Ao de la inversin para el desarrollo rural y la seguridad alimentaria

Universidad Nacional del Centro del Per

LABORATORIO CLNICO

CATEDRTICO: Dr. RODRGUEZ ALIAGA, Ciro ESTUDIANTE: Anaya Urea, David. SEMESTRE: VI 2013

TEMA:

PRUEBAS RPIDAS PARA LA TUBERCULOSIS

INTRODUCCIN A pesar que el tratamiento para Mycobacterium tuberculosis es conocido hace casi 50 aos, este ha tenido el problema de presentar patrones de resistencia a antibiticos desde el inicio debido a los regmenes de tratamiento no adecuados y a problemas en la adherencia del paciente. La aparicin de cepas MDR (multidrogo resistente, donde por lo menos hay resistencia a la vez de isoniazida y rifampicina) y XDR (que son cepas MDR que adems tienen resistencia a quinolonas y una droga de segunda lnea inyectable) crea la necesidad de buscar mtodos rpidos de diagnstico para poder iniciar un tratamiento personalizado (individualizado), reduciendo as las posibilidades de fracaso y/o recada, adems de evitar la propagacin de dicha cepa en la comunidad, las pruebas rpidas de susceptibilidad podran permitir determinar el patrn de resistencia, permitindole al mdico brindar un tratamiento adecuado lo ms pronto posible. Las tasas encontradas en el Per de TB-MDR son de 5,3% en pacientes sin episodio previo de TB y de 24% en aquellos previamente tratados2, lo cual muestra un escenario en donde la TB-MDR (encontrndose ya reportes nacionales sobre la TB-XDR3) es un problemas creciente en nuestro pas; por lo que se hace necesaria la bsqueda de diagnsticos ms rpidos de los patrones de resistencia, que permitan la identificacin rpida del paciente y su inmediato inicio de tratamiento. Estos mtodos diagnsticos son directos o indirectos: directo es cuando se usa la muestra de esputo directamente en la prueba, e indirecto es aquella prueba que se necesita una cepa previa (hay que realizar un cultivo de la muestra de esputo, de donde se sacar la respectiva cepa en la que se realizar la prueba de sensibilidad). En esta revisin se muestran aquellas pruebas de sensibilidad disponibles segn la Norma Tcnica para el control de la tuberculosis y algunas otras que estn en fase de investigacin, principalmente en nuestro pas.

EXAMEN MICROSCPICO A pesar de que en los ltimos aos la micobacteriologa ha experimentado importantes avances tecnolgicos, el diagnstico precoz de la tuberculosis en el laboratorio sigue recayendo en el examen microscpico (Baciloscopia) de las muestras clnicas teidas de manera adecuada. En la actualidad, es el procedimiento ms simple, ms barato y ms rpido para proporcionar al clnico una orientacin diagnstica preliminar. El examen microscpico permite valorar la calidad de los especmenes clnicos recibidos, identifica los pacientes ms contagiosos y adems resulta til para monitorizar la respuesta de los pacientes al tratamiento antimicobacteriano.

BACILOSCOPIA Y TINCIONES ACIDORRESISTENTES Uno de los mtodos convencionales ms rpidos para la deteccin de las micobacterias, es la baciloscopia, que consiste en la visualizacin microscpica mediante la tincin de Ziehl-Neelsen para la bsqueda de bacilos cido alcohol resistentes (BAAR) en preparaciones obtenidas de los diferentes especimenes biolgicos. Es muy til en tuberculosis pulmonar, donde con tres baciloscopias de esputo se puede establecer la presencia de micobacterias en un 70% a un 80%. En sta tcnica se utilizan dos tipos de coloraciones para microorganismos acidorresistentes: las coloraciones con carbolfuscina Ziehl-Neelsen (Coloracin en caliente), Kinyoun (Coloracin en fro); y la Coloracin con fluorocromo Auramina O, con o sin un segundo fluorocromo, la Rodamina.

1. COLORACIN DE ZIEHL-NEELSEN

La pared celular de las micobacterias confiere la singular capacidad de ligarse al colorante fuscina de modo que resiste la accin del alcohol cido. El mecanismo del cido alcohol resistente, es un mecanismo doble que requiere la penetracin de la fuscina al citoplasma bacilar, as como la interaccin qumica con los cidos miclicos y los pptidos glicolpidos presentes en la pared celular de las micobacterias. Esta reaccin impide la salida de la fuscina atrapada en el citoplasma celular, cuando es expuesta a la accin del alcohol cido. El papel del mordiente (solucin fenolada) es definitivo porque fomenta la penetracin de la fuscina y su unin con los glucopeptidos bacilares, hacindola ms liposoluble y menos hidrosoluble. Esta reaccin de tincin permite la visualizacin de los bacilos rojos contra un fondo azul, lo que se denomina bacilos acidorresistentes. Aunque las tcnicas de Ziehl-Neelsen y Kinyoun en teora son las mismas, la experiencia de algunos investigadores indica que la primera es ms sensible para detectar micobacterias de crecimiento rpido. La sensibilidad de las tinciones acidorresistentes vara entre 40-75%. Existen estrategias para aumentar la sensibilidad como recolectar entre 5-10 ml de esputo, recolectar tres muestras de esputo como mnimo, en caso de tuberculosis pulmonar, debido a la liberacin irregular e intermitente de estas bacterias a la luz bronquial. REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguno. REQUISITOS DE LA MUESTRA Las muestra remitidas al laboratorio deben cumplir una serie de condiciones generales de las que depende la calidad y eficiencia de los resultados microbiolgicos: indicacin correcta del estudio de micobacterias, seleccin de la muestra ms representativa, y rentable, recogida de forma estril en cantidad suficiente, y si es posible antes del inicio del tratamiento antimicobacteriano. No deben utilizarse fijadores ni sustancias conservantes. Tampoco es recomendable emplear escobillones, hisopos o torundas de algodn. Las muestras se deben recoger y enviar en contenedores estriles de un solo uso y con cierre hermtico. Las muestras que no vayan a ser remitidas de manera inmediata al laboratorio debern guardarse refrigeradas 2-8C. Cualquier tipo de material clnico puede contener micobacterias, por lo que cualquier espcimen es susceptible de ser visualizado al microscopio. TIEMPO DE RESPUESTA -Peticiones urgentes sobre muestra directa: 1 hora -Muestras homogeneizadas: 1 da INFORME DE LOS RESULTADOS La siguiente es la escala adoptada internacionalmente para el informe de los resultados de extendidos examinados por la tcnica de Ziehl Neelsen:

El informe utilizando la escala semicuantitativa estandarizada asegura la reproducibilidad de los resultados y permite evaluar: - la gravedad de la enfermedad - la infectividad del paciente - la evolucin del paciente bajo tratamiento 2. COLORACIN AURAMINA-RODAMINA La auramina-O y la rodamina son colorantes inespecficos, fluorescentes bajo luz ultravioleta que se unen a los cidos miclicos de las micobacterias soportando la decoloracin con alcohol-cido. Esta coloracin tiene la ventaja que puede ser observadas con menor aumento de 200x y 400x, permitiendo la observacin de las muestras en menos tiempo y con mayor sensibilidad en las muestras paucibacilares.

CULTIVO DE MICOBACTERIAS EN MEDIOS LQUIDOS Y SLIDOS INFORMACIN CLNICA El aislamiento de micobacterias a partir del cultivo de muestras clnicas contina siendo fundamental para el diagnstico especfico de las infecciones por estos microorganismos. El cultivo ha demostrado ser ms sensible (101-102 bacterias viables/ml) que el examen microscpico. Adems, el aislamiento del agente causal permite la identificacin de la especie, los posteriores estudios de sensibilidad frente a los antimicrobianos, la monitorizacin de la efectividad del tratamiento, y la genotipificacin de cepas. DESCRIPCIN DEL MTODO Las micobacterias suelen ser bastante exigentes en cuanto a sus requerimientos nutricionales. Los medios de cultivo se pueden dividir en dos grupos bsicos: medios con huevo o con agar.

Medios slidos con huevo. Son medios ricos que contienen huevo (entero o slo yema), fcula de patata, sales, glicerol y un agente inhibidor como es el verde de malaquita. Las ventajas fundamentales radican en la buena recuperacin de gran parte de las especies micobacterianas y su buena capacidad tanto, inhibidora de la flora contaminante, como tamponante que permite neutralizar mltiples productos txicos presentes en las muestras clnicas, as como algunos restos de diversos productos descontaminantes. Adems, poseen una vida media prolongada cuando se conservan a 2-8 C (6 meses). Tambin presentan, a veces, algunos problemas para distinguir entre los restos del inculo y el crecimiento micobacteriano. Por ltimo, cuando se contaminan se afecta todo el medio pudiendo llegar a licuarse. Medios slidos con agar. Los empleados en la URM son los medios sintticos tipos Middlebrook 7H10 y 7H11. Son transparentes y permiten una deteccin rpida del crecimiento micobacteriano que puede distinguirse de los residuos de la muestra en la siembra. Adems se pueden utilizar para las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos. La inclusin de un 2% de glicerol permite un mejor crecimiento del complejo M. avium-intracellulare. El medio 7H11 contiene un 0,1% de hidrolizado de casena que favorece la recuperacin de las cepas de M. tuberculosis resistentes a la isoniacida. El almacenaje es delicado ya que el exceso de temperatura o la exposicin a la luz puede deteriorar el medio y

la produccin de formaldehdo que resulta txico para las micobacterias. La vida media es ms corta 1 mes a 2-8C. Medios lquidos. En general, son medios muy enriquecidos que recuperan un mayor nmero de micobacterias, y ms rpidamente que los medios slidos. Aparte de los clsicos Middlebrook 7H9, Dubos, Youmans, Proskauer-Beck, etc., existen una serie de sistemas comerciales que, utilizando la base de los convencionales incorporan sistemas totalmente automatizados de incubacin y lectura. En la Unidad de Referencia Regional de Micobacterias del HUCA para el aislamiento primario a partir de muestras clnicas se emplea una combinacin de medios lquidos (sistemas BactAlert 3D y Bactec MGIT 960) y slidos (Lwenstein-Jensen). REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguno. REQUISITOS DE LA MUESTRA Las muestras remitidas al laboratorio deben cumplir las condiciones generales comentadas anteriormente.

1. LWENSTEIN-JENSEN INFORMACIN CLNICA El medio slido de Lwenstein-Jensen es un medio a base de huevo, fcula de patata, glicerol y sales, solidificado por calentamiento de 85 a 95 C durante 30-45 min. La mayora de micobacterias crecen bien en Lwenstein-Jensen, este medio resiste muy bien la desecacin durante bastante tiempo, lo que conlleva caducidades largas, e incorpora verde de malaquita en concentraciones que dificultan el crecimiento de otros microrganismos no deseados. REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguno. REQUISITOS DE LA MUESTRA Las muestras remitidas al laboratorio deben cumplir las condiciones generales comentadas anteriormente. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Cultivo de Micobacterias: Positivo (se aslan bacilos cido-alcohol resistentes) Cultivo de Micobacterias: Negativo TIEMPO DE RESPUESTA Todos los cultivos son incubados durante un mnimo de 8 semanas, antes de considerarlos negativos.

2. SISTEMA BACTEC MGIT 960, medio de cultivo BBL MGIT INFORMACIN CLNICA El tubo MGIT (indicador de crecimiento micobacteriano) contiene 7 mL de base de Caldo Middlebrook 7H9 modificado. Los tubos deben suplementarse inmediatamente antes de su uso con OADC (cido oleico, albmina, dextrosa y catalasa) y la mezcla antibitica denominada PANTA (polimixina B, anfotericina B, cido nalidxico, trimetoprima, azlocilina). Este medio es apto para todo tipo de muestras clnicas, tanto pulmonares como extra-pulmonares, excepto sangre y orina. Los tubos inoculados se colocan en el incubador-lector para el control continuo hasta obtener una lectura positiva o hasta el final del procedimiento de anlisis. El suplemento OADC se aade con la finalidad de proporcionar nutrientes esenciales para el crecimiento rpido de las micobacterias. El cido desempea un papel importante en el metabolismo micobacteriano. La albmina acta como agente protector al ligar cidos grasos libres, los cuales pueden ser txicos para las especies Mycobacterium. La dextrosa es una fuente de energa. La catalasa destruye las peroxidasas txicas que pueden estar presentes en el medio. La microbiota acompaante se reduce al aadir PANTA al caldo base. Los tubos, de fondo redondo, llevan incorporado en su parte inferior-interna, un compuesto fluorescente incluido en silicona. El compuesto fluorescente es sensible a la presencia de oxgeno disuelto en el caldo. Inicialmente, la gran cantidad de oxgeno disuelto apaga las emisiones procedentes del compuesto y se puede detectar muy poca fluorescencia. Ms tarde, los microorganismos que respiran activamente consumen el oxgeno y permiten que se detecte la fluorescencia. Los tubos que se introducen en el instrumento BACTEC MGIT son incubados continuamente a 37C y ste controla los tubos cada 60 minutos para detectar un aumento en la fluorescencia. El anlisis de la fluorescencia se utiliza para determinar si el instrumento detecta el tubo como positivo, es decir, que la muestra analizada contiene organismos viables. Cada tubo que el instrumento detecta como positivo contiene aproximadamente 105 a 106 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL). Los frascos de cultivo que permanecen negativos durante un mnimo de 42 das y que no muestran indicios de ser positivos se retiran del instrumento como negativos. REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguno. REQUISITOS DE LA MUESTRA Las muestras remitidas al laboratorio deben cumplir las condiciones generales comentadas anteriormente. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Cultivo de Micobacterias: Positivo (se aslan bacilos cido-alcohol resistentes) Cultivo de Micobacterias: Negativo TIEMPO DE RESPUESTA Todos la muestra son incubadas durante un mnimo de 6 semanas antes de considerarlas negativas.

PRUEBA GENEXPERT INFORMACIN CLNICA La prueba Xpert MTB/RIF, que se usa con el sistema Cepheid GeneXpert, consiste en una PCR semicuantitativa, integrada y en tiempo real, que se utiliza para: 1) la deteccin de ADN de Mycobacterium tuberculosis en muestras clnicas 2) la deteccin de mutaciones asociadas a la resistencia a la rifampicina del gen rpoB en muestras de pacientes susceptibles de presentar resistencia a la rifampicina. La prueba MTB/RIF est pensada para usarse con muestras de pacientes no tratados que presentan indicios clnicos de padecer tuberculosis (TB). El uso de Xpert MTB/RIF para la deteccin de M. tuberculosis (MTB) o la determinacin de la resistencia a la rifampicina no ha sido validado para pacientes que estn recibiendo tratamiento para la tuberculosis. El ensayo Xpert MTB/RIF incluye reactivos para la deteccin de la tuberculosis y la resistencia a RIF, as como un control de procesamiento de muestra para controlar el adecuado procesamiento de las bacterias diana y para supervisar la presencia de inhibidores en la PCR. Mediante la funcin de comprobacin de sonda, se comprueba la rehidratacin de los reactivos, el llenado del tubo de RCP en el cartucho, la integridad de la sonda y la estabilidad del fluorocromo. Los iniciadores del ensayo Xpert MTB/RIF amplifican una porcin del gen rpoB que contiene la regin "central" de 81 pares de bases. Las sondas son capaces de distinguir entre la secuencia salvaje conservada y las mutaciones de la regin central que se asocian a la resistencia a RIF.

REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguno. REQUISITOS DE LA MUESTRA Las muestras remitidas al laboratorio deben cumplir las condiciones generales comentadas anteriormente. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Deteccin genoma M. tuberculosis complex: Positivo Deteccin genoma M. tuberculosis complex: Negativo

TIEMPO DE RESPUESTA 1-2 das laborables. GENOTYPE MDRPLUS INFORMACIN CLNICA

El kit Genotype MTBDRplus est basado en la tecnologa DNA y permite la identificacin mediante gentica molecular del complejo Mycobacterium tuberculosis y su resistencia a rifampicina y/o isonizida, desde cultivo o material de paciente procedente de muestras pulmonares con baciloscopia positiva. La identificacin de la resistencia a rifampicina es posible gracias a la deteccin de las mutaciones ms significativas del gen rpoB (que codifica por la subunidad de la ARN polimerasa). Para investigar la resistencia de isoniacida de alto nivel se amplifica el gen katG (que codifica la catalasa perioxidasa), y para la resistencia a isoniacida de bajo nivel, es examinada la regin del promotor del gen inhA (que codifica la NADH enoil ACP reductasa). El procedimiento completo se divide en tres pasos: aislamiento de DNA procedente de cultivo (placas de cultivo/medio lquido) o de material directo (muestras pulmonares baciloscopia positiva decontaminadas), una amplificacin mltiplex con primers marcados con biotina, y una hibridacin reversa. REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguno. REQUISITOS DE LA MUESTRA M. tuberculosis complex aislado en los medios de cultivo especficos para micobacterias a partir de las muestras clnicas que son remitidas regularmente al laboratorio y que cumplen las condiciones generales comentadas con anterioridad. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Se detecta mutacin en el gen rpoB y/o katG y/o inhA No se detecta mutacin en el gen rpoB y/o katG y/o inhA

TIEMPO DE RESPUESTA De 1-5 das laborables desde el aislamiento e identificacin de la micobacteria en los cultivos

PRUEBAS DE XIDO - REDUCCIN Estas pruebas estn basadas en la reduccin de un indicador aadido al medio de cultivo luego de que el M. tuberculosis ha sido expuesto in vitro a diferentes antibiticos; logrando detectar la resistencia con el cambio del color del indicador, por este motivo son tambin llamadas pruebas colorimtricas. Dentro de estas pruebas est la prueba de Griess y las pruebas que usan como indicadores al azul de alamar, MTT y resazurina. LA PRUEBA DE GRIESS fue inicialmente desarrollada en el Instituto Central de Investigacin de Tuberculosis en Mosc, Rusia. Consiste en una prueba colorimtrica de deteccin de sensibilidad de drogas de primera lnea, siendo ste es uno de los mtodos autorizados por la Norma Tcnica como prueba rpida para la deteccin de resistencia a isoniazida y rifampicina. Una de las grandes ventajas que tiene este mtodo es que se cre para poder ser realizado con materiales accesibles para cualquier laboratorio. Se basa en la idea de que el M. tuberculosis tiene la habilidad de reducir el nitrato a nitrito, que es rutinariamente usado para la identificacin bioqumica de las especies de micobacterias. El medio de cultivo que se usa es el convencional Lwenstein Jensen (LJ) al que se le aade NaNO3, que es usado como sustrato para evaluar la reduccin del nitrato. La presencia de nitrito es fcilmente detectada con reactivos especficos (Reactivo de Griess), los cuales producen un cambio de color. Se considera que el resultado es negativo cuando no hay cambio de color o es un color rosado plido, y es un resultado positivo si es un color rosado brillante hasta un rojo o violeta. El tiempo promedio para la entrega de resultados es entre 7 a 18 das luego de haber obtenido el cultivo positivo (mtodo indirecto) o 21 a 28 das si se aplica a una muestra de esputo frotis positivo. MICROSCOPIC OBSERVATION DRUG SUSCEPTIBI-LITY (MODS) Es un mtodo de diagnstico rpido desarrollado en la Universidad Peruana Cayetano Heredia que permite tanto la deteccin como la realizacin de la prueba de susceptibilidad directa a drogas de primera lnea. Es tambin un mtodo rpido autorizado por la Norma Tcnica para la deteccin de resistencia a isonizacida y rifampicina4. Se basa en tres principios: 1. M. tuberculosis crece ms rpido en medios lquidos en comparacin con medios slidos. 2. La morfologa del M. tuberculosis en cultivos lquidos es caracterstica y reconocible, la que consiste en cordones formados por los microorganismos. Por medio de un microscopio de luz invertido se examinan placas con una delgada capa del medio

Middlebrook 7H9 y sembradas con esputo decontaminado, de esta manera el M. tuberculosis se puede detectar antes que sea visible a simple vista. 3. La incorporacin de drogas anti-TB permite realizar susceptibilidad a rifampicina e isoniacida. En un ensayo clnico realizado en nuestro pas18 reportan un tiempo promedio de positividad del cultivo y de la prueba de susceptibilidad de siete das, teniendo adems una sensibilidad y especificidad de 97,8% y 99,6% respectivamente. Este mtodo, debido a su bajo costo y su rapidez para detectar TB-MDR, est en proceso de implementacin en el Per, se espera ver en dos aos el impacto de este mtodo en el sector pblico. Las principales limitaciones de este mtodo son la necesidad de un microscopio invertido y el entrenamiento para reconocer la formacin de cordones. CONCLUSIONES En los ltimos aos se ha producido un vertiginoso avance en las tcnicas diagnsticas de la tuberculosis. La aparicin del virus de la inmunodeficiencia humana ha despertado ms el inters en ellas, dado que contribuye a incrementar la incidencia de la tuberculosis en el mundo. Es as como el diagnstico se convierte en la piedra angular dentro de la lucha contra la tuberculosis, aunque se ha demostrado que en el perodo comprendido entre la consulta y el diagnstico se pierden alrededor del 40% de los casos. De otra parte los avances tecnolgicos y la variabilidad de las pruebas de diagnstico, se encuentran en los pases desarrollados en contraste con los pases en vas de desarrollo o subdesarrollados, donde se concentra el mayor porcentaje de enfermos que no pueden acceder a dicha tecnologa. Por consiguiente, se hace indispensable implementar nuevos mtodos, en los laboratorios de bacteriologa que garanticen precisin, bajo costo, oportunidad de acceso a toda la poblacin, sin que los costos sean muy altos. El xito del tratamiento de la tuberculosis depende de muchos factores, como tratamiento y apoyo al paciente; sin embargo, debido al problema existente de tuberculosis MDR, es imperativo que se universalice las pruebas de sensibilidad (que sean rpidas y econmicas para que estn a la alcance de nuestra realidad) a todos los pacientes con diagnstico de tuberculosis, ya que permitir un tratamiento adecuado con la consiguiente recuperacin integral del paciente, adems que a largo plazo permitir no seguir favoreciendo la aparicin de nuevas cepas resistentes y el aumento de los casos de tuberculosis MDR y XDR.

BIBLIOGRAFA

. QUIRS, G. DURANGO. ARTCULOS DE INVESTIGACIN CIENTFICA O TECNOLGICA. Utilidad de la tcnica genotype MTBDRplus para el diagnstico de tuberculosis pulmonar. CES Med. vol.25 no.1 Medelln Jan./June 2011 C. Ugarte; M. Alvarez. ARTCULO DE REVISINPruebas de sensibilidad para Mycobacterium tuberculosis. Acta md. peruana v.25 n.3 Lima jul./set. 2008. URL: file:///F:/Acta%20M%C3%A9dica%20Peruana%20%20Pruebas%20de%20sensibilidad%2 0para%20Mycobacterium%20tuberculosis.htm http://www.slideshare.net/degarden/56609323tincionfluorescenteconauraminarodamina http://www.slideshare.net/normagarciiadeleon/tincin-de-ziehl-neelsen http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S0120-87052011000100005&script=sci_arttext http://www.slideshare.net/Vittyman/practica-3-tinciones-bacterianas sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/rmv/v04n1/pdf/a03v4n1.pdf http://www.hca.es/huca/web/contenidos/websdepartam/Cartera%20Laboratorios/Uni dad%20Ref%20Regional%20Micobacterias.pdf