Modelli di terapia genica

Modelli di terapia genica

Definizione e background Sistemi di rilascio Strategie di terapia genica Esempi di trials clinici Prospettive future

Terapia Genica: perch ?

Molte patologie, dovute a proteine malfunzionanti, non sono trattabili con terapie tradizionali Negli anni 70 nasce lidea della Terapia Genica
(rilascio intracellulare di materiale genetico per generare un effetto terapeutico, con diverse strategie di intervento a seconda dello scopo prefissato)

DNA e mutazioni
A C G T
GENOMA UMANO 3 miliardi di basi (A,C,G,T) circa 30.000 geni circa 250.000 proteine

GCA Ala

AAA Lys

GAT Asp

AAT Asn

TGT Cys

Proteina anomala

Sequenza mutata

MUTAZIONI

ereditarie (patologie genetiche) acquisite (tumori) dovute a virus (malattie infettive)

Patologie bersaglio
Monogeniche
Immunodeficienze - Distrofia muscolare - Fibrosi cistica - Emofilie Retinopatie - Emoglobinopatie - Ipercolesterolemia fam - Xeroderma pigmentosum

Multifattoriali
Malattie cardiovascolari e neurodegenerative - Diabete Artrite reumatoide

Tumorali
Leucemie - Carcinomi

Infettive
AIDS - Epatite B e C

Acquisite
Traumi (fratture ossee, ferite, ustioni) - Ischemie

Terapia genica: quale tipo?

SOMATICA
manipolazione dellespressione genica in cellule differenziate dellindividuo adulto

GERMINALE
manipolazione dellespressione genica in cellule riproduttive

lalterazione genica riguarda esclusivamente il paziente su cui stata realizzata

eventuali modificazioni geniche verrebbero trasmesse alla progenie

non autorizzata !!!!

Terapia genica: come?

ex vivo
Le cellule bersaglio sono prelevate dal paziente, modificate geneticamente in laboratorio e reintrodotte nello stesso individuo

in situ
il transgene viene rilasciato localmente nel sito di azione mediante iniezione i.m. o intratumorale o per inalazione ecc

in vivo
il transgene viene somministrato per via sistemica e.v. nel corpo del paziente

no problemi immunologici efficienza delle metodiche di trasduzione in vitro solo alcune malattie (immunologiche, ematologiche, metaboliche)

tumori localizzati; patol. dellapparato respiratorio; tessuto cutaneo ecc

cellule e tessuti poco accessibili scarsa efficienza di trasduzione, barriere

TERAPIA GENICA: come ?

Rilascio gene modificato Rilascio cellule modificate

in vivo

ex-vivo

Trasferimento Genico in vivo

Aerosol Iniezione diretta

(miocardio)

Perfusione organo Uso di cateteri

(tumori solidi)

elettroporazione Via sistemica

TERAPIA GENICA: come ?

DNA nudo elettroporazione pistola genica microiniezione liposomi

non-virali Vettore per rilasciare e proteggere il gene terapeutico

virali

adenovirus

adenoassociati

retrovirus

lentivirus

herpesvirus

Differenze nei sistemi di rilascio

integrazione del transgene nel genoma ospita espressione stabile

il transgene non si integra nel genoma espressione temporanea

DNA nudo e metodi fisici

Iniezione diretta

Vantaggi
assenza di immunogenicit alta efficienza ex-vivo rilascio di grossi geni utile per le vaccinazioni a DNA

Elettroporazione Pistola genica

Svantaggi
instabilit nella maggior parte dei tessuti espressione transitoria in vivo solo per tessuti superficiali (cute), muscolo, cuore, fegato

Microiniezione

Cromosomi Artificiali (MACs)

Vantaggi
capacit di trasportare grossi geni mantenimento autonomo espressione genica regolabile

Svantaggi
difficolt di costruirlo in laboratorio difficolt di rilascio per le sue dimensioni

Vettori chimici
Liposomi
- DNA

- -

Vantaggi
non contengono geni virali limitata immunogenicit anche costrutti molto grandi

++++

liposomes

Svantaggi
poco efficienti nel rilascio genico in vivo espressione transitoria difficolt a rilasciare il DNA nel nucleo

Vettori virali

Adenovirus

Retrovirus*

Lentivirus*

Herpes-simplex virus

Vantaggi
altamente efficienti nel trasferimento genico espressione a lungo-termine*

AAV*

Svantaggi
reazione immunitaria tossicit integrazione random/mutagenesi inserzionale*

Vettore ideale
di facile produzione e in elevate quantit esprimibile per un lungo periodo e regolabile sicuro, cio inerte dal punto di vista immunologico selettivo per determinati tipi cellulari capace di trasportare geni piccoli e grandi capace di integrarsi in siti specifici del genoma capace di infettare sia cellule in divisione che quiescenti

Strategie di terapia genica

Compensazione genica Riparo genico Inattivazione Suicida Anti-angiogenica Anticorpale Anti-infiammatoria Vaccinazione Terapie cellulari
introduzione di copie funzionali del gene difettivo o assente correzione del gene difettivo introduzione di RNA antisenso per inibire lespressione genica introduzione di geni suicidi che producono tossine o pro-farmaci interruzione del nutrimento ai tumori introduzione di geni che producono anticorpi intracellulari prevenzione del riconoscimento dei tessuti da parte dellorganismo introduzione di geni che inattivano agenti infettivi trapianto di cellule geneticam modif

Strategie e patologie
trapianti cellulari tp. riparativa tp. compensativa patologie ereditarie tp. ablativa suicida di inattivazione anticorpale anti-angiogenetica immunoterapia tp. anti-infiammatoria
(mendeliane)

patologie multifattoriali
(neurodegen, diabete ecc)

patologie acquisite
(traumi, ischemie ecc)

patologie tumorali

patologie infettive
(++AIDS, epatite)

patologie autoimmuni

Strategie a confronto
Compensativa (x patologie AR. Trials clinici:FC, emofilia, SCID)
gene X

gene mutato

no proteina

espressione della proteina normale

Riparo (anche x patologie AD da gain-of-function)

wt m

gene X
m m m

X X
wt wt wt wt

wt

gene mutato

no proteina

gene corretto

espressione della proteina normale

RILASCIO DI DNA TERAPEUTICO MEDIANTE MICROINIEZIONE

FRAMMENTI DI DNA

RIPARO GENICO

RILASCIO GENICO
DNA NUDO

CROMOSOMI ARTF o PLASMIDI

INTEGRAZIONE DEL TRANSGENE SOSTITUZIONE OMOLOGA

MANTENIMENTO DEL TRANSGENE

SOLO DNA GENOMICO CORRETTO

DNA GENOMICO MUTATO e DNA INSERITO

Riparo genico
Vantaggi
Mantiene il gene integro Mantiene la relazione tra sequenze regolatrici e codificanti Assicura un livello di espressione accurato Dovrebbe essere a lungo-termine

Svantaggi
Efficienza pu essere bassa Rischio di mutagenesi inserzionale Degradazione del DNA terapeutico

Strategie a confronto
VETTORE VIRALE CELLULA BERSAGLIO RISULTATO ATTESO

TERAPIA GENICA COMPENSATIVA

per patologie ereditarie cellula epitelio respiratorio
VETTORE VIRALE CELLULA BERSAGLIO RISULTATO ATTESO

timidin-kinasi

TERAPIA GENICA ABLATIVA

per patologie tumorali cellula tumorale

ganciclovir

ganciclovir-fosfato

Cellule Tumorali: caratteristiche

Cellule altamente proliferanti

Effetto spettatore

Terapia suicida
Conosciuta anche come terapia attivante un profarmaco (GPAT) Introduzione in cellule bersaglio di un gene che codifica per un enzima (es. HSV-TK) metabolizzante un farmaco (DME) Successivo trattamento con un pro-farmaco non tossico (es. Gangiclovir) che viene convertito selettivamente nella forma tossica (Gangiclovir-P) dal DME

Inattivazione Genica
mutagenesi mirata ODN TFO (elica triplice)

gene mutato (es. HIV)

filam.anti-senso (stampo)

filam. senso

mRNA ODN antisenso RNA antisenso ribozima siRNA

AAA

AAA ibrido RNA-DNA Rnasi H inibizione della traduzione taglio diretto dellmRNA

Inattivazione Genica: RNA

1. Oligonucleotide antisenso

2. Ribozimi

no RNA

Inattivazione genica: RNA

3. RNA interference Interferenza mediata da RNA (RNAi) un nuovo meccanismo per il silenziamento genico specifico Meccanismo evolutivam conservato come linea di difesa contro virus Si legano allmRNA complementare e lo inattivano in maniera specifica Uso di siRNAs sintetizzati chimicam come nuova metodica di RNA terapeutico

Terapia genica in Cellule Staminali

Cellula staminale CSE

Introduzione del gene terapeutico

Gene terapeutico verr espresso in tutte le cellule del sangue

Perch usare le cellule staminali ematopoietiche?

Cellule che si autorinnovano: nessuna necessit di ripetute somministrazioni Poco numerose e facilmente rimovibili Facilmente identificabili, manipolabili e reintroducibili Il gene terepautico risieder in tutte le cellule derivate CSE possono migrare in numerosi distretti corporei (midollo osseo, fegato, milza, linfonodi) e funzionare come vettori di trasferimento genico

Bersagli di Terapia Genica con CSE

Malattie monogeniche
SCID, ADA-SCID, malattia di Gaucher, Sindrome di Hurler, anemia di Fanconi, Malattia granulomatosa cronica Marcatori genici, geni-suicida, geni di resistenza ai chemioterapici Vaccini a DNA/RNA, recettori chimerici cellule T Riboenzimi catalitici, RNA antisenso, repressori dominanti di geni HIV, RNA decay

Trapianti e tumori

Immunoterapia

Sindromi da immunodeficienza acquisita (HIV)

Terapia cellulare
Trapianti cellulari Trapianto cellule staminali geneticamente modificate ex-vivo

SUCCESSI
ADA-SCID, Aiuti, 2002 X-SCID, Hacein-Bey-Abina, 2002 Epidermolisi bullosa, De Luca, 1998 Ferite epidermide, Quesenberry, 2002

POTENZIALITA
Malattie metaboliche Malattie ematologiche M. Parkinson M. di Alzheimer Infarto Diabete Artrite reumatoide

Trials clinici
ADA e X-SCID Fibrosi cistica Emoglobinopatie Malattie metaboliche Emofilia A e B Ipercolesterolemia familiare Tumori cerebrali Neuroblastomi Carcinomi renali Melanomi Leucemie mieloidi croniche

Terapia genica: es. Emofilia A

Malattia emorragica X-linked dovuta a mutazioni nel gene per fattore VIII incidenza: 1/5000 maschi

Fattore VIII buon candidato per terapia genica: - lespressione non influenzata dagli episodi di
sanguinamento - non rischio di overdose - espressione organo-specifica non richiesta - anche bassi livelli possono dare benefici clinici

elettroporazione DNA plasmidico in fibrablasti da 6 pazienti con emofilia grave A in 4 / 6 pazienti incremento significativo dei livelli di fattore VIII nel sangue riduzione degli episodi di sanguinamento, minor uso di fattore VIII esogeno

Terapia genica: risultati

Buoni risultati in modelli animali Pochi esempi di risultati a lungo termine nelluomo
(X-SCID, ADA-SCID, Emofilia A)

Procedure di rilascio genico relativam sicure

(sviluppo risposta infiammatoria sistemica, sviluppo di leucemia)

Alcune patologie pi facilmente trattabili Alcune aree pi promettenti

(vaccini a DNA, angiogenesi per m. cardiovascolari, trapianti cell)

Terapia genica: limiti e prospettive

Limiti attuali
bassa efficienza di rilascio genico bassa specificit di bersaglio espressione transiente e non-fisiologica

Prospettive future
sviluppo di nuovi vettori

sviluppo di strategie cellulo-specifiche

approcci di gene-targeting

reazione immunitaria contro i vettori

sviluppo di vettori nonimmunogenici

Terapia genica: passaggi-chiave

comprensione dei meccanismi patofisiologici della malattia individuazione dellappropriato bersaglio cellulare individuazione del metodo di trasferimento ottimale creazione di un modello animale della patologia per studi pre-clinici in vivo

Sicurezza e Terapia Genica

- Si riteneva comunemente che la terapia genica somatica per il trattamento di una malattia grave fosse unopzione terapeutica corretta dal punto di vista etico: i benefici erano ritenuti maggiori di costi e rischi, per malattie mortali o terminali. Il 17 Settembre 1999 Jesse Gelsinger muore a causa di una risposta iperimmune contro la grande quantit di vettore necessaria per una terapia non mirata: il consenso generale messo in discussione. Jesse Gelsinger, 18 anni, relativamente sano ed ha una forma lieve di deficienza parziale di ornitina transcarbamilasi (OTC) che poteva anche essere controllata con la dieta e con i farmaci (anche se con un regime molto stretto). In questa malattia, per una incapacit a demolire correttamente le proteine della dieta si ha accumulo tossico di ammoniaca - Integrazione retrovirale in vicinanza di un oncogene e sviluppo di leucemia in trial clinico per X-SCID (2/15 pazienti)

Necessit di procedimenti sicuri e criteri selettivi nella scelta dei pazienti

CONCLUSIONI
Non esiste una pallottola magica valida per tutte le patologie

Il successo della terapia genica dipender dalla collaborazione di pi specialisti e dallutilizzo dellappropriata combinazione strategia/vettore per il trattamento di ciascuna patologia

Distrofinopatie: trials innovativi

Il gene distrofina
short arm, Xp21 Genome size: 2.5 Mb 79 constitutive exons (1% of the gene) very large introns and non-coding regions (99% of the gene) 7 promoters (3 driving full length isoforms)

BMP

B3

1B 1M 1P 2a 4

19

29

44

55

62

68 70-75 78

La distrofina : dove si esprime

SkM

Heart

Come distinguere fra Becker e Duchenne

Dystrophin is virtually absent in skeletal muscle of Duchenne patients, in rare cases strongly reduced (rare revertant fibers) Dystrophin is present though qualitatively and quantitatively reduced in skeletal muscle of Becker patients

CTRL

BMD

DMD

revertant fibers (courtesy of Patrizia Sabatelli)

Extracellular Matrix
Collagen VI

Laminin 2

SGCD

DYS
Cytoplasmic actin

9 CC B A

Integrin

Sarcolemma
DSP T-tubule

CLP LDB3
Cytoplasmic actin

Costameres

MVCL

CTF1 TAZ

DES

Sarcoplasmic Reticulum
Ca2+

DYS

TTN
MYH7 MYBPC3 Mithocondria
Ca2+

PLN

ACTC
Z disc

TNNT2 TPM1 TCAP

I band

A band M line

I band Z line

Nucleus

Z line

Sarcomere
Lancet, 2005

Outer nuclear membrane

Inner nuclear membrane

LMNA

EYA4

La ricerca Modulare mutazioni della distrofina con oligonucleotidi antisenso (AONs) >>exon skipping

Come funzionano gli ANTISENSO

LA RICERCA : UTILIZZO DI NANOPARTICELLE PER VEICOLARE OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO

R R R R R R R

R R

R R RR R R R R R

R R

R R

NANOPARTICELLE ( 500nm)

T1-AONs : IL LEGAME
+ + + + + + + + + + + + + + + + +

ArON

LE NANOPARTICELLE T1 LEGANO GLI ANTISENSO

T1 Fluorescenti (T1-fluo)

Al microscopio elettronico

ESPERIMENTI NEL TOPO MDX

EPSERIMENTO NEL MODELLO ANIMALE DI DISTROFINOPATIA (MDX) ANTISENSO SU ESONE 23 (DOVE PRESENTE LA MUTAZIONE DEL TOPO) INOCULO SISTEMICO INTRAPERITONEALE STUDIO DELLA PROTEINA NEI TESSUTI DEL TOPO STUDIO DELLRNA

RISULTATI LA DISTROFINA RICOMPARE NEI MUSCOLI DEL TOPO TRATTATO

C57BL6

mdx group 2 (day 21)

mdx group 1 (day 21)

mdx group 1 (day 60)

diaphragm

gastrocnemius

quadriceps

RISULTATI LA DISTROFINA RICOMPARE NEI MUSCOLI DEL TOPO TRATTATO

C57BL6 mdx group 1 (day 21) mdx group 1 (day 60)

diaphragm

gastrocnemius

quadriceps

RISULTATI LA DISTROFINA RICOMPARE NEL CUORE DEL TOPO TRATTATO

C57BL6

mdx group 4 (day 21)

mdx group 1 (day 21)

mdx group 1 (day 21)

COME SI DIFFONDONO LE NANOPARTICELLE CON LEGATI GLI ANTISENSO

VASI LINFATICI
CELLULE DELLE PARETI DEI VASI

DIAFRAMMA

CELLULE DEL MESOTELIO

ALTRI ORGANI: NON SEGNI DI TOSSICITA

Fegato

Milza

Altre strategie terapeutiche

Up-regulation of functional analogues fo dystrophin (utrophin) Gene therapy Cell therapy Molecular Therapy (Antisense) gentamicin (1996-1999) PTC124 (pilot trial in progress)

Gene therapy
somatic cell gene replacement
cDNA distrophin (13.9 Kb) in gutted adenovirus (g-AV) cDNA distrophin 6.3 Kb in viral vector (AV adenovirus I) cDNA distrophin 4.3 Kb (micro dystrophin) in adenoassociated virus (AAV)

ADVANTAGES ONCE-IN-MAN THERAPY (stable therapy) Correct localization of dystrophin (gastrocnemius and tibialis anterior) Correct localization of glycoprotein complex DISADVANTAGES Great immuno response!! Requires chronic immunosuppression!! Low availability of viral vectors Genome integration (side effects) Systemic delivery: no ideas about the late-onset side effects

CELL THERAPY

Heterologous cells -mesangioblasts (perycites) injection in dystrophic dogs (golden retriever) -rescue of dystrophin protein synthesis and localisation both in heart and skeletal muscles -reduction of necrotic and inflammatory changes at the morphological analysis of the treated dogs

CELL THERAPY
ADVANTAGES Once-in-man therapy Useful potentially for all muscular disorders DISADVANTAGES -safety issues: unknown! -side effects: theoretically many -staminal cells-related trouble (proliferation) -heterologous cells: chronic immunosoppression

Terminato nel 2009 Dati non ancora disponibili PTC124

USA company is contacting european groups for a trial for nonsense mutations Coordination: PTC Therapeutics (US)

PTC124 (gentamicin analogue): read through premature termination codons PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations (Nature, 2007)

PTC124: it may correct nonsense mutations only

PTC124 Stop mutations correction

Stop (nonsense)
AAGGTCTGTTCACCCATTATC AAGGTCTGTTGA (stop)

Lead to TRUNCATED non functional proteins (generally DMD phenotype) PTC124: drug able to convert a PREMATURE STOP CODON (TGA, TAA, TAG) in a SENSE codon. Ribosomal correction (post-transcriptional)

PTC124 (gentamicin analogue): read through premature termination codons

Pre-trial studies in mdx preliminary results: dystrophin rescue up to 5% in mdx treated for 8 weeks No side effects. US Multicentric trial (Italy : E.Mercuri, P.Comi and E.Bertini) oral administration period: 6 months-1 year Limitations: low efficiency of dystrophin rescue Side effects: none known

Prosensa first in man trial

PRO051 drug: 5 UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU 3 IC:at least 50% of spared muscle Concurrent glucocorticoid treatment 0.8 mg of PRO051 IM injection Dystrophin rescue 40-60% Mild side effects

Conclusioni -primi trial nelluomo con antisenso e PTC124 gi effettuato in Olanda e USA

Ma sono necessari: -ulteriori studi per cercare sistemi di rilascio -accurata valutazione delle efficacia e tossicit -ricerca di biomarkers