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Barajas-Lpez y Robinson-Fuentes.

M
RESUMEN

EDICIN DE LA TASA DE FILTRADO GLOMERULAR POR ELECTROFORESIS CAPILAR CON TRES MARCADORES RADIOGRFICOS EN PERROS
Barajas-Lpez Ignacio y Robinson-Fuentes Virginia

Maestra en Ciencias de la Salud de la Facultad de Ciencias Mdicas y Biolgicas Dr. Ignacio Chvez. U.M.S.N.H.:

La determinacin de la tasa de filtrado glomerular (TFG) es considerada en general como el parmetro ms importante de la cuantificacin de la funcin renal. Su estimacin se ha realizado a travs del aclaramiento renal y para esto, se han usado marcadores difciles de manejar. Es por esto que se han investigado otros marcadores que son ms fciles de manejar porque son no radioactivos, se usan en concentraciones bajas y se ha visto que algunos de ellos pueden analizarse mediante cromatografa de lquidos y con deteccin por fluorescencia. Ejemplos de estos marcadores son el iotalamato, el iohexol y el iopamidol. Para estos, ya existen algunos mtodos de anlisis publicados; sin embargo, en este trabajo se quiere analizarlos por Electroforesis Capilar (EC) que es una tcnica de separacin que combina la precisin y control de instrumentacin de la cromatografa lquida, adems de presentar las ventajas de ser rpida, se puede automatizar, requiere volmenes de muestra y reactivos reducidos. En este trabajo se desarrollara la metodologa necesaria para analizar iotalamato, iohexol y iopamidol en sangre y orina de perros sanos y as estimar la TFG. Para esto se cont con una camada de seis perros en los que se ensay un protocolo con los diferentes marcadores que han sido identificados por EC y se espera permitan medir la TFG en perros sanos. Palabras clave: Filtrado glomerular, electroforesis capilar, iohexol, iopamidol, iotalamato.

INTRODUCCIN Actualmente en medicina veterinaria, el funcionamiento renal en los perros se valora por la medicin de la urea y la creatinina en suero que son un reflejo crudo de la tasa de filtrado glomerular (TFG), as como la densidad urinaria. Uno de los problemas ms persistentes con la valoracin de la funcin renal es la baja sensibilidad diagnstica de los parmetros tradicionales de laboratorio ya que la creatinina srica, uno de los analitos ms usados, solamente se incrementa despus que se ha perdido ms del 75% de la masa renal. Adems, la urea es afectada por condiciones no renales como la dieta, funcin heptica y flora bacteriana intestinal (Heine y Moe, 1998; Reyers, 2003). Cuando los valores de urea y creatinina se observan elevados (azotemia), junto con la densidad urinaria menor a 1.030, se diagnostica insuficiencia renal en el perro. Sin embargo, estas pruebas tienen la limitacin de ser poco especficas y no permiten establecer un diagnstico temprano de esta patologa (Polzin, 2007). [Pgina 1]

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La base de la formacin de la orina es la ultrafiltracin del plasma en el glomrulo. La medicin de la magnitud de esta filtracin por lo tanto es generalmente aceptada como el mejor ndice general de la funcin renal, pero la TFG no puede ser medida directamente, y es estimada usando un marcador que se elimine por el filtrado glomerular (Levey, 1989). La TFG se ha definido como el volumen de plasma que puede ser completamente aclarado (limpiado) de una sustancia en particular por los riones en una unidad de tiempo (Heymsfield et al., 1983), y es considerada el mejor ndice para evaluar la funcin renal en sujetos sanos y enfermos. Esta medicin es usada para estimar la efectividad de los tratamientos que se aplican, para disminuir el avance de la enfermedad renal o valorar la condicin de riones trasplantados (Rose, 1985). La evaluacin exacta del flujo sanguneo renal y la TFG son tambin necesarios para ayudar a los fisilogos y farmaclogos para interpretar los datos clnicos y experimentales (Boschi y Marchesini, 1981), y es superior a las mediciones en plasma de creatinina y la cistatina C y otras pruebas sencillas de la funcin renal (Bexfield et al., 2008). La determinacin de la TFG se puede realizar midiendo la tasa de excrecin urinaria de algn compuesto endgeno o exgeno que sea libremente filtrado en el glomrulo renal, que no se metabolice en el organismo ni se secrete o absorba en los tbulos renales y por ello se excrete en la orina libremente (Barbour et al., 1975). Las indicaciones para la medicin precisa de la TFG en medicina veterinaria son amplias. Se incluye la bsqueda de enfermedad en animales

con poliuria no azotmicos o incrementos moderados de la concentracin plasmtica de creatinina, monitoreo en razas con predisposicin a una enfermedad renal familiar, monitoreo pre quirrgico o posterior a un tratamiento, para guiar la dosificacin cuando se emplean drogas que tengan eliminacin por va renal y para evaluar los efectos de la dieta u otras intervenciones teraputicas sobre la funcin renal. La medicin secuencial de la TFG tambin provee informacin til sobre las alteraciones de la funcin renal con el paso del tiempo (Bexfield et al., 2008). La medicin de la TFG es crtica en el manejo de los pacientes enfermos. La cuantificacin rigurosa de la TFG requiere de pruebas de aclaramiento renal. La prueba de aclaramiento con la inulina se consideraba la prueba estndar de oro (Rose, 1985), sin embargo, este mtodo clsico de aclaramiento no es accesible universalmente, ya que requiere infusin intravenosa y la recoleccin completa de orina que la hace una tcnica tediosa, adems requiere un anlisis qumico complejo, del que no disponen la mayor parte de los laboratorios, haciendo difcil el procesamiento central de muestras (Hall y Rolin, 1995), por lo que no es prctico su uso en la clnica ni en los estudios de investigacin (Barbour et al., 1975). Como consecuencia, nuevos marcadores alternativos y mtodos de aclaramiento se han desarrollado y validado (Gaspari et al., 1991). Las caractersticas ideales de un marcador de filtracin ideal son que no altere la permeabilidad capilar glomerular durante la filtracin glomerular, no se una a los glbulos rojos o a las protenas plasmticas en la circulacin, no exista escape extrarenal (a menos que sea completamente reversible, como en el liquido del espacio intersticial), no exista [Pgina 2]

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secrecin tubular (aun que si bien se ha probado que el indicador es completamente retenido en el epitelio tubular, la reabsorcin tubular es tericamente permitida si el aclaramiento plasmtico est siendo medido) y que no exista difusin a travs de la membrana tubular siguiendo la filtracin (la cual ocurre si existe necrosis tubular extrema, pero tambin a bajas tasas en otras formas clnicas menos obvias de dao tubular, como en la nefrotoxicidad por ciclosporinas) (Peters, 2004). Sustancias que han sido usadas como marcadores del filtrado glomerular, adems de la inulina, incluyen a: (1) quelatos solubles radioactivos, como 51Cr-EDTA y 99TcDTPA; (2) quelatos no radioactivos, como Gd-DTPA; (3) medios de contraste radioactivos, como el 131Iiotalamato; y (4) medios de contraste urolgicos no radioactivos, tanto los monmeros inicos (p. ej.: metrizoato, diatrizoato, iotalamato), como los monmero no inicos (p. ej.: iohexol, iopamidol, iopromida). Ha existido un incremento en el uso de medios de contraste no radioactivos como marcadores en la medicin de la TFG. El iohexol, un monmero no inico ha venido siendo uno de los marcadores de la TFG ms comnmente usado en Europa. Se asume que otros monmeros no inicos, como el iobitridol, iomeprol, opamidol, ioversol y el iopromide, son igualmente efectivos como marcadores de la TFG debido a sus caractersticas farmacocinticas similares (Frennby y Sterner, 2002). Meucci et al., (2004), realizaron la medicin del flujo de plasma renal y TFG en perros con la administracin

intravenosa de iohexol y cido paminohiprico por cromatografa de lquidos de alta resolucin. Estos mtodos evitan el uso de radioistopos pero requieren una labor intensa, por lo tanto, no han sido ampliamente aceptados para su uso de rutina. Otros mtodos se han enfocado en la medicin de la concentracin de iohexol en plasma por fluorescencia de rayos X y estimar el aclaramiento con una o dos muestras de sangre. La tcnica con fluorescencia evita los problemas asociados a los radioistopos pero es menos sensitivo y requiere la aplicacin de dosis relativamente elevadas del frmaco en los sujetos para medir la TFG (Brown y ORilly, 1991). La EC combina la separacin selectiva de la electroforesis estndar con la precisin y control de instrumentacin de la cromatografa de alta resolucin (Stocking et al., 1998). La electroforesis se refiere a la migracin de especies elctricamente cargadas en solucin o suspensin en un electrolito, cuando se les hace pasar una corriente. Los cationes migran hacia el electrodo cargado negativamente (nodo) y los aniones son atrados hacia el electrodo cargado positivamente (ctodo). Los solutos neutros no son atrados a ninguno de los electrodos. La EC es una tcnica relativamente nueva que separa molculas cargadas o no cargadas en un capilar delgado lleno de solucin buffer por la aplicacin de un voltaje. La separaciones por EC son extremadamente rpidas: algunas son obtenidas en menos de 5 minutos, con estudios de reproducibilidad que comnmente muestran una covarianza menor del 2% (Jenkins, 2000). El iotalamato es un medio de contraste radiopaco iodado, inico, indicado para angiografa, nefrografa y urografa. Es [Pgina 3]

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hidrosoluble con un peso molecular de 821.138 g/mol, y se le ha estimado una vida media de 45 min. (Frennby y Sterner, 2002). El iohexol, es un medio de contraste radiogrfico, iodado no inico, con bajo peso molecular, lo cual lo hace seguro y no txico en estudios angiogrficos y urolgicos, que se elimina del plasma exclusivamente por filtrado glomerular (Back et al., 1988). La vida media del iohexol en plasma es de ~90 minutos, se distribuye en el espacio extracelular y presenta una unin menor del 2% a las protenas plasmticas (Krutzen et al., 1984). El iohexol es excretado completamente sin metabolizar en la orina, con una recuperacin del 100% en las 24 hrs posteriores a la aplicacin. La eliminacin extra renal del iohexol es insignificante en situaciones de reduccin de la TFG (Nilsson-Ehle y Grubb, 1994). Debido a que el iohexol puede ser cuantificado en pequeas cantidades, se puede muestrear tanto de vasos venosos como de capilares. El iopamidol es un medio de contraste iodado nefrotrpico, no inico, de bajo peso molecular, de uso intravascular para estudios de angiografas y urografa. Su peso moleculares es de 777.08 g/mol (Krutzel et al., 1990).

La pruebas en suero y orina, usando electroforesis capilar en zona (ECZ), para la medicin del aclaramiento con los medios de contraste iohexol y el iotalamato como marcadores de la TFG han sido descritos en humanos. Una ventaja que presenta la medicin de la TFG con iotalamato por EC es que requiere dosis bajas del medio de contraste, pocas tomas de muestra de sangre y orina en tiempos relativamente cortos (Bergert et al., 1997; Wilson et al., 1997), pero su uso en perros no se ha reportado como tampoco se ha reportado el uso de iopamidol. El objetivo de este trabajo es medir la tasa de filtrado glomerular con tres marcadores radiogrficos por electroforesis capilar, para lo cual se propone estandarizar la metodologa de electroforesis capilar para identificar y cuantificar los marcadores radiogrficos, iotalamato, iopamidol e iohexol (Figura 1), en sangre y orina de perro por electroforesis capilar de zona, y as calcular la TFG por aclaramiento plasmtico y renal con estos marcadores en perros sanos.

Figura 1. Estructura qumica de los marcadores radiogrficos: a) iotalamato; b) iohexol, c) iopamidol.


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MATERIAL Y MTODOS Tipo de estudio. El presente estudio es de tipo experimental, transversal y estructurado. Cumple con las Normas Oficiales Mexicanas NOM-062-ZOO1999, que se refiere a las especificaciones tcnicas para la produccin, cuidado y uso de los animales de laboratorio; y la NOM-087ECOL-1995, que establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos que se generan en establecimientos que presten atencin mdica. Reclutamiento de animales. Se obtuvieron seis perros (Canis familiaris) de raza criolla de una misma camada de un particular en la ciudad de Morelia, Mich., los cuales se identificaron con un collar numerndose progresivamente del 1 al 6. Para cada uno de ellos se abri un expediente clnico donde se registraron las variables de inters. Para valorar su estado de salud se realiz un examen clnico y se tomaron muestras de control para hemograma, perfil bioqumico renal (urea, creatinina, protenas totales, albumina, globulinas, relacin albumina: globulinas, calcio, fsforo, sodio, potasio, cloro, bicarbonato, anion GAP y diferencia de iones fuertes), urianlisis, biopsia renal para estudio de histopatologa y medicin de la presin arterial perifrica por oscilometra. Se alojaron individualmente en jaulas de 3.0 m2 de la Clnica Veterinaria de la UMSNH. Se procedi al aseo de los perros con jabn de uso veterinario, la administracin de desparasitantes va oral y se aplic un ectoparasiticida tpico. 10 das despus

se les aplico, va IM, una vacuna polivalente para la inmunizacin activa contra los principales patgenos (Distemper canino, Adenovirus Tipo 2, Parainfluenza, Parvovirus canino, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae y Coronavirus canino). Se les ofreci alimento comercial para perros en crecimiento en forma de croquetas conforme a las recomendaciones del fabricante de acuerdo a la edad y peso, y agua a libre acceso. Las instalaciones se mantuvieron en buen estado durante todo el proceso de investigacin, diariamente se les sac a caminar por una hora, los perros se condicionaron al manejo del personal el cual consisti en subirlos a la mesa de exploracin, realizar muestreo y medir de la presin arterial perifrica. Medicin de la Tasa de Filtrado Glomerular con por ECZ. Los anlisis electroforticos se realizaron en un aparato de electroforesis capilar (Beckman P/ACE MDQ) equipado con detector de arreglo de diodos, empleando capilares de slice fundida de 75 m de dimetro interno (Polymicro Tech., Phoenix, USA) de 40 cm de longitud. Se utilizan soluciones buffer de borato a un rango de concentraciones de 5 a 20 mM, con un rango de pH de 10.5 a 12.0. Los voltajes se modificaron de 5.0 a 27.5 KV, y la temperatura del capilar se mantuvo a 20C. Se prepararon soluciones de los tres marcadores en concentraciones que van de 6 a 48 g/mL. Estas soluciones se realizan tanto en plasma como en orina de perro sano. La orina del perro fue centrifugada a 3000 rpm por 10 min, desech el sedimento y posteriormente la orina se filtro con membranas de 45 m y se diluyo 1:10 con la solucin buffer de corrimiento. Las muestras de plasma se trataran de acuerdo a los descrito por Wilson et al. (1999), para desproteinizarlas por [Pgina 5]

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centrifugacin con microfiltros de 10 m (Amicon 10). Para evaluar los parmetros de validacin del mtodo (precisin, exactitud, linealidad y reproducibilidad) las soluciones descritas se inyectan en el instrumento en cinco niveles de concentracin (48, 36, 24, 12 y 6 g/mL) con cinco repeticiones cada una, por tres das diferentes. Protocolo de aplicacin de los marcadores. Se modifico el protocolo descrito por Wilson et al., (1999), aplicando los marcadores va intravenosa a los animales con una semana de separacin entre la aplicacin de cada marcador. Los marcadores aplicados fueron iotalamato Conray (600 mg/mL de iodotalamato de sodio, Mallinckrodt, EEUU), iohexol Omnipaque (612.4 mg/mL de iohexol, Amersham Health, EEUU), y el iopamidol Iopamiron 300 (612.4 mg/mL de iopamidol, Schering AG, Italy). Previo ayuno de 12 hrs, cada perro fue pesado y se le coloc tanto un catter en una vena perifrica (Ceflica o Safena), como un catter vesical. Los marcadores radiogrficos fueron administrados por va intravenosa empleando jeringas para insulina en un volumen de 0.5 mL por animal en bolo IV, en un periodo de 30 a 60 segundos, seguido de 10 mL de cloruro de sodio al 0.9%. La aplicacin de los medios se inicio entre las 9:00 y las 11:00 AM. Se ofreci agua a libre acceso previo al inicio del estudio y posteriormente cada hora durante los estudios cinticos, una vez terminados stos se les ofreci su dieta habitual. Los perros fueron pesados nuevamente al trmino del estudio. Las muestras de sangre (2 a 3 mL) se colocaron en tubos de Vacutainer heparinizados. La

aplicacin del marcador represento el tiempo cero. Se obtuvieron muestras de sangre antes de la aplicacin del marcador (P0) y a los 5, 15, 30, 50 (P1), 95 (P2), 180, 260, 320, 440, y 600 minutos (min) despus de la inyeccin. Se vaci la vejiga por la sonda con jeringa a los 45 min posteriores a la aplicacin del medio (UE), esta muestra fue desechada, y posteriormente se cuantifico la produccin de orina (mL/kg) de los siguientes 45 min y obtuvo una muestra de orina (U1). Para confirmar que la vejiga se encontraba vaca se monitoreo por medio de ultrasonido abdominal (Aloka 500, trasnsductor de 5 mHz). Durante el estudio los animales se mantuvieron en jaulas individuales y se les coloc un collar isabelino para evitar que se quitaran los catteres. Las muestras de sangre fueron centrifugadas a 1,000 g por 7 min para obtener el plasma. El plasma separado y la orina se mantuvieron en congelacin a -70C hasta su procesamiento. Las muestras de plasma (P1 y P2) y orina (U1) fueron utilizadas para calcular el aclaramiento renal y para el aclaramiento plasmtico se emplearon las 10 muestras de plasma post aplicacin (Heine y Moe, 1998). RESULTADOS Y DISCUSIN La camada de los seis perros tuvo un periodo de crianza y acondicionamiento de cuatro meses. Se determinaron clnicamente sanos de acuerdo con los resultados de hemograma, urianlisis, perfil bioqumico y estudios histopatolgicos. Estos estudios fueron repetidos despus de un consumo de alimento y agua, dentro de rangos normales, sin que se presentaran cambios significativos. La medicin de la presin arterial perifrica, realizada con un monitor digital [Pgina 6]

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de tipo oscilomtrico, demostr que despus de la aplicacin intravenosa de los diferentes marcadores no se observaron reacciones adversas. Empleando tanto el buffer de borato de sodio 5 mM, a pH de 11.3 y 12.0, de 5 a 25 KV para determinar el iotalamato; como el buffer de borato de sodio 5 mM, a pH de 11.3 y de 5 a 20 KV para determinar el iohexol y el iopamidol en las diferentes muestras, se lograron obtener picos simtricos y agudos individuales para cada marcador. En todos los casos se estableci una ventana para que ningn componente de la orina interfiriera con el pico electrofortico del marcador en cuestin. a

En la Figura 2 se muestran los electroferogramas obtenidos para cada uno de los tres marcadores, los cuales fueron aplicados y analizados por separado. Las condiciones de ensayo varan para el iotalamato (Figura 2a) no as para el iohexol y el iopamidol que utilizan las mismas condiciones (Figura 2b). Estos resultados demuestran la especificidad del sistema, ya que es posible separar las seales de los compuestos involucrados en picos individuales. Adems, la desviacin estndar relativa para el tiempo de migracin, de 1.7%, corrobora la reproducibilidad del sistema.

Figura 2. Electroferogramas de orina diluida 1:10 en borato 5 mM, capilar de 40 cm, 75 m DI, 20C, y longitud de onda de 254 nm, a) Electroferogramas superiores de orina sola diluida 1:10 en borato y electroferogramas inferiores de orina diluida 1:10 en borato con spiking de iotalamato 48 g/mL realizados con borato a 5 mM, pH 12 y 25 KV; b) Electroferograma inferior de orina sola diluida 1:10 en borato; electroferograma de en medio de orina diluida 1:10 en borato con spiking de iohexol 10.2 g/mL y electroferograma superior de orina diluida 1:10 en borato con spiking de iopamidol 10.2 g/mL realizados a 7.5 KV con borato 5 mM a un pH 11.3.

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En la Figura 1 se observa que las estructuras qumicas que presentan el iopamidol y el iohexol son semejantes y diferentes a la estructura qumica del iotalamato. Esta diferencia estructural trae como consecuencia que las condiciones electroforticas para analizar al iopamidol y al iohexol fueran diferentes que para analizar al iotalamato. Actualmente, se estn obteniendo los parmetros de validacin faltantes para as proceder a analizar las muestras obtenidas de los protocolos de administracin de los marcadores en los perros, con la finalidad de determinar las TFG en dichos animales.
Agradecimientos INBL agradece a la Coordinacin de la Investigacin Cientfica de la UMSNH por el financiamiento dentro del Programa de Investigacin 2009, a la UMSNH por la beca de estudio otorgada y al apoyo por parte del personal de la Clnica Veterinaria de la UMSNH. Referencias
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