir la absorbancia varias veces con intervalo de minutos; permite comprobar que realmente estas en la zona lineal de la curva, zona ideal para la determinacin; si se detectan desvos de la linealidad, se puede despreciar alguna de las medidas finales de la absorbancia; en los protocolos comerciales se indican los pasos a seguir en cada determinacin para que el resultado sea fiable; tipos => a. En muchas reacciones enzimticas participan como cofactores los complejos NADNADH o NADP-NADPH y en esta participacin se basan muchos metodos analticos. b. Metodos colorimtricos miden la formacin del color. Calculo de la actividad enzimtica - una vez obtenida la variacin de absorbancia por minuto, para calcular AE se pueden emplear los siguientes metodos: - la aplicacin de una variante de la ley de Lambert-Beer - la construccin de una recta de calibrado - medidas indirectas de la concentracin de sustrato Formula => AE (UI-L) = DO/min x factor de calculo

Tema 15 - Funcin Heptica

Higado - un rgano de naturaleza glandular, profusamente vascularizado, rodeado por una capsula fibrosa con un peso +/- 2,5% del peso corporal; es el encargado de la transformacin bioqumica delos principios inmediatos ingeridos en la diete y absorbidos a nivel intestinal, as como su distribucin por todo el organismo; irrigado por la arteria heptica y la vena porta, la sangre sale del higado por venas supra-hepticas que desembocan en la vena cava inferior; histologa => clulas hepaticas o hepatocitos, elementos vasculares (vasos sanguneos, vasos linfticos y vas biliares), parnquima (la propia masa glandular); Funcin: - Interviene activamente en el metabolismo de los principios inmediatos Participa junto con la mdula osea y el bazo en de sntesis y regeneracin sanguinea

los

procesos

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- Forma la bilis (cuya composicin: sales biliares, bilirrubina, urobilingeno, colesterol, agua fosfolipidos, electrolitos) - Encargado de la eliminacin de productos potencialmente txicos para el organismo (detoxificacin por bio-transformacin) - Participa en las funciones del sistema monocito-macrfago (SRE) - Participa en el metabolismo de hormonas y vitaminas => (1) sintetiza protenas encargadas de transportar hormonas y vitaminas en la sangre (2) degrada las hormonas y facilita su eliminacin (3) sirve de almacn de ciertas vitaminas (4) participa en el metabolismo de la vitamina D3 activa (calcitriol) Actuacin heptica en el metabolismo de los principios inmediatos - se encarga deproporcionar a los tejidos: energa, glucosa y cidos graso en periodos inter-digestivos. a. Hidratos de carbono: - despus de las comidas => almacena la glucosa en forma de glucgeno o TG - entre las comidas => glucogenognesis y gluconeognesis b. Lpidos: - moviliza cidos grasos procedentes del tejido adiposo (liplisis) - sintetiza AG a partir del exceso de glucosa y AA => para sintetizar TG que forma parte de las lipoprotenas VLDL y HDL - utiliza AG para sintetizar "cuerpos cetnicos" (fuente de energa para higado y el resto del organismo) - sintetiza colesterol (1,5-2 g diarios) c. Protenas: - metaboliza selectivamente los AA - utiliza el amoniaco de la degradacin AA, del rin y intestino, para sntesis de urea y glutamina - sintetiza protenas plasmaticas (albumina, factores de coagulacion, etc.) Actuacin heptica en la secrecin biliar - formar la bilis, cuya composicin: sales biliares, bilirrubina, urobilingeno, colesterol, agua fosfolipidos y electrolitos que desempea funciones de: - Servir de vehculo para la eliminacin de bilirrubina, colesterol y otras sustancias - Mantener disuelto el colesterol - Facilitar la digestin y absorcin de las grasas a nivel intestinal (mediante las sales biliares) Metabolismo de la bilirrubina : - una pequea parte de BB tiene su origen en el catabolismo de enzimas hepticas (citocromos, catalasas) y en la destruccin en la MO de eritrocitos (inmaduros) - la mayor parte de BB procede del catabolismo de la Hb presente en el interior de los eritrocitos que tiene lugar en las clulas del SRE (bazo, higado, ganglios linfticos y MO); los hemates que ja han completado su ciclo vital (120 das) son degradados, liberando la Hb que contenan; Hb se desdobla en globina y grupo HEM ; grupo HEM se desdobla, liberando el tomo de Fe y el HEM se transforma en una cadena lineal formado por 4 anillos (pirrlicos) que son la estructura bsica de los pigmentos biliares; el 1er pigmento formado esbiliverdina; tras su reduccin => bilirrubina indirecta (insoluble e hidrofbica); este se incorpora a la sangre unida a la albumina; en el hepatocito se conjuga con el cido glucurnico => BB hidrosoluble/conjugada y directa; una pequea parte regresa a la sangre, pero la mayor parte accede al intestino delgado por el esfnter de Oddi; por la accin de la flora intestinal, una parte se transforma en estercobilingeno que al oxidarse => estercobilina, se elimina por las heces (confiere su color caracterstico); el resto de BB
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conjugada se absorbe en el intestino y pasa a la sangre y se elimina por la orina (una pequea parte) y la mayor parte vuelve al higado e intestino (circulacin entero-heptica). Funcin de la bilis => servir de vehculo para la eliminacin de colesterol, bilirrubina y otras sustancias; mantener disuelto (emulsionado) el colesterol; favorecer la digestin y absorcin de las grasas a nivel del intestino delgado (debida a las sales biliares)

Actuacin heptica en la destoxificacin por bio-transformacin toxico endognos (bilirrubina, amoniaco) y exgenos (txicos, frmacos): - Modificar su actividad reduciendo o eliminando su toxicidad orgnica - Hacerlos hidro-solubles y por tanto fcilmente eliminables (va biliar o urinaria) Actuacin hepatica a nivel del sistema monocitomacrfago (clula Kupffer/fagocitosis) - sistema retculo endotelial que atribuyen a las siguientes funciones: - hematopoyesis - respuesta inmunitaria (especifica y inespecifica) - funciones de tipo metablico - formacin de pigmentos Actuacin heptica en el metabolismo de hormonas y vitaminas: - Sintetiza protenas transportadoras de hormonas y vitaminas en el torrente sanguneo - Degradar las hormonas y facilitar su eliminacin - Almacena vitamina D (circulacin entero-heptica) Trastornos hepticos - clasificacin morfologica de las hepatopatas A. Enfermedades del parnquima (alteraciones intra-hepticas) - Hepatitis (viral o toxico - aguda o crnica) - Cirrosis (de origen alcohlico; de tipo biliar; hemocromatosis => acumulacin de Fe, cirrosis, intolerancia de hidratos de carbono; posnecrtica; fibrosis qustica pancreatica /enfermedad de Wilson) - Infiltrados (de grasa TG, colesterol; de glucgeno; de tipo amiloide; otros (leucemia, linfoma, granuloma) - Lesiones que ocupan un espacio (tumores, quistes, abscesos)
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- Trastornos funcionales que cursan con ictericia => supresin o detencin del flujo de bilis (colestasis) en el embarazo; diversos sndromes. B. Enfermedades hepato-biliares (resultado de alteraciones en las vas biliares donde fluye la bilis) - Obstruccin biliar extra-heptica - Colangitis (inflamacin de los conductos biliares) C. Enfermedades vasculares (son de origen circulatorio) - Malformaciones arteriovenosas - Trombosis de la vena heptica o de la vena porta - Congestin pasiva crnica Trastornos mas frecuentes de la funcionalidad heptica: Trastornos en el metabolismo de los principios inmediatos (1) Hidratos de carbono - hiperglucemia => siempre que los niveles de insulina no < de VN, puede ser debida auna reduccin de la capacidad del higado para metabolizar la glucosa/ glucogenognesis y gluconeognesis (disminucin del numero de hepatocitos y alteraciones de la estructura heptica); - hipoglucemia => solo en insuficiencias hepticas graves como consecuencia de laincapacidad del higado para sintetizar y liberar glucosa (glucogenlisis) al torrente sanguneo. (2) Lpidos - dficit de ciertas enzimas que intervienen decisivamente el metabolismo lipdico causando alteracin en la va metablica; dficit de lecitil-colesterolacil-transferasa (LCAT) que regula la esterificacin del colesterol en sangre => aumenta el colesterol libre que se deposita sobre la membrana de hemates (se altera), los hace mas frgiles y causa anemia hemoltica. (3) Protenas a- La urea NH2CONH2 se sintetiza en el higado de la neutralizacin del anin bicarbonato HCO3- con amonio NH4; una deficiencia heptica puede provoca: - acumulo de amonio en sangre => alteracin cerebrales graves (encefalopata heptica) - nivel alto de bicarbonato en sangre => alcalosis (pH alcalina de la sangre) - descenso en la sntesis de urea y su nivel en el plasma b- Fallo a nivel heptico de la sntesis de factores de la coagulacion (de carcter proteico) Trastorno en la funcin biliar (1) Ictericia - coloracin amarilla que aparece en la piel y mucosas debida a la presencia de un pigmento, la bilirrubina, cuando este se encuentra en la sangre > 2 mg/dl; indica trastornos en la formacin, captacin conjugacin y eliminacin (el proceso mas difcil) de la bilirrubina por el higado. Causas - clasificacin fisiopatolgica: - Aumento de la produccin de BB en anemias hemolticas => incapaz de asumir el aumento de BB debido a la rotura masiva de eritrocitos => acumulacin de BB indirecta. - Captacin anormal de BB por los hepatocitos en sndrome de Gilbert => falla la sntesis hepatica de la protena transportadora (albumina) => acumulacin de BB no conjugada. - Alteracin del proceso de conjugacin de BB en trastorno del recin nacido =>inmadurez de la glucoroniltransferasa => acumulacin de BB insoluble. Trastorno en la eliminacin de la BB conjugada en hepatopatas difusas, enfermedades congnitas => incapacidad de los hepatocitos para eliminar la BB conjugada con la bilis => acumulacin de BB conjugada.

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- Alteraciones del flujo biliar de la BB en diversos trastornos de obstruccin en las vas biliares=> la BB conjugada al no poder seguir su camino normal, vuelve a la sangre => acumulacin de BB directa. Tipos de Ictericia: - Pre-heptica o hemoltica => aumenta la BB indirecta en el suero - Heptica o hepato-celular => aumenta la BB directa y indirecta - Post-heptica u obstructiva => aumenta la BB directa Diagnostico - para determinar que tipo de ictericia instaurado es necesario los datos de: - tipo de BB preferentemente aumentada en el suero - presencia o ausencia de BB en orina (coluria) - color de las heces y cantidad de urobilingeno en ellas - cantidad de urobilingeno en la orina

(2) Colestasis - la alteracin de la formacin de la bilis o de su excrecin hacia el duodeno por causa de un mal funcionamiento de las clulas hepticas (hepatocitos)/ intra-heptico o por obstruccin de las vas biliares/ extra-heptico; inicialmente => ictericia, coluria, hipocolia o acolia (disminucin de secrecin biliar) y prurito; posteriormente => si se prolonga aparecen xantomas (alteracin cutanea de un trastorno del metabolismo lipdico)esteatorrea (exceso de grasa en las heces/heces blancas) y sndrome de malabsorcin;diagnostico => ecografa, tomografa axial computerizada (TAC) y datos laboratorio. Clasificacin de colestasis (segun sus causas): Intraheptica => infecciones (hepatitis vrica), txicos (alcohol, frmacos, de origen industrial), neoplasias (carcinoma, metstasis), infiltraciones (amiloidosis), otras (cirrosis heptica, embarazo, postoperatorio). Extraheptica => litiasis (en el coldoco), neoplasias (pancretica, en la vescula biliar, en las vas biliares), infestaciones parasitarias (hidatidosis, ascridos, fasciola heptica),pancreatitis (aguda o crnica) otras causas (estenosis del conducto biliar, ulcera duodenal).

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Trastornos en la capacidad de detoxificacin por bio-transformacin - como consecuencia de la insuficiencia heptica para eliminar ciertos compuestos, puede aparecer

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una cierta intolerancia a sustancias => frmacos, txicos, etc. que no pueden ser degradadas y se acumulan, llegan a provocar trastornos. Trastornos en el metabolismo de hormonas y vitaminas - puede causar importantes alteraciones (cualitativa y cuantitativas) de la sntesis de algunos metabolitos como"somatomedina" (hormona imprescindible para un funcionamiento normal de la hormona del crecimiento (GH) Determinacin de la funcionalidad heptica: - de tipo fsico (palpacin y percusin del abdomen) => la sensibilidad, consistencia y textura de la superficie heptica; el aumento del tamao del higado (hepatomegalia => tumores, insuficiencia cardiaca, obstruccin de las vas biliares y inflamacin en hepatitis); - de tipo instrumental - de tipo funcional

Tcnicas de exploracin instrumental de las hepatopatas - Radiologia: en caso de hepatomegalia => el diafragma derecho es desplazado hacia arriba (Rx torax) - Gamma-grafa: mediante isotopo radioactivo con afinidad sobre los hepatocitos y clulas Kupffer => ofrece imagen de la existencia de lesiones (abscesos, quistes y tumores) que no tienen capacidad de fijar el compuesto radiactivo. - TAC: ofrece imagen del higado con su forma y tamao, la existencia de lesiones, calibre de las vas biliares. - Ecografa: utiliza ondas sonoras que da informacin => tipo lesiones existente, si es solida o lquidos, calibre de los conductos biliares intra-hepticos - Laparoscopia: introduccin de un dispositivo ptico en la cavidad abdominal => permite observar directamente el higado. - Puncin-biopsia: la obtencin de una muestra del tejido heptico para su posterior estudio mediante anatoma patologica. Pruebas funcionales hepticas Marcadores sricos de las hepatopatas - son constituyentes sanguneos, tiles en el reconocimiento de la enfermedad heptica, aunque no sirven para medir la funcionalidad heptica global; su alteracin refleja fundamentalmente el dao del hepatocito o del rbol biliar; citolisis heptica/ necrosis hepato-celular/ rotura celular => las enzimas saldrn al exterior aumentando su nivel en el suero; disminucin de sus niveles sricos => inhibicin de la sntesis de enzimas; perfil heptico de rutina => GOT, GPT, ALP, GGT, Bilirrubina Transaminasas (GOT y GPT) - el aumento de ambas nos indica citolisis heptica; la GPT aumenta en lesiones de poca entidad y la GOT aumenta en lesiones hepticas mas graves; tienen poco valor pronostico, pero se usan para determinar la actividad de las enfermedades hepticas con lisis celular. - Glutamicoxalacetica (GOT) o Aspartatoaminotransferasa (AST): se encuentran en el interior de clulas hepaticas y musculares (tanto en el citoplasma como en las mitocondrias);VN plasmticos = 5-35 U/L; se encuentra aumentada en lesiones hepticas graves (> de 3000 U en hepatitis agudas y mas moderado en hepatitis crnicas), en necrosis del miocardio(IAM), en procesos que afectan las clulas musculares (triquinosis => parsitos de cerdo/jabal), necrosis tisular (embolia pulmonar) y hemlisis masivas con ictericia; disminucin: difcil (sera por desaparicin absoluta del parnquima hepatica).
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- Glutamino piruvica (GPT) o Alaninaminotransferasa (ALT): se encuentra solo en el citoplasma de las clulas sobre todo hepticas (hepatocitos) y musculares; VN plasmticos < 55 U/L; esta aumentada en los mismos casos que la GOT, pero sugiere mas a una alteracin heptica, en hepato-carcinoma, en metstasis hepticas y hepatitis;cualquier aumento indica enfermedad que afecte al higado (es mas especifica del hgado); - Fosfatasas alcalina (ALP): son un conjunto de isoenzimas (se difieren en sus propiedades fsicas, qumicas e inmunolgicas) y se encuentra aumentadafundamentalmente en las alteraciones oseas (osteoporosis) y hepticas; VN = 60 - 250 U/L; la isoenzima heptica aumenta cuando existe obstruccin biliar total o parcial (colestasis) o una lesin que ocupa un espacio en el higado (tumor o quiste); la elevacin de las fosfatasas alcalina heptica es indicativa de: colestasis (patrn de colestasis => el aumento de ALP heptica y GGT, mientras los niveles de las transaminasas son normales), cirrosis heptica y metstasis hepticas, carcinomas de vescula biliar, etc; se encuentradisminuida en personas que sufren hipotiroidismo y nios que presentan retraso en el crecimiento; pruebas que acompaan a F.A./ALP => - LAP y 5-NT - son enzimas de gran utilidad para aumentar la especificidad de la FA, ya que se encuentran elevadas en las enfermedades hepticas, pero no en los trastornos seos;FA/ALP + LAP o 5-NT elevados => alteracin heptica; si LAP y 5-NT son normales => otro origen. Alteracin de la fosfatasa alcalina / ALP (esquema)

- gamma-Glutamiltranspeptidasa (GGT) - es un marcador de gran sensibilidad para hepatopatas (citolisis y colestasis); VN = 5-40 U/L; cuando su valor plasmtico es
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normal, es muy posible que no haya ninguna alteracin a nivel heptico; se utiliza en combinacin de la ALP para diferenciar el origen heptico u oseo de una alteracin; ALP + GGT elevadas y GOT + GPT normales => colestasis; todas elevadas => citolisis. - Lactato deshidrogenasa (LDH) - presente en la mayor parte de las clulas del organismo, formada por varias isoenzimas; LDH-5 es de localizacin heptica; su aumento es indicativo de necrosis hepato-celular o de carcinoma metastsico de hgado; VN = 230-480 U/L. - Bilirrubina (BB) => hiper-bilirrubinemia fisiolgica (recin nacido, permanecer en grandes alturas) cursa con ictericia; hiper-BB patolgica (preheptica/hemoltica, heptica/hepato-celular, post-heptica/obstructiva); hipobilirrubinemia aparece en anemias intensas(ferropnicas, aplsicas); VN de BB total 0,15 1 mg/dl mas de 2 mg/dl => ictericia; VN de BB directa/conjugada 0-0,25 mg/dl; VN de BB indirecta/insoluble 0,15-0,8 mg/dl; el aumento de BB directa/conjugada => alteraciones en el flujo biliar/ colestasis; el aumento de BB indirecta/unida a la albumina es causado por => anemias hemolticas masivas, fallo de la protena transportadora, alteracin del proceso de conjugacin fisiolgica => la inmadurez de la glucuroniltransferasa; para ver que tipo de ictericia => que tipo de BB aumenta, coluria en la orina, presencia o ausencia de BB en las heces;

El diagnostico de las enfermedades hepticas en el laboratorio, todava no es totalmente satisfactorio. Ocasionalmente siguen apareciendo hepatopatas crnicas en las que todas las pruebas BQ arrojan resultados normales. En casos excepcionales se puede demostrar una relacin causa-efecto entre determinadas pruebas y la etiologa o alteracin detectada a nivel heptico. La prueba funcional, la causa de la alteracin heptica y la patologa, no se
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encuentran en estricta correlacin, por esto hay que acompaan las con pruebas de TAC, ecografa, etc. Parmetros biolgicos para Hepatitis (1) Transaminasas => en las hepatitis sus niveles plasmticos son entre 10 y 100 veces superiores a VN (2) Pruebas de Coagulacion => la mas utilizada es Tiempo de Quick (se reduce mas de la mitad - proceder a la hospitalizacin) (3) Serologa => investigacin de la presencia de ciertos Ags procedentes del virus causante de la hepatitis; determinacin de los distintos Acs especficos (IgM e IgG) que aparecen en el plasma de la persona afectada, tanto cualitativa como cuantitativamente. (4) Proteinograma

Tema 16 - Funcin Endocrina

Hormona - es un mediador/mensajero qumico que es secretadas por glandulas especializadas y influye en la actividad de las clulas (regulador bioquimico); funciones => mantener la homeostasia; iniciar, mediar y regular los procesos de crecimiento, desarrollo, maduracin, reproduccin y envejecimiento; endocrinologa => estudia la comunicacin y el control ejercidos dentro de los organismos vivos por medio de mensajeros qumicos/hormonas; el sistema endocrino junto con el sistema nerviosoconforman el mecanismo por el cual el organismo controla e integra la funcin de los distintos tejidos y rganos, sintetizando y liberando hormonas;

Clasificacin - pueden agruparse en cuatro grandes familias en funcin de su estructura qumica: - Pptidos; de diferente complejidad: TSH (h.tiroestimulante/tiroliberina), GH (h.del crecimiento), polipptidos (glucagn), oligopptidos (vasopresina), glucoprotena (gonadotropinas) - Derivadas de aminoacidos: triyodotironina, adrenalina - Esteroideas (derivan del colesterol): progesterona, andrgenos, estrgenos, corticosteroides, vit. D - Derivadas de los cidos grasos: prostaglandinas

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Los mecanismos de accin de las hormonas (las funciones) : - funcin Autocrina y paracrina (ella misma y celula vecina): retrogadamente sobre sus clulas de origen para modular su propia secrecion u otros procesos intracelulares; la clulas secretora es a la vez diana; - funcin Paracrina: actua sobre clulas diana/adyacentes que se encuentran en el mismo lugar mediante la simple difusion a travs del liquido intersticial que las separa (cerca una de la otra); - funcin Endocrina: acta sobre clulas diana alejadas, siendo transportada por la circulacion sanguinea a los diversos tejidos donde actuaran; - funcin Neurocrina: mediante un sistema hibrido de transmision de seales, en el cual, la seal hormonal tiene su origen en una neurona y tras el transporte axonal a la circulacion sanguineas, es llevada al una celula diana alejada (la celula secretora es una neurona). Sinapsis quimica => seal paracrina (de neurona a neurona hasta llegar al organo diana).

Mecanismo de regulacin hormonal las hormonas sintetizadas por clulas de rganos diana pueden controlar por retroaccin las glndulas endocrinas; el
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mecanismo de regulacin dominante es el de la retroalimentacin/ retroaccin negativa;hay 3 tipos => - r. n. de asa larga (bucle largo de regulacin por r. n.) => enva seal a larga distancia para que se deje de sintetizar hormonas estimulante; - r. n. de asa corta (bucle corto) => e.j. la hormona de la hipfisis envia seal al hipotlamo para que no sintetice/ envi mas hormonas estimulante; - r. n. de asa ultra corta (bucle ultra corta) => la hormona enva la seal a su propia glndula Las condiciones fisiolgicas que requieren la accin de una hormona, estimulan su liberacin y los productos resultantes, suprimen su liberacin; esta asociacin homeostatica puede ser entre: - una hormona y uno o mas sustratos - una hormona y otras hormonas - una hormona y factores qumicos Tambin existen pautas de liberacin hormonal dirigidas por => ritmos diurnos, fases del sueo, variaciones estacionales, fases del desarrollo, dolor las emociones, las lesiones, etc. a traves de complejas vas neurales;

Efecto de la unin entre hormona y receptor: a- Cuando la unin es en la membrana plasmtica de la clula, el complejo resultante acta generando en el citoplasma moleculas de sealizacin como el cAMP(adenosinmonofosfato cclico/ mensajeros moleculares) que influyen en los procesos metablicos de la clula activando o inhibiendo enzimas pre-existentes. b- Cuando la unin se produce en el citoplasma o en el ncleo, el complejo formadointeracciona con moleculas de ADN generalmente activando un gen determinado e incrementado la sntesis de la protena corespondiente. Resultado => tienen que aumentar o disminuir uno o mas procesos intracelulares en la clula diana (reacciones enzimticas, movimientos inicos, reordenamientos citoesqueleticos (algo que re-establece la actividad celular). Metodos analticos generales para el estudio de la funcin endocrina: - Medida de las concentraciones plasmticas de las hormonas - Cuantificacin de la excrecin urinaria de la hormona o sus metabolitos - Medida de Ac circulantes que interfieren la accin hormonal o lesionan la glndula en estudio - Determinacin de la tasa de produccin y secrecin hormonal

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- Pruebas funcionales o dinmicas, de estimulacin o supresin - Estudio de los receptores de la hormona (biopsia, cultivos celulares)

Tcnicas inmunoqumicas que se utiliza con mas frecuencia en la cuantificacin hormonal: - RIA (radioinmunoanlisis) => son tcnicas inmunolgicas cuantitativas en las que se utilizan isotopos radiactivos como marcadores de los Ag o Ac. La radiacin emitida puede ser medida con un contador (de centelleo) gamma obtenindose la actividad radiactiva que es la velocidad de desintegracin. - EIA (enzimoinmunoanalisis) => son tcnicas inmunoquimicas cuantitativas que emplea reacciones Ag-Ac, marcando uno u otro con enzimas; a la reaccin inmune le sigue una reaccin indicadora: se aade el sustrato de la enzima, se desarrolla la reaccin enzimtica y se determina la actividad de la enzima marcadora fotomtricamente mediante tcnicas colorimtricas habitualmente; los EIA pueden ser homogneos y heterogneos; se diferencian en que los ensayos homogneos no se requiere lavado o separacin fsica de las sustancias reaccionantes antes de medir la actividad enzimtica y en los heterogneos es necesaria la separacin fisica de los reaccionantes en las fracciones libre y ligada antes de la determinacin de la actividad de la enzima marcador. ***cuadro 16.6 y 16.7 pag.225 EIA heterogneos : - tcnica competitivo => Ag Pr y Ag marcado compiten por el Ac; la actividad enzimtica sera inversamente proporcional a la cantidad de Ag Pr. - tcnica sandwich => mediante procesos de lavados y incubacin; la actividad enzimtica esdirectamente proporcional a la cantidad de Ag Pr. - tcnica enzimomtrico => mediante procesos de lavados y incubacin; la actividad enzimtica sera inversamente proporcional a la cantidad de Ag presente en la muestra problema. - FIA (fluroinmunoanlisis) => tcnica de determinacin cuantitativa que emplea reacciones Ag-Ac en las que se marcan unos u otros con compuestos fluorescentes midindose posteriormente la fluorescencia desarrollada con aparatos llamadosfluormetros; pueden ser homogneos o heterogneos. - Otras tecnicas: espectrofotomtricas, cromatogrficas y pruebas de inmunoaglutinacin (inhibicin de la hemaglutinacin y aglutinacin directa o indirecta de partculas de ltex).

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rganos y tejidos secretores de hormonas: 1- Hipotlamo => es una parte del SNC, regin del cerebro por debajo del tlamo y por encima de la hipfisis acta en respuesta a estmulos nerviosos; ah se encuentran clulas neuroendocrinas (neuronas) con capacidad de sintetizar y secretar hormonas estimulantes o inhibidoras de la hipfisis y hormonas que emigran por va nerviosa al lbulo posterior de la hipfisis donde se almacenan hasta su secrecin, como vasopresina y oxitocina; factores liberados => -GHRF / somatoliberina (factor regulador de la hormona del crecimiento); -LH-RH / gonadotropina/gonadoliberina (factor regulador de LH /lutropina/ luteinizante y FSH/ folitropina/ foliculoestimulante); -TRH / tiroliberina (factor regulador de la tirotropina /TSH); -CRF / corticoliberina (factor regulador de la corticotropina /adrenocorticotropa /ACTH); - factores inhibidor => somatostatina.

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2- Hipfisis => rgano glandular y nervioso, pequeo, como una aceituna situado en la base del crneo, en una depresin osea (silla turca); consta de 2 partes anatmicas y funcionalmente diferentes (anterior/ adenohipfisis y posterior/ neurohipfisis); adenohipfisis secreta => ACTH / adrenocorticotropa/corticotropina => sntesis de glucocorticoides GH / somatotropina => efectos anablicos; crecimiento oseo y cartlago de conjuncin TSH / tirotropina => sntesis de hormonas tiroideas FSH / folculo estimulante/folitropina => espermatognesis, el desarrollo del folculo y sntesis de estrgenos en ovarios LH / luteinizante/lutropina => desarrollo de las clulas intersticiales testiculares y sntesis de andrgenos LTH / prolactina => produccin de leche

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3- Glndulas perifricas (a) Tiroides => se localiza en la parte anterior del cuello, sobre los cartlagos de la laringe y esta constituida por 2 lbulos unidos por un istmo; en ocasiones se puede observar un tercer lbulo piramidal (lbulo de Lalouette) que parte del istmo; tiene como objetivo primordial la sntesis y liberacin al torrente circulatorio de las hormonas tiroideas (tiroxina/T4 y triyodotironina/T3) que se forman tras la captacin del yodo y protelisis de la tiroglobulina; la unidad funcional e histologa de la tiroides es el folculo tiroideo => compuesto por una capa de clulas tireocitos y dentro se encuentra unasustancia peptdica yodada (tiroglobulina), que se incluye en su secuencia a T3 y T4; funcin => - influyen en el crecimiento y maduracin de los tejidos - regulan el consumo total de energa - regulan el recambio de sustancias esenciales como vitaminas y hormonas, incluyndose a si mismas - ejercen acciones a nivel mitocondrial, sobre el metabolismo oxidativo y a nivel de la membrana plasmtica influyendo sobre el flujo de sustratos y cationes; El eje hipotlamo - hipfisis - tiroideas: la regulacin se hace con TSH y con el contenido de tiroides; la TSH provoca estimulacin tiroidea para sintetizar hormonas tiroideas; la regulacin de la TSH es mediante el TRH (estimula) y hormonas tiroides (inhiben su secrecin y antagonizan con el TRH); Hipotlamo => TRH (tiroliberina) => Hipfisis => TSH (tirotropina) => Tiroides => T3 (triyodotironina) (+) T4 (tiroxina) => metabolismo basal y reacciones celulares (+)tirocalcitonina => metabolismo fosfoclcico.

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Deteccin de los problemas tiroides: Caso 1 - TSH aumentada y T4 disminuida => hipotiroidismo primario (problema de tiroides); al haber poco T4, la hipfisis cree que tiene que sintetizar mas TSH y estimular a la tiroides, pero la tiroides no funciona bien; si TSH alto y T4 normal => autoinmune, existe Ac anti tiroides. Caso 2 - TSH aumentada y T4 aumentada => hipertiroidismo secundario, la disfuncin puede ser de la hipfisis o del hipotlamo; habr que determinar TRH (si TRH baja - problema de hipfisis; si TRH alta - problema de hipotlamo. Caso 3 - TSH disminuida y T4 disminuida => hipotiroidismo secundario; la disfuncin puede ser de la hipfisis o del hipotlamo; hay que determinar TRH (si TRH baja - problema de hipotlamo; s TRH alta - problema de hipfisis) Caso 4 - TSH disminuida y T4 aumentada => hipertiroidismo primario; problema de tiroides; T4 inhibir a la TSH, por eso esta baja, pero la tiroides seguir produciendo T4 Hipotiroidismo; causas => falta de yodo; enfermedad gentica (dficit enzimtico); tratamiento del hipertiroidismo con yodo radiactivo o ciruga; tiroiditis de Hashimoto(destruccin autoinmune de la tiroides); sntomas => pulso lento, voz ronca, habla lenta, cara hinchada, cada de pelo y cejas, parpados cados intolerancia al fri, estreimiento, aumento de peso, cabellos escasos y secos, piel seca, sndrome del tnel carpiano, confusin, depresin, demencia; descenso del consumo calrico. Hipertiroidismo /tirotoxicosis; causas => (1) enfermedad de Graves (autoinmune, se fabrican Ac anti receptor de la TSH en la tiroides => TSH baja; (2) ndulos toxicos (adenomas) => bocio multinodular toxico o bocio hipertrfico; (3) hipertiroidismo secundario por tumor hipofisiario que libera mucha TSH; sntomas => aumento del metabolismo general del organismo, frecuencia cardaca, hipertensin arterial, sudor, escalofros y temblor, nerviosismo, perdida de peso, insomnio, movimiento intestinal, diarrea, debilidad, ojos saltones y enrojecidos, sensibilidad de los ojos a la luz, mirada fija, confusin.
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(b) Suprarrenal => es un organo endocrino; son 2 glndulas de pequeo tamao situadas en los polos superiores de ambos riones en las que se diferencian tanto anatmica como funcionalmente 2 partes: - corteza / zona externa - secreta => hormonas corticales /esteroideas derivados del colesterol: (1) mineralcorticoides aldosterona con funcin => reabsorcin de sodio a nivel renal (equilibrio hidroltico) y regulacin balance inico (eliminar K+); (2) glucocorticoides cortisol con funcin => protelisis, liplisis, gluconeognesis (causando hiperglucemia), anti-inflamatorios y inmunosupresor (3) andrgenos suprarrenales (androsterona y dehidroepiandrosterona) con funcin => virilizacin y proteognesis; - mdula / zona interna - secreta => adrenalina (favorece la tensin arterial, taquicardia, glucemia metabolismo basal y estimula del SNC) y noradrenalina (aumenta la tensin arterial).

Sndrome Cushing => se produce por sobre exposicin del organismo alcortisol/glucocorticoides (hipercorticismo) ocasionado por hiperfuncin de las glndulas suprarrenales (corteza); causas => adenoma hipofisiario, corticotropina ectpica, adenoma suprarrenal, carcinoma suprarrenal; sintomas => calvicie e hirsutismo facial en mujeres; joroba de bfalo; hipertensin; adelgazamiento cutneo hematomas con facilitad; curacin defectuosa de las heridas; acne, cara de luna, mejillas pletricas; osteoporosis; aumento de la grasa abdominal; estras abdominales; necrosis avascular de la cabeza femoral; debilidad muscular. El eje hipotlamo - hipfisis - suprarrenales:
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Hipotlamo => CRF (corticoliberina) => Hipfisis => ACTH (adrenocorticotropa/ corticotropina) => Glndula suprarrenal => corteza (mineralcorticoides aldosterona, glucocorticoides cortisol, andrgenos /androsterona y dehidroepiandrosterona) + mdula (catecolaminas /adrenalina y noradrenalina)

(c) Hormona y factores de crecimiento - la hormona de crecimiento (GH) es un polipptido producido por el lbulo anterior de la hipfisis; su secrecin es estimulado porGHRF/ somatoliberina (factor liberador de la GH) secretado por el hipotlamo; funcin : - indirecta: por medio de factores de crecimiento similares a la insulina (IGFs) que estimulan el crecimiento esqueltico, la sntesis proteica y la proliferacin celular; la fuente principal de estos factores es el higado; - directa: accin antiinsulinica que provoca hiperglucemia e hiperlipemia favoreciendo la gluconeognesis;

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Pruebas diagnosticas mas utilizadas en el estudio de problema de crecimiento: 1- la valoracin basal de la GH 2- los niveles sricos de los IGFs (factores de crecimiento semejantes a la insulina) 3- las pruebas de estimulacin de la GH => las mas aceptadas son la prueba con GHRH y la de hipoglucemia insulnica (la hipoglucemia estimula la produccin de GH) 4- las pruebas de supresin => se hacen cuando se sospecha un exceso de produccin de GH(gigantismo o acromegalia) 5- las pruebas de secrecin espontanea integrada => valoran la secrecin de la hormona durante 24h con una determinada periodicidad o su excrecin urinaria (no hay problema de secrecin puntual, sino alteracin en el patrn de secrecin de GH). Gigantismo => exceso de somatotropina en los nios que con lleva a un crecimiento lineal excesivamente rpido suele ser debido a un tumor hipofisiario antes de que se cierren las epfisis; otras causas: hiperplasia suprarrenal congnita, hipertiroidismo, trastornos hereditarios (sindrome de Klinefelter). Acromegalia => es el aumento de la secrecin de somatotropina en una edad posterior (al crecimiento habitual), despus de la fusin de las epfisis oseas; suele ser por un adenoma hipofisiario. (d) Gonadal (testiculo y ovario) El eje hipotlamo - hipfisis - gnadas: I. Hipotlamo => LH-RH (gonadoliberina) => Hipfisis => gonadotropina FSH (folculo estimulante/ folitropina) => Ovarios (estimula la maduracin de ovulo y produccin de estrgenos/ estradiol) o Testculos (estimula espermatognesis) II. Hipotlamo => LH-RH (gonadoliberina) => Hipfisis => gonadotropina LH (luteinizante /lutropina) => Ovarios (estimula ovulacin y produccin de progesterona/cuerpo lteo) o Testculos (estimula produccin de testosterona /andrgenos y desarrollo clulas intersticiales)

Ciclo menstrual => en la mujer, los niveles de gonadotropinas (FSH y LH) tienen variaciones cclicas, cada 28 das (ciclo menstrual) aproximadamente la FSH estimula elcrecimiento y maduracin del vulo (del 1er da de menstruacin hasta 10-12 das) y la produccin de estrgenos en el ovario; los estrgenos son hormonas feminizantes responsables de los caracteres sexuales femeninos; a lo largo del ciclo menstrual ambas
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hormonas (FSH y estrgenos) estimulan el desarrollo del folculo; sobre el da 10 los niveles de estrgeno que han ido aumentando estimulan el hipotlamo que determina un gran aumento en la sntesis de LH producindose el pico de la ovulacin; esto provoca la rotura del folculo maduro y la ovulacin; en la 2 mitad del ciclo, tras la ovulacin,el folculo estimulado por la LH origina el cuerpo lteo que secreta progesterona; los altos niveles de progesterona frenan la sntesis de gonadotropina; sino hay fecundacin, el cuerpo lteo degenera y se produce la eliminacin de la mucosa endometra (menstruacin); descienden los niveles de estrgenos y progesterona y comienzan a aumentar los niveles de estrgenos y FSH

Fecundacin => el cuerpo lteo no degenera y sigue secretando progesterona (se ira engrosando); el ovulo fecundado se implanta en la mucosa endometra uterina, se desarrolla el embrin y la placenta que secreta estrgenos, progesterona y hormonas anlogas a las hipofisirias y sexuales como gonadotropina carinica (hCG) y somatotropina carinica; la hCG formada por 2 subunidades (alfa y beta) se sintetiza en los 1s das del embarazo con un mximo al 3er mes, luego desciende hasta 5 mes y es estable hasta el final del embarazo (el parto); en el embarazo aumentan extraordinariamente los estrgenos y la progesterona decayendo bruscamente al final; al eliminarse la placenta se secreta prolactina (LTH) hipofisiria que activa en las glndulas mamarias desarrollados por el efecto de estrgenos y progesterona => produccin de leche; el amamantamiento estimulala secrecin de oxitocina en la hipfisis con 2 efectos => secrecin lactea y contraer la musculatura uterina para recuperar el tamao original del tero;

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Las hormonas gonadal y su secretores Testosterona => secretada por los testculos a partir de la pubertad; funcin: - funcin virilizante - estimulan el desarrollo muscular y esqueltico - estimulan los caracteres sexuales masculinos: vellosidad, voz, maduracin testicular, espermatognesis - controla la secrecin de las hormonas hipotlamo-hipfisis, estimulantes del testculo (FSH y LH) retroalimentacin negativa; - responsable del crecimiento y la funcin de la prstata y testculos por la LH en las clulas intersticiales. Oxitocina => secretada por el hipotlamo y emigra al lbulo posterior de la hipfisis (neurohipfisis) donde se almacena hasta su secrecin; funcin: - favorecer la secrecin lctea - contraer la musculatura uterina para recuperar el tamao original del tero - estimula la contracciones en el parto Progesterona => secretada por el cuerpo lteo (el ovario) tras la ovulacin y tambin secretada por la placenta (la mucosa uterina) durante el embarazo; funcin : - frenar la sntesis de gonadotropinas tras la ovulacin - ayuda a la implantacin del ovulo fecundado en la mucosa uterina - ayuda al embarazo - ayuda a desarrollar las glndulas mamarias en el embarazo Estrgenos => secretada por el ovario durante el ciclo menstrual y tambin por la placenta durante el embarazo; funcin: - maduracin y funcin feminizante de rganos sexuales - responsable de los caracteres sexuales femeninos - estimula en el desarrollo del folculo (aumenta en 10 da del ciclo menstrual) - estimula la ovulacin - desarrollo y mantenimiento del endometro - ayuda en el embarazo (placenta) - ayuda a desarrollar la glndulas mamaria en el embarazo

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Prolactina/LTH => secretada por la adenohipfisis/hipfisis anterior, gracias a la eliminacin de la placenta tras el parto; funcin: estimula la produccin de leche en las glandulas mamarias Gonadotropina carinica (hCG) => secretada por la placenta; esta formada por 2 subunidades (alfa y beta) se detecta en suero o orina; tiene mucha importancia en el 1er trimestre del embarazo y a lo largo de los 9 meses ; es semejante a la LH y FSH y hormona sexuales; funcin: - sirve para el diagnostico de embarazo normal y/o ectpico => 150-800 mUI/ml o menores; - peligro de aborto 1er trimestre(niveles persistentes bajos) - diagnostico y tratamiento de tumores trofoblsticos (clulas despus del cigoto) - crecimiento y mantenimiento de la placenta

Pldora anticonceptiva - compuesto de progesterona engaa al organismo haciendo creer que hay embarazo => impide la ovulacin; no deja que se desarrolla el endometro (menos grueso); aumenta el espesor / la consistencia del flujo vaginal y as es como barrera para los espermatozoides. Gonadotropina carinica /hCG (secretada por la placenta) - VN en embarazo 5000-80000 mUI/ml Variacin de la secrecin de hCG durante la gestacin - se sintetiza en los 1s das del embarazo, alcanzando el mximo nivel al 3er mes de la gestacin (70 das despus de la ultima menstruacin), luego desciende hasta el quinto mes y se mantiene estable hasta al final del embarazo. Niveles de hCG en el embarazo ectpico - 150-800 mUI/ml o menos (niveles bajos), porque esta hormona es secretada por la placenta que se ubicara en la cavidad uterina; cuando el embrin se desarrolla ectpicamente trompas de Falopio) no va a encontrar lo necesario para sobrevivir (no endometro, placenta sin nutrientes); el nivel de hCG aumentara al principio pero luego parara su aumento; tambin se pueden encontrar estos niveles de hCG en un peligro de aborto en el 1er trimestre (crecimiento embrionario normal); en caso de presencia de tumor trofoblastico, los niveles notablemente aumentados (no siempre) => altos mas de lo normal para esa poca del embarazo.

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Hipogonadismo primario (masculino) - produccin deficiente de espermatozoides y una secrecin disminuida de testosterona por causas => deficiencia testicular, hipofuncin de las gnadas, agenesia testicular, agresiones testiculares, traumatismo por radiacin, frmacos. Hipogonadismo secundario - produccin deficiente de espermatozoides y secrecion disminuida de testosterona por defecto en el hipotlamo o la hipfisis (ausencia de gonadotropinas) Hipogonadismo primario (femenino) - hipo-funcin de los ovarios, amenorrea Hipogonadismo secundario - secrecin deficiente de estrgenos amenorrea, infertilidad, se debe a un problema con la hipfisis o el hipotlamo.

Tema 23 - Estudio de la funcin renal y de los productos finales del metabolismo

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Urea - es el principal compuesto de excrecin del amoniaco, que se forma en el transcurso del catabolismo de los aminocidos y las protenas (producto final del catabolismo proteico en el higado y musculos); sintetizada en el higado a partir de los aminocidos+bicarbonato => pasa a la sangre => eliminada por los riones (tras la desaminacin => el grupo amino => amoniaco => urea). Valor normal en suero = 10 - 50 mg/dl Inters clnico - el aumento de la concentracin de la urea en sangre (hiperuremia) esta estrechamente relacionada con alteraciones en su eliminacin por lo que es un indicador de insuficiencia renal y una gran utilidad como mtodo sencillo de seguimiento de una insuficiencia renal ya instaurada; la urea se elimina por va renal, siendo filtrada facilmente a nivel glomerular; una vez filtrada, se reabsorbe en un 40% a nivel de los tbulos proximales; si falla el rion, no se filtra y se acumula en sangre; un aumento de urea en sangre, nos indicara una causa => extrarenal (alteracin heptica, hemorragia digestiva, aumento de urea por catabolismo de protenas, aumento por exceso proteico en la dieta) onefroptica (insuficiencia renal aguda o crnica); las causas de hiperuremia: insuficiencia renal aguda (glomerulonefritis aguda, pielonefritis, neoplasias, clculos renales, hemlisis) insuficiencia renal crnica (glomerulonefritis crnica, neoplasias, diabetes, hipertensin arterial)

Acido urico - es el producto final de la degradacin de las purinas (adenina, guanina e hipoxantina) procedentes del catabolismo de los cidos nucleicos (ADN, ARN) por la enzima xantinooxidasa; las purinas proceden de: - exgena => el consumo de protenas de origen animal - endgenas => con la renovacin celular; es la mas importante; al combinarse con un azucar => nucleosidos + fosfato => nucletidos (ADN, ARN, AMP-cclico y ATP) Valor normal en suero = 3,4-7 mg/dl en hombres y 2,4-5,7 mg/dl en mujeres (20% menos) Inters clnico - interviene en la renovacion celular; diariamente 60% del AU es eliminado por la orina, mediante filtrado glomerular; luego es reabsorbido en los tubulos renales 90% del total; el resto es eliminado con la bilis (va hepatica) y los jugos pancreaticos y gastrico; los trastornos en su nivel plasmtico, se manifiestan como hiper o hipo uricemia y nos pueden indicar una serie de patologas (se puede determinar en sangre y orina): - hiperuricemia: causas metablicas (aumento de la uricemia y uricuria) => por incremento en la sntesis de AU procedente de => la dieta rica en purinas; lisis celular (leucemias); consumo de ATP (ejercicio intenso); trastornos metablicos hereditario (dficit enzimtico); causas renales (uricuria < uricemia porque se acumula en sangre)=> dficit de su secrecin/ insuficiencia renal; inhibicin por competitividad con ciertos metabolitos como acido lctico y cuerpos cetnicos; consecuencia de
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hiperuricemia =>problemas a nivel articular (gota aguda/crnica y tofos => deposito de uratos), clculos renales/ obstruccin renal de los tbulos. - hipouricemia es causada por dficit enzimtico de xantinooxidasa, hormona antidiurtica /ADH y fallo en la reabsorcin tubular (no hay reabsorcin o la secrecin es excesiva);cuando la causa de la hipouricemia es el aumento de la eliminacin renal, existe riesgo de litiasis renal (uricuria > uricemia); cuando la causa es por la insuficiente sntesis de AU => ambos nivel de uricuria y uricemia son bajos; Amoniaco - es uno de los productos finales del metabolismo de las protenas y se forma en el intestino por accin de las bacterias sobre las protenas y por la hidrlisis de la glutamina en el rin; normalmente, el higado elimina la mayor parte del amoniaco en sangre que fluye por la vena porta y lo convierte en urea; valor normal en suero = 80-100 microgramo/dl. Inters clnico - sirve para ver la funcionalidad del higado => su metabolismo, la evolucin de una hepatopata y el grado de respuesta al tratamiento; su aumento en sangre podra afectar seriamente al equilibrio acido-base y a la funcin cerebral (es toxico para las neuronas); su nivel plasmtico depende de la ingestin de protenas, el ejercicio fsico y algunos frmacos. Creatina - es un compuesto nitrogenado no proteico; se sintetiza en los riones, el intestino delgado, el pncreas y el hgado a partir de los aminocidos metionina, arginina y glicocola; es importante para el metabolismo muscular porque constituye un importante mecanismo de almacenamiento de fosfato de alta energa (fosfocreatina); la mayor parte de creatina se encuentra a nivel muscular en forma de fosfocreatina y una pequea parte en el plasma y en los hemates. Creatinina - es un producto final del metabolismo muscular; es un anhdrido de la creatina que se forma mediante una reaccin espontanea e irreversible y su formacin tiene una relacin directa con la masa muscular; cuando este libre, no se utiliza en el metabolismo del cuerpo, y funciona nicamente como producto de excrecin de la creatina; valor normal en suero = 0,5 - 1,1 mg/dl Inters clnico - sirve como marcador precoz de la funcin renal, especialmente de la filtracin glomerular; tras pasar por la sangre, se elimina en su mayora via renal (filtrado glomerular) y una pequea cantidad por las heces; su nivel plasmtico es bastante constante, de manera que no se modifica ni con el ejercicio ni con las variaciones del catabolismo, por lo que cualquier incremento del nivel srico indica problema renal, insuficiencia renal (suele ser paralelo al aumento de urea), lesin renal, prerrenal, sistmicas o vasculares del rion u obstruccin; nunca se altera al no ser que haya alteracin renal. Aclaramiento de creatinina - se utiliza para determinar la funcin renal, especialmente la filtracin glomerular; es la velocidad con que la creatinina es depurada de la sangre por el rion / la velocidad con que el rion pasa la creatinina de la sangre a la orina en un minuto; la formula: aclaramiento de creatinina = (mg/dl creatinina - orina) x (volumen de orina /24h) (mg/dl creatinina - suero) x (60' x 24h)

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Determinaciones que se realizan en suero y en orina para estudiar la funcin renal => urea/uremia (indicador de insuficiencia renal y su seguimiento de tratamiento) y creatinina (filtracin glomerular y aclaramiento de creatinina en orina 24 h);la diferencia entre urea y creatinina como marcadores sricos de alteracin renal: 1- urea => indicar insuficiencia renal rpidamente pero su aumento tambin depende de la ingesta proteica, catabolismo proteico endgeno, si hay hemorragias digestivas y hepatopatas (se puede ver alterada por otras causas); creatinina => aunque es mas lentoque la urea, siempre indica insuficiencia renal (mas especifica), siempre que la masa muscular se mantenga constante; no se modifica ni con el ejercicio ni con variaciones del catabolismo y no depende de la dieta; 2- urea puede estar alto y la creatinina no en lesiones hepticas (se determina GOT y GPT); 3- urea => producto de excrecin de amoniaco; creatinina => producto final del metabolismo muscular; 4- urea se elimina va renal y creatinina se elimina va renal y heces; Determinaciones que se deben realizar segn la peticin analitica: a. Perfil hepatico => hemograma, proteinograma, factores de coagulacion, BQ (urea, amoniaco, urobilingeno, GOT, GPT, GGT, ALP, LDH-5, BB total , LAP, 5-NT); muestra sangre total para hemograma (tubo lila), en plasma para coagulacion (tubo azul) y en suero (tubo amarillo/rojo) para el resto de las pruebas; la muestra se extrae en ayunas para hemograma; exento de hemlisis; procesamiento de inmediato, porque las enzimas pierden actividad y temperatura mxima 37 para que las enzimas no se desnaturalizan; BB protegido de la luz y refrigerado, porque es un pigmento. b. Pre-operatorio => hemograma, pruebas de coagulacion (t.de Quick), PTT, grupo sanguneo, BQ (glucosa, urea, creatinina, electrolitos (Na+, K+, Cl-); muestra sangre total para hemograma (tubo lila), en plasma para coagulacion (tubo azul), en suero para BQ
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(tubo amarillo); la muestra se extrae en ayunas o no ingerir alimento graso para no tener plasma lipmico; se rechazan el primer tubo (por la tromboplastina tisular); no tomar medicacin 2 semanas antes? c. Estudio de posible IAM o seguimiento del mismo => CK total, CK-MB, LDH-1/LDH2, GOT, marcadores precoces (mioglobina y troponina I,T) solo se piden al principio si no se sabe cuando empez (precoz o tarda); seguimiento => determinaciones seriadas los primeros 3 o 4 das con curva de ascenso y normalizacin tipicas en cada una de las enzimas y protenas en sangre a diferentes intervalos de tiempo desde la 1a hora hasta incluso 7 das despus; generalmente se realizan en suero (tubo amarillo); condiciones de urgencia=> seguimiento 6, 8, 12, 24 horas - 7 das y con protena precoces; muestra no hemolizada y procesado inmediato; d. Perfil renal => muestra de orina en recipiente estril: la orina 1 hora de la maana en ayunas para la determinacin de: acetonuria, glucosuria, proteinuria, bilirrubinuria, urobilinogeno, micro albuminemia; muestra en suero (tubo amarillo) para la determinacin de: urea, urato, creatinina, Na+, K+ Cl-, glucosa; el aclaramiento de creatinina no se hace de rutina; no realizar ejercicio intenso. e. Perfil lipidico => TG /triglicridos, colesterol, HDL, LDL; muestra en suero (tubo amarillo) en ayunas, dieta habitual 2-3 semanas antes, no realizar ejercicio fsico intenso 3 horas antes, suspender medicacin??? 1 mes antes y retrasar en caso de enfermedad; realizar colesterol y TG antes de 48 horas; para la lipoprotenas => solucin conservante y antes de 3-4 das (muestras refrigeradas); puede salir suero hiperlipdico (diluir y repetir prueba).

Tema 17 - Estudio del lquido seminal

El semen - es una solucin compleja, compuesta bsicamente por espermatozoides suspendidos en un liquido llamado plasma seminal que proporciona un medio nutritivo y volumen adecuado para llevar los espermatozoides hacia el moco cervical; es una mezcla de secreciones producidas por los testculos y las glndulas => vesculas seminales, prstata, epiddimos, conductos deferentes, glndulas bulbouretrales (Cowper) y glndulas uretrales (Littr); formacin del lquido seminal => en los testculos se producen espermatozoides y hormonas sexuales masculinas => pasan al epiddimo (se maduran y se almacenan => eyaculados o reabsorbidos por el organismo); eyaculacin => conducto deferente + fluidos de vesculas seminales y prstata; - fraccin pre-eyaculatoria (lubricante clara) de las glndulas uretrales y bulbouretrales - fraccin previa de la prstata (cido ctrico y fosfatasa cida) - fraccin principal de testculo - epiddimo - deferente => espermatozoides - fraccin final de las vesculas seminales (coloide) => fructosa

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Examen del liquido seminal 1. Datos del paciente => cdigo de barras, etiqueta 2. Condiciones del examen => hora de eyaculacin, hora de examen, tiempo de transporte, mtodo de obtencin abstinencia sexual, ultimo proceso febril. 3. Examen fsico (macroscpico) - Volumen normal (tras 3-5 das de continencia): 2-6 ml - Tiempo de liquacion: debe licuarse totalmente a los 15 minutos - Color: blanquecino - pH: 7-8,1 - Viscosidad normal: cae gota-a gota - Filancia: filamento menor o igual a 1cm 4. Examen microscpico - Examen en directo - observacin directa en fresco de una gota en porta => si hay o no cristales de fosfato de espermina (cristalizacin), leucocitos, espermatozoos, hemates, aglutinacion, espermiofagia (fagocitados por leucocitos) - Estudio de la motilidad - es necesario que tengan una motilidad activa para penetrar en el moco cervical y emigren hacia el ovulo; se realiza mediantela tcnica de observacin directa en fresco => se registra el porcentaje total de espermatozoides que presentan movilidad y inmviles y clasificando los mviles segn presenten movilidad activa (avanzan) o pasiva (se mueven pero no avanzan) o con indice de vitalidad (test de Williams Pollak) en fresco o en frotis teido => los resultados se expresan como porcentaje de espermatozoides teidos y se indica el indice de vitalidad que es la inversa del numero de espermatozoides teidos (si estos son 40%, el indice de vitalidad es de 60%) - Recuento normal 20-250 millones/ml (en cmara de Neubauer); Hiperespermia > 250 millones/ml; Oligospermia entre 1-20 millones/ml; Azoospermia => ausencia de espermatozoides maduros (presencia de clulas de espermiognesis/ inmaduros); Aspermia=> ausencia de espermatozoides y de clulas de espermiognesis. - Motilidad normal 60-90% movilidad (antes de 2 horas); Astenospermia =><50% de formas mviles a las 2 horas; Necrospermia => todas las formas carecen de
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movilidad; determinacin de las categoras a,b,c,d (ha de haber un 50% entre a y b para ser frtil). - Indice de vitalidad => estudio de necrospermia (cuantos hay de vivos y muertos); los espermatozoides vivos no se tien con eosina => la membrana no es permeable; valor normal => coloracin con eosina <40% (vivos al 60%) - Formula espermtica => % de espermatozoides normales y anormales(anomalas de anatoma cabeza, cuello y cola); presencia de clulas de espermiognesis y teratognicas (tumoracin en su maduracin), de descamacin y cualquier otro tipo; informe de estudio morfolgico. 5. Examen Bioqumico - Estudio prstata: Zinc => disminuido en inflamaciones (parmetro de la actividad bacteriana); Acido ctrico => transporte calcio (afecta a la motricidad de los espermatozoides); es un parmetro representativo del funcionamiento prosttico; disminuido en insuficiencias prostticas, inflamaciones y neoplasias (valores normales 250800 mg/dl); Fosfatasa cida => aumentada en tumores y PSA (marcador tumor) UI/ml - Estudio vesculas seminales: Fructosa => valores normales 160-500 mg/dl; disminuida en trastornos funcionales de las vesculas seminales o dficit de testosterona. - Estudio epididimo: Carnitina => necesaria en la adquisicin de movilidad del espermatozoide; disminuida en problemas de baja motilidad.

Tema 18 - Estudio del lquido cefalorraqudeo

El liquido cefalorraquideo (LCR) - es un liquido transparente e incoloro en el espacio subaracnoideo (entre la membrana piamadre y aracnoides de las meninges) que se forma por filtracin de sangre a traves de los capilares coroideos; funcin =>(1) protector, amortiguador del encfalo y mdula espinal; (2) transferencia de sustancias entre la sangre y los tejidos nerviosos (el medio extra-celular de las neuronas) semipermeable; su examen sirve para =>(1) determinar infecciones, hemorragias cerebrales, aumento de la presin intra-craneal y otras afecciones del SNC; (2) diagnostico de cefaleas, entumecimiento de las extremidades y otros sintomas neurolgicos;

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Toma de muestras - por puncin lumbar (4 espacio lumbar) se recoge 2,5-5 ml - depende de la presin repartidos en 3 tubos (bioqumica en tubo con fluoruro sdico para evitar gluclisis, citologa en un tubo con heparina y microbiologia en un tubo estril) Examen fsico - estudio de caracteres organolpticos: - Aspecto normal: limpio, transparente y cristalino; anormal => turbio (procesos infecciosos, presencia de microorganismos, de leucocitos), empaado, opalescente o sanguinolento (extraccin traumatica => tras la puncin el 1er tubo sera el nico sanguinolento; patologa => si todos los tubos son sanguinolentos) - Color normal: incoloro / transparente; anormal => rojizo (presencia de hemates enhemorragia reciente, puncin traumtica); amarillo (xantocrmico por degradacin de la hemoglobina, hemorragia antigua con bilirrubina, oxihemoglobina, ictericia, pus). - Volumen: 90-200 ml (adultos); 10-60 ml (recin nacidos) - Presin: 70-200 mm agua en adultos; 50-100 mm agua en nios - Densidad: 1,005-1,008 - pH: 7,4-7,5 Examen citolgico - para ver si hay infeccin - Recuento celular total normal: <5 clulas/micro-litros (linfocitos y monocitos); >5 puede haber meningitis; patolgico => pleocitosis (moderada, acentuada, extrema): patologa del SNC, generalmente enfermedades inflamatorias o infecciosas. - Recuento diferencial; tcnica => concentracin celular, tincin, observacin microscpica (neutrfilo s, linfocitos, eosinfilos, clulas plasmaticas con linfocitos, histiocitos malignos con linfocitos en esclerosis multiple, macrfagos en infarto craneales) Examen qumico - determinaciones de metabolitos y pH - Protenas normal: 0,2-0,4 g/l (importante determinacin de albumina e IgG que se sintetiza en SNC para evaluar la integridad de la barrera sangre-LCR); los valores aumentados en procesos que afectan al SNC como inflamaciones, infecciones, procesos tumorales, abscesos cerebrales; es muy importante en el diagnostico de esclerosis multiple mediante electroforesis del LCR.
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- Glucosa normal: 50-80 mg/dl (mitad del nivel sanguneo); variacin de la glucorraquia => disminuida en hipoglucemia y aumentada en diabetes mellitus; la determinacin de glucosa es de ayuda para demostrar algn impedimiento en el transporte de glucosa desde el plasma hacia el LCR o un uso aumentado de la glucosa en SNC debido a la presencia de leucocitos o grmenes. - Acido lctico es aumentado en meningitis bacterianas y en hipoxia del tejido del SNC y no se modifica en las meningitis vricas. - Lactato deshidrogenasa (LDH) se utiliza pra el diagnostico diferencial de la meningitis bacteriana y vrica. - Creatin-kinasa (CK) aumenta en mltiples trastornos del SNC; > 4 U/L => lesin cerebral isqumica. - Adenosindesaminasa (ADA) su aumento sirve para el diagnostico de la meningitis tuberculosa >9 U/L - Aspartato aminotransferasa (AST/GOT) aumenta en meningitis, hemorragias y tumores. - Cloruros se disminuye en meningitis tuberculosas y purulentas. Examen inmunolgico / serolgico - deteccin de Ags y Acs - Anticuerpos anti VIH - Acs anti-microbianos (segn la patologa que se sospecha) - Acs anti treponema pallidum (FTA-ABS) sfilis => afecta al SNC Examen microbiolgico - demostracin del germen causal o de la etiologa infecciosa - Cultivo y antibiograma - Tincin en porta si fuera necesario Tipos de Meningitis => tuberculosa, bacteriana, vrica, sifiltica, mictica, parasitaria, purulenta; meningitis bacteriana => glucosa disminuida, acido lctico aumentada , LDH aumentada; meningitis tuberculosa => ADA (adenosindesaminasa) aumentada, cloruro disminuida, glucosa disminuida;

Tema 19 - Estudio del liquido sinovial

Liquido sinovial - se encuentra en las articulaciones de las extremidades (cavidad articular); se deriva del plasma sanguneo que se filtra a traves de los capilares sinoviales difundiendo hasta la cavidad articular, donde se aaden algunas sustancias sintetizadas en la membrana sinovial como protenas y acido hialurnico (macromolcula compleja que le da viscosidad); funcin => lubricar las superficies de rozamiento; aportar nutrientes al cartlago articular; su estudio es para el diagnostico de enfermedades articulares(artritis/ inflamacin de las articulaciones y artrosis/ enfermedad degenerativa articular); su anlisis permite realizar un diagnostico preciso en la mayora de las artritis infecciosas agudas y en las artropatas inducidas por cristales.

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Clasificacin de artritis => infecciosas, metablicas (gota/cristales de urato; pseudogota/ condrocalcinosis/ cristales de pirofosfato de calcio), mecnicas (traumatismos, tumores),relacionadas con otras enfermedades (alergia, hemofilia), idiopticas (reumatoide), lupus eritematoso. Toma de muestras - mediante puncin articular (artrocentesis) estando el paciente en ayunas (si se va a determinar la glucosa); se extrae 2-5 ml. Examen fsico - Aspecto normal => amarillo plido trasparente; anormal => lechoso (artritis, lupus eritematoso) purulento (artritis infecciosa), verdoso (artritis por haemophilus, sinovitis aguda por gota o pseudogota/ condrocalcinosis), amarillo intenso (proceso inflamatorios), rojo(artritis traumtica, tumores, artropatas). - Viscosidad y filancia: muy viscoso, pegajoso al tacto (acido hialurnico - disminuida en inflamaciones/ infecciones); se mantiene elevada en derrames traumticos y artrosis;filamento de unos 3-6 cm. Examen citolgico

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- Recuento celular total normal 10-200 clulas/micro-litro (leucocitos); anormal=> osteoartritis, traumatismos, gota, condrocalcinosis, artritis reumatoide, artritis infecciosa, etc. - Recuento diferencial; tcnica => frotis, tincin, estudio morfologa celular (clulas AR, clulas LE, clulas de Reiter)

Examen de cristales - en artropatas - Urato monosdico (gota) - Pirofosfato clcico (condrocalcinosis) - Hidroxiapatita (artritis) - Colesterol (artritis reumatoide) Examen qumico - Protenas normal 15-30 g/l (albumina 55-70%); aumentadas en procesos articulares en los que esta afectada la membrana sinovial (trasvasa de protenas). - Glucosa normal: similar a la glucemia; disminuida en procesos inflamatorios e infecciones (las bacterias la consumen); si es inferior a la mitad de la simultanea en suero, => infeccin bacteriana - Lactato => indicador de inflamacin (cuando es >30 mg/dl) - Complemento => niveles reducidos con respecto a los niveles sricos simultneos, es indicativo de artritis reumatoide y/o lupus eritematoso. Examen microbiolgico - Sedimento - Cultivo y antibiograma Examen inmunolgico - Complemento

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Tema 20 - Estudio del lquido pleural, pericrdico y peritoneal

Lquido pleural, pericrdico y peritoneal - son fluidos serosos derivados del suero y secretados por las membranas con funcin de proteger a los rganos de la friccin; liquido pleural se encuentra entre las capas pleura visceral y pleura parietal (membranas que revisten los pulmones); liquido pericrdico se encuentra entre la capa parietal y la capa visceral que reviste el exterior de corazn liquido peritoneal se encuentra entre las capas peritoneo parietal y peritoneo visceral; efusin serosa (derrame) => se produce cuando hay un aumento anormal de la cantidad de liquido, causado por el dao en los mecanismos fisiolgicos (desequilibrio) de la formacin o absorcin del fluido; tipos: - Trasudados: fluidos no inflamatorios que se producen por alteracin de la presin osmtica del plasma sanguneo o la presin hidrosttica capilar (no altera la membrana) - Exudados: fluidos inflamatorios producidos como consecuencia de procesos patolgicos (lesionan la membrana) con inflamacin o irritacin de la membrana serosa y aumento de la permeabilidad capilar. - Derrame quiloso: fluido producido por el escape de quilo desde el conducto torcico como consecuencia de lesin u obstruccin linftica (trauma, tumor o tuberculosis) Anlisis de los derrames serosos - Fsico => observacin del aspecto
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- Citolgico => recuento de hemates, leucocitos y recuento diferencial - Bioqumico => protenas totales, ADA - Microbiolgico => cultivos Examen qumico - Liquido pleural => determinacin de protenas para la diferenciacin entre exudado y trasudado (< de 3 g/dl en trasudado; > de 3 g/dl en exudado); adenosindesaminasa (ADA)ayuda para el diagnostico de la pleuritis tuberculosa; la concentracin de glucosa > a 0,5 con la srica (< de 60 mg/dl en exudado); un nivel alto de triglicridos indica la presencia de quilomicrones (quilotrax por traumatismo o obstruccin linfomatosa); lasamilasas estn aumentadas en las pancreatitis; pH < a 7,3 indican una posible evolucin del derrame hacia empiema (acumulacin de pus en la cavidad pleural causado por una infeccin en el pulmn) y si < de 6 indica rotura esofgica. - Liquido asctico => determinacin de protenas, glucosa, fosfatasa alcalina y amoniaco. - Liquido pericrdico => determinacin de la glucosa.

Tema 21 - Drogas de abuso

Droga - toda sustancia que introducida en un organismo vivo puede modificar una o varias de sus funciones, es susceptible de crear dependencia, y puede a la vez provocar tolerancia(incluido => nicotina, alcohol y cafena); droga de abuso => sustancias administradas en un organismo vivo, y capaces de producir cambios en el estado de percepcin, comportamiento, creando habito de consumo y presentando una sintomatologa psquica y/o de dependencia; Analtica de dogas de abuso - el anlisis inicial (screening o de presuncin)y anlisis de confirmacin; - La orina es muestra de eleccin por razones => contiene una concentracin superior(solubilidad elevada) y durante mas tiempo que otras muestras; la facilidad de su obtencin con procedimiento no invasivo. - El suero o plasma y sangre total son tiles para la deteccin del consumo reciente, anlisis toxicologia forense y analtica post-morten. - En la analtica post-morten se emplean extractos tisulares - En el consumo de drogas de abuso en el ultimo trimestre del embarazo, se emplea el meconio. - La analtica de screening presentan informe cualitativo de resultados (presencia/ausencia)

(plantas de coca) Tiempo de deteccin de drogas en orina - Anfetaminas: 2-4 das o superior
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- Barbitricos: 1-21 das o superior - Benzodiazepinas: 3 das o superior - Cannabinoides: 1-36 das o superior - Cocaina: hasta 72 horas - Etanol: depende del peso, la edad salud y el metabolismo individual - Opiceos: 2-5 das o superior Screening /presuncin - son pruebas para eliminar las muestras con resultado negativo y reducir al mximo el numero de anlisis de segundo nivel (confirmacin); no precisan personal especializado al ser fciles de realizar; para ser cuantitativa, comparar con patrones de calibracin; los metodos de screening son adecuados para => verificar el consumo de estupefacientes, evaluar el grado de consumo/abuso y identificar sustancias consumidas;las tcnicas => se basan en la inmunoqumica (RIA/ radioinmunoensayo, EIA/ enzimoinmunoensayo, FPIA/ inmunoensayo de polarizacin fluorescente) y cromatografia en capa fina /TLC); test inmunolgico rpido se realiza en un anlisis de screening cualitativo.

(cannabis sativa) FIA - Ac anti droga en pocillo, se introducen los Ag (muestra) y trazador (Ag comercial marcado con fluorforos/florescencia); compiten por el Ac; si la fluorescencia es elevada habr poca droga (el resto de fluorescencia se elimina con el lavado?); cuanto mas droga => menos fluorescencia. EIA - Ac antidroga en pocillo, se introducen los Ag (muestra) y trazador (Ag comercial marcado con una enzima); compiten por el Ac; si hay mucha droga, quedara mucha enzima libre que reaccionara con sustrato y dara el producto coloreado (mucho color); cuanto mas droga => mas enzima => mas color.

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RIA - Ac antidroga en pocillo con Ag (muestra) y trazador marcado con isotopo radioactivo;compiten por el Ac; se lava (el resto de radiactividad se elimina con el lavado); cuanto mas droga => menos radiactividad. TLC - separacin de diferentes drogas segn sus caractersticas fisico - qumicas; para la identificacin de la droga se emplean diferentes estndares. Metodos de confirmacin - se utiliza tcnica cromatografia de gases (GC), espectrometra de masas (MS) y cromatografia liquida de elevada resolucin (HPLC).

(la planta opio / adormidera) Principales drogas de abuso - Cannabinoides => cannabis sativa, THC - Depresoras => barbitricos, benzodiazepinas, alcohol - Alucingenas => fenciclidina, mescalina, LSD - Opiceos => herona, codena, dihidrocodeina, hidrocodona, hidromorfona, oxicodona, oximorfona, metadona, propofixeno, antagonistas Opiceos - Estimulantes => anfetaminas, cocana - Otras drogas => tabaco, sustancias voltiles

Tema 22 - Marcadores tumorales (MT)

Los marcadores tumorales (MT) - macromolculas orgnicas que se encuentran en el torrente circulatorio y/o en diversos tejidos o fluidos y cuya presencia o variacin en su concentracin, presenta cierta relacin con la aparicin y/o desarrollo de algunos tumores malignos; se encuentra en el espacio intracelular o en la superficie de las clulas tumorales, tambin pueden proceder de otras clulas donde ha sido inducida su produccin; tipos de MT => antgenos, glucoprotenas, enzimas, hormonas, protenas sricas, otras (zinc, cobre, etc.)

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Tema 23 - Estudio de las heces

Las heces - constituidas fundamentalmente por agua, restos alimenticios no digeridos, productos de la digestin y gran cantidad de bacterias; su anlisis es til para orientar un diagnostico; Patologas segn los hallazgos en las heces - Deteccin de sangre y/o moco => patologas intestinales (colitis ulcerosa, carcinoma de colon, plipos hemorroides) - Deteccin de restos de principios inmediatos mal digeridos => patologas digestivas(sndrome de malabsorcin esteatorrea, amilorrea, creatorrea) - Deteccin del germen causal => infecciones intestinales (diarrea) - Deteccin de huevos, quistes, parsitos => parasitosis intestinales (diarreas, anemias)
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Anlisis a realizar en una muestra de heces - Examen fsico-qumico => caracteres organolpticos, pH, sangre - Estudio de la digestin => examen macroscpico y microscpico (montaje hmedo directo, tinciones) - Estudio microbiolgico coprocultivo => siembras de cultivos, observacin macroscpica y microscpica, tinciones, pruebas bioqumicas e inmunolgicas - Estudio parasitolgico => examen macroscpico y microscpico (montaje directo, tinciones, tcnicas de concentracin) Sndrome de malabsorcin - Malabsorcin pancreatgena => esteatorrea (presencia anormal de grasa en las heces),creatorrea (presencia anormal de protenas), amilorrea (presencia anormal de hidratos de carbono/almidn). - Malabsorcin hepatgena => esteatorrea - Malabsorcin entergena => en general, siendo mas importante la esteatorrea Examen fsico-qumico de las heces

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Caracteres organolpticos patolgicos - Moco: es patolgico excepto en nios recin nacidos; masa gelatinosa formando grumos de forma irregular y consistencia viscosa; aspecto filamentoso o formando membranas; es blanquecino, mas o menos transparente; las partculas de moco de gran tamao proceden de la porcin inferior del intestino grueso; el moco finamente dividido y mezclado con las heces, procede de las porciones mas altas; indica => inflamacin o irritacin de la mucosa intestinal, especialmente del colon en neoplasias, colitis ulcerosa, disentera bacilar, etc. - Pus: macroscpicamente como una masa blanquecina normalmente asociada con sangre y /o restos de mucosa; los leucocitos se observa microscpicamente en una tincin; aparecen en => colitis ulcerosa, disentera bacilar y pacientes con abscesos o fistulas anales. - Sangre: macroscpicamente como heces rojas o melenas (heces alquitranadas) o presentarse como "sangre oculta" cuando se encuentra en menor cantidad y esta digerida; cuando es roja procede de los tramos finales del aparato digestivo; la sangre oscura esta digerida y procede de las partes altas del aparato digestivo; se encuentra en => tumores, ulceras, colitis ulcerosa, fistulas anales, hemorroides.
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Determinacin de pH - valor normal 6,8-7,2 (depende de la alimentacin); las protenas alcalinizan las heces (producen amonio y urea) y los hidratos de carbono las acidifican (fermentacin); importante: - reaccin cida => indica trastornos digestivos con aumento de la fermentacin - reaccin alcalina => indica trastornos digestivos con aumento de la putrefaccin Investigacin de sangre oculta - la tcnica mas utilizada se basan en la investigacin de peroxidasas como indicadores de la presencia de Hb en las heces; HEMDETECT IMMO => prueba inmunolgica rapida para la deteccin de sangre oculta en heces; es una prueba inmunocromtica especifica de deteccin de Hb humana.

Tema 24 - Estudio del equilibrio hidroelectroltico, acido bsico y gaseoso del organismo humano
Equilibrio hidro-electroltico Neutralidad elctrica - un estado en el cual hay una igualdad entre el total de aniones y cationes en los compartimentos liquidos corporales; los electrolitos se absorben mediante un mecanismo de: - trasporte activo (con gasto energtico); - difusin pasiva (debido a la diferencia de gradiente electro-qumico); - difusin facilitada (acompaando al agua en su respuesta a una diferencia del gradiente osmotico/ arrastre por el solvente) Osmolaridad - el numero de partculas de soluto, por unidad de volumen, en una disolucion expresada en miliosmoles de soluto/Litro de solucion (mOsm/L); el agua difunde en general, de una zona de menor concentracin osmolar a una de mayor concentracin, para igualar osmolaridades;

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Mecanismos de concentracin y aumento de flujo urinario en condiciones fisiolgicas de normalidad el rion regula la concentracin de solutos y mantiene la osmolaridad de los lquidos organicos dentro de los limites estrictos: (1) Si el organismo necesita retener agua => los mecanismos de reabsorcin entran en funcionamiento => aumenta la osmolaridad de la orina (mas concentrada - menos agua) (2) Si hay un exceso de agua en el organismo => el flujo urinario aumenta => disminuye la osmolaridad (menos concentrada - mas agua) Mecanismo de absorcin y secrecin de agua y electrolitos mediados por hormonas (vasopresina /ADH) y neurotransmisores: (1) Un aumento de la osmolaridad del suero => estimula la secrecin de la hormona antidiurtica (ADH) que acta sobre los tbulos renales => resorcin de agua aumenta => la orina se concentra (2) Un descenso de la osmolaridad del suero => inhibe (incluso llega a suprimir) la liberacin de ADH => resorcin de agua disminuye => la orina se diluye (disminuye la osmolaridad de la orina) Evaluacin del equilibrio hidro-electroltico en el organismo (evaluar la capacidad del rion como regulador) => determinar cualitativa y cuantitativamente los solutos presentes en la orina: - calculando el peso especifico (densidad) de la muestra - medir la osmolaridad urinaria (normalmente coincide con la el peso especifico) - determinar los electrolitos presente Con el resultado de las pruebas, tambin se consigue determinar: - el estado de hidratacin
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- la funcionalidad de la hormona antidiurtica (ADH) - la gravedad de un estado de coma en un paciente (actividad hipotlamo/SNC) Estudio de los electrolitos orgnicos mas importantes - el suero/plasma es elfluido biolgico de eleccin a la hora de evaluar la composicin en aniones y cationes del organismo.

Sodio (Na+) - su metabolismo tiene estrecha relacin con el de agua; el desplazamiento del sodio es paralela a la del cloro; es el principal catin extracelular que rige el volumen del compartimento; Natremia normal => 135-148 milimoles/L (mEq/L); sodio en orina normal => 60-180 milimoles/L (mEq/L); su concentracin es controlada por los riones y SNC (sistema endocrino). Hipernatremia - estado hipertnico; en suero superior a 150 mEq/L; causas => aumento del aporte, disminucin de la eliminacin renal, alteracin endocrina, sudoracin intensa, diarrea, frmacos diurticos. Hiponatremia - estado hipotnico; dficit del aporte, polidipsia, aumento perdidas gastrointestinales, renales, alteracin endocrina, quemaduras, sudoracin excesiva; clasificacin de hiponatremia segn la determinacin volemica => isovolmicas (insuficiencia renal),hipovolmicas (vmitos o diarreas), hipervolmicas (sndrome nefrtico). Filtracin - transporte activo (consume energa) Excrecin - la mayora por va renal Reabsorcin - regulado por Aldosterona (umbral renal = 110-130 mEq/L) Funciones biolgicas - conserva la presin osmtica (la integridad celular), mantener el equilibrio acido-base (pH), participa en transmisin de impulsos nerviosos Mecanismo de regulacin - flujo de sangre (mas flujo => mas excrecin Na+ y Cl);anhidrasa carbnica (enzima con actividad diurtica); aldosterona (acta en reabsorcin de Na+); otros esteroides/ estrgenos y progesterona (retencin de agua y Na+ durante ciclo menstrual); renina (origina retencin de agua y sal); ADH/ hormona antidiurtica o AVP/arginina vasopresina (regula la reabsorcin/ retencin de agua). Determinacin puede realizarse en suero o en plasma; no utilizar heparina sdica como anti-coagulante; procesar las muestras antes de 3 horas (evitar el
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desplazamientos de ion entre el interior y el exterior); anotar frmacos que pueden aumentar/disminuir Na+ en sangre; metodos => absorcin atmica/ fotometra de llama ypotenciometra. Potasio (K+) - es un catin intracelular; se transporta mediante el transporte activo (con gasto de energa celular); una ingestin diaria insuficiente puede ocasionar una grave reduccin de la sntesis proteica; valores normales de Kalemia => 3,5-5 milimoles/L (mEq/L); concentracin urinaria (potasuria) normal => 1,5-3,5 g/24 horas (<90mEq/dia); su nivel plasmtico esta regulado por su excrecin renal. Hiperpotasemia /hiperkalemia => valores > 5,5 mEq/L; causas => aumento del aporte/ alimentos proteicos (destruccin celular, perfusin de K+); disminucin de la excrecin renal; acidosis metablica (extrado de las clulas); valores >6,5 mEq/L puede causar problemas cardacos incluso la muerte por paro cardaco. Hipopotasemia/hipokalemia => < 3,5 mEq/L; valores < 2,5 mEq/L puede causar problemas cardacos incluso la muerte; causas => disminucin del aporte, perdidas gastrointestinales, alteraciones endocrinas, alcalosis, insulinoterapia, quemaduras graves. Excrecin - 80-90% del K+ de las clulas es filtrado y excretado por va renal; no existe un umbral renal para el K+ => se sigue eliminando aunque hay carencia de K+. Funciones biolgicas - conduccin nerviosa; contraccin muscular; regulacin de la presin osmtica; equilibrio acido-bsico; regulacin junto con Ca2+2 y Mg+2 del gasto cardaco (velocidad y fuerza con que se contrae el corazn). Determinacin - til para el diagnostico de alteraciones => del equilibrio acido-base; del equilibrio hidro-electroltico; se utiliza una muestra de sangre venosa sin aplicar torniquete;metodos => turbidimtricos, absorcin atmica, fotometra de llama. Metabolismo fosfoclcico - se encuentra en el hueso 99% del calcio, 81% del fosfato (P) y 65% del magnesio; las cifras de fosfato siempre son evaluadas con relacin a las de calcio; son cationes extracelulares que ejerce importantes funciones orgnicas => tampones acidobase, cofactores de enzimas, factores de la coagulacion, etc. Regulacin hormonal de calcio y fsforo (1) Paratohormona/ paratiroidea (PTH) sintetizada y secretada por las glndulas paratiroides; se regula por la concentracin de Ca+2 plasmtico (feedback negativo Ca+2 alta => PTH baja; nivel Ca+2 baja => PTH alta); funcin =>mantenimiento de los niveles de calcio plasmtico (reabsorcin /subir el nivel de Ca+2); formacin de tejido oseo nuevo. (2) Calcitonina/ tirocalcitonina - producida el el tiroides; su secrecin esta regulada por el nivel de fosfo-calcio plasmtico total (hipercalcemia => su secrecin alta para bajar el nivel de Ca+2; hipocalcemia => inhibe su secrecin); funcin => es la contraria de PTH(inhibe la reabsorcin de calcio y facilita el deposito de calcio nuevo (hipocalcemia); ejerce su accin a nivel oseo. (3) Calcitriol - es la forma activa de la vitamina D3; necesita los rayos ultravioleta sobre la piel para sintetizarse; su sntesis es completada en el hgado y rion; funcin =>incrementa los niveles de calcio (accin paralela y sinergia con la PTH); se regula => mecanismo feedback (cuando hay hipocalcemia, hipoparatiroidismo, hipofosfatemia => la sntesis de vitamina D3 es alta). Calcio (Ca2+) - de todo el calcio plasmtico, calcio libre es la fraccin ionica (fisiolgicamente activa); se encuentra en el esqueleto oseo y los dientes 98%; en el plasma 2% => calcio inico activo 46%, calcio unido a las protenas 40% (unido a la albumina 80% y a las globulinas 20%) y formando complejos solubles de bicarbonato, citrato, fosfato y sulfato 14%; Calcemia normal => 8,5-10,5 mg/dL (2,1-2,6 milimoles/L); nivel Ca+2 esta
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influenciada por el pH: acidosis => favorece la disociacin => aumenta Ca+2; al contrario, alcalosis => dificulta la disociacin => disminuido Ca+2; calciuria normal 50200 mg/24 horas; Hipercalcemia - > 10,5 mg/dL (hipercalcemia grave > 13,5 mg/dL); causas => aporte elevado, tumoral, alteracin del sistema endocrino, secundaria a un hiperparatiroidismo. Hipocalcemia - causado por aporte disminuido, alteracin endocrino, secundaria a hiperfosfatemia. Aumento de Ca2+ - causado por hipoparatiroidismo primario; diurticos tiacidicos (impide la excrecin urinaria de calcio => hipercalcemia). Disminucin de Ca2+ causado por hiperparatiroidismo primario; hormona paratiroidea ectpica (productora de tumores); ingestin excesiva de vitamina D, diversas malignidades. Hipocalciuria - se produce en raquitismo Hiper-calciuria - se produce en hiperparatiroidismo, hipertiroidismo,mieloma multiple. Regulacin - PTH eleva los niveles de calcio al recibir el estimulo del calcitriol; Calcitrioleleva los niveles de calcio; Calcitonina disminuye los niveles de calcio; Estrgenos aumenta los depsitos de calcio en los huesos; Andrgenos estimula la corteza suprarrenal y puede ocasionar hipocalcemia y descalcificacin de los huesos. Funciones biolgicas - constituyente fundamental del esqueleto oseo; regulacin hormonal (paratiroides); coagulacion sangunea. Metodos analiticos - utilidad: medir la actividad de la PTH; valorar la funcionalidad del metabolismo del calcio; evaluar determinadas enfermedades malignas; tcnica => potenciometro. Fsforo (P) - 85% de fsforo orgnico forma parte de la matriz osea; 15% se encuentra en el plasma => unido a protenas (12%), como H2PO4-/fosfato dicido (10%), en forma de HPO4-2/fosfato monocido y NaHPO4/ hidrgeno fosfato de sodio (75%); valores normales de fosfatemia en nios 4-6,5 mg/dL (2,3-3,8 mEq/L) y en adultos 3-5 mg/dL(1,78-2,9 mEq/L); las concentraciones plasmticas de fosfato varan en funcin => pH; el momento de dia (ritmo circadiano noche mas bajo); aspectos fisiolgicos (disminuido en el embarazo); concentracin urinaria normal (fosfaturia) => 0,5-3g/24h; Hiperfosfatemia - causas => aporte elevado (alimentos proteicos), alteracin endocrina, aumento de procesos catabolismos, insuficiencia renal aguda o crnica, frmacos; nivel > 9 mg/dL => disminuye el calcio podra causar arritmias, contracciones musculares. Hipofosfatemia - causas => alcoholismo crnico, disminucin del aporte, trastornos equilibrio electroltico (hipercalcemia), alteraciones renales (elevada perdida), alteraciones endocrinas; valores < a 1mg/dL puede causar alteraciones en la musculatura esqueltica respiratoria => insuficiencia respiratoria. Absorcin - a nivel intestinal mediante un mecanismo de transporte, regulado por la vitamina D. Excrecin - va urinaria por la accin de la PTH. Funciones biologicas - forma parte de la matriz osea y tejido dentario, tejido nervioso, protenas celulares, membrana celular; equilibrio acido-base (el sistema HPO4-2 / H2PO4- en el plasma acta como tampn interviene en la contraccin muscular; participa en los mecanismos de absorcin y metabolismo de los principios inmediatos. Magnesio (Mg2+) - se encuentra en el hueso 65-70%; su estudio tiene escaso valor clnico; valores normales de magnesemia => 1,8-2,9 mg/dl (1,5-2,5 mEq/Litro); todos los alimentos naturales (leche y legumbres) son ricos en Mg; es difcil tener un dficit en la dieta;una dieta pobre en potasio o calcio, dificulta el proceso de absorcin del Mg.

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Funcin biolgicas => muy relacionadas con las funciones de calcio en el organismo (mantener el nivel calcio intracelular; equilibrio neuromuscular); participa en procesos de transferencia energtica (cofactor en sistemas enzimticos ATP-asa); es indispensable para metabolismo de carbohidratos, sntesis de protenas, sntesis de cidos nucleicos. Hipermagnesemia => valores > 3,5 mEq/L

Tema 25 - Estudio del equilibrio cido-bsico

cido - sustancia que pueda dar un protn a otra (dador de protones) y aceptor de un par electrnico Base - sustancia que pueda aceptar protones de otra (aceptor de protones) y dador de un par electrnico; PH sanguineo normal (7,35-7,45) se encuentra en el lado alcalino de neutralidad; Tampn (amortiguador) - una mezcla de un cido y su base conjugado con funcin fundamental => la de resistir los cambios de pH; Equilibrio acido-basico - aquella situacin de equilibrio, establecido en el balance entre sustancias de carcter acido y de carcter bsico de la sangre, como consecuencia de la interrelacin entre los sistemas respiratorio y metablico; alteracin respiratoria => la concentracin de CO2 o cido carbnico constituye el cambio primario; alteracin metabolica => la alteracin de la concentracin de bicarbonato (HCO3-). Regulacin del equilibrio acido-basico - evitar las variaciones en el pH es la tarea de los tampones (sistemas amortiguadores) presentes en el organismo, capaces de captar o liberar protones (H+) como respuesta a os cambios de acidez de los distintos lquidos orgnicos con la ayuda de los pulmones y los riones. La acidosis - exceso de H+ en la sangre (acidemia); pH < 7,35 La alcalosis - dficit de H+ en la sangre; pH > 7,45 Tampones mas importantes del organismo - en el plasma => tampn bicarbonato/ acido carbnico (H2Co3 / HCO3-); tampn fosfato (H2PO4-); protenas plasmticas; en los hemates => tampn Hb y bicarbonato/ acido carbnico. Determinar la alteracin del equilibrio acido-base - la concentracin H+, HCO3-, Pco2; - determinar la presin parcial de CO2 (en caso de trastornos respiratorios) - determinar la concentracin de bicarbonato (en caso de trastornos metablicos) Clasificacin de las alteraciones del equilibrio cido bsico: - Metablica: dficit primario de HCO3- => acidosis; aumento primario de HCO3- => alcalosis - Respiratoria: aumento primario de CO2 => acidosis; dficit primario de CO2 => alcalosis

Tema 26 - Equilibrio gaseoso

Ventilacin - intercambio de aire, entre la atmsfera y los alvolos Difusin - intercambio de gases a traves de la membrana de los alvolos pulmonares Perfusin - paso de la sangre a traves de los vasos sanguneos pulmonares Oxigeno => disuelto en plasma (presin parcial de oxigeno /Po2) y unido a la Hb; valor normal Po2 en sangre => 97 mmHg o entre 80-100 mmHg (varia con la edad); < de 80 mmHg => hipoxemia; excepciones neonatos entre 40-70 mmHg. Dixido de carbono /anhdrido carbnico =>disuelto en plasma (como CO2 y como bicarbonato o acido carbnico) y unido a la Hb; valores normales en la sangre Pco2=> 3545 mmHg (no varia con la edad)
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Insuficiencia respiratoria : - alteraciones en la perfusin (a nivel de la circulacin pulmonar) - alteraciones en la difusin (a nivel de la membrana alveolo-capilar) - alteraciones en la ventilacin => obstructiva, restrictiva, mixta Pruebas funcionales respiratorias - espirografa simple y gasometra arterial

Tema 27 - Monitorizacin de frmacos (MF)

Se recomienda la monitorizacin de un frmaco cuando: - Su ventana teraputica es reducida y bien definida - Se sospecha incumplimiento del tratamiento - Se sospechan interacciones con otros medicamentos - Se observan posibles sintomas de toxicidad - Se sospecha inefectividad (no se observa la respuesta teraputica esperada) - Se observa gran variabilidad individual en la farmacocintica - Existen otras patologas que pueden modificar la respuesta - Existe un estado fisiolgico que puede modificar la respuesta - Se exige una revisin o seguimiento clnico-legal del tratamiento Farmacocintica => absorcin - distribucin - eliminacin (metabolismo - excrecin) Programa de monitorizacin de frmacos - se basa en la relacin individual existente entre la concentracin srica del frmaco y su respuesta clnica , estableciendo los indicadores de respuesta adecuados para cada frmaco => se encarga la unidad de farmacocintica clinica en el hospital Indicaciones para la monitorizacin de frmacos- es aconsejable realizar la monitorizacin de frmacos cuando: - Se sospechan interacciones medicamentosas - Se sospecha una mala aplicacin del tratamiento (no respetar las dosis, no terminar) - Se conoce la dificultad de aplicacin del tratamiento, p.ej. en la poblacin anciana - El frmaco tiene un margen o ventana teraputica estrecho - No se alcanza el efecto teraputico deseado con la dosis indicada - Se observan sintomas y/o signos de toxicidad - Se observa variabilidad inter-individual con respecto al metabolismo - El metabolismo esta alterado debido a otra patologa subyacente - El metabolismo esta alterado como consecuencia del estado psico-fsico del paciente - Se cuestiona la bio-disponibilidad de la formulacin administrada - Se requiere un seguimiento o comprobacion medico-legal del tratamiento

Tema 28 - Tcnicas electroqumicas

La qumica electro-analtica - un grupo de metodos analticos cuantitativos basados en las propiedades elctricas de la disolucion de un analito cuando forma parte de una clula elctrica. La clula electro-qumica - 2 conductores (electrodos), cada uno sumergido en una solucin adecuada de electrolito, un puente salino inerte entre ambos para que circule la corriente elctrica y un potenciometro para medir la diferencia de potencial generada.
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Fundamento - Reaccin de oxidacin: tomo metlico neutro => ion positivo + electrn (soltado); M => M+ + e- Reaccin de reduccin: ion positivo + electrn => tomo metlico neutro; M+ + e- => M Las tcnicas electroqumicas mas utilizadas en el laboratorio clnico son las amperomtricas y las potenciomtricas; los metodos amperomtricos se basan en la medida de la cantidad de corriente que fluye cuando se aplica un voltaje constante al electrodo de medida (dinmicos); los metodos potenciomtricos se basan en la medida del potencial de las clulas electroqumicas en ausencia de corriente (estticos); Su utilidad en el laboratorio : - Medida del pH - Determinacin de concentracin de iones - Medida de la presin parcial de gases (CO2 y O2) => PO2 y PCo2 - Medidas del punto final de metodos volumtricos - Medida del poder de oxidacin o reduccion de una solucion El equipo requerido para estos metodos es simple, consta de => electrodo de referencia, electrodo indicador,dispositivo para medir el potencial.

Tema 29 - Estudio de la orina

Funcin del rin: - La eliminacin de nuestro organismo de una importante cantidad de residuos metablicos, muchos de ellos intiles, y de otros que incluso pueden comportarse como txicos. - La regulacin de la composicin de los fluidos de nuestro organismo facilitando as, tanto la supervivencia de las clulas como el optimo desarrollo de todos los procesos metablicos. - El control hormonal de la presin arterial (adrenalina, noradrenalina) - El control de los niveles orgnicos del calcio (mineral corticoides aldosterona, 1,25 dihidroxicolecalciferol) - El control de la eritropoyesis (eritropoyetina) Nefronas - son unidades funcionales bsicas consiste de 2 partes => el glomerulo (dentro de la cavidad "capsula de Bowman") y la red tubular. El glomerulo - filtrar/ depurar el plasma 25 ml de sangre por minuto (150 litros de plasma/ dia); se filtra agua, urea, creatinina, aminocidos, cido rico, glucosa, protenas de bajo pm. La red tubular - el filtrado por el glomerulo es recogido en la capsula de Bowman y se dirige hacia la red tubular donde se lleva a cabo un proceso de reabsorcion selectiva => reabsorber agua, ciertos elementos tiles par el organismo y que deben ser recuperadas (glucosa, agua, sodio, cloruro, potasio, bicarbonato, urea, aminocidos, proteina) y permite la secrecin de otras que, po su toxicidad, deben ser posteriormente eliminadas mediante la miccin (amonio, urea, hidrogeniones); se elimina 1 ml de orina por minuto (1500 ml diarios) Caractersticas fundamentales en recogida de muestras de orina - Miccin espontanea => anlisis fisico-qumico, estudio del sedimento, concentracin de creatina.
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- Cateterismo vesical (sondaje) => pacientes que presentan dificultades de la miccin, mujeres para evitar la contaminacin vaginal. - Puncion suprapubica => diagnostico de infeccin por microorganismos extraos en nios. Tipos de muestras para un anlisis de orina (sin supervision): - Primera orina de la maana => se recomienda porque la concentracin de solutos es variable a lo largo del da y esta en relacin con la ingesta de liquidos. - Orina tomada al azar => muestra valida para cultivos microbiologicos - Orina minutada (fraccionada, de 2 horas, de 24 horas) => gran utilidad para el paciente diabeticos Anlisis de orina - objetivos : - obtener informacin del estado general del rion y las lesiones que pudieran afectarlo - detectar la existencia de una alteracin a nivel de las vas urinarias - teniendo en cuenta aquellos productos que se eliminan va urinaria, detectar alteraciones funcionales de otros rganos - detectar las alteraciones metablicas de diversa etiologia - se intenta encontrar sustancias o componentes que normalmente no se encuentran en la orina - detectar alguna alteracin en la concentracin (por defecto o por exceso) de componentes que habitualmente se encuentran en la orina Tipos de anlisis de orina => anlisis elemental, completo, rutinario, anormales y sedimento. Parmetro bioqumico => Densidad - Bilirrubina - Cuerpos cetnicos - Protenas Urobilinogeno - Glucosa - Hemoglobina - Nitritos. Examen fsico - macroscopico 1)- Cantidad / diuresis normal 800-200 ml; alteracin => oliguria, poliuria, anuria 2)- Aspecto / turbidez clara y transparente; alteracin => gelatinoso, opalescente, turbidez con sedimento rojo, espuma persistente de agitar (albumina) 3)- Color amarillo / mbar (en funcin de la concentracin) 4)- Olor aromtico, ligeramente amoniacal 5)- Densidad 1.010-1.030 (se determina mediante urodensimetro, tiras reactivas o refractrometria); alteracin => insuficiencia renal, diabetes, trastornos nerviosos, procesos febriles 6)- pH 4,5-8,2 (normal pH 6) Importancia clnica del estudio de "anormales" en orina Protenas - en condiciones normales las protenas se encuentran 130-150 mg/da en funcin del volumen de orina eliminado; en recin nacidos 2-8 mg/100 ml; cantidad de proteina => albumina 1/3 del total (fisiolgica), globulinas, proteina de TammHorsfall (T-H) no se encuentra en el plasma - se forma en el tubulo contorneado distal, transferrina, IgA; proteinuria => eliminacin de proteina en orina superando los VN (intensa >4 g/dia: leve <0,5 g/dia) Glucosa - la orina normal carece casi por completo de glucosa; normoglucemia => 6-120 mg/dl; umbral renal 160 mg/dl; glucosuria => aumento de la concentracin de glucosa en orina por encima de los VN, causada por (1) aumento de la glucemia por encima de umbral renal (2) alteracin renal (tubulopatia)
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Cuerpos cetnicos - en personas sanas, los CC se sintetizan en el hgado y se metabolizan por completo, de forma que en la orina aparecen en concentraciones mnimas (indetectables); cetonuria => aparicin de cueros cetnicos detectable sen orina; la presencia de cetonuria y el aumento de cetonemia implica que no se realiza correctamente el catabolismo oxidativo de los cidos grasos; las causas de cetonuria: - sobrecarga de lipidos en la dieta - diabetes mellitus (coma diabetico) - vmitos (nios embarazadas) - bajo consumo de hidratos de carbono o alteracin en su metabolismo - ayuno prolongado Hemoglobina - no aparece en orinas normales; hemoglobinuria => presencia de Hb en orina (si la cantidad en alta, se puede ver a simple vista); causas => enfermedad renal de vas altas, anemias hemolticas reacciones transfusionales, infecciones (malaria, paludismo) Pigmentos biliares (bilirrubina y biliverdina) - aparece BB en orina, siempre que aumente la BB directa en sangre por causas => enfermedad obstructiva, lesiones hepticas. Uribilinogeno - BB directa con la bilis, pasa al intestino delgado donde por accin de la flora bacteriana se transforma en urobilinogeno o estercobilinogeno (se elimina en mayora con las heces y la orina en menor concentracin); la cantidad de urobilinogeno aumenta en la orina en las hepatitis y las anemias hemolticas; la determinacin de urobilinogeno debe realizarse rpidamente en orina, ya que se transforma en urobilina + O2 (falso negativo). Nitritos - su aparicin en la orina indica crecimiento bacteriano (bacteriuria), de germenes capaces de reducir los nitratos ingeridos con la dieta, hasta nitritos (entero-bacterias); un resultado negativo de la prueba de los nitritos, no indica ausencia de microorganismos, ya que puede haber bacterias que no son productores de nitritos o ausencia de nitratos ingeridos en la dieta.

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