STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Docente: M.Sc. Lic. Flores Rios Abraham Auxiliar: Univ. Vargas Gonzales J. Maricela Estudiante: Bonilla Herbas Laura Angelica Grupo: mircoles G-5 Fecha: 11 diciembre 2013

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

OBJETIVOS
Objetivo General Determinar la presencia de staphylococcus aureus en una muestra. Objetivos Especficos Determinar la presencia de staphylococcus aureus en la carne molida por el mtodo recuento en placa. Comparar los resultados obtenidos con una norma especfica.

MARCO TEORICO
Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por formas cocaceas de 0,8-1.0 m de dimetro, que se dividen en ms de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en racimos. Son inmviles y carecen de esporas. Son grampositivas. Es una especie muy sensible a la accin del calor y de los desinfectantes. Su presencia o la de sus toxinas en los alimentos es signo evidente de falta de higiene. Una caracterstica muy importante de este germen es que sus toxinas pueden ser causa de intoxicacin cuando se ingieren con los alimentos. En general, la presencia de un nmero elevado de Staphylococcus aureus en un alimento refleja higiene defectuosa por mala manipulacin. Si, adems, los St. Aureus aislados son cepas enterotoxigenicas, suponen un riesgo para la salud. Mtodo de recuento en placas Se utiliza cuando se sospecha que el alimento por analizar contiene ms de 100 St. aureus por gramo. Se lo hace a partir de la siembra en el medio agar Baird-Parker. Se selecciona placas que contengan 20 y 200 colonias tpicas. Una vez contadas estas colonias en las placas elegidas, la cifra obtenida se multiplica por el factor de dilucin de la placa, lo que da el recuento total de St. aureus. Despus de esto se realiza las pruebas confirmativas Pruebas confirmativas Se selecciona como mnimo, dos colonias tpicas para su confirmacin. Con este fin, se investiga la capacidad de la cepa en estudio de producir:

Coagulasa Desoxirribonucleasa

Investigacin de coagulasa: las colonias tpicas se siembran en caldo cerebro corazn a los cuales despus de un tiempo de incubacin se aade plasma de conejo EDTA. La reaccin es positiva cuando el coagulo formado es firme. Investigacin de desoxirribonucleasa: la desoxirribonucleasa es una poderosa enzima elaborada por las cepas patgenas de St. aureus. Se caracteriza por depolimerizar el ADN y por su termo resistencia, razn por la que se denomina termonucleasa.

MATERIALES Y MEDIOS
Materiales 2 botes 1 bolsa estomacher 1 mechero Pipetas de 2,5 y 10ml 3 placas Petri con agar BairdParker 1 encendedor 1 gradilla 4 tubos de ensayo para las diluciones Balanza Cuchara Muestra : carne molida Alcohol 70% Desinfectante 15% tubos para el caldo BHI tubos para la mezcla de BHI con plasma de conejo. Medios Baird-Parker Caldo cerebro corazn BHI Plasma de conejo EDTA

PROCEDIMIENTO
Preparar la serie de diluciones poniendo 9ml de solucin fisiolgica a los 4 tubos de ensayo. Preparar la solucin madre con 25g de carne molida y 225 de solucin fisiolgica (dilucin -1) De la dilucin -1 trasvasar 0,2ml a la primera placa Petri (-1) que tiene el agar solidificado Baird-Parker y 1ml mas al primer tubo de ensayo (dilucin-2), homogeneizar bien la dilucin -2.

De la dilucin -2 trasvasar 1ml al segundo tubo de ensayo (dilucin-3) y homogeneizar. De la dilucin -3 trasvasar 0,2ml a la segunda placa Petri (-3) que tiene el agar solidificado Baird-Parker y 1ml al tercer tubo de ensayo (dilucin -4) hogeneizar. De la dilucin -4 trasvasar 1ml al cuarto tubo de ensayo (dilucin-5) y homogeneizar. De la dilucin -5 trasvasar 0,2ml a la segunda placa Petri (-5) que tiene el agar solidificado Baird-Parker. Esparcir la muestra en el agar Baird-Parker con un asa driglaski previamente esterilizada, empezar por la dilucin ms pequeas (-5) hasta llegar a la menos diluida (-1). Todas las placas Petri llevar a incubar a 37C por 24 horas. Despus de la incubacin hacer el conteo y escoger la placa de conde se hara la confirmacin. Escoger 3 colonias tpicas de la dilucin seleccionada. Sembrar con un asa aguja previamente esterilizada la primera colonia seleccionada en el caldo BHI, hacer lo mismo con las otras dos colonias siempre esterilizando el asa. Llevar a incubar a una temperatura de 37C por 24 horas. De los tubos que salieron positivo (turbidez) realizar la prueba de coagulasa. En un tubo aadir 0,1 ml del cultivo positivo obtenido en caldo BHI y 0,3ml de plasma de conejo EDTA, hacer lo mismo con los que salieron positivos. Incubar a 37C por 24 horas y ver si da coagulasa positiva

DATOS, CALCULOS Y RESULTADOS

Datos: Dilucin 1x10-1 1x10-3 #de 24 horas 11 0 colonias 48 horas 143 2 Prueba coagulasa: de 3 colonias seleccionadas nos dio 3 coagulasa (-) Clculos: 1x10-5 0 0

St. aureus= 0 Reporte de resultados: St. aureus= 0 UFC/g

OBSERVACIONES
El hecho que no nos haya dado coagulasa positiva es que las colonias seleccionadas tal vez no eran colonias tpicas pero las que escogimos tenan ese aspecto caracterstico que es una colonia negra con un halo transparente aunque el halo no era muy notorio. El halo de estas colonias no se pudo distinguir por el tiempo que paso ya que suele perderse despus de mucho tiempo. Otra posibilidad de que no nos haya dado coagulasa positiva es que podrimos haberlo quemado la muestra al instante de hacer la siembra en el caldo BHI

CONCLUSIONES
La presencia de St. aureus nos dio 0 UFC/g, ya que de las colonias supuestamente tpicas la confirmacin de coagulasa nos dio negativo. Para los Lmites establecidos por el Cdigo Alimentario Argentino en los art. 255, 302 y 286 bis para carne picada se tiene el siguiente rango: m=100/g M=1000/g, pero para coagulas positivo/g, esto nos demostrara que la muestra de carne que tenemos est libre de St, aureus.

BIBLIOGRAFIA
Libro Microbiologa Alimentaria Vicente Calderon y Pascual 2 edicin. Tema: investigacin y recuento de Staphylococcus aureus pag: 77 a 83

CUESTIONARIO

1. Detalle en forma esquemtica el mtodo de recuento en placa para anlisis de S. aureus en alimentos (incluyendo la prueba de confirmacion)

2. Cul es la diferencia entre intoxicacin alimentaria e infeccin alimentaria? R. En una infeccin, la enfermedad est causada por los microorganismos patgenos que se reproducen en el interior del organismo, como virus, bacterias o parsitos, mientras que la intoxicacin est provocada por la ingesta de toxinas presentes de forma natural en el alimento o aadidas de manera artificial. Si el trastorno lo origina un alimento contaminado con microorganismos, se habla de infeccin. Si, en cambio, se debe a las toxinas producidas por los grmenes presentes en el alimento, entonces se entiende que ocurre una intoxicacin. 3. S. aureus produce intoxicaciones o infecciones alimentarias? R. El S. aureus produce intoxicaciones alimentarias ya que los St. Aureus aislados son cepas enterotoxigenicas. 4. Cul es el fundamento de los diferentes medios empleados en la prctica indicando cuales son los componentes inhibidores y como es el desarrollo tpico de S. aureus en cada medio de cultivo? R. Baird-Parker: Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo slido, el cual inhibe el desarrollo de gneros diferentes al Staphylococcus, pero adems permite reconocer el desarrollo caracterstico del microorganismo buscado. En estos da colonias con actividad lecitinasa, son colonias circulares, brillantes, convexas, de 2-3 mm de dimetro, de color negro azabache o gris oscuro, con margen claro (blanco), rodeado por zona opaca y fuera de ella una zona clara, de consistencia cremosa Caldo cerebro corazn BHI: Recuperacin de la cepa, este paso permite restaurar las clulas daadas de Staphylococcus aureus. El tubo debe presentar turbidez. Plasma de conejo EDTA: presencia de la enzima coagulasa 5. Qu tipo de alimentos son susceptibles a la contaminacin de S. aureus? R. Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos de pastelera, como pasteles rellenos con crema, pies de crema, coberturas de chocolate, leche y sus derivados, rellenos para sndwiches y papas, son los ms comnmente asociados con intoxicaciones estafilocccicas. 6. Cul es el rango de recuento de colonias segn la norma ISO? R. Rango segn la ISO es: de 15 a 150 colonias. 7. Hacer un reporte de resultados con los siguientes datos obtenidos al procesar una muestra solida: Dilucin # de colonias tpicas en medio de cultivo VRBL -1 350 -2 32 -3 3

De la dilucin (-2) se realiz las pruebas confirmativas a 5 colonias de las cuales 3 colonias dieron coagulasa (+). El volumen de muestra sembrado es 0,2 ml.

UFC/g

COLIFORMES TOTALES Y FECALES

Docente: M.Sc. Lic. Flores Rios Abraham Auxiliar: Univ. Vargas Gonzales J. Maricela Estudiante: Bonilla Herbas Laura Angelica Grupo: mircoles G-5 Fecha: 11 diciembre 2013

COLIFORMES TOTALES Y FECALES

OBJETIVOS
Objetivo general Determinar la presencia de coliformes totales y fecales de una muestra Objetivos especficos Determinar la presencia de coliformes totales y fecales de la carne molida por el mtodo del nmero ms probable (NMP). Determinar la presencia de coliformes totales y fecales de la carne molida por el mtodo de recuento en placa. Comparar los resultados obtenidos con una norma de sanidad.

MARCO TEORICO
Las Enterobacteriaceae lactosa-positivas o grupo coli-aerogenes constituyen un grupo de bacterias que se definen ms por las pruebas usadas por aislamiento que por criterios taxonmicos. Pertenecen a la familia enterobacteriaceae se caracterizan por la capacidad de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas en un periodo de 48 horas a una temperatura de incubacin de 37C. Son bacilos gramnegativos, aerobios facultativos, no esporulados. Del grupo coliformes forman parte varios gneros: Escherichia Enterobacter Klebsiella Citrobacter

Se encuentran en el intestino, del hombre y de los animales, pero tambin en otros ambientes: suelo, plantas, cascara de huevo, etc. Dentro de este grupo, son los coliformes fecales los que tienen significado sanitario y por consiguiente, los que ms interesan en el anlisis microbiolgico de alimentos. Se considera a los coliformes fecales como presuntos escherichia coli. Sus principales caractersticas son: Aptitud para desarrollarse entre 43,5-45,5C. Capacidad para crecer en presencia de sales biliares. Facultad para producir indol en agua de peptona.

INVESTIGACION Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIACEAE LACTOSA-POSITIVAS (COLIFORMES) Investigacin y recuento en medio lquido (NMP) La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de 24 a 48 h. Finalmente, la bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioqumicas bsicas (IMViC) a las colonias tpicas. Investigacin y recuento en medio solido Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se desarrollan en ABRV, el cido producido por la fermentacin de la lactosa, ocasiona el vire del indicador rojo neutro y la precipitacin de las sales biliares por lo que las colonias son color rojo oscuro y generalmente estn rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas, de color rojo claro o rosa. La posibilidad de contar las colonias se fundamenta en su dispersin y separacin, como se explic en la tcnica de preparacin de diluciones. NOTAS Cuando se utiliza el medio de agar bilis rojo violeta (ABRV) para la cuenta en placa de coliformes, debe considerarse lo siguiente:

Si el alimento contiene mono o disacridos en altas concentraciones, stos pueden ser fermentados por otro grupo de microorganismos, generando colonias semejantes a las de coliformes. El medio no debe esterilizarse ni sobrecalentarse por lo que se debe utilizar antes de 3 h. a partir de su preparacin; en cuanto se disuelva el agar se debe colocar en bao de agua a 45 C para mantenerlo fundido, hasta el momento de utilizarlo. Debe ponerse una sobrecapa de medio una vez que las placas vertidas han solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, ms adecuadas para los coliformes. El sobrecalentamiento del medio y las variaciones en las condiciones de incubacin, especialmente la incubacin prolongada, pueden ocasionar la formacin de colonias rojas de cocos Gram positivos. El rango estadstico para tener confiabilidad en el aspecto cuantitativo (de sensibilidad del mtodo) es de 15 a 150 UFC por placa. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se vierten los medios de cultivo en las cajas con las muestras de diluciones, no debe exceder de 20 minutos.

MATERIALES Y MEDIOS
Materiales 2 botes 1 bolsa estomacher 1 mechero Pipetas de 2,5 y 10ml 3 placas Petri 1 encendedor 1 gradilla 4 tubos de ensayo para las diluciones Balanza Cuchara Muestra : carne molida Alcohol 70% Desinfectante 15% NMP 9 tubos de ensayo con tubo dulham (caldo lauril) 9 tubos de ensayo con tubo dulham (caldo VBB) 9 tubos de ensayo con tubo dulham (caldo EC) Medios caldo lauril sulfato de sodio agar VRBL caldo VBB caldo EC

Recuento en placa 3 tubos de ensayo con tubo dulham (caldo VBB) 3 tubos de ensayo con tubo dulham (caldo EC)

PROCEDIMIENTO
Preparar la serie de diluciones poniendo 9ml de solucin fisiolgica a los 4 tubos de ensayo. Preparar la solucin madre con 25g de carne molida y 225 de solucin fisiolgica (dilucin -1) De la dilucin -1 trasvasar 1ml a la primera placa Petri (-1) y 1ml mas al primer tubo de ensayo (dilucin-2), homogeneizar bien la dilucin -2. De la dilucin -2 trasvasar 1ml al segundo tubo de ensayo (dilucin-3) y homogeneizar. De la dilucin -3 trasvasar 1ml a la segunda placa Petri (-3), 1ml a cada uno de los 3 tubos de ensayo con tubo dulham de caldo lauril (-3) y por ultimo 1ml al tercer tubo de ensayo (dilucin -4). De la dilucin -4 trasvasar 1ml al cuarto tubo de ensayo (dilucin-5) y homogeneizar, 1ml a cada uno de los 3 tubos de ensayo con tubo dulham de caldo lauril (-4). De la dilucin -5 trasvasar 1ml a la tercera placa Petri (-5), 1ml a cada uno de los 3 tubos de ensayo con tubo dulham de caldo lauril (-5). Todas las placas Petri llevar a incubar a 37C por 24 horas y los tubos con caldo lauril incubar a 30C durante 24-48 horas.

Recuento en placa Despus de la incubacin realizar el conteo en cada placa y escoger de que placa se sacaran las colonias para su confirmacin. Escoger tres colonias tpicas de la placa seleccionada. Con un asa aguja previamente esterilizada picar la primera colonia y sembrar en el tubo con el EC, luego volver a cargar el asa y sembrar en el tubo de caldo VBB, repetir el proceso para las otras dos colonias restantes sin olvidarse de esterilizar el asa antes de cargar una nueva colonia. Llevar los 3 tubos de caldo EC a incubar a 44,5C por 24-48 horas y los 3 tubos de caldo VBB incubar a 37C por 24-48 horas. Observar si se produce gas en todos los tubos durante ese periodo de tiempo y hacer la toma de datos.

Nmero ms probable Despus del tiempo de incubacin observar que tubos de caldo lauril dieron positivos (produccin de gas). Sembrar de los tubos lauril positivos a los caldos EC y VBB. Con un asa volumtrica previamente esterilizada sacar una muestra del caldo lauril y sembrar al caldo EC, volver a cargar el asa con la muestra d caldo lauril y sembrar al caldo VBB. Realizar este proceso para todos los tubos de caldo lauril que dieron positivos no se olvide de esterilizar el asa cada vez que vaya a sembrar de un nuevo tubo. Llevar los tubos de caldo EC a incubar a 44,5C por 24-48 horas y los tubos de caldo VBB incubar a 37C por 24-48 horas. Observar si se produce gas en todos los tubos durante ese periodo de tiempo y hacer la toma de datos.

DATOS, CALCULOS Y RESULTADOS

Recuento en placa Datos: Dilucin 1x10-1 1x10-3 #de colonias Incontables Incontables Seleccin de colonias: 3 colonias de la dilucin -5 Colonias 1 2 VBB Gas (-) Gas (-) EC Gas (-) Gas (+) Clculos: CT= 0 EC = 3,3 x10 5 UFC/g 1x10-5 10 3 Gas (-) Gas (-)

Reporte de resultados No se har un reporte de resultados ya que los datos obtenidos son totalmente incoherentes. Nmero ms probable Datos: Diluciones Tubos Gas(-) 1x10-3 Gas(-) Gas(-) 1x10-4 Gas(-) Gas(-) 1x10-5 Gas(-) Gas(-)

Gas(-)

Gas(-)

Reporte de resultados CT= 0 UFc/g CF= 0 UFc/g

OBSERVACIONES
Coliformes totales nos dio cero y sin embargo si hay coliformes fecales esto fue por un mal desarrollo de la prctica ya que se pudo haber contaminado o la siembra lo hicimos mal es por eso que no hay un reporte de resultados. En el caso de CT y CF por recuento en placa las colonias contadas no se vean colonias tpicas y si lo fueron la confirmacin es lo que hicimos mal. En el proceso de nmero ms probable todos los tubos de caldo lauril nos dio gas negativo esto pudo pasar porque las diluciones eran muy bajas tal vez si se lo hubiera hecho las diluciones -1 y -2 nos hubieran dado una presencia. Si lo hubiramos realizado correctamente el procedimiento lo ms probable es que los resultados no hubieran congeniado ya que las carnes usadas para ambos procedimientos fue distinta.

CONCLUSIONES
Los datos obtenidos en el nmero ms probable fueron: CT=0 UFc/g y CF=0 UFc/g Esto fue porque en ningn tubo de caldo lauril sali gas positivo por tanto no se hizo confirmacin eso sera que no hay presencia de ni uno de los dos. No se obtuvo resultados de presencia de coliformes totales y fecales por un mal desarrollo de la prctica. A partir de los resultados obtenidos del mtodo nmero ms probable se lo puede comparar con alguna norma: - CT=0 UFc/g: segn los lmites establecidos por el Cdigo Alimentario Argentino en los art. 255, 302 y 286 bis para carne picada la cantidad de coliformes totales debe ser menor a 1x102 UFC/g y segn la carne molida que tenemos esta entra en el rango establecido por tanto es una carne apta para su comercializacin y consumo. - CF=0 UFc/g: segn la norma boliviana NB 32020 la cantidad de coliformes fecales (escherichia coli) en la carne molida es de m=1x10 2 M=1x103 por tanto nuestra muestra de carne molida entra en el rango establecido por tanto es una carne apta para su comercializacin y consumo.

BIBLIOGRAFIA
Libro Microbiologa Alimentaria Vicente Calderon y Pascual 2 edicin. Tema: investigacin y recuento de Staphylococcus aureus pag: 77 a 83

2. Si se desea determinar la presencia de Escherichia coli Qu pasos debe seguirse y cul es la prueba de confirmacin que se realiza? R. A partir de toda la serie de dilucin, siembra e incubacin. Se debe escoger las colonias tpicas de alguna de las placas. - Con un asa aguja previamente esterilizada picar la primera colonia y sembrar en el tubo con el caldo EC que es una fuente de nutriente ms que todo para la Escherichia coli - hacer lo mismo con todas las colonias que se seleccion, luego llevar a incubar a 44,5C por 24-48 horas. - observar en cul de los tubos con el caldo EC hay presencia de gas 3. Cul es el rango de colonias segn las normas ISO? R. Rango segn la ISO es: de 15 a 150 colonias. 4. Cul es el fundamento de los diferentes medios empleados en la prctica de recuento e placa; indicando cuales son los componentes inhibidores y como es el desarrollo tpico de colonias totales y fecales?

5. Cul es la importancia que tiene este parmetro en la industria y en la salud del consumidor? 6. Hacer un reporte de resultados con los siguientes datos obtenidos al procesar una muestra liquida: Dilucin -1 -2 -3 # de colonias tpicas en medio de cultivo VRBL INC 48 5 De la dilucin (-2) se realiz las pruebas confirmativas a 4 colonias de las cuales: Caldo VBB= 4 tubos dieron gas (+) y presentaron turbidez Caldo EC=2 tubos dieron gas (+) y presentaron turbidez 8. En qu tipo de muestras se aplica generalmente este mtodo de anlisis? 9. De acuerdo a las 2 practicas realizadas Cules son las ventajas y desventajas de mtodo al otro?