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2^ Lezione

Struttura molecolare delle proteine

07/03/12

Per comprendere al meglio la struttura terziaria delle proteine dobbiamo analizzare come gli elementi di struttura secondaria si ripiegano e quali sono le conformazioni che assumono. Definiamo quindi quello che chiamato motivo cio un avvolgimento polipeptidico caratteristico che formato da due o tre elementi di struttura secondaria e ovviamente dagli elementi di connessione delle varie strutture secondarie. Le strutture secondarie quindi alfa eliche e foglietti beta possono organizzarsi tridimensionalmente in strutture ben definite che sono state caratterizzate e raggruppate in tre classi: strutture tutto alfa: organizzazioni spaziali di strutture secondarie che sono tutte alfa eliche; strutture alfa/beta: organizzazioni che comprendono strutture secondarie sia di tipo alfa che di tipo beta; strutture tutto beta: comprende strutture di elementi solamente beta. Ognuna di queste classi contiene un gran numero di motivi caratteristici i quali o sono delle organizzazioni strutturali che ritroviamo in molte proteine oppure sono presenti solo in un'unica proteina e l'importanza che rivestono in quest'ultima talmente grande che vengono considerati come motivo a parte. Un'altra considerazione che il motivo se viene isolato della proteina non mantiene le sue caratteristiche, quindi non ha pi la sua struttura e se al motivo associata una funzione questa verr persa.

STRUTTURE TUTTO ALFA

Quello pi semplice il fascio che contiene due alfa eliche. Quindi sono presenti due alfa eliche che interagiscono fra di loro in questo caso due alfa eliche che sono orientate nella stessa direzione ma potrebbero essere anche in direzione opposta. Nella zona centrale blu e rossa le due eliche prendono contatto tra di loro formando questo fascio caratteristico. Gli aminoacidi presenti in questa struttura (leucina, valina, leucina, ecc) sono aminoacidi non polari e quindi idrofobici infatti il fascio di alfa eliche caratterizzato da interazioni idrofobiche che le tengono unite. La figura a rappresenta le due eliche viste dall'alto; all'interno, il punto di contatto tra le alfa eliche, dato da interazioni idrofobiche quindi in questo caso le alfa eliche rivolgono da questo lato aminoacidi idrofobici che possono interagire tra loro. Le 1

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interazioni che possono stabilizzare questa struttura sono di diverso tipo e ci possono essere anche interazioni ioniche che sono date dagli aminoacidi che si trovano nel versante laterale dell'elica (figura b). Quindi glutammato, aspartato e lisina che possono interagire con altri aminoacidi carichi dell'altra alfa elica. Questa struttura associata spesso ad una funzione, infatti, questo fascio di alfa eliche spesso si trova nelle proteine che legano il DNA ad esempio le cerniere di leucina quindi vedete le due alfa eliche che in questo punto rivolgono i residui idrofobici in particolar modo i residui di leucina e quindi tengono stretta questa struttura mentre in quest'altra parte della proteina abbiamo degli aminoacidi che sono carichi positivamente perch devono interagire con il DNA carico negativamente.

Un altro motivo tutto alfa abbastanza semplice il motivo elica-ansa-elica. Questa la posizione spaziale che occupano le alfa eliche. Non formano un angolo di 90 ma l'elica rossa spostata verso l'interno e sono anche quasi parallele per le estremit carbossi-terminale e amminoterminale sono rivolte dalla stessa parte. un motivo composto da circa 20 aminoacidi, quindi ogni elica ha circa sette dieci aminoacidi e anche in questo caso, questo motivo, associato ad una funzione ovvero quella di legare il DNA. Oltre a queste due eliche che costituiscono il motivo elica-ansa-elica presente anche un'altra elica perch tale struttura generalmente ha bisogno di un'altra elica che serve per stabilizzare il legame con il DNA quindi spesso il motivo elica-ansaelica lega il DNA in presenza di un'altra alfa elica che anche in questo caso ha degli aminoacidi carichi positivamente che possono interagire con il DNA carico negativamente e quindi stabilizzare lintera struttura. Un altro motivo chiamato sempre elica-ansa-elica quello mostrato nella figura sotto che viene anche chiamato EF-hand. Anche qua abbiamo un elica, unansa e un'altra elica per la disposizione delle eliche e il tipo di ansa nettamente diverso da quello precedente infatti le eliche sono disposte con un angolo di 90 e fanno un giro in cui sono presenti degli aminoacidi specifici ad esempio glutammato, aspartato, asparagina, treonina, ecc. e di questi importante la natura perch creano un ambiente ideale per il legame degli ioni calcio infatti questi motivi si trovano proprio nelle proteine che legano gli ioni calcio. Questo motivo lo ritroviamo ad esempio nella calmodulina che una proteina che lega il calcio e che va a modulare l'attivit di altre proteine; nella figura a la calmodulina priva di calcio e possiede quattro motivi EF-hand. Nel momento in cui lega il calcio (figura b) lega quattro ioni calcio in corrispondenza delle ansa e porta ad un cambio conformazionale della proteina che fa s che la proteina assuma una conformazione tale da poter legare la sua molecola bersaglio che un peptide o una proteine la cui attivit viene modulata quindi pu essere attivata dal legame con la 2

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calmodulina. In generale importante conoscere questi motivi perch supponendo che si stia lavorando con una proteina di cui si scoperta la struttura primaria, attraverso programmi bioinformatica, possibile ipotizzare la struttura secondaria e la presenza di motivi EF-hand quindi conoscendo questi ultimi posso supporre che un motivo che lega gli ioni calcio quindi la ricerca verr indirizzata in questo senso perch questa proteina regolata da gli ioni calcio quindi si studier che cosa fa il calcio in questa proteina: la attiva, la inattiva o la denatura. Un altro esempio di struttura tutto alfa rappresentato dal fascio di quattro alfa eliche quindi sempre una -elica, un elemento di connessione, un'altra alfa elica, un elemento di connessione e cos via in questo caso le quattro alfa eliche sono antiparallele per questo orientamento diverso da proteina a proteina ma comunque l'orientamento pi stabile quello antiparallelo perch lalfa elica un macrodipolo poich il legame peptidico ha sempre lo stesso orientamento e quindi il dipolo di ogni legame peptidico si va a sommare agli altri determinando un'estremit amminoterminale con una parziale carica positiva ed un'estremit carbossi-terminale con una parziale carica negativamente quindi se presente un ulteriore proteina carica, questa pu interagire con essa e quindi potrebbe anche destabilizzare la struttura dell'alfa elica in questo caso le alfa eliche sono antiparallele quindi il macrodipolo di unalfa elica annullato dal macrodipolo dell'altra. Le interazioni che tengono unite le quattro alfa eliche sono di tipo idrofobico quindi anche in questo caso le quattro alfa eliche hanno queste sfere verdi che indicano gli aminoacidi idrofobici che si rivolgono verso l'interno che interagiscono tra loro (ed questa la forza che tiene unita questa struttura) mentre all'esterno le sferette rosse indicano gli aminoacidi idrofilici che sono in contatto con la fase acquosa. Questa interazione molto forte e impedisce che all'interno di questa struttura possa entrare una molecola d'acqua. Sempre all'interno delle strutture tutto alfa doveroso citare il globin fold, ripiegamento globinico, che una ripiegamento caratteristico delle globine quindi mioglobina ed emoglobina. Questo motivo costituito da otto alfa eliche in cui gli elementi di connessione sono delle linee e le alfa eliche dei cilindri; questultime sono numerate dalla lettera A alla H e questo motivo una struttura caratteristica in cui ogni elica ha una posizione precisa; possibile vedere che gli angoli sono generalmente di circa 90 tra due eliche successive oppure di 45-50 comunque una struttura caratteristica in cui l'eliche hanno una posizione e lunghezze definite ad esempio la lunghezza lelica C unelica molto corta di circa 7-9 aminoacidi mentre l'elica H quella pi lunga con 27-30 aminoacidi. Le alfa eliche si dispongono in 3

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modo da creare all'interno una cavit idrofobica che ha la caratteristica di legare o le molecole di substrato a seconda dellenzima oppure nel caso della mioglobina ed emoglobina il gruppo prostetico e cio leme.

STRUTTURE ALFA/BETA La struttura pi semplice l'ansa -- in cui il foglietto beta prosegue con l'alfa elica e successivamente un altro foglietto beta. Questo motivo generalmente non si trova da solo ma abbiamo cinque o pi di questi motivi che si uniscono tra di loro ottenendo quello che si chiama barile alfa/beta. All'interno vengono rivolti i foglietti beta e in particolare questi rivolgono verso l'interno della cavit gli aminoacidi idrofobici mentre nella parte esterna gli aminoacidi idrofilici e anche le alfa eliche rivolgono gli aminoacidi idrofobici all'interno quindi sono delle alfa eliche anfipatiche. Il barile alfabeta viene anche chiamato TIM barrel perch stato scoperto per la prima volta nella trioso fosfato isomerasi; successivamente stato scoperto che anche molti altri enzimi della via glicolitica possiedono questo motivo. Un altro motivo il Rossmann fold dal nome del suo scopritore. In questo caso la struttura ha un'alternanza di alfa eliche e beta foglietti e tutti i beta foglietti sono rivolti nella stessa direzione quindi sono paralleli fra di loro. Questo motivo ha di particolare il fatto che si ha un'alternanza di alfa eliche e foglietti beta tra i beta foglietti 3 e 4 perch c' una alfa elica di connessione che fa s che il quarto beta foglietto possono interagire con il primo quindi si ha sempre alternanza tranne in questo punto. Anche in questo caso, dall'immagine non si capisce bene, questo motivo disposto in modo tale da formare all'interno un core idrofobico. A questo motivo associata una funzione caratteristica che generalmente quella di legare i nucleotidi; stato scoperto nella lattico deidrogenasi ma successivamente anche in altri enzimi capaci di legare i nucleotidi. Un altro motivo alfa/beta un ripiegamento che assume la forma di un ferro di cavallo anche in questo caso si hanno beta foglietto, alfa elica e beta foglietto dalla cui alternanza si origina questa struttura caratteristica. Anche qui l'aminoacido rivolto principalmente verso l'interno di questa struttura una leucina quindi si forma un core idrofobico.

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Un'altra struttura importante il motivo a dita di zinco che composto da due foglietti beta antiparalleli e non una alfa elica. Anche in questo caso abbiamo particolari residui aminoacidi che sono istidine e cisteine che creano l'ambiente adatto per il legame con lo zinco. Anche questo tipo di dominio ha una funzione caratteristica che quella di legare il DNA e quindi stato trovato in molti fattori di trascrizione quindi in proteine in grado di legare il DNA e la parte della molecola in grado di legare il DNA l'alfa elica che ha una struttura e aminoacidi tali da poter legare la catena di DNA.

STRUTTURE TUTTO BETA Sono strutture in cui vi sono solo elementi di tipo beta. Il pi semplice il barile costituito interamente da beta foglietti che si trovano in posizione antiparallela fra di loro che si dispongono a formare un core idrofobico interno. Un'altra struttura tutto beta il motivo a chiave greca che si chiama cos perch la struttura che assumono i beta foglietti ricorda le figure ornamentali greche. In caso i quattro foglietti beta assumono una conformazione diversa e caratteristica.

Un altro motivo tutto beta il Jelly roll barrel che ha una struttura ancora pi complicata, costituito da almeno otto foglietti beta, che assumono una struttura a spirale come quella delle merendine. Anche in questo caso si ripiega in modo tale da avere questo tipo di orientamento. Il concetto fondamentale il fatto che i foglietti che si trovano uno dopo l'altro nella sequenza aminoacidica, quando le strutture secondarie si riorganizzano nello spazio, non necessariamente interagiscono fra di loro ad esempio il foglietto 1 interagisce con il foglietto 2 poi seguendo la catena polipeptidica, questa continua verso il foglietto 3 che distante dal foglietto 2 il quale invece interagisce con il foglietto 7. Questi sono dei motivi che si ritrovano spesso in diverse proteine quindi anche studiando una proteina ci sono delle regole che dipendono dalla natura degli

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aminoacidi presenti in queste strutture che ci portano a ipotizzare che in quella proteina pu esserci quella struttura piuttosto che un'altra.

Oltre alla definizione di motivo, sempre parlando di organizzazione di struttura secondaria nello spazio, dobbiamo definire che cos' il DOMINIO. Quando polipeptidi di grandi dimensioni si concentrano in due o pi raggruppamenti, questi si chiamano domini. Quindi il motivo riguarda pochi elementi di struttura secondaria che si riorganizzano in strutture ben definite. Qualche volta al motivo pu essere associata una specifica funzione e se il motivo viene separato dalla proteina non mantiene la sua struttura e neanche la sua funzione mentre il dominio rappresenta una parte della proteina che pu comprendere anche pi motivi messi insieme o comunque comprende lorganizzazione di elementi di struttura secondaria che possono essere anche isolati dalla proteina e che mantengono la loro struttura quindi il dominio una struttura maggiormente indipendente rispetto al motivo inoltre cosa molto importante che spesso i domini sono unit funzionali quindi al dominio associata una funzione della proteina quindi quando si analizza la struttura della proteina la si divide, soprattutto se di grandi dimensioni, in pi domini che hanno ognuno una funzione specifica all'interno di quella proteina ed un esempio abbastanza semplice perch presenta soltanto due domini la gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi che un unico polipeptide formato da due domini: quello rosso lega il NAD, l'altro dominio, in verde, lega il substrato e quindi la gliceraldeide 3-fosfato quindi ogni dominio ha una sua funzione caratteristica. La struttura quaternaria l'associazione di due o pi catene polipeptidiche o subunit. Non tutte le proteine quindi arrivano ad ottenere la struttura quaternaria perch non tutte le proteine sono formate da pi subunit quindi quelle che sono costituite da un unico polipeptide hanno come massimo di organizzazione 6

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strutturale la struttura terziaria. Le catene polipeptidiche possono essere di diverso numero quindi dimero quando le subunit sono due, trimero se sono tre sino a multimero quando le subunit sono numerose. Le interazioni che stabilizzano la struttura quaternaria sono le medesime che stabilizzano anche la struttura terziaria quindi le interazioni che sono dovute alle catene laterali degli aminoacidi e quindi sempre interazioni idrofobiche tra aminoacidi idrofobici, legami idrogeno e interazioni ioniche tra aminoacidi carichi e sempre ponti di solfuro quindi legami tra cisteine che rappresentano l'unico legame covalente. Parlando per di struttura quaternaria definiamo anche un altro concetto e cio di PROTOMERO che rappresentato da unit strutturali ripetute nei complessi multimerici. Questo significa che se si ha una proteina multimerica vuol dire che formata da pi subunit che interagiscono tra loro. Accade spesso che una o pi subunit si ripetano nella struttura quindi ad esempio l'emoglobina formata da due catene alfa e due catene beta quindi ci che si ripete la struttura alfa e beta per due volte quindi possiamo definire l'emoglobina come un tetramero se consideriamo ogni catena separatamente oppure possiamo definirla come un dimero di protomeri alfa/beta identificando come protomero l'unit strutturale che si ripete. Questo l'esempio pi semplice perch abbiamo solamente un protomero formato solamente da due subunit ovviamente in proteine pi complesse possono esserci pi strutture che si ripetono e quindi pi protomeri che si ripetono all'interno della stessa proteina. Le proteine multimeriche inoltre presentano un'altra caratteristica e cio che le subunit identiche o i protomeri hanno un'organizzazione simmetrica. Tale simmetria pu essere rotazionale oppure elicoidale. Questo significa che le singole subunit o i protomeri possono essere sovrapporsi nella proteina mediante una rotazione attorno ad uno o pi assi rotazionali e quindi avremo la simmetria rotazionale oppure mediante una rotazione elicoidale e quindi abbiamo la simmetria elicoidale. Ad esempio nella simmetria rotazionale ci sono due subunit o due protomeri che si ripetono all'interno della proteina; pu essere una sola subunit o due come nel caso dell'emoglobina comunque questa subunit possiamo farla sovrapporre allaltra tramite rotazione intorno all'asse immaginario; la simmetria elicoidale ha di diverso che lelemento che costituisce una subunit si ripete diverse volte e si dispone in modo elicoidale quindi se voglio sovrapporre due subunit devo far ruotare attorno ad un asse ma devo anche salire formando un'elica. Qui vedete C2 e C3 che sono gli esempi pi semplici di simmetria rotazionale C sta per ciclica seguito sempre dal numero di subunit presenti che possono sovrapporsi tra di loro. Ad esempio lemoglobina presenta una simmetria di tipo C2 in cui ogni subunit rappresenta un protomero alfa/beta. Vi sono comunque simmetrie pi complesse come ad esempio la simmetria icosaedrica in cui la struttura formata da 20 facce ognuna delle quali pu essere una o pi 7

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subunit ognuna di queste facce pu sovrapporsi alle altre e la rotazione non sar attorno ad un solo asse ma attorno a tanti assi quindi la struttura che assumono le proteine molto pi complessa per si basa sempre sul fatto che vi una simmetria e ruotando gli assi queste subunit possono coincidere. Affinch una proteina abbia una sua funzione deve raggiungere la sua conformazione quindi la conformazione tridimensionale ottimale per svolgere la sua attivit e quindi abbiamo visto come gli elementi di struttura secondaria si vanno ad organizzare nello spazio in modo tale da ottenere motivi e domini caratteristici utili per la funzione della proteina. La struttura primaria il punto di partenza fondamentale per determinare gli altri livelli della proteina questo significa che la sequenza degli aminoacidi detta le regole che stabiliscono che in un determinato punto della proteina ci deve essere un'altra elica, in un altro punto un beta foglietto cos via. La cosa pi eclatante che si pu vedere il fatto che la sostituzione di un solo aminoacido all'interno di una catena polipeptidica pu provocare gravi conseguenze quindi pu andare a modificare notevolmente la proteina stessa e quindi per fare questo prendiamo come esempio il caso dell'ANEMIA FALCIFORME. Si tratta di una patologia in cui si ha una sola sostituzione aminoacidica della catena beta dell'emoglobina quindi considerando solo la catena beta varia semplicemente laminoacido in posizione 6: nell'emoglobina normale un acido glutammico nellemoglobina che causa l'anemia falciforme laminoacido la valina quindi si ha la sostituzione di un aminoacido carico negativamente con uno che un aminoacido idrofobico. Perch la sostituzione di un solo aminoacido pu portare ad una patologia: guardando l'emoglobina vi sono le due catene alfa e le due catene beta, le catene beta cos modificate hanno il residuo di valina esposto verso l'esterno della struttura quindi le catene beta, essendo questo aminoacido idrofobico, possono interagire tra di loro proprio in corrispondenza di questo residuo. Quindi si ha una interazione idrofobica tra queste due catene beta che le porta ad interagire tra di loro a formare delle lunghe catene che a loro volta interagiscono a formare una fibra di emoglobina che deformano il globulo rosso tipico dell'anemia falciforme proprio per la costituzione di numerose fibre. Anemia falciforme perch negli individui che ne sono affetti si ha quasi la met di emoglobina disponibile perch ovviamente l'emoglobina legata in questo modo non pi disponibile per il trasporto dell'ossigeno ed inoltre si ha una diminuzione della quantit di globuli rossi perch sono molto fragili e quindi tendono a rompersi. La sostituzione vista adesso una sostituzione che porta ad una patologia per questo non sempre vero perch due proteine possono avere aminoacidi diversi portando anche a due funzioni totalmente diverse. Infatti nellossitocina (importante perch stimola il muscolo liscio in particolare nell'utero e nella ghiandola mammaria) c lisoleucina e la leucina mentre nella vasopressina ( l'ormone antidiuretico e stimola ad 8

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esempio il richiamo di acqua nel rene o produce una vasocostrizione) questi sono sostituiti dalla fenilalanina e dellarginina, il resto della struttura comprese le posizioni dei ponti disolfuro sono identici.

Quindi in questo caso la sostituzione degli aminoacidi porta ad una proteina stabile ma con una funzione totalmente differente. Quindi la struttura primaria detta le regole base per il raggiungimento della struttura nativa quindi ogni aminoacido ha un suo ruolo ben preciso all'interno della struttura questo perch se presente una certa sequenza di aminoacidi, avr la tendenza naturale, a formare o alfa eliche o foglietti beta o le varie strutture secondarie. A loro volta le strutture secondarie con una data posizione andranno a formare una caratteristica struttura terziaria questo significa che se io parto da una proteina che gi nella conformazione nativa e la denaturo, quindi aggiungo un denaturante, viene persa la struttura della proteina quindi se parto da una struttura quaternaria si passer prima alla terziaria, poi secondarie fino ad arrivare alla struttura primaria quindi il denaturante sfalda questo livello strutturale rimane solo la catena estesa di aminoacidi nella struttura primaria. Se questo vero, se tolgo la molecola che ha causato la denaturazione, ottengo che della struttura primaria ottengo la stessa proteina con le stesse funzioni. Questo stato oggetto di numerosi studi da parte dei biochimici in particolare lo studio da parte di Christian Anfinsen il quale ha preso come modello la ribonucleasi quindi una proteina abbastanza piccola che presenta elementi di struttura secondaria quindi alfa eliche, foglietti beta e presenta anche dei ponti disolfuro che stabilizzano questa struttura. Ha considerato la ribonucleasi che un enzima che idrolizza i legami fosfodiesterici del RNA, e lha trattata con due agenti denaturati: urea e mercaptoetanolo che sono dei reattivi che vengono utilizzati proprio per studiare la stabilit delle proteine. In particolare lurea destabilizza le interazione idrofobiche che sono presenti all'interno di una proteina mentre il mercaptoetanolo una sostanza riducente che riduce i ponti disolfuro. Quindi se una proteina ha una struttura terziaria o quaternaria stabilizzata dai ponti disolfuro il mercaptoetanolo li riduce e quindi li rompe e la proteina si sfalda. Anfinsen ha considerato l'attivit della ribonucleasi al variare della concentrazione dell'urea ma sempre in presenza del mercaptoetanolo.

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Egli osserv che aumentando la concentrazione di urea (da 0 a 8 molare) l'attivit della ribonucleasi diminuiva (curva rossa) questo perch inizialmente, la proteina si trovano nel suo stato nativo quindi la proteina avvolta e sono presenti quattro ponti disolfuro che stabilizzano questa struttura per in presenza di denaturati si ha prima di tutto la rottura dei ponti disolfuro quindi i gruppi SH della cisteina si trovano nello stato ridotto quindi libere e non legate tra di loro perci la struttura ha perso la sua struttura tridimensionale quindi l'enzima non pu pi svolgere la sua funzione e quindi l'attivit diminuisce. Contemporaneamente aumenta la viscosit (curva verde) questo perch quando le proteine si denaturano generalmente, la soluzione da limpida diventa torbida e questo anche un altro modo che pu essere determinato quantitativamente per scoprire la percentuale di denaturazione della proteina. Dopodich mediante dialisi ha eliminato i denaturanti e accade che la concentrazione di questi va da 8 a 0 molare quindi lattivit cresce il che significa che lenzima riprende la sua funzione e quindi la sua struttura e la soluzione ritorna limpida. Tutto questo va confermare quanto detto prima e cio che tutte le informazioni necessarie per raggiungere la struttura tridimensionale contenuta nella struttura primaria. Anfinsen stato molto fortunato perch l'esperimento condotto mostra numerose limitazioni e cio non riesce con tutte le proteine infatti l'esperimento utile solo per proteine di piccole dimensioni e poi le soluzioni proteiche non devono essere molto concentrate. Questo perch durante l'esperimento la proteina perde la sua conformazione quindi i residui idrofobici che si trovano all'interno della proteina si rivolgono ora all'esterno quindi se abbiamo soluzioni proteiche molto concentrate le proteine tendono ad aggregarsi tra di loro mediante i residui idrofobici che sono esposti verso l'esterno tendono a legarsi fra loro e formano degli aggregati molto stabili; quindi se diminuiamo il denaturante questi aggregati possono essere talmente stabili che non possibile separarli e la proteina rimane nella forma denaturata e non ritorna nella sua struttura nativa. Lo stesso ragionamento vale per la dimensione della proteina e cio se abbiamo proteine piccole poco concentrate le interazioni sono poche se invece abbiamo proteine di grandi dimensioni una proteina potr interagire con l'altra in diversi punti e quindi anche eliminando il denaturante la proteina non ritorna allo stato nativo.

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