INTRODUCCIN A LAS TCNICAS HISTOLGICAS por M.A.Aimale & Chr.J.

Gatti

Se define tcnica histolgica al conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada a fin de posi!ilitar su estudio al microscopio. "l e#amen al microscopio se hace generalmente por luz transmitida lo que significa que la luz de!e $atra%esar$ el o!jeto a e#aminar para llegar despus de ha!er pasado por las distintas lentes del aparato a impresionar a nuestro rgano %isual. &or esa causa de!e ser reducido a l'minas mu( delgadas ( transparentes las cuales lograremos efectuando una serie de operaciones que ser'n descriptas m's adelante. OBTENCIN DE LA PIEZA "l material a utilizar puede ser e#tra)do de los di%ersos animales de la!oratorio o !ien puede tratarse de material humano. "ntre los animales de o!ser%acin se eligen aquellos que por su semejanza con el ser humano pueden sustituirlo sin grandes diferencias ( cu(a o!tencin ( crianza puede ser f'cilmente efectuada en el la!oratorio. *ases en la o!tencin de material animal+ , Muerte del animal+ podemos producirla %alindonos de un traumatismo !rusco o por la into#icacin a causa de una dosis e#agerada de narctico. , Extraccin de los rganos: conociendo la anatom)a del animal de!emos dirigirnos directamente a los rganos que nos interesan estudiar. "n el caso de que estos sean %arios es con%eniente e#traer primero los que m's f'cilmente se descomponen estos son el p'ncreas ( la porcin inferior del tu!o digesti%o. , Reduccin a piezas: teniendo en cuenta que para el tama-o de las piezas de!emos considerar mu( especialmente las cualidades del fijador a usar ha!laremos de este asunto cuando tratemos la fijacin.

.educcin de la pieza /!tencin de material humano+ "l hom!re no es sujeto de e#perimentacin esta %erdad indiscuti!le hace que slo en casos e#cepcionales se pueda o!tener material humano en condiciones de ser estudiado histolgicamente. 0e tres fuentes puede pro%enir el material humano+ las necropsias las !iopsias ( las piezas operadas. 0e stas slo la primera puede darnos material normal1 las dos 2ltimas proporcionar'n tejidos patolgicos. , Necropsias+ son las piezas que se o!tienen de un cad'%er. &ara histolog)a normal es necesario que se trate de un cad'%er fresco ( que no ha(a sido atacado por ninguna lesin por lo menos el rgano que se quiere estudiar.

, Biopsias+ son trozos de tejido que se o!tienen de un sujeto con %ida con el o!jeto de estudiarlos al microscopio ( efectuar un diagnstico histopatolgico. , Piezas operadas+ los tejidos que han sido e#tra)dos de las inter%enciones quir2rgicas generalmente tumores u rganos inflamados tam!in pueden darnos material de in%estigacin pero como en el caso anterior slo ser%ir'n para anatom)a patolgica. FIJACIN 3a fijacin tiene por o!jeto matar las clulas ( conser%arlas hasta donde sea posi!le en el estado en que se encontra!an durante la %ida. &or lo tanto es un mtodo histolgico destinado a o!tener preparados duraderos que conser%an la estructura morfolgica ( qu)mica de las clulas ( tejidos al estado %i%o ( que permite realizar posteriormente los procedimientos de coloracin o de identificacin que facilitan el completo conocimiento de su constitucin )ntima.

*ijacin de la muestra. Se llaman fijadores a las sustancias qu)micas o a los agentes f)sicos que se utilizan para tal fin. Cualidades que de!e tener un fijador+ 4. Actuar con rapidez matando ( fijando a las clulas antes de que aparezcan los fenmenos agnicos o post,mortem 5autlisis desintegracin etc.6. 7. &oseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar. 8. Conser%ar en lo posi!le los detalles estructurales que presenta!an in %i%o. 9. &ermitir o fa%orecer el empleo de los procedimientos necesarios para su o!ser%acin ulterior 5ejecucin de cortes coloracin etc.6. :. ;mpedir la desaparicin de los elementos solu!les durante la fijacin o despus de ella. <. =o pro%ocar o impedir la produccin de estructuras artificiales. >. =o retraer e#cesi%amente los tejidos ni %ol%erlos fria!les o que!radizos. Manera de actuar de los fijadores ?ar)a con la composicin o naturaleza de los mismos+ coagulando las prote)nas sin com!inarse con ellas 5alcohol 'cido p)crico (odo calor6 formando com!inaciones qu)micas con las sustancias org'nicas 5'cido crmico ( sus sales6 o reducindose en contacto con las mismas ( originando en su seno un precipitado sumamente fino 5'cido smico !icloruro de mercurio cloruro de oro6. 3a ma(or parte de los fijadores act2an como o#idantes fa%oreciendo as) la coloracin ulterior de los tejidos 5recurdese que stos en su ma(or)a son reductores que muchos colorantes se transforman en leuco!ases incoloras al com!inar una molcula de hidrgeno con su cromforo6. *ijadores qu)micos

Son los m's utilizados1 pueden ser fijadores simples constituidos por una sola sustancia qu)mica ( fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando %arias sustancias inter%ienen en su constitucin. *;JA0/."S S;M&3"S+ a6 Formol al 10% es el m's usado. Su empleo es aconseja!le en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial principalmente cuando se trata de fijar rganos o tejidos para estudios histolgicos topogr'ficos. !6 Alco ol et!lico a"soluto o de #$% se usa generalmente en microqu)mica. c6 Alco ol met!lico se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados 5sangre mdula sea ganglio !azo l)quidos de puncin etc.6. d6 %cido smico al 1 &% es poco penetrante pero enrgico conser%a mu( !ien estructuras celulares. e6 Bicromato de potasio al '()%* *;JA0/."S C/M&@"SA/S+ "n su composicin inter%ienen un n2mero %aria!le de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la accin de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. a6 +!,uido de Fleming mezcla cromo,osmio,actica. !6 +!,uido de -en.er mezcla !icromato,su!limado,actica. c6 +!,uido de /ell0 mezcla BenCer,formol. d6 +!,uido de Bouin mezcla picro,formos,actica. e6 +i,uido de 1u"osc,(Brasil o Douin alcohlico. *;JA0/."S *ES;C/S+ 4. 0esecacin. 7. Calor seco. 8. Calor h2medo. 9. *r)o. :. Congelacin ( desecacin. DESHIDRATACIN E INCLUSIN EN PARAFINA 0eshidratacin 3as piezas al ser retiradas del fijador o despus de ha!erlas la%ado est'n em!e!idas en agua1 impidiendo que sean penetradas por la parafina. &or lo tanto en primer lugar de!emos deshidratar los tejidos sumergindolos en l)quidos anhidros '%idos de agua. &ara e%itar alteraciones pro%ocadas por una deshidratacin !rusca se aconseja proceder escalonadamente utilizando preferentemente alcohol et)lico de graduacin creciente.

Se dispone una l'mina en un cassette de deshidratacin.

0eshidratacin en alcoholes sucesi%os. ;mpregnacin por un disol%ente de la parafina 5aclaracin6 3as piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disol%ente #ilol o toluol 5este 2ltimo es el que nosotros utilizamos6. Al agregar el toluol no de!e aparecer ninguna tur!idez. Si se pone !lanco, lechoso es que la deshidratacin no ha sido !ien lograda ( de!emos repetir el !a-o de alcohol a!soluto cercior'ndonos que realmente lo sea+ una gota de alcohol agregada a unos ml de toluol no de!e entur!iarlo. &enetracin de la parafina Se sumergen las piezas en parafina 5:<,:FG de punto de fusin6 mantenida l)quida en la estufa a no m's de <7GC. 0espus de 4 a 7 horas se renue%a la parafina.

&enetracin de la parafina a :<,:FGC. ;nclusin definiti%a o formacin del !loque "n moldes de papel o de metal ad,hoc 5!arras de 3eucCart6 se %ierte la parafina fundida del mismo punto de fusin de la que ha ser%ido para la penetracin. Se colocan las piezas orient'ndolas ( luego se pone el molde en heladera.

Darras de 3eucCart A los 4:,8H minutos la parafina se ha!r' solidificado completamente recortamos los !loques en forma de pir'mide cuadrangular truncada lo adherimos a un taquito de madera mediante una esp'tula calentada con la llama de un mechero ( (a podemos realizar los cortes con el micrtomo.

*actura del taco para cortar. OBTENCIN DE CORTES "l o!jeto de la inclusin que hemos descripto anteriormente es hacer posi!le la reduccin del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para e#aminarlo al microscopio. 3os micrtomos son instrumentos de gran precisin que nos proporcionan cortes delgados parejos ( de espesor gradua!le. 3os cortes m's corrientes son los de 9,< micrones. Consideraremos cuatro tipos de micrtomos+ el de deslizamiento el tipo Minot el de congelacin ( el cristato o critomo. , 2ipo deslizamiento+ en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza por unas gu)as especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos tornillos. , 2ipo Minot+ en este caso la cuchilla queda fija ( es la pieza la que se desliza sujeta a una platina sta se desliza %erticalmente cuando se hace girar una mani%ela. &ermite o!tener cortes seriados en forma de cinta.

Corte en micrtomo tipo Minot. , 2ipo congelacin+ se parece al de deslizamiento pero la cuchilla o na%aja en lugar de deslizarse gira so!re un eje. &or otra parte el aparato se caracteriza por tener un sistema de congelacin colocado de!ajo de la platina que utiliza la e#pansin !rusca del anh)drido car!nico contenido en un cilindro con el cual se comunica. , 3ristato+ consta de un micrtomo tipo Minot incluido en una c'mara de congelacin. "l %olante de inercia que controla la realizacin del corte permanece en el e#terior mientras que la cuchilla ( el mecanismo de a%ance est'n situados dentro de la c'mara fr)a 5normalmente a ,7HG C6. &ese a la

disposicin horizontal de la cuchilla la o!tencin de secciones seriadas es posi!le gracias a la e#istencia de un sistema anti,enrollamiento que o!liga al corte a deslizarse so!re la superficie de la cuchilla. "n los modelos m's modernos es posi!le optar por el corte manual o motorizado as) como enfriar r'pidamente la muestra a ,<HG C gracias a la e#istencia de una placa de congelacin instant'nea. *rente al micrtomo con%encional de congelacin el cristato posee la gran %entaja de permitir la o!tencin de cortes mucho m's delgados 5por lo general de 9 Im ( en manos e#perimentadas hasta 7 Im6. 3os cortes de parafina se e#tienden al o!tenerlos del micrtomo en agua ti!ia contenida en un cristalizador. "n ese mismo agua se introducen portao!jetos pre%iamente desengrasados cu!iertos con una capa de adhesi%o de Ma(er ( con la a(uda de una aguja histolgica se colocan los cortes so!re el portao!jetos ( a continuacin se lo le%anta. COLORACIN 3uego de realizado el corte se procede a rehidratarlo para permitir su coloracin. 3olorantes: reci!en esta denominacin las sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos. 3oloracin: es el proceso mediante el cual un cuerpo es te-ido por una sustancia colorante sin perder el color cuando es la%ado con el disol%ente utilizado al preparar la solucin colorante. Clasificacin de los colorantes+ Seg2n su origen se clasifican en+ C/3/.A=A"S =AA@.A3"S+ , Animales 5carm)n6 , 4egetales 5hemato#ilina orce)na azafr'n6 C/3/.A=A"S A.A;*;C;A3"S / S;=AJA;C/S 5C/3/."S 0" A=;3;=A6+ , %cidos: sales cu(a !ase es incolora ( su 'cido es coloreado 5eosina o eosinato de sodio6. Son colorantes citoplasm'ticos. , B5sicos: sales cu(a !ase es coloreada ( el 'cido es incoloro 5azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno6. Son colorantes nucleares. , Neutros: sales en las que tanto el 'cido como la !ase son coloreados. Ai-en el n2cleo de un color ( el citoplasma de otro. , 6ndi7erentes: no forman sales. Ai-en aquellas sustancias que tienen un poder disol%ente superior al del l)quido que ha ser%ido para preparar la solucin colorante 5Sud'n lll rojo escarlata6. &or otro lado las coloracione pueden ser+ , 8rtocrom5ticas+ los tejidos adquieren un color igual al de la solucin colorante empleada. , Metacrom5ticas+ una sustancia o un componente celular se ti-e con un color diferente al del colorante empleado. Mtodos de coloracin+ , 3oloracin directa: e#iste una %erdadera afinidad entre el colorante ( el o!jeto. , 3oloracin indirecta: requiere la inter%encin de intermediarios o mordientes para que la coloracin tenga lugar. , 3oloracin progresi9a: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto ptimo. , 3oloracin regresi9a: se realiza primero una so!recoloracin ( luego se elimina el resto del colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo denomina diferenciacin. , 3oloracin simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado 5n2cleo fi!ras el'sticas etc.6. , 3oloracin com"inada: se ti-en los elementos nucleares ( citoplasm'ticos recurrindose generalmente al empleo sucesi%o de colores !'sicos ( 'cidos que contrastan por sus colores. , 3oloracin panptica: es una coloracin com!inada realizada sucesi%amente por colorantes neutros 5Ma(,GrKnLald,Giemsa6. , 3oloracin pancrmica: en un solo !a-o colorante act2an todos los colorantes neutros que se necesiten.

Colorantes m's utilizados en histolog)a humana+ M"MAA/N;3;=A+ , "s un colorante %egetal. , &ara ser utilizada de!e ser o#idada pre%iamente. 3os agentes o#idantes pueden ser+ el aire 5%arios meses de e#posicin6 u o#idantes artificiales 5#ido de mercurio permanganato de potasio dicromato pot'sico etc.6 , "s un colorante directo pero en la pr'ctica se lo utiliza en forma de lacas hemato#il)nicas 5se utiliza alum!re de potasio o de sodio como mordiente para preparar la solucin colorante6 comport'ndose en este caso como un colorante indirecto. "/S;=A+ , "s un colorante artificial 5se trata de deri%ados hidro#i#antnicos halogenados con tres grupos arilo6. , &resenta autofluorescencia espont'nea. , Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohlicas. &ara colorear se emplea generalmente una !ater)a de coloracin.

Dater)a de Coloracin M&". !ONTAJE 3uego de la coloracin se deshidrata el corte ( se procede a la aclaracin ( montaje definiti%o dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser o!ser%ado ( protegido del am!iente para e%itar su deterioro. 3a deshidratacin se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes. 3a aclaracin se realiza con #ilol o car!o#ilol. "l o!jeti%o de este paso es impregnar el corte con un disol%ente del D'lsamo de Canad' que al mismo tiempo le confiere un )ndice de refraccin semejante al del %idrio. &ara el montaje se limpia el portao!jeto alrededor del corte ( se deposita so!re el mismo una gota de D'lsamo de Canad' disuelto en #ilol ( se cu!re con un cu!reo!jeto. Se deja secar unas horas antes de su o!ser%acin al microscopio. PROTOCOLO GENERAL A continuacin se presenta el protocolo de tra!ajo utilizado por nuestra c'tedra para la tcnica de Memato#ilina , "os)na para preparados de uso did'ctico+ ;. *ijacin

"n formol al 4HO 54 parte de formol ( P partes de agua destilada6 por lo menos durante < hs. ;;. Corte Se le da el tama-o deseado a la pieza ( se la coloca en una !olsa de gasa con el fin de enjuagarla en agua corriente durante por lo menos 4:Q. ;;;. 0eshidratacin 46 76 86 96 :6 Alcohol >HG 4h8HQ. Alcohol P<G 4h8HQ. Alcohol 4HHG 5l6 4h8HQ. Alcohol 4HHG 5ll6 4h8HQ. Aoluol entre 4h8HQ ( 8hs.

;?. ;nclusin 46 76 86 96 :6 <6 Secado de la muestra con gasa. &arafina :<G 5l6 4h8HQ. &arafina :<G 5ll6 4h8HQ. *ormacin de la !arra. 8HQ de frezzer. *ractura del taco

?. Corte ?;. Coloracin 46 Secado de los cortes en estufa a :FGC 4:Q. 76 Nilol o toluol 5;6 4:Q en estufa. 86 Nilol o toluol 5;;6 7Q. 96 Alcohol 4HHG 8H$. :6 Alcohol P<G 8H$. <6 Alcohol >HG 8H$. >6 Alcohol :HG 8H$. F6 Agua destilada 8H$. P6 Memato#ilina 4R8H$. 4H6 Agua corriente 7R. 446 Alcohol :HG 4:$. 476 "osina 8H$. 486 Alcohol P<G 4H$. 496 Alcohol 4HHG 4H$. 4:6 Nilol 4R por lo menos. 4<6 Montaje con D'lsamo de Canad' sinttico. RECO!ENDACIONES "TILES ( +as t:cnicas istolgicas pertenecen al tipo denominado ;t:cnicas contrarrelo<;* =i >d* est5 apurado no las empiece? d:<elas para cuando su tra"a<o le permita dedicarse solo a esa acti9idad* ( Mantenga su la"oratorio en orden? con todos los elementos de 9idrio ,ue 9a a utilizar per7ectamente limpios* ( Rotule todos los 7rascos inmediatamente luego de preparar cual,uier solucin* ( @uarde siempre las soluciones en 7rascos de color caramelo* ( Mantenga los recipientes ,ue contienen xilol? toluol 0 alco ol 100A siempre tapados* ( Nunca colo,ue xilol o toluol en recipientes pl5sticos por,ue resultan atacados por estas sustancias* ( =i de"e tra"a<ar con 5cidos 5galo "a<o campana* =i se derraman o salpican la piel? la9e inmediatamente con a"undante agua con "icar"onato de sodio* ( 3uando coloree prepare primero todas las soluciones? solo despu:s comience con los pasa<es del material* ( =i de"e realizar simult5neamente 9arios procesos de inclusin? con7eccione planillas de tiempos para cada uno de los materiales* Esto e9itar5 con7usiones* ( 3ontrole cuidadosamente los tiempos esta"lecidos para cada t:cnica* Es mu0 importante respetarlos para o"tener resultados satis7actorios* ( Antes de iniciar cual,uier t:cnica? primero l:ala atentamente* Prepare el material de 9idrio necesario? reBna los reacti9os 0 colorantes? aga las diluciones? determine los tiempos? 0 despu:s comience el proceso*

( 2enga muc a paciencia 0 9oluntad* =ea perse9erante? si durante las primeras experiencias sus resultados no son lo ,ue >d* espera"a? 9eri7i,ue cada paso 0 repita tantas 9eces como sea necesario*