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ndice
Resumen del trabajo.............................................................................................................................2 Introduccin. ........................................................................................................................................3 Protimosina ..................................................................................................................................3 Apoptosis y protimosina ...............................................................................................................5 Procesamiento de protimosina . ....................................................................................................8 bjeti!os. .............................................................................................................................................8 "etodolo#$a de trabajo. .......................................................................................................................% "ateriales.........................................................................................................................................% "&todos.........................................................................................................................................1' Resultados. .........................................................................................................................................1( Procesado proteol$tico de protimosina ........................................................................................1( )itolocali*acin de la protimosina mediante inmuno+luorescencia...........................................1, )onclusiones. .....................................................................................................................................18 -iblio#ra+$a. .......................................................................................................................................18 .ablas y +i#uras. .................................................................................................................................2'
Resumen del trabajo /a protimosina 0Pro.1 es una prote$na pe2ue3a4 ac$dica4 muy conser!ada e!olut$!amente4 de distribucin ubicua en pr5cticamente todos los tejidos de mam$+eros. 6e sabe 2ue intracelularmente est5 relacionada con la proli+eracin celular4 tumor#enesis4 apoptosis y e7tracelularmente con la respuesta inmunitaria4 aun2ue los mecanismos por los cuales act8a no est5n completamente de+inidos. /a apoptosis4 o muerte celular pro#ramada es uno de los procesos implicados en la 9omeostasis de tejidos y r#anos re#ulando la super!i!encia y el n8mero de c&lulas. :s un mecanismo opuesto a la proli+eracin celular. A di+erencia de la necrosis es un proceso re#ulado #en&ticamante y no produce in+lamacin. 6e 9a comprobado 2ue en ciertos tipos de c&lulas epiteliales 9umanas inmortali*adas pro!enientes de un carcinoma de c&r!i7 0l$nea celular ;e/a1 los est$mulos apoptticos producen el procesamiento de la Pro. 2ue consiste en una ruptura proteol$tica 2ue interrumpe la se3al de locali*acin nuclear. :sto propicia 2ue la Pro. una prote$na de locali*acin mayoritariamente nuclear4 2uede e7cluida de este y de los cuerpos apoptticos 2ue se +orman en la apoptosis. :n el presente estudio se 9a in!esti#ado esta rotura en culti!os de c&lulas lin+oides 9umanas inmortali*adas 0l$nea celular <ur=at1 tratadas con di!ersos est$mulos apoptticos4 as$ como la !eri+icacin por microscopia de inmuno+luorescencia de la e7clusin nuclear y de los cuerpos apoptticos de la Pro. en culti!os de c&lulas ;e/a tratados con estaurosporina y radiacin ultra!ioleta 0>?-)1.

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Introduccin. Protimosina /a protimosina 0Pro.1 +ue aislada en 1%8( del timo de rata y en un principio +ue considerada una 9ormona t$mica 1. :s una prote$na pe2ue3a 01245 =@a1 de 1'%-111 amino5cidos en mam$+eros4 con una #ran car#a ne#ati!a de apro7imadamente (' unidades ac$dica de todas las prote$nas eucariotas
3 ( 1 2

4 tiene un punto isoelectrico de 345A siendo la m5s

. )arece de amino5cidos arom5ticos y a*u+rados 5. :s muy poco

inmuno#&nica. 6e 9alla en pr5cticamente todos los tejidos de mam$+eros alcan*ando la mayor concentracin en el timo ,. :s tan abundante como las prote$nas de c9o2ue t&rmico %'=@a y las prote$nas ribosomales :s una prote$na e!olut$!amente muy conser!ada
5 3 4 5 ,

las di+erencias en mam$+eros son m$nimas y con otros

!ertebrados son pe2ue3as como se puede obser!ar en el an5lisis reali*ado con las secuencias de la prote$na de di!ersas especies 0!er apartado de tablas y +i#uras14 lo 2ue parece su#erir una +uncin esencial de la prote$na. 6e 9a encontrado en san#re
B

y en los medios de culti!o celular

pero su locali*acin predominante es

intracelular4 presentando un distribucin mayoritariamente nuclear a donde es transportada de +orma continua potente
2

debido a una se3al de

locali*acin nuclear 06/C1

5

mostrada en la +i#ura 1.

:n el n8cleo en inter+ase

Fig 1: Secuencia de aminocidos de la seal de localizacin nuclear (SLN) de ProT zona de ro!ura "ro!eol#!ica en a"o"!osis$ %da"!ado de &

est5 asociada a la cromatina y a sitios acti!os de transcripcin mientras 2ue en mitosis colocali*a con la tubulina en el 9uso mittico (. :n nin#8n caso se encuentra en el nucleolo 2. :n 9umanos el #en 2ue se traduce se encuentra en el cromosoma 2 y pertenece a una +amilia 2ue incluye adem5s , pseudo#enes. )ontiene 5 e7ones4 ( intrones y !arias se3ales cl5sicas de re#ulacin. 6e traduce en dos mRCA 0iso+orma 1 y 21 por splicin# alternati!o poco usual 5. )arece de estructura secundaria estable 54 ad2uiriendo en disolucin +orma de 9&lice aleatoria. 6e postula 2ue Pro. podr$a ad2uirir su estructura secundaria y terciaria al interaccionar con otras prote$nas4 ad2uiriendo +unciones di!ersas. In vivo est5 +os+orilada en un #rado 2ue depende de la proli+eracin celular. :7iste una =inasa 2ue la +os+orila espec$+icamente4 la isoen*ima m2 de la piru!ato 2uinasa ( lo 2ue parece indicar la importancia de este proceso.
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Regulacin de la expresinD /os bajos ni!eles de mRCA de Pro. en c&lulas 2uiescentes aumentan con la estimulacin por mit#enos o suero
5 8

. 6e desconoce la ruta de se3ali*acin 2ue controla la e7presin de

Pro.. :st5 re#ulada positi!amente por c-"yc4 protoonco#en implicado en di!ersas +ormas de tumor#enesis4 ya 2ue el #en de Pro. presenta una secuencia :-bo7 0)A)E.E1 2ue es diana de c-"yc. /a prote$na promotora del crecimiento :F2 tambi&n re#ula positi!amente la e7presin de Pro. acti!ando un #en testi#o del promotor de Pro.. /a prote$na p53 in9ibidora de tumores4 es un re#ulador ne#ati!o. :l #en Pro. tambi&n responde a estr#enos como el estradiol 1. Funcin biolgica: /a Pro. es abundante en c&lulas en proli+eracin y sobre todo en c&lulas cancerosas. 6e sabe 2ue est5 implicada en !arios procesos celulares principalmente relacionados con la re#ulacin transcripcional4 la proli+eracin celular 0las c&lulas de+icientes en Pro. no se di!iden14 tumor#&nesis4 acti!idad apopttica y modulacin inmunol#ica
1 ( 5

. /os mecanismos por los 2ue act8a no 9an sido

dilucidados completamente. Al#unos autores postulan 2ue esta multi+uncionalidad de Pro. pudiera ser debido al mimetismo relacin entre ellas. Funcin extracelular: 6e 9a encontrado en san#re 0a concentraciones nanomolares1 y en el medio de culti!o celular. :l mecanismo por el cual es secretado no es conocido pero al carecer de se3al de secrecin es improbable 2ue sea el mecanismo tradicional a tra!&s del sistema ret$culo endoplasm5tico-complejo de Eol#i B. Presenta acti!idad inmunomoduladora4 anti!iral4 anti+8n#ica4 anticancer$#ena en !i!o4 antiis2u&mica 5. )omparte muc9as caracter$sticas con la interleu=ina1al+a I/-1 5. Parece ser un potente estimulador del inter+ern tipo I 0IFC1 !$a receptor 0./R1(. :n apoptosis un +ra#mento de Pro. es e7teriori*ado y podr$a ser!ir de marcador de super+icie de los cuerpos apoptticos para ser +a#ocitados %. Funcin intracelular nuclear: /a Pro. est5 implicada en la proli+eracin y di+erenciacin celulares
5 8

ya 2ue presenta 9omolo#$a estructural con !arias prote$nas 2ue no tienen muc9a

mediante los mecanismos 2ue se describen a continuacin de +orma muy resumidaD Acti!a la transcripcin al interaccionar con el represor del receptor de estr#eno 5. Interacciona con prote$nas de replicacin celular 0P)CA4 )d=2 y la ciclina A1 1'4 con el transductor de se3al y acti!ador de la transcripcin 3. :st5 implicada en la remodelacin de la cromatina +acilitando la acti!acin de la transcripcin al interaccionar con la oncoproteina 6:. implicada en la descondensacin de la cromatina4 tambi&n interacciona con la acetiltrans+erasa de 9istonas p3'' y otras prote$nas relacionadas la acetilacin de las 9istonas del oct5mero.
-(-

Interactua con la prote$na de unin a )R:- 0)-P1 potenciando de la transcripcin relaciones con las 9istonas y permite el ensamblado de los nucleosomas 9istones ;34 ;2A4 ;2- y ;( en el n8cleo
13 12

5 , 11

. In vi!ro establece

. In vivo interactua con las

. :st5 implicada en la traslocacin del 6.A.3 0si#nal

transducer and acti!ator o+ transcription 31 al n8cleo 5. .ambi&n parece re#ular la e7presin de #enes protectores del estr&s o7idati!o 1. Funcin intracelular citoplasmtica: Presenta acti!idad antiapopttica impidiendo la +ormacin del apoptosoma 5 1(. 6e une a las prote$nas Re! de ;I?-1 y a la proteica Re7 del !irus tipo I de c&lulas leucemias . 9umanas lo 2ue podr$a constituir un mecanismo anti!$rico 5. Importancia de la protimosina : 6e sabe 2ue en multitud de c5nceres Pro. est5 sobree7presada por lo 2ue su ni!el de e7presin podr$a ser!ir de marcador de pro#nosis4 de potencial de metastasis4 de

super!i!encia del tumor y del ries#o de muerte. .ambi&n se 9a postulado como posible diana terap&utica contra ciertos tipos de c5ncer pues su in9ibicin predispone a las c&lulas a entrar en apoptosis
1 5 8

Apoptosis y protimosina
Aun2ue la e7istencia de un tipo de muerte celular di+erente a la necrosis ya era conocida por los embriolo#os de principios del si#lo GG no ad2uiri rele!ancia 9asta el art$culo seminal de Herr en los a3os ,'
15

. /a apoptosis es un tipo de muerte celular re#ulada

#en&ticamente y per+ectamente or2uestada por un amplio #rupo de prote$nas 2ue interaccionan entre ellas y otros componentes de la c&lula. :n seres pluricelulares las c&lulas re2uieren toda una serie de +actores y est$mulos para mantener su estado 2uiescente4 para di!idirse4 o para di+erenciarse4 cuando dejan de recibirlos mueren. Podr$a decirse 2ue el estado natural de las c&lulas en seres pluricelulares es la muerte celular 0+i#. 21 1,. /a apoptosis
Fig ': Posi(les des!inos celulares$ %da"a!ado de 1&

presenta 3 +asesD de decisin4 de compromiso y de ejecucin. :n la +ase de decisin4 en la cual no se aprecian cambios mor+ol#icos4 la in+ormacin interna y e7terna4 las se3ales pro y anti-apoptticas se

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procesan e inte#ran determinando la muerte o super!i!encia celular. :n la +ase de compromiso la decisin de la muerte celular ya est5 tomada. :s una +ase contro!ertida pues se desconocen e7actamente 2ue mol&culas de la ruta de se3ali*acin inter!ienen. /a +ase de ejecucin es el punto en 2ue se puede obser!ar los cambios mor+ol#icos asociados con la apoptosis. /as c&lulas 2ue entran en apoptosis presentan caracter$sticas mor+ol#icas muy determinadasD contraccin celular4 +ra#mentacin del A@C cromosmico4 condensacin de la cromatina 2ue puede aparecer como un anillo conc&ntrico a la membrana nuclear4 p&rdida de la asimetr$a4 indentacin y IburbujeoJ de la membrana citoplasm5tica4 e7teriori*acin de prote$nas internas de la membrana4 in vi!ro +ormacin de cuerpos apoptticos 2ue son !es$culas rodeadas de membrana 2ue contiene parte del citoplasma y or#5nulos. /a e7istencia de estos cuerpos apoptticos i n vivo no es tan clara pues las c&lulas adyacentes y macr+a#os se encar#ar$an de +a#ocitarlas. :7isten dos !$as por las cuales se inicia la apoptosis. >na !e* iniciada comien*a una cascada de acti!acin de caspasas 0cistein aspartasas1 y otras prote$nas. /as caspasas son proteasas especi+icas de este proceso4 e7isten 2 tipos las IindicadorasJ 2ue re#ulan la decisin de entrar o no en apoptosis y las IejecutorasJ 2ue son las 2ue se encar#an de la de#radacin y rotura proteol$tica de componentes celulares. /as !$as 0+i#.31 son la e7tr$nseca o de receptores de muerte y la intr$nseca o mitocondrial. :n la primera receptores )@%54 la prote$na Fas o el receptor del +actor de necrosis tumoral reciben se3ales apoptticas e7ternas y a tra!&s de mol&culas adaptadoras como la FA@@ acti!an la caspasa 8 la cual a su !e* acti!ar5 otra serie de caspasas. /a !$a intr$nseca responde a se3ales e7ternas o est$mulos internos como da3os en el A@C o la interrupcin de la cadena de transporte electrnico. :n esta !$a se libera al citoplasma citocromo c desde la mitocondria4 el cual se asocia al apa+-1 0+actor 1 de acti!acin de proteasas1 y a la pro-caspasa % +ormando el apoptosoma. :l apoptosoma4 corta la pro-caspasa % a caspasa % acti!5ndola4 esta su !e* acti!a la caspasas 34,4B inici5ndose una cascada de acti!aciones y proteol$sis 2ue de#rada muc9os substratos ocasionando la muerte celular. :l inicio de este proceso 0la liberacin del citocromo c1 est5 estrec9amente re#ulado por una serie de prote$nas de la +amilia -cl-2. /a accin de las prote$nas IAP4 prote$nas in9ibidoras de la apoptosis es anta#oni*ada por prote$nas mitocondriales como 6macK@iablo y miK;trA2 despu&s de la liberacin de

estas al citoplasma. /a Pro. est5 implicada en la apoptosis mediante la in9ibicin de la +ormacin del apoptosoma 1( 1B aun2ue el mecanismo no est5 claro. tro mecanismo por el 2ue Pro. podr$a promo!er la

super!i!encia celular es a tra!&s de la ruta antiapopttica de -cl-2 18. .ambi&n Pro. podr$a empe*ar una
-,-

Fig ): %"o"!osis ProT : v#as de ac!ivacin $ %da"!ado de * 1&

ruta antiapoptotica asoci5ndose a la prote$na antiapopttica 6.A.3 2ue implicar$a la acti!acin transcripcional de la prote$na -cl-7l. tro mecanismo antiapopttico podr$a ser a tra!&s de la interaccin

con )-Ps4 estimulando la transcripcin del +actor CF-L-4 el cual puede inducir la e7presin de prote$nas antiapoptticas como .RAF4 IAPs o prote$nas de la +amilia -cl-2 (. 6e 9a descubierto 2ue la Pro. +orma un complejo 9eterodim&rico estable con p84 otra pe2ue3a prote$na 2ue tambi&n carece de estructura secundaria de+inida. Parece ser 2ue interaccionan entre ellas estabili*5ndose de +orma mutua +ormando un 9eterod$mero con una estructura secundaria y terciaria 2ue permitir$a la re#ulacin de la apoptosis blo2ueando la acti!acin de la caspasa %
1 1B 1( 5 1%

. 6e 9a demostrado 2ue en c&lulas embrionarias 9umanas de

ri3n 0linea celular 2%3.1 es necesario 2ue la Pro. est& +os+orilada para 2ue pueda lle!ar a cabo este proceso 1B.

-B-

tro mecanismo 2ue parece implicado en la in9ibicin de la apoptosis es el relacionado con la prote$na ;uR la cual se asocia con el mRCA de la Pro. y lo prote#e de la de#radacin en el citoplasma4 diri#i&ndolo a los ribosomas y potenciando su traduccin 2'. /a prote$na ;uR es una prote$na de unin a RCA 0R-P14 perteneciente a la +amilia ;uK:/A?4 2ue potencia #enes de respuesta al estr&s. Para 2ue Pro. realice estas +unciones antiapoptticas debe estar +os+orilada 21 Procesamiento de protimosina . :n el a3o 2''' !arios #rupos de in!esti#adores obser!aron la +ra#mentacin de la Pro. en c&lulas ;e/a apoptticas inducida por !arios est$mulos
, 22

. /a ruptura se produce en el e7tremo carbo7ilo terminal en el

moti!o @@?@%% dando lu#ar a dos +ra#mentos de %% y 1' amino5cidos respecti!amente. In vi!ro el procesamiento se produce por las caspasas 3 y B y es un e!ento temprano ,. /a apoptosis interrumpe la se3al de locali*acin nuclear 06/C1 impidiendo 2ue la Pro. se acumule en el n8cleo y 2ue cumpla las +unciones 2ue desempe3a en este ,. /a Pro. truncada 0tPro.1 parece 2ue es e7teriori*ada y podr$a ser!ir de marcador de super+icie espec$+ico de las c&lulas apoptticas4 lo 2ue permitir$a a macr+a#os y c&lulas adyacentes reconocerlas como tal y proceder a su +a#ocitosis %. :stos resultados parecen indicar 2ue es necesario 2ue la Pro. sea eliminada o inacti!ada para 2ue una c&lula pase del estado de proli+eracin al de apoptosis. Objetivos. :l objeti!o del si#uiente trabajo es estudiar el procesamiento de la Pro. en su e7tremo ) terminal en l$neas celulares sometidas a apoptosis inducida por distintos est$mulosD estaurosporina4 actinomicina @ y e7posicin a radiacin ultra!ioleta 0>?-)1. ;a sido probado en c&lulas ;e/a en reiteradas ocasiones
, 22

4 se

pretende comprobar 2ue este procesamiento se produce en c&lulas <ur=at. )omo consecuencia de esta rotura proteol$tica se interrumpe la se3al de locali*acin nuclear4 por lo 2ue la Pro. mayoritariamente de locali*acin nuclear es e7cluida del n8cleo y aparece en el citoplasma. 6e 9a 2uerido comprobar esta e7clusin mediante t&cnicas de microscop$a de inmuno+luorescencia en la linea celular ;e/a. :l trabajo se en#loba dentro de la l$nea de in!esti#acin 2ue se !iene reali*ando en el departamento de bio2u$mica y biolo#$a molecular sobre la di!ersos aspectos de la Pro..

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Metodologa de trabajo. Materiales ultivos celulares: 6e utili*aron dos l$neas celulares establesD ;e/a ad9erentes4 procedente de c&lulas epiteliales de un carcinoma de c&r!i7 9umano y <ur=at en suspensin4 procedentes de lin+ocitos . 9umanos de una leucemia lin+oide4 ambas disponibles en el laboratorio de bio2u$mica y biolo#$a molecular de la Facultad de -iolo#$a de la >6). Medios de cultivo: Para el culti!o en monocapa de la l$nea celular ;e/a se utili* medio esencial m$nimo de :a#le modi+icado por @ulbecco 0@":"1 p; B4(. Para el crecimiento en suspensin de las c&lulas <ur=at se emple medio RP"I 1,(' p; B4(. Ambos medios estaban suplementados con '42M de Ca;) suero +etal bo!ino 0F-61 y antibiticos 01'' >Kml de penicilina y 1'' N#Kml de estreptomicina1. !isoluciones " tamponesD #$%D '41" Ca)l4 2 m" H)l4 8 m" Ca 2P
( 3

4 1'M de

y 1 m" H;2P

. &$%'&())*D

2' m" .ris-;)l p; B4,A 13B m" Ca)l y '42M .Oeen-2'. &ampn de electro+oresis: 6@6KPAE: 1G 0.ris-#licina-6@61D 25 m" .ris-;)l p; 843A 1%2 m" #licina y '41M 6@6. &ampn de trans+erencia de la #ro&D 2'm" Acetona4 p; (45. &ampn de lisis celularD .ris-;)l 5' m" p; B4( Ca)l 15' m"4 "#)l 145 "m4 C CI@:. P-(' '45M4 a3adidos antes del uso :E.A 5 m"4 :@.A 1 m" 4 @.. 1m"4 P"6F '45 m"4 Pepst 5P#Kml4 /eup 5P#Kml4 CaF 1' m". &ampon de carga: !isolucin de activacin de la membrana: @i!inil sul+ona 014'3 ml14 dimetil+ormamida 02 ml1 y '45" Ca;)
3

KCa2)

p; 1' 01B ml1.

Reactivos: %I,M-D @"6 4 estaurosporinaD disuelta a una concentracin patrn 1 m" en @"6 4 Actinomicina @4 @i!inilsul+ona al %BM4 @imetil+ormamida4 @API. albioc.emD "oOiol (-88.

MI//I#OR)D "embranas de poli+luoruro de !inilideno 0P?@F1 de '4(5 Nm. $IO'R-!D .ritn G-1''. Merc0D 6eroalb8mina bo!ina 0-6A1 $io(.itta0erD F-64 penicilina4 estreptomicina4 tripsina -:@.A -nticuerpos inmuno+luorescencia " microscopa ptica : primarios disueltos en -6A al 3M en P-6 %uero -nti'*'terminal'#ro& 01-21aa1 0conejo1 Ceo6ystem4 dilucin 1D2'''. -nti'tubulina 0ratn1 06i#ma Q .-%'2,14 dilucin 1D2'''. 6ecundariosD 0manejos siempre en oscuridad1 disueltos en -6A al 3M en P-6 1D2''' -lexa Fluor 122 cabra anti-conejo I#E 0In!itro#en QA11''814 0!erde1 -lexa Fluor 341 cabra anti-raton I#E 0In!itro#en QA11''514 0rojo1 -nticuerpos (estern'blot : 1R1 6uero Anti-C.-Pro. conejo dD 1K8'' system 2R1 Anti-conejo-;RP 0:)/ Sestern blottin# system dD 1K5''' E: 9ealt9care1
-%-

Mtodos
/os m&todos utili*ados en este trabajo est5n basado en los protocolos utili*ados en el departamento y los libros 23 2( 25 2,. Para este trabajo en concreto se di!idi el trabajo e7perimental en !arias +ases D 11 )ulti!o y mantenimiento de las l$neas celulares. 21 Induccin de la apoptosis por radiacin ultra!ioleta 2 y , 9oras4 por estaurosporina 2 y ( 9oras de incubacin4 por actinomicina @ 2 y ( 9oras de incubacin. 31 /isado de los culti!os y determinacin de la cantidad de prote$na. (1 :lucin de las prote$nas por electro+oresis 6@6Pa#e. 51 .rans+erencia a membrana de nitrocelulosa 0acti!ada1 0Oestern blott1 y re!elado de la membrana por 2uimiolumiscencia. ,1 Inmuno+luorescencia y obser!acin microscpica.

56 ultivos celulares: /a manipulacin se reali* siempre en condiciones est&riles en el interior de una

cabina de +lujo laminar !ertical .:/6.AR -io6tar Plus pre!iamente esterili*ada por radiacin ultra!ioleta durante (' minutos. )uando los culti!os no eran manipulados permanecieron en el interior de un incubador ;eraeus a 3BR)4 en atms+era 9umidi+icada y con 5M de )
2

7lulas 8ur0at: :l culti!o de se inici a partir de una al$cuota de 5ml de otro culti!o T1' , celKmlU al 2ue se le a3adieron 5ml de medio RP"I 1,(' 7lulas 9e/a: /os culti!os se iniciaron a partir de al$cuotas de 1 ml con#eladas en nitr#eno l$2uido -1%548R) conteniendo apro7imadamente 1'Bc&lulas. :stas estaban inmersas en un medio crioprotector compuesto por %'M de F-6 y 1'M de @"6 . /as al$cuotas se descon#elaron en un ba3o a 3BR)4 centri+u#aron a %'' 7 # durante 5 minutos4 se les elimin el medio crioprotector y resuspendi con una densidad 1', celKml en @":" suplementado /os culti!os de ;e/a se mantu!ieron en +rascos de 25 cm 24 donde se +orm una monocapa ad9erente de c&lulas. :n cuanto estas ad2uirieron un car5cter semi-con+luente 0,'-B'M1 se tripsini*aron4 p ara ello4 se elimin el medio del +rasco de culti!o y se a3adi sobre las monocapa 3 ml de solucin '425M tripsina:@.A durante 3 minutos. :l resultado +ue centri+u#ado 0%'' 7 # 3 minutos1. 6e retiro el sobrenadante y el pellet se resuspendi en un !olumen de 1'ml de medio @":". /as c&lulas resuspendidas se repartieron en nue!os +rascos con 1'ml de medio con una densidad apro7imada de 1', c&lulasKml. /as c&lulas <ur=at +ueron culti!adas en +rascos de 25ml4 dobl5ndose el n8mero de c&lulas cada 2 d$as apro7imadamente4 proli+erando 9asta alcan*ar una densidad apro7imada de 1' , c&lulasKml. :n ese momento
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se dobl el medio. :n cuanto se supero la capacidad del +rasco se di!idi el culti!o en dos +rascos. Recuento del n:mero de c7lulas " viabilidad: A una al$cuota de la muestra 02' Nl1 se le a3ado otra al$cuota 02' Nl1 de solucin '4(M a*ul de tripan. :sta disolucin se deposit en la c5mara de recuento Ceubauer 0?V1mm31 donde se contaron las c&lulas !i!as4 de contorno a*ul 0el tripan no penetr en el citoplasma1 y las muertas4 a*uladas 0el tripan si +ue capa* de de penetrar en el citoplasma debido a la +alta de inte#ridad de la membrana1. :l n8mero obtenido +ue multiplicado por 2 y por 1'''' para obtener el n8mero de c&lulas por ml.

;6 Induccin de la apoptosis: /a induccin apopttica de culti!os de celulares se reali* mediante

di!ersos est$mulos. @ependiendo del culti!o y del destino +inal de las c&lulas 0lisado para Oesternblottrans+erencia o inmuno+luorescencia1 el procedimiento +ue li#eramente distinto. /os e7perimentos se reali*aron en placas de 2( pocillos por duplicado para cada una de las condiciones e7perimentales. Incubacin con estaurosporina <8ur0at " 9e/a6: Para estudiar el procesamiento en las c&lulas <ur=at se a3adi a cada pocillo al$cuotas de 2''Nl del culti!o celular y se complet 9asta 1ml con medio 02 7 1' , c&lulasKml1. Para el estudio de la citolocali*acin en c&lulas ;e/a en cada pocillo se deposit un un porta circular y se dej 2ue las c&lulas +ormara un tapi* semicon+luente sobre el porta. Al medio de culti!o celular RP"I 0<ur=at1 y @":" 0;e/a1 se a3adi estaurosporina 01m" en @"6 1 a una concentracin +inal de 1 N" durante dos tiempos de incubacinD dos y cuatro 9oras. A las c&lulas control se les a3adi 2' Nl @"6 e2ui!alente al a3adido con la estaurosporina. Para la incubacin se mantu!ieron a 3BR) y 5M )
2

Incubacin con actinomicina ! <8ur0at6: :l procedimiento +ue similar al descrito para la incubacin con estaurosporinaD al medio de culti!o celular RP"I se a3adi actinomicina @ 01 m#Kml en @"6 1 a una concentracin +inal de '45 N#Kml durante dos tiempos de incubacinD tres y cinco 9oras. A las c&lulas control se les a3adi 2'Nl @"6 mantu!ieron a 3BR) y 5M )
2

e2ui!alente al a3adido con la estaurosporina. Para la incubacin se

Irradiacin con ultravioleta <8ur0at " 9e/a6: :l culti!o de c&lulas <ur=at se centri+u#o de +orma sua!e4 %'' 7 # 3 minutos4 el pellet +ue resuspendido en P-6 est&ril para e!itar 2ue el medio absorbiera la lu* ultra!ioleta. 6e deposit 2'' Nl 01425 7 1' , c&lulas1 en cada uno de los pocillos. :stas +ueron irradiadas ' 0control14 15 y 3' se#undos con lu* ultra!ioleta >?-) 0 ;31nm1. .ras la irradiacin se diluyo el P-6 a3adiendo medio RP"I 08'' Nl1 y se dej incubando 2 y , 9oras a 3BR) y 5M )
- 11 2

. /as c&lulas ;e/a se

9icieron crecer en porta objetos circulares 9asta la semicon+luencia. 6e elimin el medio y se irradiaron durante 15 y 3' se#undos4 se les a3adi medio 0@":"1 y se incubaron 2 y , 9oras a 3BR) y 5M )
2

=6 #reparacin de lisados de c7lulas 8ur0at apoptticas: .ras la induccin apopttica del

culti!o4 las c&lulas <ur=at se centri+u#aron a ,'' 7 # durante 5 minutos4 el pellet con las c&lulas se resuspendi en 1'' Nl 0Irradiacin con >?4 incubacion 2 9oras1 y en 5' Nl 0si#uientes e7perimentos1 de tampn de lisis. 6e someti la muestra a una 9omo#enei*acin y burbujeo con la pipeta para romper las membranas celulares4 posteriormente se le aplicaron 3 ciclos de descon#elacin-con#elacin en nitr#eno l$2uido. Finalmente4 el lisado +ue micro+u#ado a 1(''' 7 # durante 3' minutos a (R). 6e reco#ieron los sobrenadantes y su concentracin proteica +ue determinada por el m&todo -rad+ord. !eterminacin prot7ica por el m7todo colorim7trico de $rad+ord : /a cantidad de prote$na +ue

determina mediante el m&todo de -rad+ord

23

en al$cuotas de 1Nl y 2Nl de muestra. 6e eli#ieron

al$cuotas pe2ue3as4 a consta de disminuir la precisin de la medida4 por 2ue la cantidad de prote$na total de los lisados no era muy alta.

16 %eparacin por %!%'#-,): /a electro+oresis 6@6-PAE: se lle! a cabo si#uiendo el

procedimiento de 23. /a concentracin de poliacrilamida empleada para el #el concentrador +ue del (M y para el #el separador del 15M. A las al$cuotas 02' N#1 de los di+erentes e7tractos se les a3adi 5 Nl de tampn de muestra 5G y pironina al 1M4 y se completaron con ; 2 destilada 9asta un !olumen +inal de 25

Nl. Fueron calentadas a 1''R) durante 5 minutos y micro+u#adas. /as muestras se corrieron a un amperaje constante de 35 mA con el !oltaje limitado a 2'' ? 9asta la salida del +rente de pironina.

36 &rans+erencia a membrana <(estern blot6 " revelado: /a trans+erencia proteica se reali* a

membranas de nitrocelulosa de '422 Nm acti!adas para la Pro. 2B. /a acti!acin se lle! a cabo mediante la incubacin de la membrana en una solucin de acti!acin durante 1 9 a temperatura ambiente y en a#itacin sua!eA se#uidamente4 +ue incubada 3' minutos en 1M trietilamina y +inalmente4 tratada con 1M #lutaralde9ido en '45" Ca;)
3

KCa2)

p; 1' durante 15 minutos. .ras el proceso4 las membranas se

la!aron en a#ua miliW a temperatura ambiente durante 2( 9. /as prote$nas se trans+irieron durante B 9oras a (5 mA constantes y 13 ? a (R)4 en tampn acetato sdico 2' m" p; (.5. /a inmunodeteccin se reali* se#8n los protocolos est5ndar4 utili*ando .-6-'42M .Oeen p; B4, para los la!ados de las membranas y

- 12 -

lec9e en pol!o disuelta al 5M en .-6-'42M .Oeen para los blo2ueos e incubaciones con los anticuerpos espec$+icos. 6e utili* como anticuerpo primario el suero anti-C.-Pro.A el anticuerpo secundario lle!aba conju#ada la en*ima pero7idasa 0;RP1. :l re!elado de las membranas se reali* utili*ando el =it :)/ 0Sestern blottin# analisis system4 E: 9ealt9care1 me*clando ('' Nl de los dos componentes 0A y -1 y dej5ndolo actuar sobre el substrato 1 minuto. Posteriormente se e7puso la membrana 14 34 5 minutos y en al#una ocasin 9asta 15 minutos a una placa +oto#r5+ica4 2ue posteriormente +ue re!elada. .ras la trans+erencia el #el se ti3o con A*ul )oomassie.

>6 Inmuno+luorescencia " microscopa ptica: Para reali*ar los ensayos de inmuno+luorescencia
en c&lulas ;e/a se sembraron estas en cubreobjetos circulares esterili*ados4 el protocolo est5 descrito en 2(. :ste consisti enD una !e* +ormado un tapi* semicon+luente en los portas 0apro7imadamente 2( 9oras tras la siembra1 se procedi a la!ar las c&lulas con P-6 03'' NlKpocillo1 e inmediatamente +ijarlas con (M para+ormalde9ido en P-6 03'' NlKpocillo1 durante 15 minutos a temperatura ambiente. .ras un la!ado con P-64 se procedi a la permeabili*acin de las c&lulas +ijadas con '42M .ritn G-1'' en P-6 03'' NlKpocillo1 durante 2 minutos. A continuacin4 +ueron la!adas 3 !eces con P-6 y blo2ueadas con 3M -6A en P-6 03'' NlKpocillo1 durante 1 9ora a temperatura ambiente. @espu&s de 1 la!ado con P-6 se lle! a cabo la incubacin con los anticuerpos espec$+icosD las c&lulas se mantu!ieron con el anticuerpo primario diluido con 3M -6A en P-6 03'' NlKpocillo1 durante 1 9ora a temperatura ambiente4 y con el anticuerpo secundario diluido con 3M -6A en P-6 03'' NlKpocillo1 durante 35 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. /os n8cleos celulares se ti3eron con colorante @API4 diluido 0'42 N#Kml1 en la me*cla de incubacin de los anticuerpos secundarios. :l protocolo +inali* con 2 la!ados con P-6. /os anticuerpos primarios utili*ados +ueron suero Anti-C. Pro. 0conejo1 0dD 1K2'''1 y Anti-tubulina 0ratn1 0dD 1K2'''1. /os anticuerpos secundarios de cabra anti-conejo 0reconoce los anticuerpos anti-C. Pro. puri+icado1 y anti-ratn 0reconoce el anticuerpo anti-tubulina1 est5n marcados con 2 +luorocromos di+erentesD Ale7a (88 0emisin en !erde1 y Ale7a 5%( 0emisin en rojo1 respecti!amente. /os cubreobjetos circulares con las c&lulas +ijadas y te3idas se retiraron de los pocillos de la placa 0eliminando los restos de P-61 y se colocaron en #rupos de 3 sobre portaobjetos rectan#ulares. A cada cubre se le a3adi 1 #ota 0B Nl1 de "oOiol (-88. Finalmente se coloc 1 cubreobjetos rectan#ular sobre los circulares montados en el portaobjetos y se inmo!ili* en los e7tremos para iniciar el an5lisis por
- 13 -

microscop$a. Para la obser!acin microscpica de +luorescencia se utili* un microscopio Ci=on @iap9ot 3'' con +iltros rojo y !erde y la captura de im5#enes se reali* con una c5mara Ci=on @B' con s+tOare @ar=table. #rocesado digital: :l procesado di#ital se reali* con el s+Oare EI"P. :ste consisti en el +iltrado di#ital de la se3al a*ul 0@API1 en las im5#enes tomadas sin +iltro y la superposicin con un 5'M de transparencia de las im5#enes tomadas con el +iltro rojo 0anti-tubulina1 y las tomadas con el +iltro !erde 0anti-Pro.1.

Resultados.
Procesado proteoltico de protimosina 6e anali*aron tres series de muestras de los lisados de c&lulas <ur=at en apoptosis sometidas a di!ersos est$mulos. :n cada serie se reali*aron dos #eles de electro+oresis 06@6-PAE:1 y se trans+irieron a sendas
)*+),-M)N./ 102 N Clulas [Clulas] millones/ml .iem1o de +rote5na +rote5na Muestra in'uba'i2n Viabilidad medida .otal 'ar7ada 3%oras4 67/ml 3#!6l4 7el ml vivas muertas vivas muertas total 1,17 # ,$$ 17,14 Control 64 7 1,2 !,14 1,42 "!,14 1,44 72,17 1$, 6 Control 61 1! 1,22 !,2 1,42 #,"2 1,16 # ,17 17,1" 4% 71 14 1,42 !,2 1,7 $,#$ 1,26 6$ 1#, 7 4% 2$ 22 !,46 !,44 !," #1,11 1,2# 62,67 1#,"6 2% 66 1 1,$2 !,$6 1,6 7 ,#7 2,$" 11",67 ,$6 2% 4# 11 !," !,22 1,12 !,$6 1,26 6$ 1#, 7 Control 1!# " 2,1 !,1 2,2 "2,11 1,$4 66, 14,"7 Control 1#! 1! $ !,2 $,2 "$,7# 1,1$ #6,$$ 17,7# #% $7 2 !,74 !,!4 !,7 "4, 7 1,#6 77, $ 12, # #% 122 1! 2,44 !,2 2,64 "2,42 1,72 6,17 11,61 $% 14 11 2,"6 !,22 $,1 "$,! 1,76 ,17 11,$4 $% 14$ 1! 2, 6 !,2 $,!6 "$,46 Muestra

*1 2 $ Estaurosporina *4 # *6 7 * " &'tinomi'ina ( *1! 11 *12

Ta(la 1 : +ia(ilidad, "ro!e#na medida "or el es"ec!ro-o!me!ro, "ro!e#na !o!al

Muestra N Clulas

can!idad de mues!ra cargada en los geles$ Las mues!ras marcadas con un as!erisco son de la serie .ue se consigui !rans-erir, revelar son las re-erenciadas en resul!ados

)*+),-M)N./ $0 4

-rradia'i2n 3se7undos4

[Clulas] millones/ml

9V:C 2 %oras -n'uba'i2n

9V:C 6 %oras -n'uba'i2n

*1 !88 3'ontrol4 2 !88 3'ontrol4 $ 1#88 *4 1#88 # $!88 *6 $!88 7 !88 3'ontrol4 !88 3'ontrol4 " 1#88 *1! 1#88 *11 $!88 12 $!88

vivas muertas vivas muertas 26 2 !,#2 !,!4 1$ 1,76 !,26 7" 2! 1,# !,4 #7 14 1,14 !,2 7# 6 1,# !,12 121 24 2,42 !,4 67 " 1,$4 !,1 76 $ 1,#2 !,!6 #2 4 1,!4 !,! 76 4 1,#2 !,! "2 $ 1, 4 !,!6 ! 4 1,6 !,!

+rote5na +rote5na Muestra Viabilidad medida .otal 'ar7ada 67/ml 3#!6l4 7el ml total "2, 6 !,"6 47,7# 2!,"4 !,#6 7,1$ 1,27 6$,# 1#,7# 2,!2 7", !,62 $1,17 $2,!" 1," !,2 !,74 $6, 27,12 1,42 "2,#" 1,!" #4,6$ 1 ,$1 1,62 $,4# 1,17 # ,$ 17,1$ 2," 1,4# 72,67 1$,76 1,#2 ,16 1,# 7# 1$,$$ 1,# "6,2 1,61 !,$$ 12,4# 1,12 "2, 6 1,7 # 11,76 1,6 "# 1,67 $,$$ 12 1," "6, 4 1,42 71 14,! 1,6 "#,24

Ta(la ': +ia(ilidad, "ro!e#na medida "or el es"ec!ro-o!me!ro, "ro!e#na !o!al can!idad de mues!ra cargada en los geles$ Las mues!ras marcadas con un as!erisco son la serie .ue se consigui !rans-erir, revelar son las re-erenciadas en resul!ados - 1( -

membranas de nitrocelulosa acti!ada. 6olo en una de las series4 la +ormada por las muestras marcadas con asterisco 0tablas 1 y 21 se consi#ui trans+erir la Pro. a la membrana y re!elarla. Probablemente debido a lo delicado del proceso de acti!acin de la membrana. )ada una de las series cont con un patrn de Pro.4 un patrn de peso molecular4 un par de controles por tratamiento y los lisados de c&lulas <ur=at en apoptosis sometidas a di!ersos est$mulos 0por duplicado1. -poptosis inducida por estaurosporina: :n la ima#en de la +i#ura ( se obser!a la rotura

proteol$tica de la Pro. compatible procesado con descrito el por

Fig *: Procesamien!o de ProT de c/lulas 0ur1a! en a"o"!osis inducida "or es!auros"orina$ Imagen o(!enida "or inmunode!eccin de la mem(rana ac!ivada$

otros autores ,. @e +orma

co9erente4 en la muestra ( sometida a ( 9oras de incubacin se obser!a un procesamiento muc9o mayor 2ue en la muestra ,4 de 2 9oras de incubacin. /a +i#ura 5 corresponde al #el de electro+oresis a partir del cual se trans+irieron las prote$nas a la membrana acti!ada. :n &l se puede comprobar 2ue la cantidad de prote$na en las muestras es muy similar4 lo 2ue e7cluye 2ue
Fig 2: 3el de elec!ro-oresis (S4S5P%36) de c/lulas 7urca! en a"o"!osis inducida "or es!auros"orina !eido con azul coomassie$ PP8 9 "a!rn de "eso molecular: P$ P 9 "a!rn de ProT

la baja cantidad de Pro. en la muestra ( de la membrana se deba a una insu+iciente car#a de prote$na y re+uer*a la 9iptesis del procesamiento. Puede obser!arse como en el carril correspondiente al patrn de Pro. no 9ay banda ya 2ue toda la prote$na se 9a trans+erido a la membrana. -poptosis inducida por actinomicina: :n la ima#en de la +i#ura , tambi&n se obser!a el procesamiento de Pro. inducida en este caso por
Fig &: Procesamien!o ProT de c/lulas 0ur1a! en a"o"!osis inducida "or ac!inomicina 4$ Imagen o(!enida "or inmunode!eccin de la mem(rana ac!ivada$

actinomicina @. Al i#ual 2ue en el caso de la estaurosporina el procesamiento en la muestra 1' con una incubacin de 5 9oras es muc9o m5s marcado 2ue en la muestra 12 con incubacin de 39. :l control de la la actinomicina @ 0muestra 81 no es muy +uerte por 2ue no se car# su+iciente cantidad de prote$na 0tal como
- 15 -

se deduce del #el te3ido con A*ul )oomassie4 no mostrado1. -poptosis inducida por radiacin ultravioleta ?@' :n la +i#ura B no se obser!an +ra#mentos del procesamiento de la Pro.. :n e7perimentos similares 9ec9os en el laboratorio 0datos no mostrados1 se obser!a 2ue
Fig ;: Procesamien!o de ProT de c/lulas 0ur1a! en a"o"!osis inducida "or radiacin <+5=$ Imagen o(!enida "or inmunode!eccin de la mem(rana ac!ivada$

disminuye la banda de Pro.4 sin aparecer la de tPro.. :sto puede ser debido a un postprocesamiento de tPro.4 2ue pierde el e7tremo C terminal o se +ra#menta en tro*os muy pe2ue3os. Al i#ual 2ue en el caso de la muestra 8 de la apoptosis inducida por actinomicina @ las bandas de las muestras 1 y ( son m5s d&biles debido a una car#a insu+iciente de prote$na 0tal como se deduce del #el te3ido con A*ul )oomassie4 no mostrado1 Citolocalizacin de la protimosina mediante inmunofluorescencia /os resultados se muestran en la +i#ura 8. 7lulas controlD "uestra de +orma muy clara la distribucin mayoritariamente nuclear de Pro.4 las im5#enes superpuestas demuestran 2ue la Pro. ocupa pr5cticamente el mismo 5rea 2ue el @CA te3ido con @API4 puede obser!arse una pe2ue3a cantidad de la Pro. en el citoplasma celular y sobre todo en las 5reas perinucleares. )staurosporina ;. de incubacinD 6e obser!a muy claramente como Pro. ocupa todo el citoplasma de la c&lula se3alada con la +lec9a. 6e puede obser!ar en esta ima#en4 como las c&lulas ;e/a al encontrarse en apoptosis 9an perdido su mor+olo#$a ad9erente y el n8cleo est5 completamente +ra#mentado. )omo el tratamiento no se 9a reali*ado sobre c&lulas s$ncronas puede obser!arse c&lulas donde la distribucin de Pro. es nuclear probablemente por 2ue se encuentran en un estado apopttico no tan a!an*ado. )staurosporina 1. de incubacinD :n estas c&lulas el #rado de apoptosis es mayor4 se puede obser!ar *onas circulares muy marcadas 2ue corresponden a los restos del n8cleo4 donde la e7clusin de Pro. es casi total. /a distribucin de Pro. si#ue con bastante precisin el contorno citoplasm5tico marcado por el

- 1, -

Fig >: Localizacin celular de la ProT median!e microsco"#a de inmuno-luorescencia en c/lulas ?eLa a"o"!!icas some!idas a varios es!#mulos$ Las -lec@as (lancas corres"onden a una clara localizacin ci!o"lasm!ica de ProT (imgenes c) como se "uede o(servar "or com"aracin con las imgenes a (an!i5!u(ulina) .ue marcan el ci!o"lasma con las !eidas con 4%PI (imgenes () .ue marcan el nAcleo$ Las -lec@as azules "e.ueas indican unos "un!os ms (rillan!es en las c/lulas irradiadas con <+5= , lo .ue "odr#a cons!i!uir una acumulacin de la ProT en "un!os nucleares (Nuclear do!s)$ %n!icuer"os: a) an!i5!u(ulina (ro7o) () 4%PI (azul) c) an!i5N!5ProT (verde) d) su"er"osicin$

- 1B -

anticuerpo antitubulina. Irradiacin ultravioleta <?@' 6 ;.D :n esta ima#en se obser!a una apoptosis muy incipiente4 la c&lula aun conser!a su mor+olo#$a ad9erente y el n8cleo est5 bastante entero4 pero ya se puede obser!ar el comien*o de una distribucin citoplasm5tica de la Pro.. Pueden obser!arse unos puntos brillantes en la ima#en c 2ue podr$an corresponder con la acumulacin de la Pro. en puntos nucleares 0Cuclear dots1. Irradiacin ultravioleta <?@' 6 >.: 6e obser!an claramente los cuerpos apoptticos4 si#no de 2ue un estad$o a!an*ado de la apoptosis. /a distribucin de Pro. es completamente citoplasm5tica. Al i#ual 2ue en las c&lulas irradiadas con >?-) e incubadas 2 9oras se obser!an puntos brillantes en el marcaje anti-C. Pro.4 aun2ue un poco menos marcados.

onclusiones.
A la !ista de los resultados obtenidos en este trabajo y otros e7istentes en el departamento 0datos no publicados1 se puede a+irmar 2ue la Pro. su+re4 en c&lulas <ur=at4 un procesamiento proteol$tico compatible con el obser!ado pre!iamente
, 22

. :n el presente trabajo no se 9a conse#uido obser!ar el

procesamiento en c&lulas <ur=at cuando el est$mulo apopttico es radiacin ultra!ioleta4 procesamiento 2ue si se 9a obser!ado en c&lulas ;ela sometidas a las mismas condiciones 0e7perimentos reali*ados en el departamento4 datos no publicados1. :n ;e/a este procesamiento se puede deducir de la sublocali*acin celular 2ue se obser!a en las im5#enes de inmuno+luorescencia. 6i este comportamiento +rente a la radiacin ultra!ioleta en c&lulas <ur=at es un mecanismo +isiol#ico de este tipo celular se deber5 determinar con nue!os e7perimentos ya 2ue el procesamiento de la Pro. parece no ser uni!ersal4 al no 9aberse obser!ado en en c&lulas CI;3.3 tal como se desprende en el art$culo
22

. tra l$nea de in!esti#acin podr$a consistir en

in!esti#ar si los Ipuntos brillantesJ obser!ados en las im5#enes de inmuno+luorescencia anti-C. Pro. en c&lulas apoptticas tratadas con radiacin ultra!ioleta >?-) corresponde a un arte+acto de la preparacin o a un mecanismo +isiol#ico relacionado con la acumulacin en puntos nucleares 0nuclear dots1. $ibliogra+a.
1.

San# "4 P. <. Protymosin alp9a and tumor. current statuis and perspecti!es. 02'',1. at X9ttpDKKOOO.cjcsysu.comK:Cpd+K2''BK3K333.pd+Y :n=emann4 6. A.4 Sard4 R. @. Z -er#er4 6. /. "obility Sit9in t9e Cucleus and Cei#9borin# )ytosol Is

2.

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a Hey Feature o+ Prot9ymosin-. 0ournal o- ?is!oc@emis!r B = !oc@emis!r 12A 13(1[1355 02'''1. 3. (. Aniello4 F. e! al$ First e!idence o+ prot9ymosin alp9a in a non-mammalian !ertebrate and its in!ol!ement in t9e spermato#enesis o+ t9e +ro# Rana esculenta. 8ec@$ 4ev$ 55BA 213[21B 02''21. @a!id "oreira \l!are*. .:6I6 @ ). RA/ :6.>@I @: /A F 6F RI/A)I]C @: /A PR .I" 6ICA :C )^/>/A6 :C PR /IF:RA)I]C. @:6)>-RI"I:C. @: /A I6 :C_I"A "2 @: /A PIR>?A. W>ICA6A. 02'121. 5. ,. "osoian4 A. Intracellular and e7tracellular cyto=ine-li=e +unctions o+ prot9ymosin D implications +or t9e de!elopment o+ immunot9erapies. Fu!ure 8edicinal =@emis!r =A 11%%[12'8 02'111. :!sta+ie!aa Ale7andra E. 4 Eeor#e A. -elo!a`b 4 "ar=us Hal=umc 4 Cina ?. )9ic9=o!aa 4 Ale7ey A. -o#dano!a 4 ?adim I. A#ola`b 4 Andrey -. ?artapetian. Prot9ymosin alp9a +ra#mentation in apoptosis. 02'''1. B. 8. %. Panneersel!am4 ).4 ;aritos4 A. A.4 )aldarella4 <. Z ;orec=er4 -. /. Prot9ymosin alp9a in 9uman blood. Proceedings o- !@e Na!ional %cadem o- Sciences 21A ((,5[((,% 01%8B1. 1%%% Fi+teen years o+ prot9ymosin alp9a contradictory past and neO 9ori*ons0Pineiro4 )ordero4 Co#ueira1.pd+. 01%%%1. :!sta+ie!a4 A. E. e! al$ Apoptosis-related +ra#mentation4 translocation4 and properties o+ 9uman prot9ymosin alp9a. 6C"$ =ell Des$ ;21A 211[223 02''31. 1'. Freire4 <.4 )o!elo4 E.4 6arandeses4 ).4 @$a*-<ullien4 ). Z Freire4 ". Identi+ication o+ nuclear-import and cell-cycle re#ulatory proteins t9at bind to prot9ymosin alp9a. Eioc@em$ =ell Eiol$ C4A 123[131 02''11. 11. 6ubramanian4 ). e! al$ :pstein--arr ?irus Cuclear Anti#en 3) and Prot9ymosin Alp9a Interact Oit9 t9e p3'' .ranscriptional )oacti!ator at t9e );1 and );3K;A. @omains and )ooperate in Re#ulation o+ .ranscription and ;istone Acetylation. 0ournal o- +irolog C>A (,%%[(B'8 02''21. 12. @$a*-<ullien4 ).4 P&re*-:st&!e*4 A.4 )o!elo4 E. Z Freire4 ". Prot9ymosin alp9a binds 9istones in !itro and s9oOs acti!ity in nucleosome assembly assay. Eioc@im$ Eio"@ s$ %c!a 5;4>A 21%[22B 01%%,1. 13. )o!elo4 E.4 6arandeses4 ). 6.4 @ia*-<ullien4 ). Z Freire4 ". Prot9ymosin Interacts Oit9 Free )ore ;istones in t9e Cucleus o+ @i!idin# )ells. 0ournal o- Eioc@emis!r 51BA ,2B[,3B 02'',1. 1(. Wi4 G.4 San#4 /. Z @u4 F. Co!el 6mall "olecules Relie!e Prot9ymosin abalp9aa-"ediated In9ibition o+ Apoptosome Formation by -loc=in# Its Interaction Oit9 Apa+-1. Eioc@emis!r 14A 1%23[1%3' 02'1'1. 15. Herr4 <. F.4 Syllie4 A. ;. Z )urrie4 A. R. ApoptosisD a basic biolo#ical p9enomenon Oit9 Oide-ran#in# implications in tissue =inetics. Eri!is@ 7ournal o- cancer ;>A 23% 01%B21. 1,. %"o"!osis. 0 7+ord >ni!ersity Press4 2''21. 1B. <ian#4 G. e! al$ @istincti!e roles o+ P;AP proteins and prot9ymosin-alp9a in a deat9 re#ulatory pat9Oay. Science ;44A 223[22, 02''31. 18. 2''5 6ur+in# on prot9ymosin "inire!ieO 0/etsas1.pd+. 02''51. 1%. "alicet4 ). e! al$ Re#ulation o+ apoptosis by t9e p8Kprot9ymosin comple7. Proceedings o- !@e Na!ional %cadem o- Sciences o- !@e <ni!ed S!a!es o- %merica 5B=A 2,B1[2,B, 02'',1. 2'. /al4 A.4 HaOai4 ..4 `an#4 G.4 "a*an-"amc*ar*4 H. Z Eorospe4 ". Antiapoptotic +unction o+ RCA- 1% -

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&ablas " +iguras.

Re+erencia * $I de la protena CPc''281(.3 CPc'32%%8.1 CPc''123%12B.1 CPc''1153558.1 CPc''1'1,523.1 CPc''1'8B(8'.1 CPc%1%35B.2 &ipo de protena prot9ymosin alp9a iso+orm 2 prot9ymosin alp9a prot9ymosin alp9a prot9ymosin alp9a prot9ymosin4 alp9a prot9ymosin alp9a-prot9ymosin alp9a-A ?$ sa"iens 8$ musculus =$ lu"us -amiliaris S$ scro-a G$ !ro"icalis G$ laevis 4$ rerio )specie Id<D6 1''.' %5.5 %8.2 %8.2 B3.2 B1.( B'.2 /ongitud <aa6 1'% 11' 1'% 1'% 1'B 111 1'(

Ta(la ): Porcen!a7e de simili!ud en la secuencia de aminocidos de ProT en dis!in!as es"ecies o(!enido de la He( de la N=EI

Residuo A?FP"I/S @: RH 6.`;)CEW tros

)olor Rojo A*ul ma#enta !erde #ris

Propiedad pe2ue3o e 9idro+bico 0incl.aromaticos -`11 Acidico -asico - ; ;ydro7ylo e sul+9ydrylo e amina e E inusuales

d resido 8nico completamente conser!ado D #rupos con propiedades +uertemente similares Y '.5 en la matri* Eonnet PA" 25' . #rupos con propiedades de!ilmente similares XV '.5 en la matri* Eonnet PA" 25'

Ta(la *: =om"aracin de la secuencia de aminocidos de la ProT de diversas es"ecies alineados con el "rograma =L<ST%L F863%$ Secuencias o(!enidas de la (ase de da!os N=EI

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