DIFERENCIACIN BIOQUMICA DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS OBJETIVOS Reconocer las caractersticas morfolgicas y en los cultivos de las bacterias Grampositivas

Identificar bioqumicamente las diferentes bacterias Gram positivas deimportancia clnica. INTRODUCCIN Existen una gran variedad de bacterias Gram positivas de importancia clnica conforma de cocos como Staphylococcus aureus, especies de Streptococcus ,principalmente S. pneumoniae y cocos anaerobios: Peptostreptococcus Entre los bacilos Gram positivos patgenos ms comunes tenemos Bacillusanthracis, Clostridium, Gardnerella, Listeria , Corynebacterium. Todas esta bacterias se encuentran causando procesos infecciosos en los sereshumanos y en algunos casos estas se encuentran colonizando alguna parte delcuerpo junto con bacterias de la flora normal. Por eso se hace necesario para suaislamiento e identificacin realizar toma de muestras y procesamiento bacteriolgicos correctos.Dentro de los Gram positivos, los cocos y en especial las especies de Streptococcus y los Staphylococcus son los ms fciles de aislar e identificar mediante observacin de hemlisis, pruebas bioqumicas o diferencialesespecficas como la prueba de catalasa para diferenciar Staphylococcus de Streptococcus, la prueba de coagulasa para diferenciar Staphylococcus patgenos de los no patgenos, la reaccin de Quellung para distinguir neumococos etc. METODOLOGA Pruebas bioqumicas para Staphylococcus y Streptococcus Observar el tipo de hemlisis que presentan las placas de agar Sangre Realizar la prueba de catalasa con una colonia de la placa de agar Sangre y conunade Manitol salado. Para la prueba de coagulasa , en dos tubos con un ml de plasma cada uno,depositar en uno 0,5 ml del cultivo de Staphylococcus aureus y en otro un ml de Streptococcus epidermidis. Incubar 30 minutos a 37 C. Preparar un frotis con las colonias que han desarrollado en el agar Sangre y enagar Manitol salado Preparacin de Frotis

METODOLOGA La identificacin de Staphylococcus y Streptococcus, se basa en la morfologa delas colonias que se observan en los cultivos primarios y en el tipo de hemlisis en agar Sangre. Sin embargo para evitar errores de interpretacin , se emplean pruebas bioqumicas como : Prueba de Catalasa La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin de perxido dehidrgeno en agua y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos excluyendo los estreptococos.La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con desprendimiento de burbujas : la enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno , en agua y oxgeno molecular. Esta prueba se emplea para diferenciarlos gneros Micrococcus y Staphylococcus : catalasa positivo del gnero Streptococcus: catalasa negativo

Fermentacin del manitol El agar Manitol salado es un medio altamente selectivo para el aislamiento de Staphylococcus patgenos en cultivos mixtos, ya que se aprovecha la capacidad de los Staphylococcus de desarrollar en presencia de Cloruro de sodio (Na Cl) al 7,5 %y la de fermentar manitol, en este caso se observar la formacin de un halo amarillo en el agar circundante a las colonias. Perxido dehidrgeno Coagulacin del plasma Staphylococcus aureus produce una protena llamada coagulasa , capaz de aglutinar el plasma tratado con oxalato, citrato o heparina en presencia de un factor contenido en el suero. Este factor srico reacciona con la coagulasa , activando el fibringeno y produciendo un cogulo o trombo de fibrina. La coagulasa se presenta en forma unida (adherida a la clula) y en forma libre. El estudio de la actividad coagulasa se puede llevar a cabo en un tubo de ensayo (para coagulasa libre) y en portaobjetos(coagulasa nido), tambin llamado factor de agregacin , la prueba en tubo se hace poniendo un ml de plasma al que se le agrega una asada de un cultivo nocturno de S. aureus . Se incuba la mezcla a 37 C durante 4 horas y se considera positivo ante cualquier grado de coagulacin

RESULTADOS DE LAS PRUEBAS BIOQUMICAS Streptococcus

IDENTIFICACIN DE ENTERO BACTERIAS PSEUDOMONA BJETIVOS Conocer los procedimientos de identificacin bioqumica de las principalesbacteriaGram negativas. Interpretar los resultados de las pruebas bioqumicas y correlacionarlas con ladiferentes especies de bacterias Gram negativas. INTRODUCCIN Las bacterias Gram negativas pueden presentarse como bacilos o cocos siendo losprimeros los ms abundantes tanto en el hombre como en los animales. Varios deestos microorganismos pertenecen a la flora intestinal normal , algunos estnasociados a infecciones entricas y a procesos infecciosos (especialmente cuandostas bacterias invaden otros rganos o sistemas).Es posible que las infecciones procedan de un reservorio animal , de un portadorsano o de la diseminacin endgena de la bacteria en una persona susceptible,pudindose ver afectado cualquier rgano del cuerpo.Familia de bacilos entricos Esta familia Enterobacteriaceae, incluye a varios patgenos que causan sndromesdiarreicos . Un gran nmero de ensayos han sido desarrollados a manera deidentificar rpidamente al patgeno, para que posteriormente el mdico, con baseen el reporte, indique el tratamiento adecuado o para que los epidemilogospuedan localizar la fuente de infeccin. Dentro de los bacilos Gram negativos , lasenterobacterias son responsables del 30 a 35 % de todas las septicemias, ms del70 % de todas las infecciones del tracto urinario y muchas infecciones intestinales.Dentro de las especies de enterobacterias que son los agentes etiolgicos deinfecciones entricas tenemos :Salmonella , Shigella, y Escherichia coli. Estas pueden producir cuadros diarreicos e infeccin sistmica , que son procesosinfecciosos que se diseminan generalmente por va sangunea o linftica.Medios de aislamiento primarioSon medios selectivos porque permiten el desarrollo de algunas bacterias e inhibenel desarrollo de otras. Esta capacidad puede ser moderada (agar Eosina azul demetileno (EMB) y Mac Conkey) y alta (agar Salmonella-Shigella, Desoxicolato yCitrato) o completamente especfica (Sulfato de bismuto y Verde brillante).Algunos de los medios selectivos contienen lactosa y un indicador de pH, lo quepermite desde el principio tener colonias aisladas de bacterias fermentadoras como Escherichia coli y no fermentadoras de la lactosa Salmonella, Shigella .Medios diferenciales : Pruebas BioqumicasSon aquellos en los que se pone de manifiesto las propiedades metablicas de losmicroorganismos frente a diferentes sustratos. Existen medios que permitenobservar una, dos o ms caractersticas metablicas de la bacteria inoculada .Entre los ms utilizados estn : Agar Triple Azcar (TSI): medio slido que contiene glucosa, sales de hierroy un indicador de pH. Permite conocer la capacidad de la bacteria para fermentarlos carbohidratos. Se detecta la produccin de sulfuro de hidrgeno (H2S), as como de gas. El tubo se siembra por picadura y en estra por lo que se debe observartantoel fondo como la superficie del medio Agar Lisina Hierro (LIA) : medio slido que contiene lisina, sales de hierro,glucosa y un indicador de pH. Se determina la descarboxilacin y desaminacinoxidativa de la lisina, la produccin de cido sulfhdrico o sulfuro de hidrgeno(H2S) y la fermentacin de glucosa. Se siembra por picadura y estra. Medio para Sulfuro , Indol y Movilidad (SIM) : medio semislido, se utiliza enla produccin de sulfuro de hidrgeno, la formacin de Indol y movilidad. Seinocula con una nica puncin con asa de siembra recta a travs del centro, hastauna profundidad de unos dos tercios del medio. Agar Citrato de Simmons

: medio slido que contiene citrato de sodio,compuesto que puede ser utilizado como nica fuente de carbono, por algunasbacterias. Se siembra por picadura y estra Agar rea (Mtodo de Christensen) : medio slido, se utiliza para determinar lacapacidad de un organismo para producir la enzima ureasa, que hidroliza la rea .La hidrlisis de la rea produce amonaco y anhdrido carbnico. La formacin deamonaco alcaliniza el medio y el cambio de pH se detecta por el cambio de colordel rojo fenol de naranja plido a magenta.Existen ms pruebas bioqumicas que pueden utilizarse como complemento a lasya descritas como son : rojo de metilo, Voges Proskawer, utilizacin de malonato,las cuales ayudan a determinar la especie del microorganismo aislado. Enocasiones a pesar de recurrir a diversas pruebas metablicas, no se consigue laidentificacin , siendo necesario realizar reacciones inmunolgicas para llegar aldiagnstico definitivo. BACTERIAS PIGENAS GRAM NEGATIVAS Otro grupo menos abundantes en especies pero de gran importancia clnica son lasbacterias pigenas Gram negativas, que pueden ser cocos o cocobacilos . Lasenfermedades que producen por lo general incluyen la acumulacin de abundantescantidades de pus y afectan frecuentemente el aparato genital o respiratorio.Dichas enfermedades comprenden : uretritis purulenta (gonococo) , meningitis ,neumonas , bronquitis, sinusitis, otitis media, conjuntivitis, epiglotitis etc.Las bacterias pigenas Gram negativas patgenas en humanos son : Neisseria,Haemophilus, Bordetella, Moraxella. Las bacterias del gnero Neisseria son diplococos Gram negativos inmviles, cuyoslados adyacentes son aplanados y ligeramente cncavos. Slo dos especies de estegnero son patgenas exclusivamente de humanos : Neisseria gonorroheae ogonococo, agente causal de la enfermedad de transmisin sexual, la gonorrea y la N .meningitidis o meningococo productos comensales para el hombre y quehabitan principalmente el tracto respiratorio superior.Espordicamente se pueden comportar como patgenos oportunistas N. sicca y N. mucosa. El diagnstico definitivo de una infeccin gonoccica se hace por el aislamiento encultivo de N. gonorrhoeae. Para el diagnstico del gonococo, el lugar de la toma de la muestra depender dela edad, sexo y de las caractersticas de la infeccin.La tincin de Gram es el mtodo de eleccin para el examen directo de lasmuestras. Son oxidasa positiva.Para los cultivos , el medio debe ser de preparacin reciente, bien hidratado yprecalentados. Se utilizan medios selectivos como agar Thayer Martin modificado.Se debe utilizar un medio no selectivo ya que algunas cepas pueden inhibirse porlos antimicrobianos contenidos en los medios selectivos. Debe estar adems enuna atmsfera que contenga de 3 a 5 % de CO2.El diagnstico de la infeccin meningoccica, se hace con el aislamiento de N.meningitidis a partir de lquido cefalorraqudeo, sangre, lquido sinovial, pleural opericrdico. Las ms utilizadas son las dos primeras.Con la tincin de Gram se observan como diplococos Gram negativos, crecen enlos medios de cultivo enriquecidos y su crecimiento se favorece con una atmsferade CO 2. Son oxidasa positivo y fermentan los carbohidratos. METODOLOGA Enterobacterias En las prcticas se harn los trabajos de laboratorio que nos permitan observarlascaractersticas de cultivo y con ello su identificacin A partir de uno de los tubos problema, tomar con el asa de siembra previamenteesterilizada una muestra y sembrar por estras en los medios Eosina azul demetileno y Salmonella Shigella. Incubar a 37C por 24 horas. Transcurrido el tiempo de incubacin , observar la morfologa de las colonias delasplacas sembradas

(Mac Conkey, EMB y S-S). Seleccionar una colonia y realizar cultivos en los tubos de TSI, Citrato deSimmons,LIA y SIM. Esto se hace por puntura en los medios y luego en estras en la partedeinclinacin (pico de flauta) como lo indicar el profesor en cada medio. Llevar aincubar a 37C por 18 a 24 horas. Hacer la lectura de las pruebas bioqumicas, interpretar y realizar laidentificacindel microorganismo proporcionado. Interpretacin Bioqumica Agar Triple Azcar (TSI): Fermentacin de glucosa : en la picadura (fondo del tubo) el medio vira a coloramarillo. Es una reaccin dbil. Fermentacin de sacarosa : en todo el tubo el medio cambia a amarillo,principalmente en el fondo, donde se intensifica el color debido a la reaccin de laglucosa. Fermentacin de lactosa : en la superficie el medio vira a amarillo.Debido a la fermentacin puede hacer produccin de gas, lo que se manifiestapor lapresencia de burbujas en el medio. Produccin de cido sulfhdrico o sulfuro de hidrgeno (H2S): por degradacinenzimtica de aminocidos que contienen azufre originan un precipitado de colornegro. La produccin de H2S tiene lugar en ambiente cido, de ah que elprecipitadonegro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan cidos a partir de laglucosa. As , un fondo negro indica que existe acidez en el fondo del tubo,aunqueel color amarillo se haya enmascarado con el precipitado negro. Agar Lisina Hierro (LIA) : Descarboxilacin de lisina : el medio se alcaliniza y se observa lila o ligeramentemorado en la superficie. Fermentacin de la glucosa : en el fondo del tubo el medio vira a amarillo. Desaminacin de la lisina : vira a color rojizo en la superficie del medio. Escaracterstico de Proteus y Providencia. Produccin de H2S : precipitado de color negro ( por el mecanismo citadoanteriormente). Agar Citrato de Simmons : Utilizacin de citrato como fuente de carbono : el medio vira a color azul. Agar rea : Los microorganismos que hidrolizan la rea producen un cambio de color en elpicode flauta de naranja plido a magenta. Medio para Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM) : Motilidad: Los cultivos mviles muestran un crecimiento difuso o turbidez lejos delalnea de inoculacin , por lo que observando si el crecimiento est solo en lapicadura o se extiende a los lados de ella, se puede determinar si elmicroorganismoes inmvil o mvil. Indol : la aparicin transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en lainterfase entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por lo tanto ,laprueba se considera positiva. El indol es capaz de reaccionar con el grupoaldehdo del reactivo originando un complejo de color rojo. Produccin de H2S: precipitado de color negro ( por el mecanismo citadoanteriormente).

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO: ANTIBIOGRAMA OBJETIVOS Entender el fundamento del antibiograma , el modo en que se realiza y lasprincipales fuentes de error. Conocer los principales mtodos de susceptibilidad a un antimicrobiano. Evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibiticos de una bacteria decrecimiento rpido aislada en prcticas anteriores. El mtodo utilizado es el dedifusin en agar o de Kirby-Bauer. INTRODUCCIN La actividad de los antimicrobianos (antibiticos y quimioterpicos) debe serevaluada in vitro para obtener la informacin que permitir decir si unmicroorganismo es susceptible o resistente a determinado producto.Los antimicrobianos actan produciendo toxicidad selectiva , no actandirectamente sobre el husped, sino que se combinan qumicamente con determinados sistemas de los microorganismos , enfocando as la accin sobre losmicroorganismos ms que sobre el husped.La determinacin de la mnima concentracin inhibitoria (MIC) nos proporciona ladosis mnima necesaria del quimioterpico para impedir el desarrollo bacteriano, loque permite hacer estudios de uso clnico y detectar mutantes resistentes.Dos son los procedimientos empleados para conocer sta informacin, el mtododel tubo dilucin y el del disco difusin en agar, a ste ltimo se le denomina :antibiograma. Accin de los antibiticos La actividad antimicrobiana in vitro determina:a. La potencia de un agente antibacteriano en solucinb. Su concentracin en los lquidos del cuerpo o en los tejidosc. La sensibilidad de un microorganismo a concentraciones conocidas delmedicamento. Inhibicin de sntesis de pared celular: Penicilina, Cefalosporinas, Bacitracina,Vancomicina, Novobiocina. Alteracin de la permeabilidad de la membrana celular: Anfotericina B, Colistina,Nistatina, Polimixina. Inhibicin de la sntesis proteica : Aminoglucsidos ( Kanamicina, Amikacina ,Estreptomicina ), Tetraciclinas, Cloramfenicol, Macrlidos ( Eritromicina ),Lincomicinas. Inhibicin de sntesis de cidos nucleicos : cido Nalidxico, Novobiocina,Sulfonamidas, Trimetropin, Rifampicina. Medicin de la actividad antimicrobianaEsta se determina mediante los mtodos de dilucin o difusin, utilizando unmicroorganismo standard y una cantidad conocida del antimicrobiano. Para ello seutilizan las pruebas de dilucin en tubos y el mtodo de difusin. Prueba de dilucinEn ste ensayo se incorporan cantidades conocidas de antimicrobianos en medioslquidos, se inoculan despus con las bacterias en prueba y se incuban. El puntofinal se toma cuando la cantidad de sustancias antimicrobiana es capaz de inhibirel crecimiento o de matar a las bacterias en prueba. Mtodo de difusin Preparacin del inculoLa tcnica del antibiograma slo es aplicable a especies bacterianas en cultivopuro. Por ello previamente se proceder, si es preciso, a hacer un aislamiento enplaca.Cultivar la bacteria aislada en un tubo con medio lquido apropiado (caldo Nutritivo,Infusin cerebro corazn) o preparar una suspensin directa a partir del cultivo enplaca usando el siguiente mtodo:a. Tomar una colonia aislada con el asa y resuspender en el tubo de solucin salinafrotando en la pared del tubo.b. Homogeneizar bien y ajustar la densidad ptica con un patrn de turbidez N

0,5de Mac Farland : 0,5 ml de cloruro de bario 0,048 M a 99,5 ml de cido sulfrico0,36 N 0,18 M. Esto equivale a 108 clulas/ml . Diluir si es necesario la suspensin oaadir ms inculo.c. Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez, sumergir unatorunda estril en la suspensin, rotar la torunda estril varias veces. Presionando firmemente sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del lquido, pararemover el exceso de inculo.d. Inocular la superficie seca de la placa con agar Mueller Hinton estriando con unatorunda en tres direcciones mediante rotacin de la placa, para asegurar unadistribucin uniforme del inculo, dejar secar la placa a temperatura ambiente por3 a 5 minutos para que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido.e. Colocar los discos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza estril(o con un aplicador automtico) presionando suavemente sobre cada disco paraasegurar un contacto completo son la superficie del agar.Distribuir los discos uniformemente de modo que estn a una distancia de 15 mmdel borde de la placa y a 25 mm uno del otro (el dimetro de los discos segn lasnormas de la Organizacin Mundial de la Salud debe ser de 6 mm), no debencolocarse ms de 6 discos en una placa.La dificultad de ste mtodo est en las diferentes velocidades de crecimiento paralos diversos microorganismos.El uso de un disco para cada antibitico estandarizado , permite dar el informe de S(sensible), I (intermedio) y R (resistente) Factores que pueden afectar la actividad antimicrobiana in vitro: El pH del medio, ya que algunos antibiticos son ms activos a pH cido(Nitrofurantona), otros a pH alcalino (Aminoglucsidos , Sulfonamidas) Los componentes del medio, en este caso las protenas sricas fijan a laspenicilinas desde 40 % para la Meticilina y 98 % para la Dicloxacilina. Estabilidad de los medicamentos , a la temperatura de la incubadora variosagentes antimicrobianos pierden su actividad. Cuanto ms grande sea el inculo bacteriano, ms baja ser la sensibilidad delmicroorganismo. Cuanto ms tiempo se prolonga la incubacin, mayor es la oportunidad depresentarse las mutantes resistentes , igualmente los microorganismos que crecenrpido y activamente son ms sensibles a la accin de los antibacterianos queaquellos que se encuentran en fase de reposo. Dilucin en tubo Se obtiene un resultado cuantitativo , destacando dos caractersticas importantes: Concentracin mnima inhibitoria (CMI) : es la concentracin mnima deantimicrobiano que inhibe el crecimiento de un microorganismo. Concentracin mnima bactericida (CMB) : es la concentracin que mata a losmicroorganismos.Normalmente la CMI es suficiente para combatir una determinada infeccin, ya quelos mecanismos inmunitarios se encargan de eliminar al microorganismo METODOLOGA Sumergir la torunda en caldo tripticasa de soya con cepa bacteriana , presionarfirme sobre las paredes del tubo y extender uniformemente en la superficie de laplaca de agar Mueller Hinton. Colocar con la ayuda de pinzas, los discos impregnados con diferentes antibiticosobre la superficie del agar. Los discos deben quedar a una distancia de 25 mm entre ellos. Incubar a 37C durante 24 horas

Realizar la lectura, observar y anotar los resultados. Lectura de los discos de sensibilidadEl dimetro de la zona de inhibicin se mide con una regla milimetrada, colocadadebajo de la placas de Petri.El lmite del rea de inhibicin est dado por la inhibicin completa del desarrollo,tal como se puede apreciar a simple vista.Los milmetros de la lectura sernllevados a la tabla correspondiente para traducir su interpretacin en los trminos :Sensible (S), Intermedio (I) ,Resistente (R)