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ALMA MATER STUDIORUM UNIVERSIT DI BOLOGNA

FACOLT DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI

Corso di Laurea Magistrale in Biotecnologie Molecolari e Industriali

DERIVAZIONE ED ANALISI DI NEURONI


DOPAMINERGICI DA CELLULE STAMINALI
PLURIPOTENTI INDOTTE (iPSCs) DI PAZIENTI
CON MALATTIA DI PARKINSON

Laureanda

Relatore

IRENE LOMBARDELLI

Prof. ANTONIO CONTESTABILE

Correlatore
Dott. VANIA BROCCOLI

Sessione I
Anno Accademico 2013/2014

ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSIT DI BOLOGNA


FACOLT DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI
Corso di Laurea Magistrale in Biotecnologie Molecolari e Industriali

DERIVAZIONE ED ANALISI DI NEURONI DOPAMINERGICI


DA CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI INDOTTE (iPSCs)
DI PAZIENTI CON MALATTIA DI PARKINSON
Laureanda

Relatore

IRENE LOMBARDELLI

Prof. ANTONIO CONTESTABILE


Correlatore
Dott. VANIA BROCCOLI

La malattia di Parkinson la seconda patologia neurodegenerativa per diffusion e al


mondo e colpisce l1-2% della popolazione mondiale sopra i 65 anni. I sintomi
distintivi sono tremore a riposo, rigidit, bradicinesia ed instabilit posturale, ma
questa malattia genera anche problemi non motori, quali demenza e depressione. Nel
complesso, la malattia di Parkinson fortemente invalidante, ed preoccupante
laumento dei casi di forme giovanili della malattia (insorgenza sotto i 40 anni).
Capire quali siano i meccanismi che regolano linstaurarsi della malattia, ed
auspicabilmente in questo modo trovare una via per risolvere questo problema, risulta
essere una questione rilevante.
Attualmente allo scopo vengono impiegati modelli animali, poich le colture primarie
di neuroni affetti sono difficili da ottenere e mantenere in coltura. I sintomi della
patologia negli organismi modello vengono indotti ad esempio con neurotossine che
agiscono

in

modo

specifico

sui

neuroni

dopaminergici,

oppure

mediante

manipolazione genica. Questo sistema per non ricapitola correttamente il lento


decorso che si osserva nei pazienti umani. Inoltre, la carenza di strutture neuronali
complesse o la breve aspettativa di vita di questi organismi pu rendere difficile la
trasposizione dei risultati osservati rispetto allessere umano.
Lottenimento di neuroni dopaminergici da iPSCs umane vantaggioso rispetto ai
modelli tradizionali per studiare la malattia di Parkinson, perch le cellule derivate dai
pazienti permettono di analizzare linstaurarsi della patologia sullo stesso assetto
genetico sul quale si sviluppa in vivo. Inoltre, possono essere studiate alterazioni
precoci di meccanismi cellulari che portano allinstaurazione e sviluppo di questa

malattia, e di conseguenza metodologie per riparare queste lesioni nei pazienti prima
che intervengano manifestazioni cliniche.
Il presente lavoro, che si inserisce nellambito di un progetto pi ampio, verte
sullelaborazione

di

un

protocollo

efficiente

per

la

generazione

di

neuroni

dopaminergici da iPSCs umane. Le cellule umane pluripotenti sono state indotte da


fibroblasti di un controllo sano e di due pazienti con malattia di Parkinson autosomica
dominante, affetti rispettivamente da duplicazione in eterozigosi del gene SNCA
codificante per la proteina -sinucleina, e da mutazione missenso G6055A in
eterozigosi nel gene LRRK2, che genera sostituzione G2019S nellomonima proteina.
Esse sono state caratterizzate dal punto di vista morfologico, molecolare e funzionale.
Allanalisi microscopica le colonie hanno indicato che la riprogrammazione ha avuto
successo.

Le

analisi

molecolari,

effettuate

mediante

cariotipizzazione,

immunofluorescenza, RT-PCR e sequenziamento hanno rivelato che le cellule hanno


espresso i marcatori per la pluripotenza e hanno mantenuto le mutazioni patogeniche
delle cellule di origine. In condizioni di coltura permissive, le hiPSCs hanno mostrato
di essere in grado di differenziare nei tre foglietti germinali. In seguito stato indotto
differenziamento in senso neuronale, nello specifico verso un fenotipo dopaminergico.
In ultimo, le cellule differenziate sono state caratterizzate dal punto di vista
molecolare

funzionale.

Le

analisi

molecolari,

condotte

mediante

immunofluorescenza e Real-Time RT-PCR, hanno rivelato che la proteina -sinucleina


ed i marcatori di maturit neuronale venivano espressi, e che questi ultimi mostravano
una buona efficienza di differenziamento in senso dopaminergico delle cellule. In
seguito alle analisi in modalit whole-cell current-clamp e whole-cell voltage-clamp
stato verificato che le propriet elettrofisiologiche d ei neuroni dopaminergici in
coltura corrispondevano a quelle in vivo.
I risultati hanno indicato che il protocollo utilizzato costituisce senzaltro un sistema
per ottenere un modello affidabile della malattia di Parkinson in vitro, e che presenta
promettenti

possibilit

di

miglioramento,

specialmente

per

quanto

riguarda

lefficienza di differenziamento delle iPSCs umane in senso neuronale e di


maturazione dei neuroni ottenuti in senso dopaminergico.

DERIVATION AND ANALYSIS OF DOPAMINERGIC NEURONS


FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS (iPSCs) OF
PARKINSONS DISEASE PATIENTS
Parkinsons disease is the most common neurodegenerative disease in the world,
affecting 1-2% of global population after the age of 65. Distinctive symptoms are
tremor at rest, rigidity, bradykinesia and postural instability, but this disease also
causes non-motor symptoms, such as dementia and depression. On the whole,
Parkinsons disease is strongly disabling, and the increase i n the number of cases of
early-onset forms (under 40 years of age) is alarming. Understanding the mechanisms
which regulate the onset of the pathology, and hopefully finding a way to solve this
problem, is a relevant issue.
Animal models are now used for this purpose , because primary neurons cultures are
difficult to obtain and to maintain in vitro. Parkinsons disease symptoms in model
organisms are induced for example by neurotoxins acting specifically on dopaminergic
neurons, or by genetic manipulation. By the way, this system does not recapitulate the
slow development observed in human patients. Moreover, the lack of elaborate
neuronal structures or the reduced life expectancy of these organisms can make more
difficult the transposition of the obtained results in respect to human beings.
The derivation of dopaminergic neurons from human iPSCs is convenient compared
with traditional models for studying Parkinson s disease, because the cells obtained
from patients allow the analysis of its onset on the same genetic background on which
the disease develops in vivo. Furthermore, it is possible to study early changes in
cellular mechanisms which lead to the development of the disease, and subsequently
to find ways to repair these alterations in patients before the appearing of clinical
manifestations.
This work, which is part of a wider project, aims to develop an efficient protocol for
producing dopaminergic neurons from human iPSCs. Human pluripotent cells were
induced from fibroblasts of an healthy control and of two patients both with an
autosomal dominant form of Parkinsons disease, that is to say heterozygous
duplication of SNCA gene, encoding for -synuclein protein, and heterozygous
missense mutation G6055A in LRRK2 gene, which leads to G2019S substitution in the
homonymous protein. These cells were morphologically, molecularly and functionally
characterized. At microscopical observation colonies showed that reprogramming was
successful. Molecular analysis through karyotyping, immunofluorescence, RT-PCR

and sequencing revealed that cells expressed pluripotency markers, and that the
pathogenic mutations of the original cells were maintained. In permissive culture
conditions, hiPSCs showed to be able to differentiate into the three germinal sheets.
Subsequently, neural differentiation of these cells was induced, specifically towards a
dopaminergic fate. Lastly, differentiated cells were molecularly and functionally
characterized. Molecular analysis through immunofluorescence and Real Time RTPCR showed that -synuclein protein and neural markers were both expressed, and
that these markers also showed a good efficiency of differentiation towards a
dopaminergic phenotype. After the whole-cell current-clamp and whole-cell voltageclump analysis it was verified that electrophysiological properties of dopaminergic
neurons in culture corresponded to in vivo ones.
Results showed that the employed protocol is a system to obtain a reliable model of
Parkinsons disease in vitro, and that it presents promising chances of improvement,
expecially for what concerns neural differentiation efficiency of human iPSCs and
maturation of obtained neurons towards a dopaminergic fate.

INDICE
INTRODUZIONE ........................................................... ........................

1. Embriologia ....................................................... ...............................

1.1

Prima settimana di sviluppo ............................................................

1.2

Seconda settimana di sviluppo ........................................................

1.3

Gastrulazione .................................................................................

1.4

Sviluppo embrionale del sistema nervoso .................................. ......

2. Cellule staminali ...............................................................................

2.1

Classificazione delle cellule staminali in base allorigine .................

2.2

Caratteristiche delle cellule staminali ..............................................

2.2.1 Stato indifferenziato .............................................................

2.2.2 Automantenimento ................................................................

2.2.3 Potenziale differenziativo .....................................................

Cellule pluripotenti ........................................................................

10

2.3.1 Cellule staminali embrionali ..................................................

10

2.3.2 Cellule staminali epiblastiche ................................................

11

2.3

2.3.3 Cellule germinali embrionali


e cellule staminali germinali adulte .......................................

11

2.3.4 Cellule di carcinoma embrionale ................................. ...........

12

2.4

Mantenimento della pluripotenza ....................................................

12

2.5

Applicazioni delle cellule pluripotenti .............................................

15

3.

Riprogrammazione ............................................. ..........................

18

3.1

Tecniche di riprogrammazione ........................................................

20

3.1.1 Trasferimento nucleare da cellule somatiche ..........................

20

3.1.2 Fusione cellulare ..................................................................

20

3.1.3 Induzione di fattori di trascrizione .........................................

21

3.1.3.1 Fattori essenziali


ed agonisti della riprogrammazione ..........................

21

3.1.3.2 Tecniche di induzione


con fattori di trascrizione ........................................

22

3.1.3.2a Metodi integranti ..........................................

22

3.1.3.2b Metodi non integranti ...................................

23

3.2

Modello elitario e modello stocastico ..............................................

26

3.3

Problemi nella riprogrammazione ....................................................

26

4.

Cellule staminali pluripotenti indotte ...........................................

27

4.1

Sviluppo ........................................................................................

27

4.2

Valutazione della pluripotenza ........................................................

28

4.3

Confronto con le hESCs .................................................................

30

4.4

iPSCs come modello in vitro ...........................................................

30

4.5

Potenziale terapeutico ....................................................................

31

5.

Anatomia del sistema nervoso centrale .........................................

32

5.1

Il mesencefalo adulto ed i nuclei dopaminergici ...............................

32

5.2

I gangli della base ..........................................................................

33

6.

Induzione del sistema nervoso ......................................................

35

6.1

Meccanismi molecolari di induzione del sistema nervoso in vivo ......

35

6.1.1 Asse antero-posteriore ..........................................................

36

6.1.2 Asse dorso-ventrale ..............................................................

37

7.

Il sistema dopaminergico ..............................................................

38

7.1

Dopamina ......................................................................................

38

7.2

Le vie dopaminergiche ...................................................................

41

7.2.1 La via nigrostriatale ..............................................................

42

8.

Tecniche di differenziamento in vitro .......................................... .

44

8.1

Differenziamento spontaneo ...........................................................

44

8.2

Formazione di corpi embrioidi ........................................................

45

8.3

Co-colture e SDIA .........................................................................

45

8.4

Terreni di coltura integrati ..............................................................

46

8.5

Differenziamento neuronale specifico in senso dopaminergico ..........

46

9.

Malattia di Parkinson ...................................................................

47

9.1

Quadro clinico ...............................................................................

47

9.2

Patogenesi ........................................................... ..........................

48

9.3

Terapie ..........................................................................................

51

10.

-sinucleina ..................................................................................

53

10.1

Ruolo fisiologico ...........................................................................

54

10.2

Ruolo patologico ............................................................................

55

10.2.1 Suscettibilit dei neuroni dopaminergici


alla citotossicit mediata da -sinucleina ............................

58

11.

LRRK2 .........................................................................................

58

11.1

Ruolo fisiologico .......................................................... .................

59

11.2

Ruolo patologico ............................................................................

59

11.2.1 Possibili interazioni patologiche con -sinucleina ................

60

SCOPO DELLA RICERCA ......................................... ...........................

63

MATERIALI E METODI .......................................................................

65

1. Preparazione di MEF ..........................................................................

65

2. Espansione di MEF .............................................................................

65

3. Preparazione delle piastre di feeders ....................................................

65

4. Produzione dei vettori retrovirali per la riprogrammazione ....................

66

5. Riprogrammazione dei fibroblasti umani ..............................................

66

6. Trasferimento dei cloni riprogrammati su feeders .................................

67

7. Espansione delle hiPSCs .....................................................................

67

8. Differenziamento delle hiPSCs in senso neuronale ................................

68

9. Differenziamento nei tre foglietti embrionali ........................................

68

10. Immunofluorescenza ................................................................. ........

69

11. Estrazione RNA, retrotrascrizione, RT -PCR .......................................

69

12. Real-Time RT-PCR ...........................................................................

70

13. Analisi elettrofisiologiche .................................................................

70

RISULTATI ...........................................................................................

73

1. Derivazione e caratterizzazione di hiPSCs ........................................

73

1.1

Morfologia delle colonie ................................................................

73

1.2

Cariotipizzazione ...........................................................................

74

1.3

Espressione dei marcatori di pluripotenza ........................................

74

1.4

Mantenimento delle mutazioni nei cloni derivati da pazienti .............

74

1.5

Analisi funzionali ..........................................................................

76

2. Differenziamento e caratterizzazione dei neuroni


ottenuti da hiPSCs ............................................................................

76

2.1

Espressione di marcatori di maturit neuronale ................................

77

2.2

Espressione di -sinucleina .............................................................

78

2.3

Efficienza di differenziamento in senso dopaminergico ....................

78

2.4

Analisi elettrofisiologiche ..............................................................

80

DISCUSSIONE ..................................................................................... ..

83

CONCLUSIONI .....................................................................................

87

BIBLIOGRAFIA ....................................................................................

91