Roteiro de Estudos Clonagem Molecular (DNA recombinante)

Disciplina

Gentica Molecular Bsica

Mdulo 3

Universidade de Braslia Curso de Farmcia Noturno

---------------------------------------------------------------------------------------------TPICOS: I- Conceitos Bsicos 1. Introduo 2. Conceito de Clonagem Molecular 3. Enzimas de Restrio 4. Construo do DNA Recombinante 5. DNA Ligase
Tipos de Fragmentos de DNA que so ligados pela DNA Ligase:

A) Fragmentos com extremidades coesivas B) Fragmentos com extremidade no-coesivas II- Vetores De Clonagem Molecular 1-Plasmdeo III- Construo e Uso de Bibliotecas de DNA Recombinante 1. Biblioteca de cDNA 1.1. Sntese de cDNA de fita dupla 2. Biblioteca genmica 2.1. Preparo do DNA inserto 2.2. Vetores utilizados na construo de biblioteca genmica ---------------------------------------------------------------------------------------------------------1. INTRODUO At a dcada de 70, o DNA era o componente celular mais difcil de ser analisado. Sua sequncia de nucleotdeos de enorme tamanho e monotonia qumica era geralmente analisada por meios indiretos como a sequncia de protenas e anlise gentica. A partir da dcada de 70 novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o isolamento e a purificao de genes especficos num processo chamado de clonagem gnica. Na verdade, muitas destas tcnicas so provenientes da Microbiologia, Bioqumica, Imunologia e Gentica Microbiana e permitiram que a anlise do DNA ganhasse um novo enfoque. O DNA tornou-se ento, a molcula mais fcil de ser analisada, sendo possvel isolar regies especficas, obt-las em grande quantidade e determinar a sua seqncia numa velocidade de milhares de nucleotdeos por dia.

A Tecnologia do DNA recombinante, como se convencionou denominar este conjunto de tcnicas, tem uma ampla aplicao. Ela pode ser usada para estudar mecanismos de replicao e expresso gnica, na determinao da seqncia de um gene e conseqentemente da protena que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas microbianas capazes de produzir substncias teis tais como a insulina humana, hormnio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. Sua aplicao comercial ou biotecnolgica parece ter um potencial inesgotvel. Como conseqncia do desenvolvimento desta tecnologia atualmente possvel realizar investigao de paternidade e o diagnstico de doenas genticas e infecciosas atravs da anlise de DNA. 2. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR A origem do termo clonagem vem da Gentica Bacteriana que considera uma colnia de bactrias como um clone porque todos os indivduos so geneticamente idnticos bactria inicial. A tcnica central da metodologia do DNA recombinante a clonagem molecular, a qual consiste no isolamento e propagao de molculas de DNA idnticas. A clonagem molecular compreende pelo menos dois estgios importantes: primeiro o fragmento do DNA de interesse chamado de inserto ligado a uma outra molcula de DNA chamada de vetor para formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo, a molcula do DNA recombinante introduzida numa clula hospedeira compatvel, num processo chamado de transformao. A clula hospedeira que adquiriu a molcula do DNA recombinante agora chamada de transformante ou clula transformada. Um nico transformante, em condies ideais, sofre muitos ciclos de diviso celular, produzindo uma colnia que contm milhares de cpias do DNA recombinante. 3. ENZIMAS DE RESTRIO Em 1953 foi descrito um estranho fenmeno no qual a eficincia da replicao de um bacterifago (vrus de bactrias) dependia da clula hospedeira na qual ele estava inserido. Algum tempo depois percebeu-se que a inabilidade de certos fagos crescerem em determinadas linhagens bacterianas era devido a presena de nucleases altamente especficas que clivavam o seu DNA. Isto pode ser encarado como um sistema de defesa bacteriano que degrada DNA que lhe estranho (restrio). A bactria protege seu prprio DNA desta degradao camuflando-o atravs da metilao de algumas bases especficas (modificao). Como conseqncia, este sistema frequentemente descrito como fenmeno da restrio/modificao e existe em um grande nmero de bactrias. As enzimas de restrio ou endonucleases de restrio so divididas em vrias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos stios de reconhecimento e clivagem. As enzimas do Tipo I, as mais importantes na Tecnologia do DNA Recombinante, so proteinas monomricas ou dimricas e clivam o DNA no mesmo stio do seu reconhecimento. O stio de reconhecimento deste tipo de enzima normalmente uma

seqncia palindrmica, isto , ela tem um eixo de simetria e a seqncia de bases de uma fita a mesma da fita complementar, quando lida na direo oposta (Figura 1).

Figura 1. Dois tipos de clivagem feitas por enzimas de restrio. As setas indicam os stios de clivagem. As linhas pontilhadas representam o centro de simetria da sequncia.

Estas enzimas reconhecem seqncias especficas de 4 a 8 pares de base (pb) na molcula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. H 2 tipos distintos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqncia especfica, gerando extremidades abruptas, ou b) os cortes so feitos simetricamente, porm, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas. Estes dois tipos de clivagens e suas conseqncias esto mostrados na Figura 1. Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrio j foram identificadas. A nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviao do nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o gnero e as outras duas a espcie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrio denominada de EcoRI purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferncia de resistncia RI, enquanto que a Hind I isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d I. A Tabela 1 mostra a seqncia palindrmica e o local de clivagem de algumas enzimas de restrio. Note que algumas enzimas deixam terminaes coesivas enquanto que outras fazem cortes abruptos ou no coesivos.

Tabela 1. Algumas endonuclease de restrio: origem e stios de clivagem. A seta indica o local de clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina.

O interesse por estas enzimas de restrio aumentou em 1973 quando se percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o DNA deixando extremidades de fitas simples de DNA que permitiam a ligao dos fragmentos. Isto significava que a recombinao poderia ser efetuada em tubos de ensaio. Alm disto, DNA bacteriano poderia recombinar com DNA humano ou de qualquer outra espcie, abrindo a possibilidade de clonar genes humanos ou isolar protenas de culturas bacterianas. Uma importante conseqncia da especificidade destas enzimas de restrio que o nmero de clivagens feito por cada uma delas no DNA de qualquer organismo definido e permite o isolamento de fragmentos deste DNA. Portanto, cada enzima de restrio gera uma famlia nica de fragmentos quando cliva uma molcula de DNA especfica. Enzimas que reconhecem stios de restrio compostos por 4 pares de bases clivam o DNA em mdia a cada 256 nucleotdeos (4=256). Aquelas que reconhecem stios com 6 e 8 pb clivam o DNA em mdia a cada 4096 e 65536 pb, respectivamente. No entanto, esta mdia pode sofrer variaes significativas, dependendo principalmente da composio de bases do DNA analisado. Por exemplo, a enzima NotI reconhece um stio de restrio contendo 8pb, incluindo nucleotdeos CpG, que raramente ocorre no DNA de mamferos. A famlia de fragmentos gerados por digesto com enzima de restrio geralmente detectada pela separao destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose. Os

fragmentos migram em funo de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente (Figura 2).

Figura 2. Molculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser separadas por eletroforese. Molculas menores movem-se mais rapidamente que molculas maiores, tornando-se portanto separadas em bandas. O DNA corado com brometo de etdeo uma molcula que fluoresce quando iluminada com luz Ultra Violeta.

4. CONSTRUO DO DNA RECOMBINANTE Uma enzima de restrio particular reconhece somente uma seqncia nica de bases. DNAs de origem diferente sob a ao da mesma enzima de restrio produzem fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de dois diferentes organismos (por exemplo, bactria e homem) podem ser ligados por renaturao das regies de fita simples. Alm disto, se a ligao for "selada" com a enzima DNA ligase, depois do pareamento de bases, os fragmentos sero ligados permanentemente. A tcnica de DNA recombinante tem um interesse especial se uma das fontes de DNA clivado for um plasmdeo.

Figura 3. Construo de uma molcula de DNA hbrida a partir de fragmentos de diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrio.

A figura 3 mostra uma molcula de DNA de plasmdeo que tem somente um stio de clivagem para uma determinada enzima de restrio. A mesma enzima usada para clivar DNA humano. Se os fragmentos de DNA humano so misturados com o DNA plasmidial linearizado, permitindo a ligao entre eles, uma molcula de DNA plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada. Este plasmdeo hbrido pode ser inserido numa bactria por transformao e ento o inserto ser replicado como parte do plasmdeo. Geralmente antibiticos so acrescentados ao meio da cultura para selecionar somente as linhagens que portam os plasmdeos (o plasmdeo usado para esta finalidade porta resistncia a pelo menos um antibitico).

5. DNA LIGASE
Conforme mencionado anteriormente esta enzima promove a ligao dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrio. A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia (Figura 4). A E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligase capaz de selar fragmentos de DNA com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli e de outras bactrias requer NAD+, enquanto que a isolada do bacterifago T4 requer ATP como cofator.

Figura 4. DNA ligase cataliza a juno de duas fitas de DNA que so partes da molcula da dupla-hlice.

Tipos de fragmentos de DNA que so ligados pela DNA ligase a) Fragmentos com extremidades coesivas: As extremidades coesivas produzidas por vrias enzimas de restrio permitem dois fragmentos de DNA ligarem-se facilmente, atravs da formao de pontes de hidrognio pela complementariedade das bases. Finalmente a ligao covalente dos fragmentos realizada pela DNA ligase (ver figura 4). b) Fragmentos com extremidade no coesivas: DNAs portando extremidades no coesivas so ligados com muito menos eficincia que aqueles que tem extremidades coesivas. Uma concentrao muito maior

DNA-Ligase ATP ou NAD de DNA ligase e mesmo dos DNAs envolvidos necessria para que as molculas com extremidades no coesivas sofram reao de ligao. No entanto, a ligao deste tipo de fragmento facilitada pela transformao prvia das extremidades no coesivas em coesivas. Este procedimento pode ser feito atravs de dois processos: a) Adio de polidesoxi (A) na extremidade 3' de um fragmento de DNA e polidesoxi (T) na extremidade 3' de um outro fragmento de DNA, atravs da enzima desoxinucleotidil transferase terminal ou simplesmente transferase. Esta enzima, uma DNA polimerase incomum, adiciona nucleotdeos extremidade 3-OH de fragmentos fita simples proeminente de uma cadeia de DNA. Para gerar este tipo de extremidade proeminente a molcula tratada previamente com uma exonuclease 5-especfica para remover alguns nucleotdeos terminais. Aps a mistura dos dois tipos de fragmentos complementares e anelamento dos mesmos, as molculas so unidas preenchendo-se os espaos existentes com o auxlio da DNA pol I e selando-os com DNA ligase (Figura 5) b) Adio de adaptadores s extremidades no coesivas Os adaptadores so oligonucleotdeos sintticos e complementares que contm stios de clivagem para uma ou mais enzimas de restrio. Eles so unidos ao DNA com o auxlio da DNA ligase (Figura 6). c) O terceiro mtodo utiliza T4 ligase em concentraes que pode ligar molculas de DNA sem proeminncias.

Figura 5. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformadas em coesivas pela adio de poli (A) e poli (T).

Figura 6. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformados em coesivas pela adio de adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restrio que reconhece o adaptador.

II. VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR Aps o isolamento de uma informao gentica, por exemplo um fragmento de DNA obtido pela clivagem com enzimas de restrio, este fragmento dever ser inserido numa outra molcula de DNA diferente, capaz de amplificar aquela informao gentica em centenas de cpias. Este processo de amplificao obtido atravs do uso de molculas de DNA que so os chamados vetores de clonagem molecular.

Atualmente, os tipos bsicos de vetores usados na metodologia do DNA recombinante apresentam caractersticas especiais que os tornam excelentes veculos de clonagem em diferentes situaes. A seguir, vamos apresentar os principais tipos de vetores atualmente em uso na biologia molecular.
1- PLASMDEO So pequenas molculas de DNA dupla fita, contendo os elementos necessrios para a sua replicao e pelo menos um gene que confere resistncia a antibitico. Estes elementos genticos extra cromossomais variam de 5 a 400 kilobases e comumente esto presentes em duas ou mais cpias por clula. Os plasmdeos presentes num grande nmero de cpias so usados como veculos de clonagem desde que capacitem a amplificao do segmento do DNA neles clonado. Um plasmdeo para ser um bom vetor de clonagem deve conter as seguintes propriedades: a) possuir uma origem de replicao (O), ou seja, uma seqncia de DNA que permita que o vetor seja replicado na clula hospedeira, b) apresentar dois ou mais stios nicos de clivagem para endonucleases de restrio. O conjunto destes stios denominado de Mltiplo Stios de Clonagem (MSC) o local onde o inserto incorporado ao vetor de clonagem, c) possuir um gene que codifica um produto que distingue a clula

transformada da clula no transformada. Por exemplo, muitos vetores de clonagem carregam o gene que confere resistncia ampicilina (AmpR). As clulas transformadas com tais vetores so capazes de crescer num meio contendo o antibitico, enquanto que as clulas no tranformadas acabam morrendo. A figura a seguir ilustra as principais caractersticas estruturais de um plasmdeo.

Figura 7. Estrutura molecular de um plasmdeo tipico usado em clonagem molecular

Um dos passos fundamentais no processo de clonagem molecular o uso de enzima de restrio que produz extremidades compatveis durante a clivagem do DNA a ser clonado (inserto) e a do DNA receptor (vetor). Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molcula hbrida dever ser introduzida numa clula hospedeira geralmente bactrias, por um processo chamado de transformao, para que o vetor possa sofrer replicaes e consequentemente amplificar o nmero de cpias do inserto. A bactria transformada ser facilmente reconhecida pela aquisio de um novo fentipo dado pelo plasmdeo, ou seja, capacidade de crescer em meios contendo antibitico. III. CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE A obteno de uma molcula de DNA recombinante, atravs da ligao de um fragmento de DNA de interesse com o DNA de um vetor, um processo direto e relativamente simples. Entretanto, problemas especiais surgem quando o fragmento de interesse constitui uma frao pequena do DNA total. Este o caso encontrado comumente quando o objetivo o isolamento de genes presentes em uma nica cpia num genoma complexo, ou quando o objetivo o isolamento de clones portadores do DNA complementar RNA mensageiro raro. Deste modo, claro que quando queremos clonar um determinado gene ou o DNA complementar da mensagem ou mensagens por ele codificada(s) necessrio a obteno de colees de clones recombinantes, portadores de molculas representantes de todo o genoma, ou de colees de clones de cDNAs derivados de toda a populao de mensageiros da clula ou tecido de interesse. Essas colees de clones de DNA recombinante so chamadas de bibliotecas: Biblioteca Genmica, no caso dos clones terem sido obtidos a partir do DNA genmico ou Biblioteca de cDNA, no caso dos clones terem sido construdos a partir de DNA complementar.

O DNA de organismos superiores bastante complexo: por exemplo, o genoma haplide de mamfero composto de aproximadamente 3x109 pares de bases (pb). Portanto, se o fragmento de interesse tiver 3000 pb, ele compreender somente 1 parte em 106 de uma preparao do DNA total. De modo similar, uma espcie de RNAm particularmente rara pode compreender somente 1 parte em 105 ou 106 da frao de RNA mensageiros de uma clula. Deste modo, para que seja garantida a presena na biblioteca de pelo menos uma verso de todas as seqncias da populao alvo, um dos pontos principais na construo de bibliotecas teis a obteno de grandes quantidades de clones. Embora a soluo deste problema envolva estratgias especficas no preparo do DNA alvo e na escolha do vetor de clonagem, em linhas gerais a construo de bibliotecas genmicas e de cDNAs segue um procedimento bsico bastante semelhante. Nos dois casos, o DNA genmico ou os cDNAs so preparados para a insero no vetor escolhido. O vetor e o DNA alvo so ligados e introduzidos em E.coli atravs de infeco ou em alguns casos, por transformao direta (Fig. 8).

Figura 8. Passos envolvidos na construo de Bibliotecas de cDNA e Bibliotecas genmicas.

1- BIBLIOTECA DE cDNA A descoberta da enzima transcriptase reversa, uma DNA polimerase dependente de RNA encontrada predominantemente em vrus de RNA de tumor, tornou possvel a sntese in vitro de DNA usando-se como molde RNAm. O DNA produto dessa reao o DNA complementar ou cpia da mensagem, abreviadamente chamado de cDNA. A sntese e possvel clonagem de cDNAs contribuiram para grandes avanos na anlise da estrutura e expresso de genes de eucariotos e propiciaram uma revoluo tecnolgica nas indstrias farmacutica e de alimentos. Esses clones so comumente isolados de bibliotecas de cDNA, construdas a partir da populao de RNAm isolada da clula ou do tecido de interesse. Portanto, em comparao com bibliotecas do genoma total essas bibliotecas so enriquecidas com seqncias gnicas. Uma vez que o cDNA cpia da

mensagem, ele no contm introns e apresenta significativamente poucas sequncias que no codificam para protenas (Fig.9). A ausncia de introns permite que cDNAs relativos a clulas de eucariotos superiores sejam diretamente transcritos e traduzidos em bactrias e em outros microorganismos, permitindo assim a produo em grande escala de polipeptdeos importantes tanto na rea de pesquisa como na rea aplicada. A ausncia de introns tambm facilita a determinao direta da seqncia da mensagem e subsequente deduo da seqncia de aminocidos da protena por ela codificada. Isso tem resultado na identificao da seqncia de uma enorme quantidade de protenas, algumas vezes mesmo antes de terem sido identificadas gentica ou bioquimicamente. De modo resumido, o procedimento para a sntese, clonagem e isolamento de cDNAs especficos envolve 4 etapas: 1) Sntese in vitro de cDNAs de fita dupla a partir de RNAs mensageiros isolados do tecido de interesse. 2) Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor escolhido 3) Introduo dos cDNA recombinantes nas clulas hospedeiras, onde sero replicados. Isto resultar na amplificao dos recombinantes e dependendo do vetor utilizado, na expresso das protenas codificadas pelas mensagens que deram origem aos cDNAs. 4) Identificao dos clones de interesse atravs de um processo de triagem dos clones recombinantes

Figura 9. Diagrama representando de forma simplificada as diferenas entre um fragmento de DNA genmico e do cDNA relativo a ele.

1.1. Sntese de cDNAs de fita dupla A construo de uma biblioteca de cDNA inicia-se com o isolamento do RNA total do tecido e subsequente seleo da frao de RNA poli (A)+, que compreende a maioria das mensagens presentes na clula. O isolamento de um RNA poli (A)+ de boa qualidade essencial, uma vez que qualquer degradao do RNAm afetar a representatividade das seqncias na biblioteca. Uma vez obtida a frao de RNA poli (A)+, procede-se a sntese dos cDNAs atravs de uma srie de reaes enzimticas (Figura 2). Nos ltimos dez anos foram descritos vrios mtodos para sntese de cDNA, cada um apresentando vantagens e desvantagens

particulares. Como exemplo, apresentamos a seguir um procedimento amplamento usado para esse fim: a) Sntese da fita de DNA complementar ao RNAm (cDNA) atravs da enzima transcriptase reversa. Essa enzima capaz de catalizar in vitro a polimerizao de DNA a partir RNA e requer um "primer" com a extremidade 3'OH livre para iniciar a sntese. Na maioria das vezes, a molcula utilizada como "primer" um oligo (dT), que se anela na cauda poli (A)+ do RNA. b) Aps a sntese dessa fita de cDNA, o RNAm parcialmente removido, pelo uso da RNase A para cortar pedaos do RNA da molcula hibrida RNA-DNA. c) Utilizando como "primer" os fragmentos de RNA no digeridos pela RNaseA, a DNA polimerase de E.coli substitui eficientemente o RNA por DNA, resultando em uma molcula de cDNA de fita dupla. d) O cDNA fita dupla tratado com T4 polimerase. A atividade 3'-5' exonuclease dessa enzima usada para remover possveis nucleotdeos extras nas extremidades 3' do cDNA. e) O produto final desse conjunto de reaes uma molcula de DNA de fita dupla, cpia exata da mensagem.

2. BIBLIOTECA GENMICA Para se obter informaes sobre a estrutura molecular de um gene de eucariotos necessrio o isolamento da poro do DNA genmico que contenha toda a unidade de transcrio, mais as regies flanqueadoras onde se localizam os elementos controladores da expresso desse gene. O modo mais eficiente para se conseguir isolar essa poro do DNA atravs do uso de uma biblioteca genmica, que deve conter clones portando fragmentos de DNA representantes de todo o genoma do organismo em questo. Deste modo, o aspecto principal considerado na construo de uma biblioteca genmica atemse obteno de um nmero grande de clones portando fragmentos do genoma, obtidos aleatoriamente. O tamanho necessrio de uma biblioteca genmica, para que um dado fragmento de interesse esteja entre os fragmentos clonados, determinado pelo tamanho do fragmento clonado e pelo tamanho do genoma. Deste modo, a estratgia bsica na construo de bibliotecas genmicas busca minimizar o nmero de clones necessrios atravs da clonagem de fragmentos de DNA de maior tamanho possvel, e maximizar a eficincia da clonagem, atravs da utilizao de vetores (plasmdeos). Basicamemte, a construo da biblioteca genmica envolve os seguintes passos: a) isolamento de DNA de alto peso molecular, que posteriormente quebrado de modo a produzir fragmentos de tamanho compatvel com o vetor de clonagem b) ligao desses fragmentos no vetor e introduo dos recombinantes obtidos nas clulas hospedeiras. Dentre esses passos, o modo de preparo dos fragmentos a serem clonados (insertos) merece ser discutido criticamente dada sua importncia na representatividade da biblioteca.