VALORACIN DE LA INMUNIDAD CELULAR IN VITRO

Por: Sofa Jaramillo Q.

OBJETIVOS
GENERALES: ESPECFICOS:
Identificar los procedimientos de laboratorio que se emplean para evaluar la inmunidad celular. Esquematizar las fases del estudio de la inmunidad celular en los procedimientos de laboratorio. Definir los criterios clnicos para la solicitud de stos anlisis.

Identificar los procedimientos de laboratorio que permiten la valoracin de la inmunidad celular in vitro.

CONOCIMIENTOS PREVIOS

Desarrollo, diferenciacin, propiedades particulares y funciones de los Monocitos, Neutrfilos, Basfilos, NK, LT y LB.

ORIGEN DE LOS ESTUDIOS SOBRE INMUNIDAD CELULAR

Estudios en otras especies: aves y mamferos Pacientes con inmunodeficiencias

Ac. Monoclonales

Anlisis funcionales in vitro

SEPARACIN

IDENTIFICA CIN

RECUENTO

VALORACIN FUNCIONAL

M. Fsicos Fycoll-Hypaque Adhesin selectiva Ms: vidrio, plstico LB, LT: nylon, algodn M. Inmunoqumicos Poblaciones Subpoblaciones

Cualitativa M. Inmunoqumico Clulas Formadoras de Rosetas Cuantitativa M. Fsicos S. Magntica S. Por afinidad de columnas M. Inmunoqumico -Globulina Antihumana Citometra de Flujo con FACS

Microscopa de fluorescencia Citometra de flujo IF RIA

Test de Actividad Fagoctica Directa Indirecta P. De Proliferacin Celular Ensayo de Proliferacin Reaccin linfocitaria mixta LT-CD4 Prueba del IFN- ELISPOT Citometra de Flujo (Citoquinas internas) LT-CD8 y NK ADCC

MATERIALES
SUSTRATO CELULAR: Citologa: Suspensiones frescas de sangre (plasma) * Histologa: Usual: Puncin M.O.* Transoperatorios Biopsias Post mortem Especial: Punciones de extraccin de lquido

TCNICA HISTOLGICA

PROCEDIMIENTOS

OBTENCIN DE LA MUESTRA

PROCESAMIENTO

FIJACIN

INCLUSIN

CORTE

COLORACIN

ANLISIS

SEPARACIN
AISLAMIENTO POR CENTRIFUGACIN EN GRADIENTE DE DENSIDAD: TCNICA FICOLL-HYPAQUE SEPARACIN POR ADHESIN SELECTIVA

Los monocitos se adhieren a superficies de vidrio o plstico y se separan de los linfocitos

Separacin de mononucleares [Ms y Linfocitos (LB, LT)]de granulocitos (Ns, Bas)

Los linfocitos B se fijan a columnas o jeringas en lana de nylon o algodn (se obtienen poblaciones separadas de LB y LT)

TCNICA FICOLL-HYPAQUE

ADHESIN SELECTIVA
LT M s

IDENTIFICACIN

Cualitativa
M. Inmunoqumico
Clulas Formadoras de Rosetas

Cuantitativa
M. Fsicos
S. Magntica S. Por afinidad de columnas Cargas elctricas (LB , LT) Aglutininas Man: Timocitos inmaduros Soja: LB

M. Inmunoqumico
CD -Globulina Antihumana Citometra de Flujo con FACS

CLULAS FORMADORAS DE ROSETA E

Receptor SRBC o CD2 CA linfoide

MTODOS FSICOS
MAGNTICA
POR AFINIDAD DE COLUMNAS

Ag para LT
Produccin de Ac. a los globulina+ fluorocromo LT Identificacin de los marcadores de LT por el antisuero resultante

Timocitos, LT sp., LT cultivo cont., LT leucmicos cabras o conejos Hibridoma murino Demostracin de especificidad

IF Directa Microscopio de fluorescencia Citmetro de flujo* Tincin vital con azul trpano Anlisis de liberacin de Cr51 (RIA)

IDENTIFICACIN LT: MARCADORES ESPECFICOS

TIPO DE CLULA DETECTADO Timocitos de la corteza Clulas de Langerhans Clulas formadoras de rosetas LT NK LT maduros Receptor para Ag. En LT LT colaboradores/inductores Monocitos LT maduros CD CD1 CD2 Relacin LT-CD4/LT-CD8: 2/1

CD3 CD4 CD6 CD7 CD8

Timocitos NK
LT supresores/ctx. NK

RECUENTO

Microscopa de fluorescencia

Citometra de flujo

IF

RIA

CITOMETRA DE FLUJO
PROCEDIMIENTO: RESULTADOS:

APLICACIONES DE LA CITOMETRA DE FLUJO

Tipificacin del Fenotipo Leucocitario Inmunodeficiencias Pronstico Seguimiento de inmuno y quimioterapia Seguimiento de la reconstitucin inmunitaria TIPIFICACIN DEL FENOTIPO TUMORAL Clasificacin de leucemias y linfomas Determinacin de la clonalidad Diferenciacin entre neoplasias de clulas hemato y no hematopoyticas Pronstico ANLISIS DEL ADN OTRAS APLICACIONES

Aneuploida Cintica del ciclo celular

Reticulocitos Deteccin de Ig. Relacionadas con Px. Pruebas cruzadas en transplantes Citogentica

VALORACIN FUNCIONAL
Test de Actividad Fagoctica Prueba de Proliferacin Celular

Migracin

Ensayo de Prolifera cin

Leucocrito+Mit geno (especfico) Medir el estado global de la respuesta celular

LT-CD4

LT-CD8 y NK
LT-CD8: Determinacin de lisis celular (CMHI)Cr51

ADCC

Ingestin

Prueba del IFN-

Clulas+Ac

Digestin
Degranulacin: Fagocitosis frustrada Muerte Intracelular: NBT, Quimioluminiscen cia, 502 de S. aureus

Reaccin linfocitaria mixta

CPA (MHC-II) Inmunidad transfucional Dx. Exposicin previa

ELISPOT

Citometra de Flujo (Citoquinas internasAc.)

NK: Lneas de clulas tumorales

Ms, Ns, Es, NK

ACTIVIDAD FAGOCTICA

PROLIFERACIN CELULAR
ENSAYO DE PROLIFERACIN REACCIN LINFOCITARIA MIXTA

LT-CD8: CITOTOXICIDAD

NK Y CLULAS TUMORALES

ADCC

IMPORTANCIA

FISIOLGICA
Inmunidad antiinfecciosa

PATOLGICA
Trastornos de inmunodeficiencia

Inmunidad transfusional
Inmunidad tumoral Enfermedades autoinmunitarias

AVERIGUAR
Nombres de mitgenos especficos. Importancia del cultivo mixto linfocitario en la medicina transfusional. Lneas de clulas tumorales empleadas en los ensayos de laboratorio para la valoracin de la actividad de los NK. Citoquinas implicadas en la :
Migracin Adherencia Lisis mediada por Ms.

Indique la importancia de la citometra de flujo en la estadificacin del VIH. Consultar las causas de variacin (en y en ) de la relacin LT-CD4/LT-CD8. Seale las diferencias entre Th1 y Th2. Enumere los Ag. Relacionados con clulas leucmicas.

BIBLIOGRAFA
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